CN1228451C

CN1228451C - 肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法

Info

Publication number: CN1228451C
Application number: CN 200310107979
Authority: CN
Inventors: 魏东芝; 钱峰
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2003-10-16
Filing date: 2003-10-16
Publication date: 2005-11-23
Anticipated expiration: 2023-10-16
Also published as: CN1528914A

Abstract

本发明构建了一种新的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选方法。该方法包括筛选靶蛋白的制备方法和逆转药物的筛选方法。该方法可用于肿瘤多药耐药性逆转药物的鉴定和评价，还可用于该类药物的高通量筛选。

Description

肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法

技术领域

本发明涉及到一种肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法，更具体地说涉及到通过药物对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物。

背景技术

本发明属于利用基因工程技术构建的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选新方法。

多药耐药性(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种抗肿瘤药物产生耐药性的同时，对结构和作用机制不同的抗肿瘤药物产生交叉耐药性。在抗肿瘤化疗(chemotherapy)中，肿瘤细胞在受到一种抗肿瘤药物作用之后，甚至在抗肿瘤药物作用之前，会产生针对这种药物及其相关药物，甚至无关药物的抗性，因此MDR是肿瘤化学治疗的主要障碍之一。

MDR的逆转剂与抗癌药物合用，将会大幅度地提高化疗药物对MDR肿瘤的疗效。但至今尚未开发成功有效的应用于临床的MDR逆转药物。本发明的目的就是利用基因工程技术构建的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选方法，筛选出有效的MDR逆转药物，解决肿瘤化疗治疗领域的难题，具有重要的经济效益和社会效益。

常规的评价方法是通过待测药物作用于抗药性细胞或移植有抗药性细胞的小鼠，判断其是否对化疗药物有增敏增效的作用。这些方法费时费力，不适合大规模的筛选。

目前研究表明，MDR的产生与MDR1基因所编码的P-gp的过度表达有关。P-gp是一种ABC(ATP Binding Cassette)转运蛋白，具有ATP依赖的膜泵结构特点。本发明确定并获得了人MDR1基因的核酸结合区域基因片段(NBD)，通过药物体外作用于靶蛋白，测定其对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物，构建了新型的筛选方法。

发明内容

本发明构建了一种新的肿瘤多药耐药性逆转药物筛选方法，筛选逆转药物的靶蛋白是由包含人MDR1基因核酸结合区域(NBD)片断所编码的：

1 M P N T L E G N V T F G E V V F N Y P T R P D I P

1 atgccgaacacattggaaggaaatgtcacatttggtgaagttgtattcaactatcccacccgaccggacatccca

26 V L Q G L S L E V K K G Q T L A L V G S S G C G K

76 gtgcttcagggactgagcctggaggtgaagaagggccagacgctggctctggtgggcagcagtggctgtgggaag

51 S T V V Q L L E R F Y D P L A G K V L L D G K E I

151 agcacagtggtccagctcctggagcggttctacgaccccttggcagggaaagtgctgcttgatggcaaagaaata

76 K R L N V Q W L R A H L G I V S Q E P I L F D C S

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101 I A E N I A Y G D N S R V V S Q E E I V R A A K E

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126 A N I H A F I E S L P N K Y S T K V G D K G T Q L

376 gccaacatacatgccttcatcgagtcactgcctaataaatatagcactaaagtaggagacaaaggaactcagctc

151 S G G Q K Q R I A I A R A L V R Q P H I L L L D E

451 tctggtggccagaaacaacgcattgccatagctcgtgcccttgttagacagcctcatattttgcttttggatgaa

176 A T S A L D T E S E K V V Q E A L D K A R E G R T

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201 C I V I A H R L S T I Q N A D L I V V F Q N G R V

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226 K E H G T H Q Q L L A Q K G I Y F S M V S V Q A G

676 aaggagcatggcacgcatcagcagctgctggcacagaaaggcatctatttttcaatggtcagtgtccaggctgga

251 T K R Q *

751 acaaagcgccagtga

通过逆转药物体外作用于靶蛋白，测定逆转药物对靶蛋白ATPase酶活的抑制率来鉴定和评价该逆转药物是否为肿瘤多药耐药性逆转药物。

逆转药物可以是蛋白(抗体等)、多肽、天然药物、化学合成药物。

本发明与现有技术相比有以下的明显优点和技术进步：

本发明用于筛选逆转药物的靶蛋白是人MDR1基因核酸结合区域(NBD)片断，它适于在原核表达***中得到高效表达。本发明通过在分子水平体外测定靶蛋白ATPase酶活的抑制率来筛选逆转药物，较常规的细胞、动物水平的实验方法具有操作简便、快速、微量、费用低廉的特点，适用在普通实验室进行高通量筛选。

附图说明

图1是人MDR1基因的NBD基因片段RT-PCR凝胶电泳图；

图2是靶蛋白NBD SDS-PAGE分析图；

其中：泳道1Marker；泳道2未诱导的大肠杆菌重组株E.coli BL21(pGEX-NBD)；泳道3IPTG诱导的大肠杆菌重组株E.coli BL21(pGEX-NBD)；泳道4纯化后的靶蛋白NBD。

图3是靶蛋白NBD ATPase酶活测定图；

图4是药物对靶蛋白NBD ATPase酶活的抑制图。

具体实施方式

本发明内容通过以下的实施例和附图作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。

实施例1

1、人MDR1基因的核酸结合区域基因片段(NBD)的获得

从多药耐药性的人表皮癌细胞KB-A1中用Trizol试剂抽提总RNA，经变性琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA完整性。用提取的总RNA反转录成cDNA，以此为模板，经PCR扩增，得扩增产物，琼脂糖凝胶电泳结果表明片段大小与预期基因片段大小相符，如图1所示，序列如下。

1 atgccgaaca cattggaagg aaatgtcaca tttggtgaag ttgtattcaa ctatcccacc

61 cgaccggaca tcccagtgct tcagggactg agcctggagg tgaagaaggg ccagacgctg

121 gctctggtgg gcagcagtgg ctgtgggaag agcacagtgg tccagctcct ggagcggttc

181 tacgacccct tggcagggaa agtgctgctt gatggcaaag aaataaagcg actgaatgtt

241 cagtggctcc gagcacacct gggcatcgtg tcccaggagc ccatcctgtt tgactgcagc

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361 agggcagcaa aggaggccaa catacatgcc ttcatcgagt cactgcctaa taaatatagc

421 actaaagtag gagacaaagg aactcagctc tctggtggcc agaaacaacg cattgccata

481 gctcgtgccc ttgttagaca gcctcatatt ttgcttttgg atgaagccac gtcagctctg

541 gatacagaaa gtgaaaaggt tgtccaagaa gccctggaca aagccagaga aggccgcacc

601 tgcattgtga ttgctcaccg cctgtccacc atccagaatg cagacttaat agtggtgttt

661 cagaatggca gagtcaagga gcatggcacg catcagcagc tgctggcaca gaaaggcatc

721 tatttttcaa tggtcagtgt ccaggctgga acaaagcgcc agtga

2、含NBD基因片段的表达载体pGEX-NBD的构建

RT-PCR产物提纯的片段、载体质粒(pGEX)均经BamHI、EcoRI 37℃双酶切过夜，酶切产物纯化后二者以5∶1浓度加入并加入T4DNA连接酶16℃连接过夜。

3、能高效表达靶蛋白NBD的大肠杆菌重组株E.coli BL21(pGEX-NBD)的构建

用CaCl₂法将连接产物转化E.coli BL21，在含氨苄青霉素的LB平板上筛选转化子，经鉴定获得含pGEX4T-1-NBD的重组转化子E.coli BL21(pGEX-NBD)。

4、利用大肠杆菌E.coli BL21(pGEX-NBD)表达靶蛋白NBD

构建的表达菌种接种于5ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm过夜培养。过夜培养的饱和菌1∶50接种于200ml 2×YT(Amp)中，37℃，300rpm培养至OD600＝0.6。IPTG诱导至终浓度0.4mM，继续培养3-5hr。8000rpm离心10min，去上清，收集菌体，-80℃保存。

5、靶蛋白NBD的纯化

收集所得菌体重悬，加入1M DTT至最终浓度为5mM，PMSF至最终浓度为100ug/ml，冰浴超声裂解细胞成匀浆，加20％Triton X-100至终浓度1％，冰浴30min，12000rpm离心10min，取上清。上清用谷胱甘肽琼脂糖4B纯化得靶蛋白NBD。靶蛋白NBD透析，取少量进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，结果如图2所示。

6、靶蛋白NBD ATPase酶活的测定

靶蛋白NBD于反应液(50mM Tris pH7.5，5mM叠氮钠，2mM EGTA，2mM乌本(箭毒)苷，50mM NaCl，6mM MgCl₂)终浓度100μg/mL。取45μL加入5μL ATP至ATP终浓度2mM，37℃反应20min。50μL 6％SDS终止反应，加入50μL 3％抗坏血酸，0.5M钼酸钠，0.5M HCl室温4分钟，加入50μL 2％柠檬酸钠，2％偏***和2％乙酸37℃ 10min，测定850nm吸光度，如图3所示。

7、肿瘤多药耐药性逆转药物EGCG的ATPase酶活抑制率测定

药物EGCG和靶蛋白NBD于反应液(50mM Tris pH7.5，5mM叠氮钠，2mM EGTA，2mM乌本(箭毒)苷，50mM NaCl，6mM MgCl₂)共孵育2小时。取45μL加入5μL ATP至ATP终浓度2mM，37℃反应20min。50μL 6％SDS终止反应，加入50μL 3％抗坏血酸，0.5M钼酸钠，0.5M HCl室温4分钟，加入50μL 2％柠檬酸钠，2％偏***和2％乙酸37℃ 10min，测定850nm吸光度，计算其抑制率，如图4所示。

8、肿瘤多药耐药性逆转药物TP的ATPase酶活抑制率测定

药物TP和靶蛋白NBD于反应液(50mM Tris pH7.5，5mM叠氮钠，2mM EGTA，2mM乌本(箭毒)苷，50mM NaCl，6mM MgCl₂)共孵育2小时。取45μL加入5μL ATP至ATP终浓度2mM，37℃反应20min。50μL 6％ SDS终止反应，加入50μL 3％抗坏血酸，0.5M钼酸钠，0.5M HCl室温4分钟，加入50μL 2％柠檬酸钠，2％偏***和2％乙酸37℃ 10min，测定850nm吸光度，计算其抑制率，如图4所示。

失败实施例

1、根据实施例1中的方法1-4扩增得到完整的人MDR1基因，但无法在大肠杆菌表达***中表达。

2、根据实施例1中的方法1-6扩增得到MDR1基因片断C21，并在大肠杆菌表达***中表达，但不具有酶活。

结果表明只有包含实施例1中NBD区域的基因片断才可以在大肠杆菌表达***中高效表达，该表达产物经过纯化后具有ATPase酶活。

序列表

<110>华东理工大学

<120>肿瘤多药耐药逆转药物筛选新方法

<130>权利要求书说明书

<140>200310107979.4

<141>2003-10-16

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>765

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(765)

<400>1

atg ccg aac aca ttg gaa gga aat gtc aca ttt ggt gaa gtt gta ttc 48

Met Pro Asn Thr Leu Glu Gly Asn Val Thr Phe Gly Glu Val Val Phe

1 5 10 15

aac tat ccc acc cga ccg gac atc cca gtg ctt cag gga ctg agc ctg 96

Asn Tyr Pro Thr Arg Pro Asp Ile Pro Val Leu Gln Gly Leu Ser Leu

20 25 30

gag gtg aag aag ggc cag acg ctg gct ctg gtg ggc agc agt ggc tgt 144

Glu Val Lys Lys Gly Gln Thr Leu Ala Leu Val Gly Ser Ser Gly Cys

35 40 45

ggg aag agc aca gtg gtc cag ctc ctg gag cgg ttc tac gac ccc ttg 192

Gly Lys Ser Thr Val Val Gln Leu Leu Glu Arg Phe Tyr Asp Pro Leu

50 55 60

gca ggg aaa gtg ctg ctt gat ggc aaa gaa ata aag cga ctg aat gtt 240

Ala Gly Lys Val Leu Leu Asp Gly Lys Glu Ile Lys Arg Leu Asn Val

65 70 75 80

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Gln Trp Leu Arg Ala His Leu Gly Ile Val Ser Gln Glu Pro Ile Leu

85 90 95

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Phe Asp Cys Ser Ile Ala Glu Asn Ile Ala Tyr Gly Asp Asn Ser Arg

100 105 110

gtg gtg tca cag gaa gag atc gtg agg gca gca aag gag gcc aac ata 384

Val Val Ser Gln Glu Glu Ile Val Arg Ala Ala Lys Glu Ala Asn Ile

115 120 125

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His Ala Phe Ile Glu Ser Leu Pro Asn Lys Tyr Ser Thr Lys Val Gly

130 135 140

gac aaa gga act cag ctc tct ggt ggc cag aaa caa cgc att gcc ata 480

Asp Lys Gly Thr Gln Leu Ser Gly Gly Gln Lys Gln Arg Ile Ala Ile

145 150 155 160

gct cgt gcc ctt gtt aga cag cct cat att ttg ctt ttg gat gaa gcc 528

Ala Arg Ala Leu Val Arg Gln Pro His Ile Leu Leu Leu Asp Glu Ala

165 170 175

acg tca gct ctg gat aca gaa agt gaa aag gtt gtc caa gaa gcc ctg 576

Thr Ser Ala Leu Asp Thr Glu Ser Glu Lys Val Val Gln Glu Ala Leu

180 185 190

gac aaa gcc aga gaa ggc cgc acc tgc att gtg att gct cac cgc ctg 624

Asp Lys Ala Arg Glu Gly Arg Thr Cys Ile Val Ile Ala His Arg Leu

195 200 205

tcc acc atc cag aat gca gac tta ata gtg gtg ttt cag aat ggc aga 672

Ser Thr Ile Gln Asn Ala Asp Leu Ile Val Val Phe Gln Asn Gly Arg

210 215 220

gtc aag gag cat ggc acg cat cag cag ctg ctg gca cag aaa ggc atc 720

Val Lys Glu His Gly Thr His Gln Gln Leu Leu Ala Gln Lys Gly Ile

225 230 235 240

tat ttt tca atg gtc agt gtc cag gct gga aca aag cgc cag tga 765

Tyr Phe Ser Met Val Ser Val Gln Ala Gly Thr Lys Arg Gln

245 250

<210>2

<211>254

<212>PRT