CN1884531A - 花鲈肌动蛋白的基因序列 - Google Patents

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CN1884531A CN 200610035878 CN200610035878A CN1884531A CN 1884531 A CN1884531 A CN 1884531A CN 200610035878 CN200610035878 CN 200610035878 CN 200610035878 A CN200610035878 A CN 200610035878A CN 1884531 A CN1884531 A CN 1884531A
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邱丽华
江世贵
张汉华
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South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
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Abstract

本发明从近源物种肌动蛋白的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，从花鲈鱼的脾脏中提取总RNA，并用PCR法扩增，克隆到花鲈肌动蛋白的基因的表达序列。该基因序列不仅为研究鱼类肌动蛋白在DNA转录中的作用奠定了基础，而且通过该基因序列可获得具有活性的体外重组蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。

Description

花鲈肌动蛋白的基因序列
技术领域
本发明涉及分子生物学中基因克隆领域，特别是涉及一种花鲈肌动蛋白的基因序列。
背景技术
肌动蛋白被定义成一种分子发动机，与细胞移动、细胞***以及伤口愈合有关；同时肌动蛋白还参与DNA转录，可以召集RNA聚合酶II，在RNA聚合酶II开始转录时充当一个分子发动机。如果肌动蛋白受到抑制，转录就无法开始。DNA转录这个过程对细胞的所有活动都非常重要。这些功能将使我们能够在遗传转录出错时进行有效干预；肌动蛋白可以作为辅助因子，具有降解细胞骨架的病毒酶的功能。
目前随着海水养殖业的发展，病害问题日趋严重，因此从鱼体自身入手，克隆相关的功能基因，获得纯化的具活性的体外重组蛋白，高鱼体抗病能力是当今病害防治的趋势。至今对花鲈细胞方面的基因研究还较少，尤其对肌动蛋白基因的研究还属空白。
发明内容
本发明的目的是通过以近源物种肌动蛋白的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，克隆到花鲈肌动蛋白的基因的表达序列。它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述；它的氨基酸序列如序列表中SEQ IDNO.2所述。
1、总RNA的提取
解剖鱼体取出脾脏，使用Trizol进行匀浆，按照使用说明提取花鲈总RNA。
2、cDNA第一链的合成
花鲈总RNA与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录。
3、引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(如虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)肌动蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为1127bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为：
F：5’ATg gA(A/T) g(A/g)(T/C) gAA ATC gCC gC 3’
R：5’TTA gAA gCA TTT (g/A) Cg gTg gA  3’
4、肌动蛋白基因PCR扩增、克隆
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有***片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。测序所得序列利用Clustal W软件进行拼接。
5、对花鲈肌动蛋白的基因的测定
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈肌动蛋白基因同源序列。比对结果为：
                                                                  Score      E
Sequences producing significant alignments：                     (Bits)     Value
gi|56554009|gb AAV97945.1 beta actin 2[Rivulus marmoratus]...    655      0.0
gi|6716561|gb|AAF26678.1|beta-actin[Rivulus marmoratus]          655      0.0
gi|52547951 gb AAR97600.2 beta actin[Epinephelus coioides]...    655      0.0
gi|40362701 gb AAR84618.1 beta actin[Acanthopagrus schlegelii]   655      0.0
gi|19309743|emb|CAD27237.1|beta-actin[Oncorhynchus mykiss]...     654    0.0
gi|13241079|gb|AAD14159.2|beta-actin[Oryzias latipes]＞gi|2...    653    0.0
该基因序列不仅为研究鱼类肌动蛋白在DNA转录中的作用奠定了基础，而且通过该基因序列可获得具有活性的体外重组蛋白，为研究新型的抗病免疫佐剂提供理论基础。
具体实施方式
1.总RNA的提取
取鲜活健康花鲈(体重约400g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，从胸腔注射脂多糖(LPS，10μg/mL)200μL。刺激6h后，解剖鱼体取出脾脏约100mg，分别放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。
2.cDNA第一链的合成
取花鲈总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃ 60min，70℃ 15min，最后放入-80℃保存备用。
3.引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(如虹鳟、牙鲆、鲤鱼等)肌动蛋白同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为1127bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成。
引物序列为：
F：5’ATg gA(A/T)g(A/g)(T/C)gAA ATC gCC gC 3’
R：5’TTA gAA gCA TTT(g/A)Cg gTg gA  3’
4.肌动蛋白基因cDNA序列的克隆
以近源物种肌动蛋白基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为1127bp。
以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10x PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl2 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，54℃退火45s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有***片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。测序所得序列利用Clustal W软件进行拼接。
5.对花鲈肌动蛋白基因的测定
所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件进行同源性测定，来确定为花鲈肌动蛋白基因同源序列。比对结果为：
                                                                 Score     E
Sequences producing significant alignments：                    (Bits)    Value
gi|56554009|gb AAV97945.1 beta act in 2[Rivulus marmoratus]...  655     0.0
gi|6716561|gb|AAF26678.1|beta-actin[Rivulus marmoratus]         655     0.0
gi|52547951|gb AAR97600.2 beta actin[Epinephelus coioides]...   655     0.0
gi|40362701|gb AAR84618.1 beta actin[Acanthopagrus schlegelii]  655     0.0
gi 19309743 emb CAD27237.1|beta-actin[Oncorhynchus mykiss]...   654     0.0
gi|13241079|gb AAD14159.2 beta-actin[Oryzias latipes]＞gi|2...  653     0.0
                       序列表
<110>中国水产科学研究院南海水产研究所
<120>花鲈肌动蛋白的基因序列
<160>2
<210>1
<211>1128
<212>RNA
<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)
<220>
<221>CDS
<222>(1)...(1128)
<400>1
atg gat gac gaa atc gcc gca ctg gtt gtt gac aac gga tcc ggt atg    48
Met Asp Asp Glu Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met
1                       7                       13
tgc aaa gcc gga ttc gcc gga gac gac gcc cct cgt gct ttc ttc ccc    96
Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro
17                      23                      29
tcc atc gtc gtg cgc ccc aga cat cag gga gtg atg gtg ggt atg ggc    144
Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly
33                      39                      45
cag aag gac agc tac gtt ggt gat aaa gcc cag agc aag aga ggt atc    192
Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Lys Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile
49                      55                      61
ctg acc ctg aag tac ccc atc gag cac ggt att gtg acc aac tgg gat    240
Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp
65                      71                      77
gac atg gag aag atc tgg cat cac acc ttc tac aac gag ctg aga gtt    288
Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu ArgVal
81                      87                      93
gca cct gag gag cac cca gtc ctg ctc aca gag gcc ccc ctg aac ccc    336
Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Aal Pro Leu Asn Pro
97                      103                     109
aaa gcc aac agg gag aag atg acc cag atc atg ttt gag acc ttc aac    384
Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn
113                     119                     125
acc ccc gcc atg tac gtt gcc atc cag gct gtg ctg tcc ctg tat gcc    432
Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Aal Val Leu Ser Leu Tyr Ala
129                     135                     141
tct ggt cgt acc acc ggt atc gtc atg gac tcc ggt gat ggt gtg acc    480
Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr
145                     151                     157
cac aca gtg ccc atc tat gag ggc tac gcc ctg ccc cac gcc atc ctg    528
His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu
161                     167                     173
cgt ctg gac ttg gcc ggt cgc gac ctt aca gac tac ctc atg aag atc    576
Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile
177                     183                     189
ctg aca gag cgt ggc tac tcc ttc acc acc aca gcc gag agg gaa atc    624
Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile
193                     199                     205
gtg cgt gac atc aag gag aag ctg tgc tat gtc gcc ctg gac ttc gag    672
Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu
209                     215                     221
cag gag atg ggc acc gct gcc tcc tcc tcc tcc ctg gag aag agc tac    720
Gln Glu Met Gly Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr
225                     231                     237
gag ctg ccc gac gga cag gtc atc acc att ggc aat gag agg ttc cgt    768
Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg
241                     247                     253
tgc cca gag gcc ctc ttc cag cct tcc ttc ctc ggt atg gag tcc tgc    816
Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys
257                     263                     269
gga atc cac gag acc acc tac aac agc atc atg aag tgt gat gtc gac    864
Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp
273                     279                     285
atc cgt aag gac ctg tac gcc aac aca gtg ctg tct gga ggt acc acc    912
Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr
289                     295                     301
atg tac ccc ggc atc gct gac agg atg cag aag gag atc aca gcc ctg    960
Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu
305                     311                     317
gcc cca tcc acc atg aag atc aag atc att gcc cca cct gag cgt aaa    1008
Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys
321                     327                     333
tac tct gtc tgg atc gga ggc tcc atc ctg gcc tcc ctg tcc acc ttc    1056
Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe
337                     343                     349
cag cag atg tgg atc agc aag cag gag tac gat gag tcc atc ccc tcc    1104
Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Ile Pro Ser
353                     359                     365
atc gtc cac cgt aaa tgc ttc taa                                    1128
Ile Val His Arg Lys Cys Phe
369                     375
<210>2
<211>375
<212>PRT
<213>花鲈(Lateolabrax Japonicus)
<400>2
Met Asp Asp Glu Ile Ala Ala Leu Val Val Asp Asn Gly Ser Gly Met
1                       7                       13
Cys Lys Ala Gly Phe Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe Pro
17                      23                      29
SerIle Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met Val Gly Met Gly
33                      39                      45
Gln Lys Asp Ser Tyr Val Gly Asp Lys Ala Gln Ser Lys Arg Gly Ile
49                      55                      61
Leu Thr Leu Lys Tyr Pro Ile Glu His Gly Ile Val Thr Asn Trp Asp
65                      71                      77
Asp Met Glu Lys Ile Trp His His Thr Phe Tyr Asn Glu Leu Arg Val
81                      87                      93
Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu Leu Thr Glu Aal Pro Leu Asn Pro
97                      103                     109
Lys Ala Asn Arg Glu Lys Met Thr Gln Ile Met Phe Glu Thr Phe Asn
113                     119                     125
Thr Pro Ala Met Tyr Val Ala Ile Gln Aal Val Leu Ser Leu Tyr Ala
129                     135                     141
Ser Gly Arg Thr Thr Gly Ile Val Met Asp Ser Gly Asp Gly Val Thr
145                     151                     157
His Thr Val Pro Ile Tyr Glu Gly Tyr Ala Leu Pro His Ala Ile Leu
161                     167                     173
Arg Leu Asp Leu Ala Gly Arg Asp Leu Thr Asp Tyr Leu Met Lys Ile
177                     183                     189
Leu Thr Glu Arg Gly Tyr Ser Phe Thr Thr Thr Ala Glu Arg Glu Ile
193                     199                     205
Val Arg Asp Ile Lys Glu Lys Leu Cys Tyr Val Ala Leu Asp Phe Glu
209                     215                     221
Gln Glu Met Gly Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu Glu Lys Ser Tyr
225                     231                     237
Glu Leu Pro Asp Gly Gln Val Ile Thr Ile Gly Asn Glu Arg Phe Arg
241                     247                     253
Cys Pro Glu Ala Leu Phe Gln Pro Ser Phe Leu Gly Met Glu Ser Cys
257                     263                     269
Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met Lys Cys Asp Val Asp
273                     279                     285
Ile Arg Lys Asp Leu Tyr Ala Asn Thr Val Leu Ser Gly Gly Thr Thr
289                     295                     301
Met Tyr Pro Gly Ile Ala Asp Arg Met Gln Lys Glu Ile Thr Ala Leu
305                     311                     317
Ala Pro Ser Thr Met Lys Ile Lys Ile Ile Ala Pro Pro Glu Arg Lys
321                     327                     333
Tyr Ser Val Trp Ile Gly Gly Ser Ile Leu Ala Ser Leu Ser Thr Phe
337                     343                     349
Gln Gln Met Trp Ile Ser Lys Gln Glu Tyr Asp Glu Ser Ile Pro Ser
353                     359                     365
Ile Val His Arg Lys Cys Phe
369                     375

Claims (2)

1、一种花鲈肌动蛋白基因，它的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
2、一种花鲈肌动蛋白基因，它的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述。
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