CN1281752C - 食管癌相关基因－2及其编码蛋白质的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食管癌相关基因领域，特别涉及食管癌相关基因-2(ECRG-2)的核苷酸序列。本发明还涉及含有所述的多核苷酸序列的重组载体以及含有该载体的大肠杆菌。本发明进一步涉及食管癌相关基因-2核苷酸序列编码蛋白的用途。用该ECRG-2多核苷酸序列转染的肿瘤细胞生长速度明显下降，凋亡增加。

Description

食管癌相关基因-2及其编码蛋白质的用途

技术领域

本发明涉及食管癌相关基因领域，特别涉及食管癌相关基因-2(ECRG-2)的核苷酸序列。本发明还涉及含有所述的多核苷酸序列的重组载体以及含有该载体的大肠杆菌。本发明进一步涉及食管癌相关基因-2核苷酸序列编码蛋白的用途。用该ECRG-2多核苷酸序列转染的肿瘤细胞生长速度明显下降，凋亡增加。

背景技术

肿瘤是威胁人类健康的重要疾病之一。食管癌是其中常见的恶性肿瘤，全世界食管癌的50％是发生在中国。近年来，有许多关于食管癌的研究，但是在食管癌中的癌基因与抑癌基因中未发现与食管癌发生、发展相关的基因(Shih Hsin Lu.Alterations of oncogenes and tumorsuppressor genes in esophageal cancer in China.MutationResearch 2000，467，343-353)。

其中我国的林县是食管癌高发地区，有许多食管癌高发家族，据分析可能有很多因素，例如饮食习惯、特定地理条件等，但食管癌的发病是否与特定基因的表达有关，这一直是研究的热点。本发明以食管癌高发家族作为基点，利用差异显示聚合酶链式反应(Differencedisplay-polymer chain reaction，DD-PCR)方法，从高发家族食管癌组织中分离出四条差异表达序列标记片断(Expressed sequence tag，EST)，其中一条是食管癌相关基因-2。

发明内容

本发明的目的是提供食管癌相关基因-2的多核苷酸序列。

本发明的另一个目的是提供食管癌相关基因-2多核苷酸序列编码蛋白质在抑制肿瘤生长中的用途。

为了完成上述目的，本发明涉及一种分离的多核苷酸，它为SEQ NO：1的多核苷酸；

本发明涉及含有SEQ NO：1的多核苷酸的重组质粒。

所述的重组质粒优选为PGEX-4T-1-ECRG-2质粒。

本发明涉及所述的重组质粒的大肠杆菌。

所述的大肠杆菌优选为BL21菌株。

本发明进一步涉及所述的多核苷酸序列在制备抑制食管癌细胞生长药物中的用途。

所述的食管癌细胞优选为Bel7402细胞。

附图说明

图1为ECRG-2基因组结构。

图2显示辐射染色体定位法的ECRG-2基因在染色体上的定位。

图3显示ECRG-2基因在原核细胞中的表达。

图4显示ECRG-2基因在原核细胞中的表达形式。

图5显示ECRG-2对Bel7402细胞增殖的影响。

图6显示ECRG-2对细胞周期的作用。

图6A显示未转染的Bel7402细胞的流式细胞仪图谱。

图6B显示转染空载体的Bel7402细胞的流式细胞仪图谱。

图6C显示转染ECRG-2的Bel7402细胞的流式细胞仪图谱。

图7显示ECRG-2对细胞凋亡的作用。

图7A显示对照细胞无凋亡小体。

图7B显示转染ECRG-2后凋亡小体增多。

具体实施方式

以下将结合附图和实施例详细描述本发明。但是实施例并非限制本发明的实质，仅仅是对本发明的技术方案进行说明，以便于本领域技术人员进一步理解本发明。

本发明人用试验结果展示了本发明ECRG-2基因的分离、鉴定、表达及其抑制肿瘤细胞增长的用途。

本发明人用试验结果展示了本发明ECRG-2基因的分离、鉴定、表达及其抑制肿瘤细胞增长的用途。

ECRG-2基因来源

1.ECRG-2基因的克隆：

我们选取林县食管癌高发家族的三例食管癌组织与正常食管上皮组织，提取RNA，进行差异显示(Difference Display，DD)-PCR(DD-PCR)，分离出4条差异EST片段，其中ECRG-2片段长度为183bp.以183bp的ECRG-2EST序列为基础，利用RACE技术(采用Clontech公司的SMART^TM RACE cDNA Amplification Kit并按手册操作)从正常的食管组织中克隆了ECRG-2基因的全长cDNA。

2.ECRG-2基因的鉴定：

1).经测序鉴定：ECRG-2基因的cDNA全长为569bp，含有258bp的阅读框架，编码85个氨基酸。其序列如SEQ NO：1所示。5’-端cDNA翻译起始密码的上游有同框终止密码子。3’-端有典型加尾信号AATAAA序列和poly A尾。

2).Northern blot检测结果与测序结果一致。

ECRG-2基因在各种肿瘤中的分布：

我们将ECRG-2在食管、肝脏、结肠和肺的肿瘤组织及其邻近组织中的表达作了比较，结果如表1所示。

                            表1

表达组织	样品数	阳性表达(％)	阴性表达(％)
				食管正常上皮邻近组织肿瘤组织肝脏邻近组织肿瘤组织结肠邻近组织	73351222217	7(100％)17(65％)14(21％)11(50％)10(45％)4(24％)	016(35％)12(55％)11(50％)10(45％)13(76％)

肿瘤组织肺邻近组织肿瘤组织

1899

4(22％)5(55％)4(44％)

13(78％)4(45％)5(55)

ECRG-2基因组的研究：

1).ECRG-2基因组的结构：ECRG-2基因组的全长为3540bp，由4个外显子和3个内含子组成(图1)。

2).ECRG-2基因组突变的研究：

(A).在第四外显子中发现(TCA)₃和(TCA)₄两种基因型多态，其中(TCA)₃基因型在食管癌及癌旁组织中明显增多，(TCA)₃基因型的人群可能易患食管癌。

STR的TCA基因型在肿瘤医院病人中的分布频率

	正常对照(％)	病例(％)	比值比(95％可信度)
				TCA4/TCA4TCA3/TCA4TCA3/TCA3Total	33(15.2)118(54.1)67(30.7)218(100)	19(12.6)66(44.0)65(43.4)150(100)	1.00(referent)1.03(0.52-2.04)0.59(0.29-1.21)

               STR的TCA基因型在林县病人中的分布频率

	正常对照(％)	病例(％)	比值比(95％可信度)
				TCA4/TCA4TCA3/TCA4TCA3/TCA3Total	21(17.9)57(48.8)39(33.3)117(100)	2(5.6)17(44.8)19(50.0)38(100)	1.00(referent)3.13(0.61-29.98)5.12(0.99-48.7)

(B).在第二外显子发现一例SNP。

(C).在第一外显子发现一例突变。

ECRG-2基因cDNA的研究：

(1)ECRG-2基因的cDNA全长已克隆为569bp。开放阅读框258bp。编码蛋白质含有85氨基酸，分子量约9.32KD。在GenBank/protein和dbEST检索，未发现与ECRG-1基因序列相似的基因，因此，ECRG-2基因是新基因。(序列见前)

(2)用辐射染色体定位法，将ECRG-2基因定位在染色体5q32-33(图2)。

(3)ECRG-2基因在正常食管上皮表达，而在食管癌组织中表达明显下降。可能为一抑癌基因。

(4)ECRG-2基因在原核细胞中表达(图3)。

(5)ECRG-2基因和其编码蛋白质能抑制食管癌细胞的生长(图4)。

(6)用流式细胞仪研究ECRG-2基因对细胞周期的作用，结果表明：ECRG-2基因有促进食管癌细胞的凋亡(图5、6)。

实施例1

ECRG-2基因的来源与提取纯化

一mRNA差异显示法

(一)组织标本细胞总RNA(TotalRNA)的提取

1.参考“异硫氰酸胍一步提取法”(《现代分子生物学实验技术》卢圣栋主编中国协和医科大学出版社，139-141)，具体步骤有修改。

取0.3g冻存组织标本，在液氮存在条件下于研钵中研成粉末，转入含3ml溶液D(4M异硫氰酸胍，25mM柠檬酸钠pH7.0，0.5％十二烷基肌氨酸钠，100mM 2-巯基乙醇)的匀浆器中匀浆(冰浴中操作)，匀浆液转入10ml离心管，按顺序加入：0.3ml2M乙酸钠pH4.0；3ml水饱和酚；0.6ml氦仿-异戊醇(49∶1)，加盖后立即强烈振荡10秒钟，置冰浴中15分钟，再以4℃，10000g离心20分钟，回收水相，加入等体积的酚-氯仿，振荡10秒钟，置冰浴中10分钟。4℃，10000g离心20分钟，回收水相，加入等体积的氯仿，振荡10秒钟，置冰浴中5分钟，4℃，10000g离心20分钟.回收水相，加入等体积预冷的异丙醇，放入-20℃沉淀1小时。4℃，10000g离心20分钟，弃上清，用75％乙醇洗沉淀和管壁，4℃，10000g离心10分钟。重复一次，抽真空干燥沉淀后，溶于适量的DEPC处理水中。

2.RNA的定量及电泳鉴定

取10ulRNA溶液加590ul水，混匀后用UV-240型紫外可见分光光度计测定OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀，OD₂₆₀/OD₂₈₀比值约为1.8。

RNA样本用1％琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

(二)mRNA差异显示

1.逆转录

分别将5例标本的总RNA与三种3’锚定引物组合，逆转录出cDNA首链，共15管，分为3组，每支0.5ml离心管中分别加入5ul正常A、正常B、癌旁、癌A和癌B总RNA(ug/ul)及5ul的10uM的锚定引物A。于70℃变性10分钟，立即置于冰水浴中，加入5ul逆转录体系(终浓度为1U/ul的RNasin(Promega，美国)、10mM DTT、1×Buffer、200uM的dNTP和200U的SuperScript II(BRL)。于42℃温浴1小时，90℃变性5分钟，置冰水浴中3分钟，每管加去离子水至终体积为100ul，防于-20℃冰箱储存。

2.PCR扩增

取5支0.5ml离心管，按顺序(正常A，正常B，癌旁，癌A，癌B)分别加入以锚定引物A起始的逆转录产物2μl，以此为一组，可另设一组为平行对照。分别加入18μl至终浓度为1×Taq酶Buffer、1.25mM MgCl₂、20uM的dNTP、0.5uM的锚定引物A、0.5uM的随机引物溶液、0.1U的Taq酶和0.25M的[α-³²P]-dCTP，使最终PCR扩增反应体系为每管20μl。加入一滴石蜡油，进行PCR扩增，反应条件为94℃2分钟、42℃5分钟和72℃5分钟，共一个循环。然后94℃30秒、56℃40秒，72℃40秒，共40个循环。最后，72℃延伸5分钟。

加入终止反应缓冲液(95％甲酰胺，20mMEDTA，0.05％溴酚兰，0.05％二甲苯兰)10μl/管以终止反应

3.6％聚丙烯酰胺凝胶电泳及曝光

参照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编中国协和医科大学出版社，85-88)介绍的方法操作，凝胶浓度为6％(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺为19∶1，尿素浓度为7M)，用1×TBE电泳缓冲液预电泳2小时。PCR产物于94变性后取3μl上样，恒定功率80W，电泳约7小时，使二甲苯兰行至凝胶底部。电泳后用滤纸平贴于凝胶上并揭下凝胶，覆盖保鲜膜后放人压片盒中，加X光片，于-70℃冰箱曝光16-20小时，无需固定凝胶或加增感屏。注意压片时应把凝胶与X光片的相对位置固定，否则会在回收差异片段时引起偏差。

4.回收及扩增差异片段

洗片前用针、锥等物在凝胶和X光片上打孔，洗片后在X光片上找出差异条带，把x光片和凝胶上的针孔对齐，在差异片段的相对位置切下凝胶条，放人0.5ml离心管中，加入50μl的PCR反应液，PCR反应条件为：94℃5分钟、然后，94℃40秒、56℃60秒和72℃60秒，共30个循环，最后72℃延伸5分钟。

(三)PCR产物的克隆

1.纯化PCR产物

按照Wizard^TMPCR DNA Purification System试剂盒(Promega公司，美国)说明书操作，纯化完毕后用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化效果。

2.连接反应

按照Promega公司的pGEM-T Vector System试剂盒说明书操作，具体步骤有所改动：取T4DNA连接酶的10×缓冲液1μl，pGEM-T(50ng/μl)载体0.2μl，去离子水0.8μl，PCR纯化产物7μ1(对照加水)，T₄DNA连接酶1μl(1Wei ss U/μl)，轻轻混匀，于15℃连接3小时。

3.制备感受态细菌

按照《现代分子生物学实验技术》(卢圣栋主编中国协和医科大学出版社，292-293)介绍的氯化钙方法操作。

4.转化

将10μl连接产物加入200μl感受态细菌中，轻轻旋转混匀，置冰浴1小时。将管放到42℃水浴中热休克90秒，然后迅速放回冰浴中，使细菌冷却2分钟。加1ml LB液体培养基，37℃，200rpm培养1小时。离心浓缩细菌，用适量的LB液体培养基重悬后，涂布到含有氨苄青霉素(Amp，100μg/ml)的LB琼脂平板上，于37℃倒置培养过夜。

5.含重组质粒的细菌的鉴定

用常规PCR方法进行鉴定。用无菌牙签挑少许细菌接种到配好的20μl PCR反应液中，同时设阴性对照(不加模板)及阳性对照(加纯化的PCR产物为模板)，进行PCR扩增，扩增条件同上。

PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳鉴定。

(四)测序

1.重组质粒DNA的小量提取

采用Promega公司的Wizard Plus Minipreps DNA PurificationSystem并按操作手册提取质粒DNA。用1％琼脂糖电泳鉴定并测定OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₃₀。

2.[γ-³²P]-ATP末端标记引物

按照Pharmacia公司的Cycle Sequencing Kit使用说明操作。

3.测序反应

以“A”“C”“G”“T”分别标记4套0.5ml离心管，并分别加入2μl对应的反应终止混合物(Terminat ion Mix)；另取一0.5ml管加入下列

试剂：

	平均每管(μl)	终浓度
			H2O5×Sequencing BufferdNTP Mix稀释的重组质粒模板Taq酶(5U/μl)末端标记的引物T7或SP6	9.85520.23	1×16uM1μg1U3pmol
总计	25μl

轻轻混匀，稍离心后分别取5μl加至A、C、G、T管中，加1滴石蜡油，放于PCR仪(PE公司480型)中，94℃2分钟，然后，94℃30秒、58℃40秒、72℃60秒，共35个循环。最后72℃延伸5分钟。反应完成后加入反应终止液(Stop Solution)3μl/管，混匀。

4.测序凝胶电泳及放射自显影

凝胶浓度为6％(丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺为19∶1，尿素浓度为7M)，用1×TBE电泳缓冲液预电泳2小时，PCR测序产物于94℃变性后取3μl上样，恒定功率80W，电泳约5小时，使溴酚兰行至凝胶底部，电泳后用滤纸平贴于凝胶上并揭下凝胶，覆盖保鲜膜后放人压片盒中，加X光片，于-70℃冰箱曝光16-20小时，无需固定凝胶或加增感屏，显影后读序。

(五)同源性比较

把测序结果输入计算机，通过Internet电脑网络与美国国立医学图书馆的GenBank数据库进行比较(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)。

二、差异片段的鉴定

(一)逆转录PCR鉴定

1.设计引物

根据测序结果，在cDNA片段两端设计一对引物。

2.总RNA的逆转录

取5份冻存的、根据方法一提取的组织标本(正常A、正常B、癌旁、癌A和癌B)总RNA，逆转录方法同方法一。

3.PCR

分别加入18μl至终浓度为1×Taq酶Buffer、1.5mM MgCl₂、40uM的dNTP、0.5μM的β-actin F和β-actin R、ECRG2AF和ECRG2AR以及0.1U/μl的Taq酶，使最终P C R扩增反应体系为每管20μl。加入一滴石蜡油，进行P C R扩增，反应条件为94℃2分钟、94℃30秒、56℃40秒，72℃40秒，共30个循环。最后，72℃延伸5分钟。

PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定，其中β-actin扩增产物作为内对照。

(二)Northern Blot鉴定

1.RNA的1％甲醛凝胶电泳及转膜

称取2g琼脂糖，加入170mlDEPC处理的水，加热溶解。待琼脂糖冷却到55-60℃时加人20血预热的10×MOPS缓冲液(0.2M MOPS pH7.0，80mM乙酸钠，10mMEDTA pH8.0)及11ml预热的甲醛(终浓度为0.66M)，混匀后在通风橱内铺胶(0.5-0.75cm厚).取0.5ml DEPC处理的离心管加入下列试剂：20μg总RNA、2μl 5×MOPS缓冲液3.5μ1甲醛、10μl去离子甲酰胺，加水至20μl。混匀后于65℃变性15分钟，迅速放入冰浴，加2μl 10×载样缓冲液(50％甘油，1mM EDTApH8.0，0.4％溴酚兰，0.4％二甲苯兰)，混匀。甲醛凝胶预电泳(以1×MOPS为电泳缓冲液，5V/cm)5分钟后加样.4V/cm电压条件下电泳约4小时，溴酚兰泳至凝胶的80％处停止。

2.碱转法转膜

按照Zeta-ProbeGT尼龙膜使用说明书操作：在水平容器中以滤纸搭桥，用玻璃棒赶净气泡。RNA凝胶用去离子水漂洗后放在滤纸中央，用玻璃棒赶净气泡。将去离子水浸透的Zeta-ProbeGT尼龙膜(膜四周边缘均比凝胶宽2mm)平铺于凝胶上，赶净气泡。铺上两张用50mM NaOH浸透的滤纸(比凝胶稍小)，赶净气泡。再在其上放置10cm厚的滤纸并压以重约500g的重物。转膜3-8小时，期间可更换滤纸一次，在刚转好的膜上可以肉眼观察到28s、18srRNA的位置，并做记录。尼龙膜用2×SSC缓冲液漂洗2次，于空气干燥后夹在两层滤纸之间放人80℃烤箱内烤干30分钟备用。

3.不对称PCR标记探针

在0.5ml离心管中加入下列试剂(以ECRG1为例)分别加入20μl至终浓度为1×Taq酶Buffer、1.5mM MgCl₂、20uM的dNTP、0.5uM的引物T7、0.005uM的引物SP6、0.1U/μl的Taq酶和0.25M的[α-³²P]-dCTP。加入一滴石蜡油，进行PCR扩增，反应条件为94℃3分钟、94℃30秒、56℃40秒，72℃40秒，共40个循环。最后，72℃延伸5分钟。存于4℃。

4.预杂交及杂交反应

将转有RNA的尼龙膜放入杂交盒，加20ml杂交液(0.25M Na₂HPO₄pH7.2，7％SDS，1mM EDTA)，于65℃预杂交3小时。倒出预杂交液，重新加入15ml杂交液并加入变性的探针，于65℃杂交20小时。倒掉杂交液，迅速加入100ml洗膜缓冲液I(40mM Na₂HPO₄pH7.2，5％SDS，1mM EDTA)，65℃振荡洗膜60分钟，重复一次。换洗膜缓冲液II(40mMNa₂HPO₄pH7.2，1％SDS，1mM EDTA)于65℃洗2次，每次60分钟。最后用室温的洗膜缓冲液II漂洗一次，使杂交膜温度恢复到室温，用保鲜膜包裹后放人压片盒中加X光片及增感屏，-70℃放射自显影。注意在每一步操作时都要使杂交膜保持湿润。

三、cDNA末端迅速扩增(5’RACE，Rapid Amplification of cDNA Ends)按照BRL公司的5’RACE试剂盒说明书操作。

实施例2

ECRG2基因编码的融合蛋白在大肠杆菌中的表达

PCR法获得ECRG-2基因

获取编码85个氨基酸的ECRG-2基因片段。PCR反应管中加入下列试剂。

试剂                        每管(ul)

TAKARALATaq                 0.25ul

10×LA BUFFER(Mg²⁺ Plus)   2.5ul

dNTP(2.5mM)                 4ul

DNA                         1ul

ECRG-25’引物(10mM)         1ul

ECRG-23’引物(10mM)         1ul

ddH₂O                      14.75ul

计                          25ul

放于PCR仪(PE公司2400型)中：94℃变性4分种后，94℃变性30秒、59℃退火45秒、72℃延伸1分钟，共35个循环，最后72℃7分钟，4℃保温。

1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。

PCR产物的克隆与纯化

1.PCR产物、载体的限制性内切酶酶切

PCR产物经酚、氯仿抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗涤后干燥，溶于ddH₂O中。先用EcolRI酶切3小时，酚、氯仿抽提，乙醇沉淀。再用SalI酶切。pGEX-4T-1同样用EcoRI，SalI酶切。

2.酶切产物的纯化

酶切产物经1％的琼脂糖凝胶(TAE缓冲液配制)电泳分离后，在长波紫外灯下用干净的刀片快速切下目的条带，置于1.5mlEP管中。用博大公司的DNA纯化回收试剂盒纯化：加入适量的溶胶液(100ul凝胶加300ul溶胶液)，颠倒混匀至凝胶完全溶解。再加10ul玻璃奶，置于冰上10分钟，期间轻轻混匀3-4次。12000转离心20秒，弃上清。沉淀用洗涤液洗两次。用洗脱缓冲液重悬沉淀，于65℃放置5分钟。12000转离心20秒回收纯化的DNA片段，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化效果并定量。

3.连接反应

将纯化的ECRG-2片段分别与pGEX-4T-1连接。连接体系如下：

pGEX-4T-1             1ul

ECRG-2                6ul

T4DNA ligase          1ul

5×Buffer             2ul

总计                  10ul

12-14℃连接12小时以上。

4.感受态细菌

按照<精编分子生物学实验指南>介绍的TSS Buffer一步法操作。挑取冻存的DH5α菌种接种于LB培养基平板，37℃倒置培养过夜。挑单个菌落，接种在5mlLB培养基中，于37℃，250RPM振荡培养过夜。转接1ml过夜培养物入100mlLB液体培养基中，于37℃培养3小时使之进入对数生长期(OD 600约为0.4-0.6)。4℃，4000rpm离心10分钟回收细菌。去尽培养基，加10ml预冷的1×TSS Buffer，重悬细菌。分装成200ul/份，冻于-70℃备用。

5.连接产物转化DH5α感受态细胞

取感受态细菌200ul，置冰上融化。将步骤2中的各种连接产物加入其中，轻轻混匀，冰浴30分钟。再于42℃水浴中热休克90秒，然后迅速放回冰浴中。加0.8mlLB液体培养基，37℃，200rpm培养1小时。离心浓缩细菌，用适量的LB液体培养基重悬后，涂布到含有氨苄青霉素(Amp，100ug/ml)的LB琼脂平板上，于37℃倒置培养过夜。

6.质粒的提取与纯化

挑取步骤4平板上的单菌落接种于5mlLB培养基中(含100ug/mlAmp)，37℃，200rpm培养过夜。4℃，12000rpm，离心10秒收集菌体。弃上清，倒置于滤纸上使残液流净。加入200ul悬浮液完全重悬细菌，再加入200ul细胞裂解液，轻轻颠倒混匀，直至溶液变清。再加200ul中和液，颠倒混匀数次。12000rpm离心10分钟，取上清加入1ml Resin中。将Wizard柱安装在一次性注射器头部，用针芯将Resin/DNA混合物推入Wizard柱。再用2ml洗液洗柱。将Wizard柱转移到1.5mlEP管上，12000rpm离心2分钟去尽残余的洗液。再将Wizard柱转移到一支新的EP管上，加50ul灭菌水，放置1分钟。12000rpm离心20秒回收纯化的质粒。1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定纯化效果。

7.重组质粒的细菌的鉴定

(1)PCR鉴定法

取少许步骤5所得的纯化质粒作为模板，用特异性引物做PCR

扩增  ECRG-2片段。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析。

(2)酶切鉴定法

取纯化的质粒10ul顺序用EcoRI，SalI于37℃酶切，产物经1％的琼脂糖凝胶电泳鉴定。

序列测定

含有经鉴定为阳性重组质粒的细菌送公司自动测序。

阳性重组体转化BL21菌株

测序证实序列、读码框无误的重组质粒按前述的方法转化BL21。

重组ECRG-2蛋白的诱导表达及纯化

1.表达GST-ECRG-2融合蛋白菌株的筛选。

挑取含PGEX-4T-1-ECRG-2质粒的单菌落，接种入5ml含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。过夜培养物50ul转入5ml新鲜的LB/Amp培养基中，37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6。加IPTG至终浓度为1mM，继续于37℃培养，分别于2小时、4小时、6小时留样。以BL21空菌，pGEX-4T-1空载体以及未加IPTG诱导的pGEX-4T-1-ECRG2培养物作为阴性对照，12％的SDS-PAGE胶分析蛋白表达情况。经IPTG诱导后，有明显的GST-ECRG2融合蛋白的表达，结果见图3。

2.表达蛋白在细菌中存在形式的确定。

已鉴定可表达目的蛋白的菌株于37℃过夜培养，培养物按1∶100的比例接种入300ml含氨苄青霉素的LB培养基中，于37℃振荡培养至OD₆₀₀为0.4-0.6。加IPTG至终浓度为1mM。继续培养3小时。收集菌体，重悬于1×PBS中，超声波破碎(工作3秒，间歇3秒，共180次。功率为200W)。裂解物经12000RPM离心10分钟。上清与沉淀分别经SDS-PAGE分析。

GST-ECRG2融合蛋白以包涵体形式表达。

3.亲和层析法纯化GST-ECRG-2

谷胱甘肽琼脂珠的准备：按所需的柱床体积的1.33倍取原液，装入一层析柱中。以10倍体积的PBS洗涤备用。

诱导表达GST-ECRG-2菌液400ml，12000rpm，10分钟离心收集菌体。PBS重悬后加PMSF至终浓度为1mM，超声破碎后，1000rpm，10分钟离心，上清过谷胱甘肽琼脂珠柱。共过三次。再以10倍体积的PBS充分洗柱，再加与柱床体积相同的10mM还原性谷胱甘肽入柱中，保留10分钟，收集流出液，共三次。洗脱物经SDS-PAGE胶分析蛋白纯化的情况。

实施例3

ECRG2基因对Bel7402细胞生长及细胞周期的影响

重组体的构建

用特异性引物(ECRG-25’-引物：TGG G GAT CCC ATG AAG ATC ACTGGG GGT CTC；3’-引物：TCG AAT TCC TTA GCA ACT TCC ATC GTG AAG)做PCR扩增ECRG-2基因，用ECORI、BamH I酶切后***载体pcDNA3.1(+)。重组体转化大肠杆菌DH5α，阳性克隆提取质粒，酶切鉴定为阳性重组体后送公司测序。

细胞培养

Bel7402细胞株于含10％的新生小牛血清的DMEM培养基，5％的CO2，37℃的环境中培养。

转染实验

1.接种适量的Bel7402细胞于35mm.皿中，待其长到80％满。稀释2ug的pcDNA3.1(+)-ECRG2入100ul的无血清的DMEM培养基(A液)，再稀释5ul的LIPOFECTAMINETM入100ul的无血清培养基(B液)，混合A、B液，室温放置30分钟。用无血清培养基洗Bel7402细胞三遍，加入2ml的无血清DMEM培养基，再将混合好的A、B液加入其中。37。C，5％的CO2环境下放置8小时后换两倍血清培养基，18-24小时后换正常培养基，72小时后按1∶10传代于含G418的选择性培养基内继续培养2周以筛选阳性克隆。

阳性克隆的RT-PCR鉴定：

阳性克隆细胞总RNA的提取：用Gibico公司的Trizol试剂提取Hela细胞总RNA，具体操作见试剂说明书，甲醛变性电泳分析RNA的完整性。

反转录反应

在一微量离心管中加入下列试剂

Bel7402细胞总RNA        6μl

10mMdNTP                1μl

Oligo(dT)0.5μg/ml      1μl

DEPC处理H2O            2μl

混匀，于65℃保温5分钟，置冰上。再加

10×RT buffer           2μl

25mM MgCL₂            4μl

0.1M DTT                2μl

Rnase抑制剂             1μl

42℃保温2分钟。加入1μl SuperScript II RT，42℃，50分钟。

70℃，15分钟，立即置于冰上，加1μlRNase H，37℃，20分钟。

以上述所得的cDNA作为模板，用特异性引物做PCR扩增ECRG-2片段。产物经1％的琼脂糖凝胶电泳分析。

MTT试验

将所筛得的阳性克隆细胞浓度调至1×10⁴/ml，每孔取100μl接种于96孔培养板，分别于24h，48h，72h，96h，120h进行MTT测定，以Bel7402细胞和转染空载体Bel7402细胞为对照组，观察ECRG2对Bel7402细胞生长的影响(见图6A、B、C)。

与对照组相比，ECRG2明显抑制Bel7402细胞的生长。

凋亡试验

将Bel7402细胞，转染空载体的Bel7402细胞以及转染重组质粒pcDNA3.1(+)-ECRG2的Bel7402细胞常规消化，收集细胞，PBS洗两次，取适量细胞PI染色30分钟后，上流式细胞仪检测。

                           序列表

<110>中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所

<120>食管癌相关基因-2及其编码蛋白质的用途

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>258

<212>DNA

<213>人

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(258)

<223>

<400>1

atg aag atc act ggg ggt ctc ctt ctg ctc tgt aca gtg gtc tat ttc     48

Met Lys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Cys Thr Val Val Tyr Phe

1               5                   10                  15

tgt agc agc tca gaa gct gct agt ctg tct cca aaa aaa gtg gac tgc     96

Cys Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Pro Lys Lys Val Asp Cys

            20                  25                  30

agc att tac aag aag tat cca gtg gtg gcc atc ccc tgc ccc atc aca     144

Ser Ile Tyr Lys Lys Tyr Pro Val Val Ala Ile Pro Cys Pro Ile Thr

        35                  40                  45

tac cta cca gtt tgt ggt tct gac tac atc acc tat ggg aat gaa tgt     192

Tyr Leu Pro Val Cys Gly Ser Asp Tyr Ile Thr Tyr Gly Asn Glu Cys

    50                  55                  60

cac ttg tgt acc gag agc ttg aaa agt aat gga aga gtt cag ttt ctt     240

His Leu Cys Thr Glu Ser Leu Lys Ser Asn Gly Arg Val Gln Phe Leu

65                  70                  75                  80

cac gat gga agt tgc taa                                        258

His Asp Gly Ser Cys

                85

<210>2

<211>85

<212>PRT

<213>人

<400>2

Met Lys Ile Thr Gly Gly Leu Leu Leu Leu Cys Thr Val Val Tyr Phe

1               5                   10                  15

Cys Ser Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ser Pro Lys Lys Val Asp Cys

            20                  25                  30

Ser Ile Tyr Lys Lys Tyr Pro Val Val Ala Ile Pro Cys Pro Ile Thr

        35                  40                  45

Tyr Leu Pro Val Cys Gly Ser Asp Tyr Ile Thr Tyr Gly Asn Glu Cys

    50                  55                  60

His Leu Cys Thr Glu Ser Leu Lys Ser Asn Gly Arg Val Gln Phe Leu

65                  70                  75                  80

His Asp Gly Ser Cys

                85

Claims (7)

1.一种分离的多核苷酸，其为SEQ NO：1的多核苷酸。

2.含有权利要求1所述的多核苷酸的重组质粒。

3.根据权利要求2所述的重组质粒，其特征在于所述的重组质粒为PGEX-4T-1-ECRG-2质粒。

4.含有权利要求2所述的重组质粒的大肠杆菌。

5.根据权利要求4所述的大肠杆菌，其特征在于它是BL21菌株。

6.权利要求1所述的多核苷酸序列在制备抑制食管癌细胞生长药物中的用途。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于所述的食管癌细胞为Bel7402细胞。

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