CN1837368A - 一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及海洋生物牙鲆“全鱼”溶茵酶基因，具体地说是牙鲆c型溶菌酶基因的克隆和表达质粒的构建，尤其是一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。该基因能够增强鱼类的免疫能力，将溶茵酶重组质粒质粒转入牙鲆鱼(转基因牙鲆)中也可以增强其免疫力，增强牙鲆鱼对病原的抵抗能力，从而提高产量。同时，从生物安全性角度考虑，本质粒完全克隆自鱼类自身的基因，有利于转基因鱼在水产养殖中得到应用。

Description

一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒

技术领域

本发明涉及海洋生物牙鲆“全鱼”溶茵酶基因，具体地说是牙鲆c型溶菌酶基因的克隆和表达质粒的构建，尤其是一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒。

背景技术

溶菌酶(Lysozyme)是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，因其有溶菌作用，故命名为溶菌酶。溶菌酶作为鱼类的非特异性免疫(先天性免疫)物质之一，在鱼体抵抗感染性致病菌的最前沿防御机制中起着重要作用。现已知，溶菌酶是一种呈抗生性的、由淋巴球分泌的溶解性酶.并主要作用于革兰氏阳性菌(G’菌)及某些特定的细菌；其主要方式之一是溶解细菌胞壁中的粘多糖。在鱼体内，溶菌酶主要存在于血液、肌肉和淋巴组织中；代表一定非特异性免疫水平的溶菌酶活性，在鱼体内比在哺乳动物体内更为重要，因为鱼类的特异性免疫(后天性免疫)***还不完善。国外关于鱼类溶菌酶已有较深入研究，如B·Grinde等选择含溶菌酶较多的虹鳟作溶菌酶基因供体，向溶菌酶含量较少的种类(如大西洋鲑和鳕)的鱼卵中注射溶菌酶基因，从遗传上改善这些鱼类的免疫状况。

实验证明，溶菌酶参与了血清的非特异性防御过程，1973年netcher和1987年Sia4cki等分别在鲽科鱼类和鲤科鱼类中发现，溶菌酶的含量和活性都在免疫后大幅提高。溶菌酶还可与几丁质酶一起作用于细菌或其他病原的细胞壁，更有效地攻击病原。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全性好、可增强牙鲆鱼对病原抵抗能力的牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒。溶菌酶来源于牙鲆鱼，名称为牙鲆“全鱼”溶茵酶重组质粒。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。

所述牙鲆“全鱼”溶茵酶基因的编码蛋白，具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

本发明克隆了牙鲆鱼溶菌酶基因，然后连接到表达载体opAFP上。

本发明基因的目的、用途、意义如下：该基因能够增强鱼类的免疫能力，将溶茵酶重组质粒质粒转入牙鲆鱼(转基因牙鲆)中也可以增强其免疫力，增强牙鲆鱼对病原的抵抗能力，从而提高产量。同时，从生物安全性角度考虑，本质粒完全克隆自鱼类自身的基因，有利于转基因鱼在水产养殖中得到应用。

附图说明

图1为重组表达质粒opAFP-ly的构建过程中相关电泳图谱；其中，A示RT-PCR扩增出的长度约为486bp的Lysozyme基因；B示引物A、B筛选克隆opAFP-ly扩增出的长度约为692bp的阳性带；C示PstI酶切阳性克隆opAFP-ly，酶切片段长度约为1.8kb(图1C)的为***片段为正向的阳性克隆；M1，M2为DNA size markers，M1为λDNA/HindIII，M2为100bp DNAladder plus；

图2为经EcoR I酶切后的线性化全鱼基因元件模式图；其中，A示opAFPpromoter；B示opAFP 5’untranslated sequence；C示lysozyme gene；D示opAFP 3’sequence；

图3为重组质粒构建的技术路线。

具体实施方式

一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，具有如下特征：

(1)序列特征：

长度：38716碱基对；类型：核苷酸；链型：单链；拓扑结构：线性

(2)分子类型：DNA

(3)假设：否

(4)反义：否

(5)最初来源：牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)。

其序列如下：GGATCCCCCAGAATGAGCTGGAACATGTTGCGGGGAGAGGGAAGTCTGGGTCAGCCTGCTTGGCCTGCTGCCACCGTGACCCGACCTCAGATAAGCGGAGGAAAATGGATGGATGGATTGAATCACAGAATGTTTCTGAAGACAGATATCACCTTCGCTTCAAAGAGGTGCGCACCTGGGCAGGCACCCACACAGCCACACAAATGGCATATGAATCAACCAAGAAGACGGTTGGAACTGGTCAAAACCTTCACTATACCATGTGTGACAGTTGTTTGTCACAGTGTATAAAAGACAGGGACTTAGAGACAGAGCTCTGAGCAGCTATGAGATTGTAGTTTGGCCAGGATGCGCTTAAGACCTTTGTGATGAAAAGTTATCAAATTCGTGAGTTTTCATGGAAGAACCTTGACGTGGCGTGGTGGCCATTTTGCGTCATTCGGCATGGAAAAGGAAGTCGTTATAACTCCCAGGTACATTATCTTATCTACACAAAATGTCTAATGCATGATACTACTTAAAGCCTGAGCATATTTCAAGGCCAGCACTTTTCAATAACTCATAGGCCACCTGCTGGCAAAAGGAAATGCCACATTTTATACTTTTATTTACTCCTAGACAGTTGACCTGATCAGTCTCAAATTTGGTAAGGATAGCCTTAAGACAATGAAGATGCTTCATCAGGAATATTGTGAGTTGTCGTTGAACGTTGTTGCCGTGGCAACGCATCATTCGCCATGAAAAAGAAGCTGATGGTTCAGTGGCTTGGGATGCTCAAAAAGTCATGGAACTTTGTACATGTGTCATAATTGATGGGAAGTTGTATGGGTTTTTGGCTTGCTTGTTATAAATTGTCTCCATAGCGCCCCCTACAATATTTCAAAAGAGCAGCCCCAGTGCTACGTACATGTATGAAACTTAGTAGCCAGATGTACCATATAGAGACTTACAAAAAGGTATCTTGGCCATGCTCTCAACCGTACTGGAAGTCGGCCATTTTGATTTTTGCATAATTTTTCAATAGATTTTTGCACATTTGTAATCGCTATACTTTAACGAACTCCTCCAAGGAACTTTGTCTAATCAATTTCAAATTTTGTCAGTACAATCTCAGTACTACAGTACCAAATCTACAGTTCTGCATCTCGTAGCTGCTCAGAGGTCTGTCTCTAAGTCCCTGTCTTTTATACACTGTGACAAACAACTGTCACACATGGTATAGTGAAGGTTTTGACCAGTTCCAACCGTCTTGTTGGTTGATTCATATGCCATTCGTGTGGCTGTGTGGGTGCCTACCCAGATGCGCACCTCTTTGAAGCGAATGTGATATCTGTCTTCATAAACATTCTGTTATTAGCAAGTTCATATGAGAATGAAGGCTGTATGCAAACAGGTGCACAGTCTGTTTCTAAGCATCATGGAAAAGTACAAGCAATTTGCACAAATCATTCTGTATTTTTCCAATAGCTAACAATGTCACCGGGACATTGTGCTATTGGATAGAAGAGACCAGCTGATCTAGACAGTTGATATCATGATCAACAGCCCCAAACAACAAGTGTGCATGCGCGAGGAGTGATTGGCAGATGTATGAGAACTAAACCACTGACTGAACTTGCACTAGAGGCATCTATTTTGTCTTTTCTCATATGATGTTGGGATGGCACATGGGAGTTTTTCCCCTGTCTCAGCTTGCTTTTTACCCCAAATATTGTATATCTATTAGAACCGTTGTCACAGGGTTCAAATTAACGTTTTAGTTTAGTTTTGATCATGATATACACATTTTATCCGTAAAGCATGTGCATATACAGTAAGGGCTTGTTATTCGACAGCAAGAAGAAGAGGATATGTGTGCAGGCAGTCAGCTAATGCATGGATCACAAGTTATAGAATGCAAGCTTGTGATAGTTTGGACAAAAACAAGTTATACTTTACTTATAAGAATATAAAATTTCCATTGCAATTGGCATAAGGAGGTGTGACACAGTGACCTACTTTCAGGCCAATAGGAAACGGGATATGCCGGTTAAGTCCTCCCACATACTGTATATTAGATGCAGCACATGGACCTGTCCTGTCAGAAGTCTCAGCTACAGCTTTCACTTCGATCCAGATCTTTTCACTTCGATCTCCGATAATTAATTAATTAATTAATTATTAATTAATTAAGTCTCAGCCACCGTTGACGATT

AATCAGAGAAACATC ATGAGGACTCTGGTGGTTCTGCTCCTCGTGGCTGTGGCC AACGCTCGAGTCTACGAACGCTGTGAATGGGCCCGACTGCTGAGAAA TCAGGGGATGGATGGTTACCGTGGCATCAGTCTGGCTAACTGGGTTTG TCTGAGTGAGTGGGAGTCACGCTACAACACCAGAGCCACCAACCACA ACACTGATGGATCCACTGACTACGGCATCTTCCAGATCAACAGTCGCT GGTGGTGTAACGACAGCCAGACGCCCACTTCTAACGCCTGTAACATC AGATGCAGTGAGCTTCTGACTGATGATGTCATTGTGGCGATCAAATGT GCCAAAAGAGTGGTCCGGGATCCAAACGGGATCGGAGCCTGGGTGG CGTGGCGTCAGCACTGTCAGGGCCAGGACCTGTCGTCCTATCTGGCA GGATGTGGTCTGTAAAAGCAACAT AATCTCTAGAGGATCCCCAACTGAACATGTCAAAACCTGTGGAGACTGTTGAGATTTGATGTTCTGAAAAGATAAAGCCTATAAATAAAATGTTGCCCAAATTTCCTGCCTGATGTTTTTCTTTGTCTTTGCTACATGGCTTTGCTGCTCGGATCGGCTCACTCTGTGTATGCCACGTTCACTTTGTACTCTCCTTCTCACGGTAGGTTTATTATTTTTAGATGTGCAGTTAGTTTCTGTGAAATAACACACCACACACTGATATTGTCTGTGCATTGACTTGGTGAGTGCACATTGTTTTTGATCTTGACATATTTATATTTGATTGATCAGGTGAACTGTGTGAATCTAAAGTGCTCCATACAGATGTTCTGCATTGAAAATATTCTCATTTTATTAGTGGAAGTGAGTGTATGCCACATCCAATCAATTTCAGCAAACACCCCAGTATGATTTAATGCAAAAAAATGAAGGTATCAAACACGCATTACTACTTTGCAGTTAAATATTTAACATTTATTCCAACACGAAAAAAAGCAGTAAATAACACTTTGACAAACACGTCAGGACATCTTATTTTTGTCACCCTCACAGGCAATTTAGTATAATATATTATATATATATATATATCATATAATAATATTCAGTATAATATATATATATATATCATATTATAATATTCAGTATAATATAAAACACAAACACATATATGTATAATATAATATAACATTTTTATTTATTGAGATGCCTCTATGGACCGTGTTATAAGAAGTAAAGATCAGGAGAAGTAAACATGAAGTGTAATTATGAATACTGATGTTAAATTAAGCTATGATGAGTTTTCACTGTTAATTTACCATCTCAATTAAATGTTGATGCCTCCATGACCAAGTTAAGCAGATGAGACTGAGACAACTGTAGAAGACAAGATGTTCACTTTGCTGAATATAGCTGGCTTGACAGTTATCTATGACTCTATAAATATATATATATTTTTTTTTTTATAAAATGATTTATTTATAACTATATATCCATTTCTCAGACAGGTGCTTCATATCCCTCACTCCCGTAGCTGTCCATGCTGGATCTGTCCCCGTTGTTTTTAAAAAGCTAAATAAGTTATTAACATGACTGCATCCAGCGAGCCAAACCTGTCTGGTGTACAGCTACCAGAGAAGCTT

在序列中，带下划线的部份代表编码区，其序列为：

ATGAGGACTCTGGTGGTTCTGCTCCTCGTGGCTGTGGCCAACGCT CGAGTCTACGAACGCTGTGAATGGGCCCGACTGCTGAGAAATCAGGG GATGGATGGTTACCGTGGCATCAGTCTGGCTAACTGGGTTTGTCTGAG TGAGTGGGAGTCACGCTACAACACCAGAGCCACCAACCACAACACT GATGGATCCACTGACTACGGCATCTTCCAGATCAACAGTCGCTGGTGG TGTAACGACAGCCAGACGCCCACTTCTAACGCCTGTAACATCAGATGC AGTGAGCTTCTGACTGATGATGTCATTGTGGCGATCAAATGTGCCAAA AGAGTGGTCCGGGATCCAAACGGGATCGGAGCCTGGGTGGCGTGGCG TCAGCACTGTCAGGGCCAGGACCTGTCGTCCTATCTGGCAGGATGTG GT共426bp，在原序列上的位置为：2230-2655。它编码的蛋白质序列为：MRTLVVLLLVAVANARVYERCEWARLLRNQGMDGYRGISLANWVCLSEWESRYNTRATNHNTDGSTDYGIFQINSRWWCNDSQTPTSNACNIRCSELLTDDVIVAIKCAKRVVRDPNGIGAWVAWRQHCQGQDLSSYLAGCG，共142个碱基。俩个双下划线部分为RT-PCR的引物，两个之间的部分是RT-PCR的产物，碱基对2195-2690，共496bp。

其具体制备过程如下：

1牙鲆c型溶菌酶基因的分离

a.RNA提取：利用15月龄的牙鲆外周血(背部抽血)单个核细胞作为RNA提取来源。将细胞按照不低于1∶10(重量g：体积ml)加入TRIZOL试剂(TRIROL^TM试剂盒购自LIFE TECHNOLOGY公司)，冰上用研磨棒碾磨后，室温下温浴5分钟，然后按照每毫升TRIZOL加0.2毫升的氯仿的比例加入氯仿，剧烈振荡15秒，然后室温放置3分钟，然后4℃12000g离心15分钟；取水相，按照每毫升TRIZOL试剂加入0.5毫升异丙醇的比例加入异丙醇，混匀后室温温浴10分钟，然后4℃12000g离心10分钟；弃上清，用75％的乙醇(每毫升TRIZOL用1毫升75％的乙醇)洗涤沉淀，然后4℃7500g离心5分钟，弃上清，自然沉淀干燥，用无Rnase的水溶解沉淀；

b.RT-PCR引物设计：按照牙鲆(Paralichthys olivaceus)c型溶菌酶cDNA序列，设计一对RT-PCR引物：P15’gtagctgcagctgtggagac，P2 5’aatcaccggagatgtttcag；P1 5’端带Pst I酶切位点；

c.RT-PCR(RT-PCR试剂盒购自Promega公司)：在10μl无Rnase的无菌水中加入2μgRNA和1μg引物，70℃水浴5分钟，然后立即放在冰上冷却。然后按照下列顺序加入试剂：

M-MLV 5×Reaction Buffer 5μl，dATP 10mM 1.25μl，dCTP 10mM1.25μl，dGTP 10mM 1.25μl，dTTP 10mM 1.25μl，rRNasinRibonuclease Inhibitor 25units，M-MLV RT 200units；加无Rnase的无菌水至25μl，轻轻混匀后42℃水浴60分钟，然后做PCR；PCR反应参数为95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s；循环30次，72℃延伸10min。

2构建“全鱼”元件基因

a.RT-PCR产物纯化：使用试剂盒胶回收(小量)试剂盒(GelExtraction Mini Kit(Watson Biotechnologies)上海华舜生物工程有限公司，W5211)纯化产物。

将产物进行1％的琼脂糖电泳，切取目的片断胶块，称重后加入三倍体积的试剂盒中的S1液(上海华舜生物工程有限公司，W5211)，50℃水浴10分钟，使胶块完全融化，加入与S1液等体积的异丙醇，50℃水浴1分钟，将液体转移至吸附柱(上海华舜生物工程有限公司，W5211)中，12000rpm离心30秒，弃离出液，加入500微升试剂盒中的W1液上海华舜生物工程有限公司，W5211)，12000rpm离心15秒，弃离出液，加入500微升W1液，室温静置1分钟，12000rpm离心15秒，弃离出液，12000rpm离心1分钟；将吸附柱转移至干净的1.5毫升的离心管中，加入30微升试剂盒中的T1液(上海华舜生物工程有限公司，W5211)于柱中心，室温放置1分钟，12000rpm离心1分钟，零下20℃保存。

b.回收产物与载体的连接：回收产物与PMD-T载体在T₄DNA连接酶(takara)的作用下室温连接3小时；连接反应体系如下：回收产物3μl；PMD-T载体1μl；10×连接缓冲液1μl；无菌水5μl；总体积10μl。

c.连接产物的转化：加10微升连接产物至100微升感受态细胞DH-5α中，冰上放置35分钟，42℃水浴45秒，冰上放2分钟，加500微升LB液体培养基(蛋白胨：1％酵母粉0.5％NaCl 0.5％)，37℃培养50分钟，铺于加10μl IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)和50μl X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)的含氨苄青霉素的LB平板上，37℃生长过夜。

d.转化产物的检测：挑取白色单菌落(阳性克隆)接种于含有50μl/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养过夜；5000rpm 5分钟收集菌体，PCR方法检测确定阳性克隆PMD-T-ly，并送至博亚测序。

e.PMD-T-ly的小量提取：挑取白色单菌落(阳性克隆)接种于含有50μl/ml氨苄青霉素的2.5毫升LB液体培养基中，37℃下220rpm振荡培养过夜；5000rpm 5分钟收集菌体，弃上清，加入200微升溶液1，剧烈振荡混匀，加入200微升溶液2，轻轻混匀，室温放置5分钟，加入200微升溶液3，混匀后冰上放置5分钟；然后12000rpm离心5分钟；转移上层液体至干净的1.5毫升的离心管，加入600微升异丙醇，混匀后冰上放置5分钟；然后12000rpm离心5分钟；把异丙醇抽吸净，加入300微升70％乙醇，振荡后12000rpm离心5分钟，将乙醇抽吸干净，风干后溶于40微升无菌水中。

其中：溶液1：50mMol/L葡萄糖，25mMol/LTris·Cl(PH8.0)，10mMol/LEDTA(PH8.0)；

溶液2：0.2MolNaOH，1％SDS；溶液3：5Mol/L；

f.PMD-T-ly 2的双酶切和opAFP-V的单酶切：用Sma I和HindII(Sangon公司)37℃双酶切PMD-T-ly(小量提取产物)2小时，用Hpa I(Sangon公司)37℃单酶切表达载体opAFP-V 2小时，其反应体系分别如下：

PMD-T-ly 2的双酶切反应体系：Buffer Y⁺1μl，DDW 4μl，SmaI 1μl，HindII 1μl，DNA模板3μl，共10μl的反应体系。opAFP-V的单酶切反应体系：Buffer Y⁺1μl，DDW 5μl，HpaI 1μl，DNA模板3μl，共10μl的反应体系。

g.酶切产物纯化后(方法同2-a)，将ly基因片段和线性化的表达载体opAFP-V在T₄DNA连接酶(takara)作用下室温进行平末端连接3小时，并转化100μl感受态DH-5α，铺于加10μl IPTG和50μl X-gal的含氨苄青霉素的LB平板上，37℃下培养过夜。

h.转化产物的检测：挑取白色单菌落(阳性克隆)接种于含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡过夜；5000rpm 5分钟收集菌体，PCR方法检测确定阳性克隆opAFP-ly，测序(方法同2-d)。测序结果表明该质粒构建正确。

PCR检测引物A、B：，A5’atctcaacagtctccacaggt；

B5’tctgctgatgccagtcttact。

PCR反应参数为95℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸60s；循环30次，72℃延伸10min。

                           牙鲆全鱼

                        SEQUENCE LISTING

<110>中国科学院海洋研究所

<120>一种牙鲆″全鱼″溶茵酶基因重组质粒

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>3871

<212>DNA

<213>牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)

<220>

<221>CDS

<222>(2230)..(2655)

<223>

<400>1

ggatccccca gaatgagctg gaacatgttg cggggagagg gaagtctggg tcagcctgct     60

tggcctgctg ccaccgtgac ccgacctcag ataagcggag gaaaatggat ggatggattg    120

aatcacagaa tgtttctgaa gacagatatc accttcgctt caaagaggtg cgcacctggg    180

caggcaccca cacagccaca caaatggcat atgaatcaac caagaagacg gttggaactg    240

gtcaaaacct tcactatacc atgtgtgaca gttgtttgtc acagtgtata aaagacaggg    300

acttagagac agagctctga gcagctatga gattgtagtt tggccaggat gcgcttaaga    360

cctttgtgat gaaaagttat caaattcgtg agttttcatg gaagaacctt gacgtggcgt    420

ggtggccatt ttgcgtcatt cggcatggaa aaggaagtcg ttataactcc caggtacatt    480

atcttatcta cacaaaatgt ctaatgcatg atactactta aagcctgagc atatttcaag    540

gccagcactt ttcaataact cataggccac ctgctggcaa aaggaaatgc cacattttat    600

acttttattt actcctagac agttgacctg atcagtctca aatttggtaa ggatagcctt    660

aagacaatga agatgcttca tcaggaatat tgtgagttgt cgttgaacgt tgttgccgtg    720

gcaacgcatc attcgccatg aaaaagaagc tgatggttca gtggcttggg atgctcaaaa    780

agtcatggaa ctttgtacat gtgtcataat tgatgggaag ttgtatgggt ttttggcttg    840

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cttggccatg ctctcaaccg tactggaagt cggccatttt gatttttgca taatttttca   1020

atagattttt gcacatttgt aatcgctata ctttaacgaa ctcctccaag gaactttgtc    1080

taatcaattt caaattttgt cagtacaatc tcagtactac agtaccaaat ctacagttct    1140

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tgtatgcaaa caggtgcaca gtctgtttct aagcatcatg gaaaagtaca agcaatttgc    1440

acaaatcatt ctgtattttt ccaatagcta acaatgtcac cgggacattg tgctattgga    1500

tagaagagac cagctgatct agacagttga tatcatgatc aacagcccca aacaacaagt    1560

gtgcatgcgc gaggagtgat tggcagatgt atgagaacta aaccactgac tgaacttgca    1620

ctagaggcat ctattttgtc ttttctcata tgatgttggg atggcacatg ggagtttttc    1680

ccctgtctca gcttgctttt taccccaaat attgtatatc tattagaacc gttgtcacag    1740

ggttcaaatt aacgttttag tttagttttg atcatgatat acacatttta tccgtaaagc    1800

atgtgcatat acagtaaggg cttgttattc gacagcaaga agaagaggat atgtgtgcag    1860

gcagtcagct aatgcatgga tcacaagtta tagaatgcaa gcttgtgata gtttggacaa    1920

aaacaagtta tactttactt ataagaatat aaaatttcca ttgcaattgg cataaggagg    1980

tgtgacacag tgacctactt tcaggccaat aggaaacggg atatgccggt taagtcctcc    2040

cacatactgt atattagatg cagcacatgg acctgtcctg tcagaagtct cagctacagc    2100

tttcacttcg atccagatct tttcacttcg atctccgata attaattaat taattaatta    2160

ttaattaatt aagtctcagc caccgttgac gattgtagct gcagctgtgg agacaatcag    2220

agaaacatc atg agg act ctg gtg gtt ctg ctc ctc gtg gct gtg gcc aac    2271

          Met Arg Thr Leu Val Val Leu Leu Leu Val Ala Val Ala Asn

          1               5                   10

gct cga gtc tac gaa cgc tgt gaa tgg gcc cga ctg ctg aga aat cag      2319

Ala Arg Val Tyr Glu Arg Cys Glu Trp Ala Arg Leu Leu Arg Asn Gln

15                  20                  25                  30

ggg atg gat ggt tac cgt ggc atc agt ctg gct aac tgg gtt tgt ctg      2367

Gly Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Val Cys Leu

                35                  40                  45

agt gag tgg gag tca cgc tac aac acc aga gcc acc aac cac aac act      2415

Ser Glu Trp Glu Ser Arg Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn His Asn Thr

            50                  55                  60

gat gga tcc act gac tac ggc atc ttc cag atc aac agt cgc tgg tgg      2463

Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp

        65                  70                  75

tgt aac gac agc cag acg ccc act tct aac gcc tgt aac atc aga tgc      2511

Cys Asn Asp Ser Gln Thr Pro Thr Ser Asn Ala Cys Asn Ile Arg Cys

    80                  85                  90

agt gag ctt ctg act gat gat gtc att gtg gcg atc aaa tgt gcc aaa      2559

Ser Glu Leu Leu Thr Asp Asp Val Ile Val Ala Ile Lys Cys Ala Lys

95                  100                 105                 110

aga gtg gtc cgg gat cca aac ggg atc gga gcc tgg gtg gcg tgg cgt      2607

Arg Val Val Arg Asp Pro Asn Gly Ile Gly Ala Trp Val Ala Trp Arg

                115                 120                 125

cag cac tgt cag ggc cag gac ctg tcg tcc tat ctg gca gga tgt ggt      2655

Gln His Cys Gln Gly Gln Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Ala Gly Cys Gly

            130                 135                 140

ctgtaaaagc aacatctgaa acatctccgg tgattaatct ctagaggatc cccaactgaa    2715

catgtcaaaa cctgtggaga ctgttgagat ttgatgttct gaaaagataa agcctataaa  2775

taaaatgttg cccaaatttc ctgcctgatg tttttctttg tctttgctac atggctttgc  2835

tgctcggatc ggctcactct gtgtatgcca cgttcacttt gtactctcct tctcacggta  2895

ggtttattat ttttagatgt gcagttagtt tctgtgaaat aacacaccac acactgatat  2955

tgtctgtgca ttgacttggt gagtgcacat tgtttttgat cttgacatat ttatatttga  3015

ttgatcaggt gaactgtgtg aatctaaagt gctccataca gatgttctgc attgaaaata  3075

ttctcatttt attagtggaa gtgagtgtat gccacatcca atcaatttca gcaaacaccc  3135

cagtatgatt taatgcaaaa aaatgaaggt atcaaacacg cattactact ttgcagttaa  3195

atatttaaca tttattccaa cacgaaaaaa agcagtaaat aacactttga caaacacgtc  3255

aggacatctt atttttgtca ccctcacagg caatttagta taatatatta tatatatata  3315

tatatcatat aataatattc agtataatat atatatatat atcatattat aatattcagt  3375

ataatataaa acacaaacac atatatgtat aatataatat aacattttta tttattgaga  3435

tgcctctatg gaccgtgtta taagaagtaa agatcaggag aagtaaacat gaagtgtaat  3495

tatgaatact gatgttaaat taagctatga tgagttttca ctgttaattt accatctcaa  3555

ttaaatgttg atgcctccat gaccaagtaa agcagatgag actgagacaa ctgtagaaga  3615

caagatgttc actttgctga atatagctgg cttgacagtt atctatgact ctataaatat  3675

atatatattt ttttttttat aaaatgattt atttataact atatatccat ttctcagaca  3735

ggtgcttcat atccctcact cccgtagctg tccatgctgg atctgtcccc gttgttttta  3795

aaaagctaaa taagttatta acatgactgc atccagcgag ccaaacctgt ctggtgtaca  3855

gctaccagag aagctt                                                  3871

<210>2

<211>142

<212>PRT

<213>牙鲆鱼(Paralichthys olivaceus)

<400>2

Met Arg Thr Leu Val Val Leu Leu Leu Val Ala Val Ala Asn Ala Arg

1               5                   10                  15

Val Tyr Glu Arg Cys Glu Trp Ala Arg Leu Leu Arg Asn Gln Gly Met

            20                  25                  30

Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Val Cys Leu Ser Glu

        35                  40                  45

Trp Glu Ser Arg Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn His Asn Thr Asp Gly

    50                  55                  60

Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Trp Trp Cys Asn

65                  70                  75                  80

Asp Ser Gln Thr Pro Thr Ser Asn Ala Cys Asn Ile Arg Cys Ser Glu

                85                  90                  95

Leu Leu Thr Asp Asp Val Ile Val Ala Ile Lys Cys Ala Lys Arg Val

            100                 105                 110

Val Arg Asp Pro Asn Gly Ile Gly Ala Trp Val Ala Trp Arg Gln His

        115                 120                 125

Cys Gln Gly Gln Asp Leu Ser Ser Tyr Leu Ala Gly Cys Gly

    130                 135                 140

Claims (3)

1.一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，其特征在于：具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列中的2195-2690碱基序列。

2.一种牙鲆“全鱼”溶茵酶基因重组质粒，其特征在于：具有序列表中SEQ ID NO.1碱基序列。

3.一种权利要求1所述牙鲆“全鱼”溶茵酶基因的编码蛋白，其特征在于：具有SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。

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