CN1928085A

CN1928085A - 斑节对虾细胞周期蛋白b的基因序列

Info

Publication number: CN1928085A
Application number: CN 200610037559
Authority: CN
Inventors: 江世贵; 邱丽华; 周发林; 张汉华
Original assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Current assignee: South China Sea Fisheries Research Institute Chinese Academy Fishery Sciences
Priority date: 2006-09-07
Filing date: 2006-09-07
Publication date: 2007-03-14

Abstract

本发明从近源物种细胞周期蛋白B的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，从对虾的性腺中提取总RNA，并用PCR法扩增，克隆得到对虾细胞周期蛋白B的基因的表达序列。通过对细胞周期蛋白B基因的克隆，了解基因的组成情况及鱼类生长发育周期过程，并通过对该基因纯化蛋白的获得，可以促进鱼体细胞发育，缩短鱼类发育周期，对提高经济效益有一定的促进作用。

Description

斑节对虾细胞周期蛋白B的基因序列

技术领域

本发明涉及一种斑节对虾细胞周期蛋白B基因序列。

背景技术

细胞周期是指连续***细胞从一次有丝***结束到下一次有丝***结束所经历的整个过程。在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在***结束时平均分配到两个子细胞中去。细胞周期又可以分为间期和有丝***期。从一次有丝***结束到下一次有丝***开始的时期就是间期。这一期以DNA合成为标志，经过***期，加倍的染色体和其他细胞组分被平均分配到两个完全一样的子细胞中。通过***，形成了一个新细胞。细胞周期能够严格按照间期到有丝***期的顺序运转是与相关调控基因的有序表达分不开的。这一基因可以诱导未成熟细胞进入有丝***期，并发现在有丝***期唯一需要合成的基因蛋白就是这个周期蛋白，这是一个起关键作用的细胞***的调节蛋白。

细胞周期蛋白B为有丝***期周期蛋白，在间期到有丝***期交界处发挥功能，诱导细胞***。细胞周期蛋白与细胞衰老关系密切，细胞周期蛋白B降解受阻，细胞不能退出有丝***期，影响细胞衰老。

发明内容

本发明的目的是通过以近源物种细胞周期蛋白B的基因的CDS序列的保守区设计的兼并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到斑节对虾细胞周期蛋白B的基因的全表达序列。

上述目的是通过以下技术方案来实现的：

解剖对虾取出性腺，提取斑节对虾总RNA，使之与反转录引物(oligo-dT接头引物)混合，进行反转录，合成第一链cDNA。

从GenBank中下载近源物种(如人、牛、斑马鱼、日本对虾等)细胞周期蛋白B同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为225bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成得到以下引物序列：

F：5’ATWGCWAGYAAATAYGAAGARATGTA 3’

R：5’TCCATIARRTAYTTKGCWARIGTATG 3’。

以合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有***片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。

根据已得到的第一链cDNA片段序列设计特异性引物，利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。

在3′端的快速扩增中，由基因引物和接头引物进行PCR反应，扩增片段大小约为1000bp。所述的基因引物和接头引物序列为

基因引物：5’TCGGGGACTTCGCATACATC 3’

接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。

在5′端的快速扩增中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物再利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。所述引物序列为：

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’

基因外侧引物：5’GCAAAGGTATGTTGAGAAGC 3’

基因内侧引物：5’GTGTAAGGGAAGGGGATAGG 3’。

经末端快速扩增技术进行PCR所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接即可得到目的基因。

通过对细胞周期蛋白B基因的克隆，了解基因的组成情况及鱼类生长发育周期过程，并通过对该基因纯化蛋白的获得，可以促进鱼体细胞发育，缩短鱼类发育周期，对提高经济效益有一定的促进作用。

具体实施方式

下面通过以下具体实施方式对本发明作进一步阐述，但是本发明的内容完全不局限于此。

1.总RNA的提取

取鲜活健康斑节对虾(体重约300g)在实验室内暂养2d后(水温约24℃，气泵充气)，解剖虾体取出性腺约100mg，放入1mL Trizol(Gibco，Japan)中进行匀浆，按照试剂盒使用说明提取总RNA。

2.cDNA第一链的合成

取斑节对虾总RNA 5μg与反转录引物(oligo-dT接头引物)1μL(10pmol/L)混合，70℃加热5min后，立即放置冰上，然后加入5×buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，Ribonuclease Inhibitor，M-MLV反转录酶，反应体系为25μL。反应过程为42℃60min，70℃15min，最后放入-80℃保存备用。

3.兼并引物设计依据，引物合成的方法

从GenBank中下载近源物种(如人、牛、斑马鱼、日本对虾等)细胞周期蛋白B同源基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计兼并引物，扩增片段大小约为225bp。引物设计后采用β-乙睛亚磷酰胺化学法进行DNA合成，得到以下引物序列：

F：5’ATWGCWAGYAAATAYGAAGARATGTA 3’

R；5’TCCATIARRTAYTTKGCWARIGTATG 3’。

4.细胞周期蛋白B基因cDNA全序列的克隆

4.1第一链cDNA用兼并引物进行PCR扩增

以近源物种细胞周期蛋白B基因CDS序列的保守区设计的兼并引物，扩增片段大小约为225bp。

以上述合成的第一链cDNA作为模板，用兼并引物进行PCR扩增，反应体系为：10x PCR反应缓冲液5μL，25mmol/L MgCl₂ 3μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，10nmol/L引物dTF和dTR各2μL，Taq酶1.25U，用PCR水将反应体系补充至50μL。反应条件为：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸45s；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。所扩增的PCR产物用1.2％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，从凝胶中纯化回收目的产物。然后将纯化的PCR产物克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。经简并引物PCR检测后，将具有***片段的质粒DNA用M13通用引物进行双向测序。

4.2第一链cDNA的快速扩增技术进行PCR扩增

根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物。利用cDNA末端快速扩增技术(Rapid Amplification of cDNA ends，RACE)对目的基因的3′和5′末端进行PCR扩增。

在3′RACE中，由基因引物和接头引物进行PCR扩增。

引物序列为：

基因引物：5’TCGGGGACTTCGCATACATC 3’

接头引物：5’GGCCACGCGACTAGTAC 3’。

反应体系同兼并引物扩增体系。

反应条件：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。

在5′RACE中，利用末端转移酶和dCTP在cDNA末端加上poly(C)尾后，以加尾后的cDNA作为模板，利用外侧特异性引物和OligodG进行第一次PCR扩增，所得PCR产物取1μL作为模板，再利用内侧引物和OligodG进行第二次PCR扩增。

引物序列为：

oligo-dG：5’GGGGGGGGGGGGGGGH 3’

基因外侧引物：5’GCAAAGGTATGTTGAGAAGC 3’

基因内侧引物：5’GTGTAAGGGAAGGGGATAGG 3’。

反应体系同兼并引物扩增体系。

反应条件：

第一次PCR反应：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。

第二次PCR反应：1个循环，94℃变性5min；35个循环：94℃变性45s，59℃退火30s，72℃延伸1min；1个循环，72℃延伸10min；4℃保温。

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用M13引物对质粒DNA进行测序，测序所得序列再与兼并引物扩增所得的序列利用Clustal W软件进行拼接即可得到目的基因。

5.对斑节对虾细胞周期蛋白B基因的测定

所得到的PCR产物在1.2％的琼脂糖凝胶电泳上进行分离检测后，将PCR产物纯化后，克隆到pMD-18T载体中，转化大肠杆菌JM-109感受态细胞，挑取阳性克隆，用3730测序仪对质粒DNA进行测序。测序结果用BLAST软件( http://www.ncbi.nim.nih.gov/)进行同源性测定，来确定为斑节对虾细胞周期蛋白B基因同源序列。比对结果为：

Score E

Sequences producing significant alignments (Bits) Value

gi|54660743|gb|AAV37462.1|cyclin B[Marsupenaeus japonicus] 528 1e-148

gi|10955|emb|CAA41255.1|cyclin B[Patella vulgata]＞gi|11617... 319 9e-86

gi|52851368|dbj|BAD52077.1|cyclin B2[Anguilla japonica]＞gi... 305 2e-81

gi|10337|emb|CAA33513.1|unnamed protein product[Spisula sol... 303 9e-81

gi|42542462|gb|AAH66507.1|Cyclin B2[Danio rerio]＞gi|282778... 302 1e-80

gi|68363504|ref|XP_709645.1|PREDICTED：similar to Cyclin B2 iso 301 3e-80

根据Iron1995年的报道，只要两个序列间用BLAST软件比对后E-Value值小于0.005，则两个序列之间具有绝对的同源性，即证明序列为同一种基因序列。从对比结果看斑节对虾目的基因序列BLAST比对后，与其他物种的细胞周期蛋白B的E值绝对小于0.005，所以证明所克隆的目的基因是细胞周期蛋白B的同源序列。

序列表

<110>中国水产科学研究院南海水产研究所

<120>斑节对虾细胞周期蛋白B的基因序列

<160>2

<210>1

<211>1658

<212>RNA

<213>斑节对虾(Penaeus monodon Fabricius)

<220>

<221>3’UTP

<222>(1322)...(1658)

<220>

<221>5’UTP

<222>(1)...(59)

<220>

<221>CDS

<222>(60)...(1262)

<220>

<221>PolyA site

<222>(1641)...(1658)

<220>

<221>PolyA signal

<222>(1642)...(1658)

<400>1

ggagatttca gagttaataa agcctcgcat cgttgattac cggttgattt ccgttgatc 59

atg tgt tta aga act acc tcg cat ctt agt aat gtg gga cat gag ctg 107

Met Cys Leu Arg Thr Thr Ser His Leu Ser Asn Val Gly His Glu Leu

1 7 13

aac aac cca cgc aaa gta gag gca aag atg atc cag ggg cca gtc gcc 155

Asn Asn Pro Arg Lys Val Glu Ala Lys Met Ile Gln Gly Pro Val Ala

17 23 29

cgt cgt gcc ttg ggg gat gtt ggc aac cat ggt att ccc gtg caa ggg 203

Arg Arg Ala Leu Gly Asp Val Gly Asn His Gly Ile Pro Val Gln Gly

33 39 45

ccc aaa gct cct ctc aag gcg ggg gag atc tct cgc aat gag ccc gtc 251

Pro Lys Ala Pro Leu Lys Ala Gly Glu Ile Ser Arg Asn Glu Pro Val

49 55 61

aag ctg cac aag ccc aag tcc ggc ctc tct ggg ctg ctc gcc aga ccc 299

Lys Leu His Lys Pro Lys Ser Gly Leu Ser Gly Leu Leu Ala Arg Pro

65 71 77

ggc aaa gaa aat gtg aag ccc ctg aag gaa gtg gta gag cat gtg gag 347

Gly Lys Glu Asn Val Lys Pro Leu Lys Glu Val Val Glu His Val Glu

81 87 93

cag atg gat gtg gag gag gaa gcc aaa gtg gaa gag ctg gct att gct 395

Gln Met Asp Val Glu Glu Glu Ala Lys Val Glu Glu Leu Ala Ile Ala

97 103 109

ttc tct acc cag aga cta gat gtt gaa gat att gat gcc caa gac agt 443

Phe Ser Thr Gln Arg Leu Asp Val Glu Asp Ile Asp Ala Gln Asp Ser

113 119 125

gat aat cct cag ctt gta tct gaa tat gtg aat gat atc tac aag tac 491

Asp Asn Pro Gln Leu Val Ser Glu Tyr Val Asn Asp Ile Tyr Lys Tyr

129 135 141

ctg cga gag ctg gag gat gcc aac aaa gtc aag ccc aga tac cta gaa 539

Leu Arg Glu Leu Glu Asp Ala Asn Lys Val Lys Pro Arg Tyr Leu Glu

145 151 157

ggc caa gta att aca gga aag atg aga gca att ttg att gac tgg ctt 587

Gly Gln Val Ile Thr Gly Lys Met Arg Ala Ile Leu Ile Asp Trp Leu

161 167 173

gtc caa gta cac ctc cgc ttc act ctg ctt caa gaa aca ctg tat ctg 635

Val Gln Val His Leu Arg Phe Thr Leu Leu Gln Glu Thr Leu Tyr Leu

177 183 189

act gtt gct atc att gac aga ttt ctc cag act cag agg aat ata cca 683

Thr Val Ala Ile Ile Asp Arg Phe Leu Gln Thr Gln Arg Asn Ile Pro

193 199 205

cgt aac aag cta cag tta gtt ggt gtg act gcc atg ttc ata gct agt 731

Arg Asn Lys Leu Gln Leu Val Gly Val Thr Ala Met Phe Ile Ala Ser

209 215 221

aaa tat gaa gaa atg tat tgc cca gaa atc ggg gac ttc gca tac atc 779

Lys Tyr Glu Glu Met Tyr Cys Pro Glu Ile Gly Asp Phe Ala Tyr Ile

225 231 237

aca gac aaa gcc tac tca aag gca gag att cgt aaa atg gag gtg acc 827

Thr Asp Lys Ala Tyr Ser Lys Ala Glu Ile Arg Lys Met Glu Val Thr

241 247 253

atg ctg aat gag ctg ggc ttc aat gta tcc tat ccc ctt ccc tta cac 875

Met Leu Asn Glu Leu Gly Phe Asn Val Ser Tyr Pro Leu Pro Leu His

257 263 269

ttc ctg cga aga aac agc aaa gct ggc tct gtt gat gct tct caa cac 923

Phe Leu Arg Arg Asn Ser Lys Ala Gly Ser Val Asp Ala Ser Gln His

273 279 285

acc ttg gca aag tac ttg atg gaa ctt tgc ttg cca gag tac agc atg 971

Thr Leu Ala Lys Tyr Leu Met Glu Leu Cys Leu Pro Glu Tyr Ser Met

289 295 301

tgc cat tac aag tca tca atg att gct gca tct gct ctc tgc ctt tca 1019

Cys His Tyr Lys Ser Ser Met Ile Ala Ala Ser Ala Leu Cys Leu Ser

305 311 317

ctt aaa ttg ttg gat ggc aat aac tgg agt gat aca ttg act ttc tat 1067

Leu Lys Leu Leu Asp Gly Asn Asn Trp Ser Asp Thr Leu Thr Phe Tyr

321 327 333

tct cgc tac act gaa caa cag ctc atg cca gtc atg tgc aaa atg gca 1115

Ser Arg Tyr Thr Glu Gln Gln Leu Met Pro Val Met Cys Lys Met Ala

337 343 349

tca gtt gta gta aag agc agt agt gcc aag caa cag gct gta aga cag 1163

Ser Val Val Val Lys Ser Ser Ser Ala Lys Gln Gln Ala Val Arg Gln

353 359 365

aag tac aaa gcc agc aag ttg atg aaa att agt gag att ccc cag ctc 1211

Lys Tyr Lys Ala Ser Lys Leu Met Lys Ile Ser Glu Ile Pro Gln Leu

369 375 381

aaa tcg aag ctc atc aac tcg ctc gca gag aag agt gcg tct tat gca 1259

Lys Ser Lys Leu Ile Asn Ser Leu Ala Glu Lys Ser Ala Ser Tyr Ala

385 391 397

tga 1262

*

ggtggtcgcc atttaaaaag taaatattgt tcatgttgaa agaatggggt tgtttttgta 1322

catatttttt taagacgcca gttttttttt ttcataagtt ttcagattta taaaatactg 1382

accaccagtt tttttttttt tttttaacaa gagtagtttt ggggggcagc atgtaccccc 1442

cagagtgggt ggtttcggca tccctccatt catcgtggtc ttcattgtat taaaataatt 1502

ttaggcagga caaaaatggt tatttgaaga aaggaaccag caaagaagta tatgcaatgt 1562

cttgtaatgt atatatgacc tgtgataaac ttttagttat gttctgtatg tatacctata 1622

taataaacca gttttatcca aaaaaaaaaa aaaaaa 1658

<210>2

<211>400

<212>PRT

<213>斑节对虾(Penaeus monodon Fabricius)

<400>2

Met Cys Leu Arg Thr Thr Ser His Leu Ser Asn Val Gly His Glu Leu

1 7 13

Asn Asn Pro Arg Lys Val Glu Ala Lys Met Ile Gln Gly Pro Val Ala

17 23 29

Arg Arg Ala Leu Gly Asp Val Gly Asn His Gly Ile Pro Val Gln Gly

33 39 45

Pro Lys Ala Pro Leu Lys Ala Gly Glu Ile Ser Arg Asn Glu Pro Val

49 55 61

Lys Leu His Lys Pro Lys Ser Gly Leu Ser Gly Leu Leu Ala Arg Pro

65 71 77

Gly Lys Glu Asn Val Lys Pro Leu Lys Glu Val Val Glu His Val Glu

81 87 93

Gln Met Asp Val Glu Glu Glu Ala Lys Val Glu Glu Leu Ala Ile Ala

97 103 109

Phe Ser Thr Gln Arg Leu Asp Val Glu Asp Ile Asp Ala Gln Asp Ser

113 119 125

Asp Asn Pro Gln Leu Val Ser Glu Tyr Val Asn Asp Ile Tyr Lys Tyr

129 135 141

Leu Arg Glu Leu Glu Asp Ala Asn Lys Val Lys Pro Arg Tyr Leu Glu

145 151 157

Gly Gln Val Ile Thr Gly Lys Met Arg Ala Ile Leu Ile Asp Trp Leu

161 167 173

Val Gln Val His Leu Arg Phe Thr Leu Leu Gln Glu Thr Leu Tyr Leu

177 183 189

Thr Val Ala Ile Ile Asp Arg Phe Leu Gln Thr Gln Arg Asn Ile Pro

193 199 205

Arg Asn Lys Leu Gln Leu Val Gly Val Thr Ala Met Phe Ile Ala Ser

209 215 221

Lys Tyr Glu Glu Met Tyr Cys Pro Glu Ile Gly Asp Phe Ala Tyr Ile

225 231 237

Thr Asp Lys Ala Tyr Ser Lys Ala Glu Ile Arg Lys Met Glu Val Thr

241 247 253

Met Leu Asn Glu Leu Gly Phe Asn Val Ser Tyr Pro Leu Pro Leu His

257 263 269

Phe Leu Arg Arg Asn Ser Lys Ala Gly Ser Val Asp Ala Ser Gln His

273 279 285

Thr Leu Ala Lys Tyr Leu Met Glu Leu Cys Leu Pro Glu Tyr Ser Met

289 295 301

Cys His Tyr Lys Ser Ser Met Ile Ala Ala Ser Ala Leu Cys Leu Ser

305 311 317

Leu Lys Leu Leu Asp Gly Asn Asn Trp Ser Asp Thr Leu Thr Phe Tyr

321 327 333

Ser Arg Tyr Thr Glu Gln Gln Leu Met Pro Val Met Cys Lys Met Ala

337 343 349

Ser Val Val Val Lys Ser Ser Ser Ala Lys Gln Gln Ala Val Arg Gln

353 359 365

Lys Tyr Lys Ala Ser Lys Leu Met Lys Ile Ser Glu Ile Pro Gln Leu

369 375 381

Lys Ser Lys Leu Ile Asn Ser Leu Ala Glu Lys Ser Ala Ser Tyr Ala

385 391 397

Claims

1、一种斑节对虾细胞周期蛋白B基因，其特征在于具有以下RNA核苷酸及相应的氨基酸序列。

ggagatttca gagttaataa agcctcgcat cgttgattac cggttgattt ccgttgatc 59

atg tgt tta aga act acc tcg cat ctt agt aat gtg gga cat gag ctg 107

Met Cys Leu Arg Thr Thr Ser His Leu Ser Asn Val Gly His Glu Leu

1 7 13

aac aac cca cgc aaa gta gag gca aag atg atc cag ggg cca gtc gcc 155

Asn Asn Pro Arg Lys Val Glu Ala Lys Met Ile Gln Gly Pro Val Ala

17 23 29

cgt cgt gcc ttg ggg gat gtt ggc aac cat ggt att ccc gtg caa ggg 203

Arg Arg Ala Leu Gly Asp Val Gly Asn His Gly Ile Pro Val Gln Gly

33 39 45

ccc aaa gct cct ctc aag gcg ggg gag atc tct cgc aat gag ccc gtc 251

Pro Lys Ala Pro Leu Lys Ala Gly Glu Ile Ser Arg Asn Glu Pro Val

49 55 61

aag ctg cac aag ccc aag tcc ggc ctc tct ggg ctg ctc gcc aga ccc 299

Lys Leu His Lys Pro Lys Ser Gly Leu Ser Gly Leu Leu Ala Arg Pro

65 71 77

ggc aaa gaa aat gtg aag ccc ctg aag gaa gtg gta gag cat gtg gag 347

Gly Lys Glu Asn Val Lys Pro Leu Lys Glu Val Val Glu His Val Glu

81 87 93

cag atg gat gtg gag gag gaa gcc aaa gtg gaa gag ctg gct att gct 395

Gln Met Asp Val Glu Glu Glu Ala Lys Val Glu Glu Leu Ala Ile Ala

97 103 109

ttc tct acc cag aga cta gat gtt gaa gat att gat gcc caa gac agt 443

Phe Ser Thr Gln Arg Leu Asp Val Glu Asp Ile Asp Ala Gln Asp Ser

113 119 125

gat aat cct cag ctt gta tct gaa tat gtg aat gat atc tac aag tac 491

Asp Asn Pro Gln Leu Val Ser Glu Tyr Val Asn Asp Ile Tyr Lys Tyr

129 135 141

ctg cga gag ctg gag gat gcc aac aaa gtc aag ccc aga tac cta gaa 539

Leu Arg Glu Leu Glu Asp Ala Asn Lys Val Lys Pro Arg Tyr Leu Glu

145 151 157

ggc caa gta att aca gga aag atg aga gca att ttg att gac tgg ctt 587

Gly Gln Val Ile Thr Gly Lys Met Arg Ala Ile Leu Ile Asp Trp Leu

161 167 173

gtc caa gta cac ctc cgc ttc act ctg ctt caa gaa aca ctg tat ctg 635

Val Gln Val His Leu Arg Phe Thr Leu Leu Gln Glu Thr Leu Tyr Leu

177 183 189

act gtt gct atc att gac aga ttt ctc cag act cag agg aat ata cca 683

Thr Val Ala Ile Ile Asp Arg Phe Leu Gln Thr Gln Arg Asn Ile Pro

193 199 205

cgt aac aag cta cag tta gtt ggt gtg act gcc atg ttc ata gct agt 731

Arg Asn Lys Leu Gln Leu Val Gly Val Thr Ala Met Phe Ile Ala Ser

209 215 221

aaa tat gaa gaa atg tat tgc cca gaa atc ggg gac ttc gca tac atc 779

Lys Tyr Glu Glu Met Tyr Cys Pro Glu Ile Gly Asp Phe Ala Tyr Ile

225 231 237

aca gac aaa gcc tac tca aag gca gag att cgt aaa atg gag gtg acc 827

Thr Asp Lys Ala Tyr Ser Lys Ala Glu Ile Arg Lys Met Glu Val Thr

241 247 253

atg ctg aat gag ctg ggc ttc aat gta tcc tat ccc ctt ccc tta cac 875

Met Leu Asn Glu Leu Gly Phe Asn Val Ser Tyr Pro Leu Pro Leu His

257 263 269

ttc ctg cga aga aac agc aaa gct ggc tct gtt gat gct tct caa cac 923

Phe Leu Arg Arg Asn Ser Lys Ala Gly Ser Val Asp Ala Ser Gln His

273 279 285

acc ttg gca aag tac ttg atg gaa ctt tgc ttg cca gag tac agc atg 971

Thr Leu Ala Lys Tyr Leu Met Glu Leu Cys Leu Pro Glu Tyr Ser Met

289 295 301

tgc cat tac aag tca tca atg att gct gca tct gct ctc tgc ctt tca 1019

Cys His Tyr Lys Ser Ser Met Ile Ala Ala Ser Ala Leu Cys Leu Ser

305 311 317

ctt aaa ttg ttg gat ggc aat aac tgg agt gat aca ttg act ttc tat 1067

Leu Lys Leu Leu Asp Gly Asn Asn Trp Ser Asp Thr Leu Thr Phe Tyr

321 327 333

tct cgc tac act gaa caa cag ctc atg cca gtc atg tgc aaa atg gca 1115

Ser Arg Tyr Thr Glu Gln Gln Leu Met Pro Val Met Cys Lys Met Ala

337 343 349

tca gtt gta gta aag agc agt agt gcc aag caa cag gct gta aga cag 1163

Ser Val Val Val Lys Ser Ser Ser Ala Lys Gln Gln Ala Val Arg Gln

353 359 365

aag tac aaa gcc agc aag ttg atg aaa att agt gag att ccc cag ctc 1211

Lys Tyr Lys Ala Ser Lys Leu Met Lys Ile Ser Glu Ile Pro Gln Leu

369 375 381

aaa tcg aag ctc atc aac tcg ctc gca gag aag agt gcg tct tat gca 1259

Lys Ser Lys Leu Ile Asn Ser Leu Ala Glu Lys Ser Ala Ser Tyr Ala

385 391 397

tga 1262

*

ggtggtcgcc atttaaaaag taaatattgt tcatgttgaa agaatggggt tgtttttgta 1322

catatttttt taagacgcca gttttttttt ttcataagtt ttcagattta taaaatactg 1382

accaccagtt tttttttttt tttttaacaa gagtagtttt ggggggcagc atgtaccccc 1442

cagagtgggt ggtttcggca tccctccatt catcgtggtc ttcattgtat taaaataatt 1502

ttaggcagga caaaaatggt tatttgaaga aaggaaccag caaagaagta tatgcaatgt 1562

cttgtaatgt atatatgacc tgtgataaac ttttagttat gttctgtatg tatacctata 1622

taataaacca gttttatcca aaaaaaaaaa aaaaaa 1658