CN1928091A - 盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3、其编码蛋白及其克隆方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了盐藻(Dunaliella viridis)碳酸酐酶3全长基因DvCA3的核酸序列、氨基酸序列、基因的克隆方法以及它在不同的环境盐浓度下的表达情况。本发明所公开的全长基因为盐藻(Dunaliella viridis)中的首次报道，对DvCA3的表达分析确证了该基因的表达受盐诱导，并在盐藻抗胁迫生理过程中具有重要的功能。

Description

盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3、其编码蛋白 及其克隆方法

技术领域

本发明涉及盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的核酸和氨基酸序列及该基因的克隆方法。

背景技术

盐藻，又叫杜氏盐藻(Dunaliella viridis)，它是一种无细胞壁的单细胞真核绿藻，是已知的最耐盐的真核生物。同时，它对光照、环境pH、温度等变化造成的胁迫也能够很好的耐受。因而被广泛的用来研究植物对各种胁迫的反应机制，特别是耐盐胁迫的机制。

碳酸酐酶(CA：carbonic anhydrase)催化的是 的可逆反应。因为CO₂和HCO₃ ^-之间的自然转化是非常慢的，不足以满足细胞代谢的需要，所以在生物代谢中，CA是必须的。盐藻直接可以利用的碳源主要是CO₂，在高盐条件下，CO₂的溶解度降低，这时细胞表面的碳酸酐酶可以将HCO₃ ^-转换为CO₂供细胞使用。碳酸酐酶对于盐藻在胁迫条件下维持正常的生理活动是非常重要的，一般情况下它们都是受盐诱导的，协助细胞抵抗高渗胁迫的耐盐基因。对这一家族的研究有助于揭示盐藻耐盐的机理。

发明内容

本发明的目的之一在于提供盐藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)具有SEQ NO 1所示的全长基因序列。

本发明的目的之二在于提供盐藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)具有SEQ NO 2所示的全长氨基酸序列。

本发明的目的之三在于提供盐藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)的克隆方法。

其特征在于该方法的具体步骤为：

a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2为引物，采用PCR方法从盐藻的BAC文库中筛选出一个不同于已知碳酸酐酶的盐藻基因组BAC克隆，该BAC克隆的大小为60kb；

b.将上述BAC克隆随机打断为2～4kb的小片段，装入测序载体，构建该BAC克隆的鸟枪文库；

c.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序；

d.在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，最终得到盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全长序列。

上述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的筛选BAC克隆的PCR方法的程序为：

94℃  5min；

94℃  30s，55℃  30s，72℃  50s，30cycles；

72℃  10min；

引物序列：

DCA3(+)-2    ACG GTT GTT GGT GAT GGC AG

DCA3(-)-2    TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。

本发明将一个大小约为60kb的BAC质粒构建成鸟枪文库，通过对文库的测序和序列的拼接，得到了BAC质粒所包含的盐藻基因组全序列。利用www.softberry.com的基因预测程序(FGENSH，选用Chlamydomonas预测模式)，预测DvCA3的核酸和氨基酸序列。NCBI中的Blastn结果显示，DvCA3是盐藻碳酸酐酶家族的一个成员，该基因家族的功能主要是吸收环境中的CO₂供细胞使用，在高盐等逆境条件下，环境中的CO₂含量降低，碳酸酐酶的大量表达，有助提高细胞利用CO₂的能力，从而增强了细胞抗逆的能力。

利用RT-PCR的方法证明，本发明得到的DvCA3是一个表达的基因，并且受盐的诱导高表达。相同情况下，环境盐浓度越高，则DvCA3的表达丰度越高。所以该基因在盐藻抗胁迫生理过程中具有重要的功能。

附图说明

图1为盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3在NCBI中的Blastn结果。图中匹配到的三条序列都是盐藻的碳酸酐酶(Dunaliella salina carbonic anhydrase)，它们在GenBank中的序列号及比对Score值如下所示：

gi|29569134|gb|AY232669.1|            Score：954

gi|23321337|gb|AF541983.1|            Score：870

gi|6435824|gb|AF190735.2|AF190735     Score：178

图2为盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的RT-PCR结果。

M：100bp的maker

1：以低盐浓度下的盐藻RT产物为模板

2：以中等盐浓度下的盐藻RT产物为模板

3：以高盐浓度下的盐藻RT产物为模板

4：阴性对照，以水为模板

上图以DCA3(+)-2和DCA3(-)-2为引物，进行PCR反应，目的PCR产物750bp。

下图以Actin(+)和Actin(-)为引物，进行PCR反应，目的PCR产物412bp。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体实验条件的实验方法，通常按照常规条件，分子克隆(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，3rd ed.)或植物分子生物学-实验手册(Plant Molecular Biology-A Laboratory Manual，Melody S.Clark编，Springer-verlag Berlin Heidelberg，1997)中所述条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例一：盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法

1.盐藻BAC文库的筛选

使用碳酸酐酶基因的特异性引物DCA3(+)-2、DCA3(-)-2，以PCR的方法从盐藻的BAC文库中筛选含有目的基因碳酸酐酶基因的BAC克隆。

引物序列：DCA3(+)-2  ACG GTT GTT GGT GAT GGC AG

          DCA3(-)-2  TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA

PCR  程序：

94℃  5min；

94℃  30s，55℃  30s，72℃  50s，30cycles；

72℃  10min

经过多轮PCR反应从盐藻的BAC文库中筛选得到一个***片段约为60k的BAC克隆。

2.鸟枪文库的构建、测序及拼接

将该BAC克隆的***片段随机打断为2～4kb的小片段，装入测序载体，构建了该BAC克隆的鸟枪文库。大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定。每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序。以该BAC克隆***片段大小为60kb计算，以每个测序反应得到可用序列为500bp，得到可用序列的成功率以75％来计算，按10倍覆盖的要求，共测序768个鸟枪文库质粒，即8块96孔板。

在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列。构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口。

通过以上工作，我们得到了一段约60k的盐藻基因组序列。该序列包含了用来筛选的引物序列(DCA3(+)-2和DCA3(-)-2)。

实施例二：DvCA3的Blastn比对

利用www.softberry.com上的基因预测程序FGENESH(Chlamydomonas模式)对长度约60kb的盐藻基因组序列进行预测，预测得到了9个基因，其中一个预测的基因包含了筛选的引物序列DCA3(+)-2和DCA3(-)-2，即从预测结果中获得了碳酸酐酶3基因与其编码的氨基酸序列。

在NCBI的核酸库中，对预测的盐藻碳酸酐酶3基因(DvCA3)进行Blastn比对，结果参见图1。根据比对结果，发现与DvCA3同源性最高的是3种盐藻的碳酸酐酶序列。据此，我们推断克隆得到的DvCA3基因是一个新的盐藻碳酸酐酶基因。

实施例三：RT-PCR验证DvCA3在盐藻中的表达情况

以低盐浓度、中等盐浓度和高盐浓度下的盐藻RT产物为模板进行PCR，鉴定DvCA3在盐藻中的表达情况。参见图2。PCR程序如下：

94℃  5min；

94℃  30s，55℃  30s，72℃  50s，30cycles；

72℃  10min

常量表达基因Actin的表达由于不受环境中盐浓度的影响，所以在本实验中作为内参对照，图2显示了在低盐浓度、中等盐浓度和高盐浓度下，以Actin(+)和Actin(-)为引物的PCR结果，3种条件下的PCR产物具有相同的亮度，证明了所使用的RT产物的模板量是相同的。

引物序列：Actin(+)  TGG CCT TGG ACT TTG AGC A

Actin(-)  CAC ATC TGC TGG AAG GTG GA

图2中，上图和下图使用相同的模板量进行PCR反应。下图显示了以Actin(+)和Actin(-)为引物的PCR反应得到了大小为412bp的目的产物，条带的亮度大致相同，说明了用于实验的三种RT产物的模板量可以视为相同；上图显示了相同的模板量下，以DCA3(+)-2和DCA3(-)-2为引物的PCR结果，结果显示，1、2、3泳道都得到了750bp的目的条带，说明低盐浓度，中等盐浓度和高盐浓度下盐藻的碳酸酐酶3基因都有表达；条带的亮度随盐浓度的增高而增强，说明了盐藻的碳酸酐酶3基因在低盐浓度，中等盐浓度和高盐浓度下的表达是逐渐增强的。

结果显示，DvCA3是一个表达的基因，并且受盐的诱导高表达。相同情况下，环境盐浓度越高，则DvCA3的表达丰度越高。

                            序列表

<110>上海大学

<120>盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3、其编码蛋白及其克隆方法

<160>2

<210>1

<211>6125

<212>DNA

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>1

agcagcgttc tggggtgtgt gtgtgtgtgt accagcaggg ctcctccaca aagagtgcct      60

cttgacactg cggtgtgccc atgcgcggcg tgtccatgtc cccatggagc gcaagtgcgc     120

gctgcaccac catgcaatgc tgaagcacac ctgcctggtc tgtccagatg agccaccaaa     180

taagcgtaag ggccaaagga agggaaggaa ggaaaaaatg gacgcacttg cttcatggcc     240

aattggctac atcccctttc cttgctgtcc gtggcgtggc tgcaaccaca cagcctgcag     300

gggctaaagt ttaaagttag ggcggtgaag tctattgaat ggatttcctt gcaggtcaca     360

aacatccaac cgtcctcctt atccagggta gtagcgctct ttccgcttct ccgctttctc     420

ttgtccaatc ggaaaactta ttactttttt cagccacgtc actcattcat ccatccatcg     480

gacacagcct cctcgtccca gttttgcgca ccgctatctg aaggtgcgtg tttccctgtt     540

tcccttgctg ctgctgcccc tgctgaacgc catcaggctg gcttgcgggc gagccatgag     600

ggctcggttg gacggtggag gacatcgctg tgtgcggtgt ctggggcctg ctggcgtgtc     660

ttcccccttt gagcagcacc tgcttgctgc accccacggt ggacctcctg cgagcgctgc     720

gctgccccct gtgttgatgt gtcgctcgcg cgatggactg cgggtgctct tgtcgctcgt     780

gtccaggagg aggcccagga ggatagggtc ctgttcctcc tgtctactac tcctcctgtc     840

tggaacacac cggccaagag gagccttcca tcacacacat catctgcacc cttcacctag     900

ctccatcctg ctggggcagg gtatgcacaa gctgttcttg ctgcctgcat ggagactgcc     960

acctcatcac agcactgacc ccttacccgc cctgtcccac acccgcccac agatggcgcg    1020

cctcgcgctg ttaggcgccg cgctactatg cgccctggcg gtctcgacgc aaggtgagct    1080

cctgcacgct gtgaggggag ggagtgtcct gcttccactt aggcaacatg gaggaggagc    1140

aggaatcttt ccactcgttg caaacaacat caggaactgc atgtgccagc aggcaggcct    1200

gtgttgtgtg catgcatggt ttgcgctgcg cgtgcggggt caacagcaga caattgtgcc    1260

agggcactcg tttccctggc tctgctgtgg ccccatctgc tgcttgctga ctgcgtgcat    1320

tccttggaca agctgtctga tgtgcatttg tgcacaaagg ctctctgtga tgctgttcag    1380

gatgaggcgc agtatctgtt tctgtgtgtc atgcctacac acagacggag atgatttacc    1440

aagccattgt ttgcccttac atgcacctgc actcgcacag gtcaccctgg ctctgatgag    1500

gcctcaggca gaaagctctt ggactcgcac ttggtaagca tgcttccttt gttcaaagca    1560

agaaagataa aatggttggt ccacctgtat gctaggccag tctcgttaag tcttcagcac    1620

tatgtaagtg cacacctcag gttccttgct gaaaaggcat gctggatagc tgattttgct    1680

ctgcaaaatg gtgttatgag gtcagtatga tgttcaggtt gtgggcagga acttctttcc    1740

ttttttcacc tgcactgctt ccatgctggg tgggctcttg atacagtgag ctgcactctc    1800

agtgtttgtc tgtttgtttc ccagaaagaa agacatactg ggaggtgtct tgaatgatga    1860

aagggtagga cagggttaag gattgccctg cacattgtcc catgtttcag ctgaaattca    1920

gttttgagca tcccactttt ggtgttctca atgggctcgt cttatcaaaa tttgtgaggc    1980

aatttggtct gtctgcacct gttcaaagag atgcaaccgg tgtcgatgag gattccagct    2040

tgcttttaat gcagaatgac agaaaactga ccaggtgcac ctgggcatgc cctcaatgtg    2100

agctcataca caggtgctcc ctattacaaa gtgtctagtg ctgcttgaat ggggccttat    2160

gtttgagtgt gagaggagcg gtaaagatcc agcaaaacag ccagaaattc tactgattca    2220

gttagaagca tcctgttcct cacatattca tcatccattt caccccgttt gttgttttgc    2280

atacacctgg ttgggcagta tgtgggtggg ctcattttga gggacgcagc atgggtgaaa    2340

ccaggccacg ctcaaagaaa actgagatca ctagcacacg caaattatgt gcaaatcagt    2400

ctgagggccc ctcactgtgg ctgtccctac cagcgccaga ccttgataca tttcctggat    2460

gtaaaattct tcgaacaatg gtcatgctcc ctgtctgcac cttgttgtcc atgcagatcc    2520

gcccctctga caagtacaac taccgggagc tcggctacga ctggaggaat gctggcttga    2580

acaactgcgc tggggatatg cagagccccg tcaacatcat gaggggcgca ctcgctgacc    2640

ccgctgacag gactgacgct tctgaaatcg acttgcgcgg catgggcgct tcagacacct    2700

acgtcatcgg caactctggg tcagatcaac caggagtgaa aatcaacctg gagcaggaca    2760

tgcagctcac cttcgaatca gaaaatctcc ctggtgccca gaagccacaa atcagaatcc    2820

ccaaatccgc cgactctctc aagacattca cccccctgca gctgcacttc caccacttcc    2880

tgagcgagca cactgtcaat ggcaagcact tccctcttga ggcccacctg gtgcgtttgt    2940

ggtgtaaaca aatgtgcata cgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg    3000

tgtgtgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgcgcg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tgcgtgtgcg    3060

cctatgcttt tttggaccca aacaagggga gagaggtttg tattctatag cctcataggt    3120

gtgggctttg ttgcgggtgt ggggtgcccc ctgttcttat tcatgtcttg ttgtcttacc    3180

ccaccatcct gtgcactcat gcctttactt gtttctttac ttgtttcttg ttgtctagaa    3240

agcttatttg aagtcagaag gtgcacctgc agcaacgtgc gtgctcaagc ccataagctg    3300

atctctttcc ccactatcct gtgcactcac agacagctgt tggcagttga ggaaacctct    3360

gtttccttcc tctgatatga tggagttcag tagaaaaaga ccagataggc cagatgaaga    3420

gcaaaccctt ggataaagca catgtgctgt tctggtattt gcaggtcatg aaggatgagg    3480

actctgacca gctggctgtc attggcatcc tgtacgagta cacagaggag gaaactcagg    3540

acgacccctt catcgaccgg ctgcaagacc ttgcaaagga tctggtggcc aatggtgagt    3600

cttgctcctg gggttttgtg aggtgtacaa tgcaagaacg cagggactgg tatagaagaa    3660

aagaaaaatt ctgtggatct gattagggtg atgaggactg atgtgcagac atttctcaag    3720

gcgactaaaa agtggctcgc gctgcggtga tttagggttc agcatgactc tggtacctct    3780

gggacccagg tgcacgtttg tcatttattt gggtcccaac caaatgaaat ggctgtggga    3840

gactgcgctc tgaatgcaaa aaaggagcat tacggggcat tttaccagct gccctactat    3900

gcttcttcca ttataaacga ttttccgcac gccatgtcaa atcaattgcg gctcctagta    3960

gctggcaaag aagagaaagg aggaatgcag gaacagttca cctaaacagg gaggggacca    4020

tacgcacaag cacacgcaca tgccaccatc tgccttctct caggcgcttc ttggggagac    4080

aatggggtgg acaccagcag cgtgagaccg gatttccaga tcgacgtccg tgacgacctg    4140

ctgcctactg aagggactaa cccgctggcc cactacggct atgatggcag cctgaccacg    4200

cccccttgcg acgagcgcgt caagtggttt gtgtttgcaa acaccaggaa ggtctcacca    4260

gcgcaaatga aggtgtttgc tgatgctact ctgaatgccc acccttctgc tgccatcacc    4320

aacaaccgtg tcatccagcc cctgaaccag aggcaggtgt ataactatgg tgtaagtgtt    4380

tgatctttcc aggcagaacg aaggctcgca tgctatttta aagccagaca tgcacagaga    4440

cggtgtatgg tgtaggctga tgagaaaact gactcggaaa tgcaccctgc gccaggaata    4500

atgatttgtt tggaatgctt tttgaaggct gcagcgtgcc aattttgaat gttctcatga    4560

cagtggtatg gtgatcatgc ttgtgttttc tttctttctt ttctttaact gcgctgcctg    4620

gcacagttat aatagccaga ggaggtcatc ttagagggaa tgttaggaaa cttgtttcct    4680

ccctgtgccc ctttctggga tcctatggta ggtcctgcac tcgcaaatta gttcagacat    4740

gcactgcacc actgtctcaa tacaattgac ctcagggcta tagttatcag ttacatacgc    4800

cattcaatca gactggttgc tcggttaatc gggtacatat gtcatccagt tagaccggtt    4860

gactgctagg caaagtatga ctggttatcg ggttgaagta cgccactaag gcaacaagcg    4920

cgacttctgg gcaaagaaac aggaagattg atagagggat accgtttaac cgtctcaccg    4980

cttacataca ccattcagtc agaccagttg actgctaggc aaattgtaaa agtctactaa    5040

agcagaaatg aaagagtaac tgtttaaccg tttacatatg ccattcagtc agaccggttg    5100

actgctaggc aaattgtaaa agtctactaa agcagaaatg aaagagtaaa cacgattgtt    5160

gcactggttc atgaactgga atacataata atctggcaca gctcgcgaag actccataaa    5220

cgaagtacca gttctaggtg acagcgaaga gaaaccacca aataagtctg gatagttctc    5280

cctgagtgtg cacacttgag gaaatctgca agccaacaga acatgcttct catcttgacg    5340

ttcaggacag ccacaactgc aatcagaaca cgcatcaaca gaccaggtgg cagtttcaac    5400

tgcaagcctg tgagctcgca aacggaaaca actcacattg cgctgaacat gccgcggcaa    5460

attgagctga aggtacttag gaaccggaag caaacgagga gacatcgaac aaggacgatg    5520

aggcaaagcc atccaatgtt catacgaagc aagcttgtca ttggttgtac aaggatctaa    5580

ccgagccaca cctcgccata cattcaaatg ccgggcacgc aaattaggta tgaaatcctt    5640

aagctcaaca ggctgcatgt tcttcactgc ctcctcaaaa gccgtcatcc tagcaagccc    5700

atgaaaggca gacaggagct ctgcggtcca acagccagca gctgtagaac tcaaacgaac    5760

atcagcactc aagacggctt tcaagaaagg attgaaattt tgaaccatag tattataaaa    5820

cttcaagttt tatcaagttg acagctgccc taaaccagta aaattgaagg ggctcctggc    5880

cacattctcg caacactgcc cagtttgttg cagagcgctt cacaccaagg gtactcttca    5940

agaaactgaa atgccatatt tgcaacgggt tatgaaactc tgcacccata cgcagaaaag    6000

gagttcccca tatctgggag ccatacatgc cagccggaat tacgtaggcc ttggataacc    6060

acaagctgac atgggggagc tgacgtaggc cttggataac cacaagctga catggggaca    6120

ataaa                                                                6125

<210>2

<211>367

<212>PRT

<213>盐藻(Dunaliella viridis)

<400>2

Met Ala Asn Trp Leu His Pro Leu Ser Leu Leu Ser Val Ala Trp Leu

1                   6                   11                  16

Gln Pro His Ser Leu Gln Gly Leu Lys Phe Lys Val Arg Ala Pro Pro

                21                  26                  31

Arg Pro Ser Phe Ala His Arg Tyr Leu Lys Met Ala Arg Leu Ala Leu

            36                  41                  46

Leu Gly Ala Ala Leu Leu Cys Ala Leu Ala Val Ser Thr Gln Gly His

        51                  56                  61

Pro Gly Ser Asp Glu Ala Ser Gly Arg Lys Leu Leu Asp Ser His Leu

    66                  71                  76

Ile Arg Pro Ser Asp Lys Tyr Asn Tyr Arg Glu Leu Gly Tyr Asp Trp

81                  86                  91                  96

Arg Asn Ala Gly Leu Asn Asn Cys Ala Gly Asp Met Gln Ser Pro Val

                101                 106                 111

Asn Ile Met Arg Gly Ala Leu Ala Asp Pro Ala Asp Arg Thr Asp Ala

            116                 121                 126

Ser Glu Ile Asp Leu Arg Gly Met Gly Ala Ser Asp Thr Tyr Val Ile

        131                 136                 141

Gly Asn Ser Gly Ser Asp Gln Pro Gly Val Lys Ile Asn Leu Glu Gln

    146                 151                 156

Asp Met Gln Leu Thr Phe Glu Ser Glu Asn Leu Pro Gly Ala Gln Lys

161                 166                 171                 176

Pro Gln Ile Arg Ile Pro Lys Ser Ala Asp Ser Leu Lys Thr Phe Thr

                181                 186                 191

Pro Leu Gln Leu His Phe His His Phe Leu Ser Glu His Thr Val Asn

            196                 201                 206

Gly Lys His Phe Pro Leu Glu Ala His Leu Val Met Lys Asp Glu Asp

        211                 216                 221

Ser Asp Gln Leu Ala Val Ile Gly Ile Leu Tyr Glu Tyr Thr Glu Glu

    226                 231                 236

Glu Thr Gln Asp Asp Pro Phe Ile Asp Arg Leu Gln Asp Leu Ala Lys

241                 246                 251                 256

Asp Leu Val Ala Asn Gly Ala Ser Trp Gly Asp Asn Gly Val Asp Thr

                261                 266                 271

Ser Ser Val Arg Pro Asp Phe Gln Ile Asp Val Arg Asp Asp Leu Leu

            276                 281                 286

Pro Thr Glu Gly Thr Asn Pro Leu Ala His Tyr Gly Tyr Asp Gly Ser

        291                 296                 301

Leu Thr Thr Pro Pro Cys Asp Glu Arg Val Lys Trp Phe Val Phe Ala

    306                 311                 316

Asn Thr Arg Lys Val Ser Pro Ala Gln Met Lys Val Phe Ala Asp Ala

321                 326                 331                 336

Thr Leu Asn Ala His Pro Ser Ala Ala Ile Thr Asn Asn Arg Val Ile

                341                 346                 351

Gln Pro Leu Asn Gln Arg Gln Val Tyr Asn Tyr Gly Val Ser Val

            356                 361                 366

Claims (4)

1.盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3，其特征在于该基因具有SEQ NO 1所示的碱基序列。

2.根据权利要求1所述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的编码蛋白，其特征在于该基因具有SEQ NO 2所示的氨基酸序列。

3.根据权利要求1所述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.以DCA3(+)-2、DCA3(-)-2为引物，采用PCR方法从盐藻的BAC文库中筛选出一个不同于已知碳酸酐酶的盐藻基因组BAC克隆，该BAC克隆的大小为60kb；

b.将上述BAC克隆随机打断为2～4kb的小片段，装入测序载体，构建了该BAC克隆的鸟枪文库；

c.大通量提取鸟枪文库的质粒DNA，在MegaBACE 4500上进行序列的测定；每个鸟枪质粒利用M13正反向引物，进行双向测序；

d.在RedHat Linux平台的并联计算机群中，使用Phred/Phrap/Consed程序拼接所测序列，构建亚克隆并测序以填补出现在序列之中的缺口，最终得到盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的全长序列。

4.根据权利要求3所述的盐藻碳酸酐酶3基因DvCA3的克隆方法，其特征在于所述的筛选BAC克隆的PCR方法的程序为：

94℃5min；

94℃30s，55℃30s，72℃50s，30cycles；

72℃10min；

引物序列：

DCA3(+)-2  ACG GTT GTT GGT GAT GGC AG

DCA3(-)-2  TTG AAC AAC TGC GCT GGG GA。