CN101058818A - 一种海因酶基因及其编码的氨基酸和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种海因酶基因，以及该基因编码的氨基酸、包含该基因的重组质粒和该基因的应用。本发明提供的海因酶基因所编码的氨基酸序列不同于目前已知来源的海因酶，所述海因酶基因的表达产物在以对羟基苯海因作为底物时表现出较高的酶活，其比活明显高于目前工业生产中常用的来源于Agrobacterium sp.KNK712的海因酶。

Description

一种海因酶基因及其编码的氨基酸和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种海因酶基因及其编码的氨基酸和应用。

背景技术

D-氨基酸及其衍生物是医药及食品领域的重要原材料，被广泛地用于半合成抗生素、多肽激素、拟除虫菊酯、杀虫剂和甜味剂等的中间物。其中，D-对羟基苯甘氨酸(D-pHPG)是合成半合成广谱抗生素阿莫西林、头孢羟氨苄、头孢哌酮、头孢罗奇有头孢羟胺唑等的重要原料。D-对羟基苯甘氨酸的传统生产工艺需要通过化学合成和拆分(D-对羟基苯甘氨酸的合成过程如图1所示)，该工艺存在着收率低，环境污染严重等缺点。

自上世纪八十年代以来，酶法制备D-对羟基苯甘氨酸的研究和应用得到发展，其过程如下：首先利用化学手段合成D，L-对羟基苯海因(D，L-HPH)作为生物酶作用的底物，然后利用生物酶将其转化为D-对羟基苯甘氨酸。一般而言，先由乙醛酸、苯酚、脲缩合得到D，L-对羟基苯乙内酰苯海因(pHPH)，pHPH可被D-海因酶(D-hydantoinase，E.C.3.5.2.2)立体专一性水解开环生成D-N-氨甲酰对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，在碱性条件或者存在消旋酶的条件下，未被开环的L-型对映体消旋化为D-型从而进一步被转化。通过这种酶促不对称水解反应，可使混消旋的pHPH完全转化为D-HPG。现在，在工业上已有采用固定化的D-海因酶或固定化细胞进行该反应的报道。

酶法生产D-对羟基苯甘氨酸在工业上有重要的应用价值，因此对其生产所用的相关酶的研究和改造有重要意义。而D-海因酶可催化5’单替代海因或二氢尿嘧啶的开环，形成氨基甲酰类的中间物，该中间产物可被氨甲酰水解酶降解为D-对羟基苯甘氨基酸，成为半合成β-内酰胺类抗生素的重要中间体。因而，对D-海因酶的研究逐渐成为了相关行业的热点研究课题之一。

近年来，人们已经从Pseudomonas fluorescens DSM84，Bacillus stearothermophilisNS1122A，Pseudomonas putida CCRC12857，Agrobacterium sp.KNK712，Agrobacteriumradiobacter NRRL B11291克隆出编码海因酶的基因，并对其进行了分子生物学改造，以改进相关的酶学性质。然而，迄今为止尚未见有克隆来源于Jannaschia sp.CCS1的海因酶的报道。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种来源于Jannaschia sp.CCS1的海因酶基因。

本发明的另一个目的在于，提供一种所述的海因酶基因编码的氨基酸。

本发明的另一个目的在于，提供一种具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列的重组质粒。

本发明的最后一个目的在于，提供一种所述的海因酶基因的应用。

为实现上述目的，本发明通过PCR方法从Jannaschia sp.CCS1基因组扩增获得海因酶基因。

再将扩增后获得的海因酶的DNA片段与载体pET28a连接，从而获得海因酶的重组质粒pETJ2。

将所述的海因酶的重组质粒转入到E.coli BL21(DE3)中，并将所述的工程菌BL21(DE3)/pETJ2发酵培养，从而获得所述的海因酶基因编码的氨基酸。

将所获得的海因酶基因的表达产物，以对羟基苯海因作为底物，制备D-对羟基苯甘氨酸，并与来源于Agrobacterium sp.KNK712的海因酶进行了比较。

本发明提供的海因酶基因编码的氨基酸序列不同于目前已知来源的海因酶，其在以对羟基苯海因作为底物时表现出较高的酶活，明显高于Agrobacterium sp.KNK712的海因酶。

虽然，在本发明中，构建表达载体时，使用的是pET28a，但是对本领域的工作人员而言，使用其它的载体来构建相应的表达载体，如pET***，pSU***，pTrc***，pMW***，pKK***，RSF1010等常用的表达载体，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。同样的，对本领域的工作人员而言，将构建好的相应表达载体转化到其它的微生物，如假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷菌属(Serratia)、农杆菌属(Agrobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)等中，获得相应的转化型微生物，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。

附图说明

图1是D-对羟基苯甘氨酸的合成示意图。

图2是新的海因酶表达载体pETJ2的构建示意图。

图3是在大肠杆菌中过表达海因酶的电泳图。

其中各泳道分别为：1为诱导前的BL21(DE3)/pETJ2；2为诱导后的BL21(DE3)/pETJ2；3为蛋白Marker。

图4是利用HPLC检测海因酶反应生成产物的曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验指南(第三版)》(J.萨姆布鲁克等著，2003)中所述的条件进行。

实施例1、含有目的基因的表达载体和工程菌的构建

1.1、引物设计

根据Genebank公布的Jannaschia sp.CCS1的基因组序列，设计引物A和B，其序列如下：

引物A：5’-AGGGGGATCCATGAGCAAGGTGATCAAGGG-3’；

引物B：5’-CTAGAAGCTTTCAAACCCCCGCCGGAATG-3’。

1.2、PCR扩增

用A和B为引物，以来源于Jannaschia sp.CCS1的基因组DNA为模板，PCR扩增目的基因。

反应体系：1×PCR Buffer for KOD plus，2mM MgSO₄，引物A和引物B各0.4μM，dJannaschia sp.CCS1基因组DNA 100ng，0.2mM dNTP，1U KOD plus/50μl。

反应条件：94℃ 5min，94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 10min。

反应结束后，按操作手册，将PCR产物用华舜公司的胶回收试剂盒回收纯化约1.5kb的产物。

对回收产物进行测序，测序结果显示，扩增获得的基因具有SEQ ID NO：3所示的DNA序列，其对应的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

以来源于Agrobacterium sp.KNK712的D-海因酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)作为Query，在GenBank中进行同源性检索。结果显示，该氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与具有SEQ ID NO：1记载的氨基酸序列(Q409E0)的同源性为40％，根据NCBI的BLAST结果分析，发现其存在海因酶的保守结构域，推测其可能具有海因酶的功能。

1.3、构建载体和工程菌

构建过程如图2所示，具体操作如下：

参考操作手册，用BamHI(购自MBI公司)和HindIII(购自MBI公司)分别对PCR扩增产物和pET28a载体(购自Novagen公司)进行双酶切，采用MBI公司的双酶切缓冲液R作为酶切反应的缓冲液。

酶切后，产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并割胶回收目的片段(PCR产物酶切后片段大小约为1.5kb，pET28a酶切后大小约为5.4kb)，然后参考操作手册，用华舜公司的胶回收试剂盒分别回收并纯化PCR产物的酶切后片段和载体pET28a的酶切后片段。

取PCR产物酶切后片段和pET28a载体片段各4μl，1μl T4连接酶缓冲液和1μl T4连接酶，于16℃，连接过夜，收获连接产物，即为表达载体pETJ2。

取5μl连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37℃培养过夜。

挑取单菌落接入液体培养基中，于37℃，250rpm，培养6-8小时后，抽提质粒，并验证克隆。选取酶切验证正确的克隆测序，以验证序列是否突变。

测序结果显示，目的基因的序列没有发生突变。

将构建好的表达载体pETJ2转化宿主菌E.coli BL21(DE3)(购自Novagen公司)，得到的工程菌命名为BL21(DE3)/pETJ2。

虽然，在本实施例中，构建表达载体时，使用的是pET28a，但是对本领域的工作人员而言，使用其它的载体来构建相应的表达载体，如pET***，pSU***，pTrc***，pMW***，pKK***，RSF1010等常用的表达载体，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。同样的，对本领域的工作人员而言，将构建好的相应表达载体转化到其它的微生物，如假单胞菌属(Pseudomonas)、黄杆菌属(Flavobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、沙雷菌属(Serratia)、农杆菌属(Agrobacterium)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)等中，获得相应的转化型微生物，也是显而易见的，故也应属于本发明的范围。

实施例2、目的基因的表达

挑取E.coli BL21(DE3)/pETJ2的单菌落接入含有50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养过夜。

将过夜培养的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，于20℃，诱导培养5小时。

将菌液于12000rpm离心2分钟后，弃上清。

用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液将沉淀重悬，超声破碎。将破碎后的细胞，通过聚丙烯酰氨凝胶电泳分析目的蛋白的表达量，结果如图3所示。

根据图3的结果可见，目的蛋白的表达量约占总蛋白的30％，可通过在大肠杆菌重组过量表达J2，以利于后续的酶蛋白的固定化和连续转化的工业化生产。

实施例3、目的蛋白酶活的测定

将实施例2中过夜培养的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，于20℃，诱导培养5小时。

收集菌液，离心，弃去上清，并于-20℃冻融一次，然后用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液将菌体重悬。

将重悬后的菌体加入到含1％对羟基苯海因、pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃反应10分钟，加入3.7％的HCl中止酶反应并混匀。

将上述反应液于12000rpm离心5分钟，取上清稀释4倍后利用HPLC分析反应产物生成的量(结果如图4所示)，计算酶活，结果如表1所示。

酶活计算方法：

         表1、目的蛋白酶活测定结果

	O.D.600	μmol/min/ml/OD
			BL21/pETJ2	2.2±0.1	0.016±0.002

实施例4、目的蛋白比活的测定

将实施例2中过夜培养的BL21(DE3)/pETJ2按1％的接种量接入含50μg/ml卡那霉素的TB液体培养基中，37℃，200rpm，培养至OD600≈0.6时，加入终浓度为0.25mM的IPTG，于20℃，诱导培养5小时。

收集菌液，离心，弃去上清，然后用50mM pH8.0的Tris-HCl缓冲液将菌体重悬。将重悬的菌液压榨破壁，采用GE公司Ni Sepharose High Performance纯化目的蛋白，并用Bradford方法测定目的蛋白浓度。

将目的蛋白用50mM pH8.0的Tris-HCl稀释为终浓度0.06mg/mL，加入到含1％对羟基苯海因pH 8.0的Tris-HCl缓冲液中，40℃反应30分钟，加入3.7％的HCl中止酶反应并混匀。

将上述反应液于12000rpm离心5分钟，取上清稀释10倍后利用HPLC分析反应产物生成的量(结果如图4所示)，计算酶比活，结果如表2所示。

用同样的方法可从含有来源于Agrobacterium sp.KNK712海因酶的工程菌(CGMCCNo.0520.2)中表达、纯化得到来源于Agrobacterium sp.KNK712的海因酶，并在上述同样的条件下，测定其活性和比活。

           表2、目的蛋白比活测定结果

	比活μmol/(min.mg蛋白)
		Agrobacterium sp.KNK712	2.0±0.02
J2	9.1±0.4

根据上述实施例中实验结果，可以推定具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的蛋白，具有海因酶的功能，因此是一种海因酶；且本发明的海因酶不同于目前已知来源的海因酶，其在以对羟基苯海因作为底物时，表现出较高的比活，其比活约为来源于Agrobacterium sp.KNK712的海因酶的4倍，因此，在运用双酶法生产对羟基苯甘氨酸的工业生产中可有较广阔的运用前景。

                                    序列表

<110>中国科学院上海生命科学研究院

<120>一种海因酶

<130>P5071012

<160>3

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>457

<212>PRT

<213>Agrobacterium sp.KNK712

<400>1

Met Asp Ile Ile Ile Lys Asn Gly Thr Ile Val Thr Ala Asp Gly Ile

1               5                   10                  15

Ser Arg Ala Asp Leu Gly Ile Lys Asp Gly Lys Ile Thr Gln Ile Gly

            20                  25                  30

Gly Ala Leu Gly Pro Ala Glu Arg Thr Ile Asp Ala Ala Gly Arg Tyr

        35                  40               45

Val Phe Pro Gly Gly Ile Asp Val His Thr His Val Glu Thr Val Ser

    50                  55                  60

Phe Asn Thr Gln Ser Ala Asp Thr Phe Ala Thr Ala Thr Val Ala Ala

65                  70                  75                  80

Ala Cys Gly Gly Thr Thr Thr Ile Val Asp Phe Cys Gln Gln Asp Arg

                85                  90                  95

Gly His Ser Leu Ala Glu Ala Val Ala Lys Trp Asp Gly Met Ala Gly

            100                 105                 110

Gly Lys Ser Ala Ile Asp Tyr Gly Tyr His Ile Ile Val Leu Asp Pro

        115                 120                 125

Thr Asp Ser Val Ile Glu Glu Leu Glu Val Leu Pro Asp Leu Gly Ile

    130                 135                 140

Thr Ser Phe Lys Val Phe Met Ala Tyr Arg GIy Met Asn Met Ile Asp

145                 150                 155                 160

Asp Val Thr Leu Leu Lys Thr Leu Asp Lys Ala Val Lys Thr Gly Ser

                165                 170                 175

Leu Val Met Val His Ala Glu Asn Gly Asp Ala Ala Asp Tyr Leu Arg

            180                 185                 190

Asp Lys Phe Val Ala Glu Gly Lys Thr Ala Pro Ile Tyr His Ala Leu

        195                 200                 205

Ser Arg Pro Pro Arg Val Glu Ala Glu Ala Thr Ala Arg Ala Leu Ala

    210                 215                 220

Leu Ala Glu Ile Val Asn Ala Pro Ile Tyr Ile Val His Val Thr Cys

225                 230                 235                 240

Glu Glu Ser Leu Glu Glu Val Met Arg Ala Lys Ser Arg Gly Val Arg

                245                 250                 255

Ala Leu Ala Glu Thr Cys Thr His Tyr Leu Tyr Leu Thr Lys Glu Asp

            260                 265                 270

Leu Glu Arg Pro Asp Phe Glu Gly Ala Lys Tyr Val Phe Thr Pro Pro

        275                 280                 285

Ala Arg Ala Lys Lys Asp His Asp Val Leu Trp Asn Ala Leu Arg Asn

    290                 295                 300

Gly Val Phe Glu Thr Val Ser Ser Asp His Cys Ser Trp Leu Phe Lys

305                 310                 315                 320

Gly His Lys Asp Arg Gly Arg Asn Asp Phe Arg Ala Ile Pro Asn Gly

                325                 330                 335

Ala Pro Gly Val Glu Glu Arg Leu Met Met Val Tyr Gln Gly Val Asn

            340                 345                 350

Glu Gly Arg Ile Ser Leu Thr Gln Phe Val Glu Leu Val Ala Thr Arg

        355                 360                 365

Pro Ala Lys Val Phe Gly Met Phe Pro Gln Lys Gly Thr Ile Ala Val

    370                 375                 380

Gly Ser Asp Ala Asp Ile Val Leu Trp Asp Pro Glu Ala Glu Met Val

385                 390                 395                 400

Ile Glu Gln Thr Ala Met His Asn Ala Met Asp Tyr Ser Ser Tyr Glu

                405                 410                 415

Gly His Lys Val Lys Gly Val Pro Lys Thr Val Leu Leu Arg Gly Lys

            420                 425                 430

Val Ile Val Asp Glu Gly Ser Tyr Val Gly Glu Pro Thr Asp Gly Lys

        435                 440                 445

Phe Leu Lys Arg Arg Lys Tyr Lys Gln

    450                 455

<210>2

<211>487

<212>PRT

<213>Jannaschia sp.CCS1

<400>2

Met Ser Lys Val Ile Lys Gly Gly Thr Ile Val Thr Ala Asp Arg Gln

1               5                   10                  15

Trp Gln Ala Asp Val Leu Ile Glu Gly Glu Lys Ile Ala Glu Ile Gly

            20                  25                  30

Glu Asn Leu Arg Gly Asp Glu Val Ile Asp Ala Glu Gly Ala Tyr Val

        35                  40                  45

Ile Pro Gly Gly Ile Asp Pro His Thr His Leu Glu Met Pro Phe Met

    50                  55                  60

Gly Thr Thr Ala Ala Glu Thr Phe Glu Thr Gly Thr Phe Ala Ala Ala

65                  70                  75                  80

Ala Gly Gly Thr Thr Met Leu Val Asp Phe Cys Leu Pro Gly Glu Asp

                85                  90                  95

Gly Ser Leu Leu Ser Ala Ile Asp Ala Trp Asp Ala Lys Ser Lys Asp

            100                 105                 110

Gln Ile Cys Val Asp Ile Ser Tyr His Met Ala Ile Thr Gly Trp Ser

        115                 120                 125

Glu Ser Ile Phe Asn Glu Met Ala Asp Val Val Asn Val Arg Gly Ile

    130                 135                 140

Asn Thr Phe Lys His Phe Met Ala Tyr Lys Gly Ala Leu Met Ile Glu

145                 150                 155                 160

Asp Asp Glu Met Phe Ser Ser Phe Lys Arg Cys Ala Glu Leu Gly Ala

                165                 170                 175

Leu Pro Leu Val His Ala Glu Asn Gly Asp Ile Val Gln Glu Leu Gln

            180                 185                 190

Gln Lys Tyr Met Ala Met Gly Val Thr Gly Pro Glu Gly His Ala Tyr

        195                 200                 205

Ser Arg Pro Pro Glu Val Glu Gly Glu Ala Ala Asn Arg Ala Ile Met

    210                 215                 220

Ile Ala Asp Ala Ala Gly Thr Pro Leu Tyr Ile Val His Val Ser Cys

225                 230                 235                 240

Glu Gln Ala His Glu Ala Ile Arg Arg Ala Arg Gln Lys Gly Met Arg

                245                 250                 255

Val Phe Gly Glu Pro Leu Ile Gln His Leu Thr Leu Asp Glu Ser Glu

            260                 265                 270

Tyr Phe Asn Lys Asp Trp Gln Tyr Ala Ala Arg Arg Val Met Ser Pro

        275                 280                 285

Pro Phe Arg Asn Lys Glu His Gln Asp Gly Leu Trp Ala Gly Leu Ala

    290                 295                 300

Ala Gly Ser Leu Gln Val Val Ala Thr Asp His Ala Ala Phe Thr Asp

305                 310                 315                 320

Glu Gln Lys Arg Met Gly Val Asp Asn Phe Gly Met Ile Pro Asn Gly

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Thr Gly Gly Leu Glu Glu Arg Met Ala Met Leu Trp Thr Arg Gly Val

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Glu Thr Gly Arg Leu Thr Pro Glu Glu Phe Val Ala Val Thr Ser Ser

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Asn Ile Ala Lys Ile Leu Asn Ile Tyr Pro Met Lys Gly Gly Ile Asn

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Thr Ile Thr Thr Ala Thr Ala Lys Ser Ile Leu Asp Tyr Asn Val Phe

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Glu Gly Met Glu Val Ser Ala Ser Pro Arg Tyr Thr Leu Ser Arg Gly

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Asp Val Val Trp Ala Ala Gly Gln Asn Ser Gln Pro Gln Pro Gly Arg

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Gly Lys Phe Val Lys Arg Pro Pro Ala Ala Ser Ala Ser Gln Ala Leu

    450                 455                 460

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465                 470                 475                 480

Met Asn Ile Pro Ala Gly Val

                485

<210>3

<211>1464

<212>DNA

<213>Jannaschia sp.CCS1

<400>3

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gtgttgatcg agggcgaaaa gattgccgag atcggggaga acctgcgcgg ggatgaggtg    120

atcgacgcgg aaggcgccta tgtgatcccg ggcggcatag acccccacac gcatcttgag    180

atgcccttca tgggcaccac ggcggcggag acgttcgaga cgggcacctt tgcggcggca    240

gcgggcggca ccacgatgct ggtcgatttc tgccttccgg gcgaggatgg cagccttttg    300

tccgccatcg atgcctggga cgccaaatcg aaggatcaga tctgcgttga tatctcctac    360

cacatggcga tcaccggctg gtcggagagc attttcaatg agatggcgga cgttgttaat    420

gtgcgcggca tcaacacatt taagcatttc atggcctata aaggcgcgct gatgatcgag    480

gatgacgaga tgttttcgtc gttcaagcgc tgcgctgaat tgggcgcgct gccgctggtc    540

catgccgaaa acggcgatat cgtccaggag ttgcaacaga aatacatggc gatgggcgtg    600

acggggccgg agggtcacgc atattcccgt ccgcctgagg tcgaagggga agccgccaac    660

cgcgcgatca tgatcgccga cgccgctggc acgccgttgt atatcgtcca tgtgtcgtgt    720

gagcaggccc atgaggccat ccgccgtgcc cgtcagaagg ggatgcgggt cttcggggag    780

ccactgatcc agcacctgac gctggatgag agcgagtatt tcaacaagga ttggcaatat    840

gcggcccgcc gggtcatgtc cccgccgttt cgcaacaaag agcatcagga cggtctttgg    900

gcaggtcttg ccgctgggtc cttgcaggtt gtggccacgg accacgccgc cttcaccgac    960

gagcaaaagc gcatgggcgt ggacaatttc ggcatgatcc ccaacggcac cggcgggctt    1020

gaggagcgca tggcaatgtt gtggacgcgc ggcgtggaaa cgggccgcct gacgccggaa    1080

gaattcgttg cggtgacgtc atcgaacatc gccaagatcc tcaacattta cccaatgaag    1140

ggtggcatca acgtcggcgg cgacgcggat atcgtggtct gggacccgaa actgggccgc    1200

acgatcacga cggcaacggc gaaatctatc cttgattaca atgtgttcga gggaatggag    1260

gtgagcgcct ccccccgcta caccctgtcg cgcggggatg tggtgtgggc ggcggggcaa    1320

aacagccagc cgcaaccggg ccgtgggaaa ttcgtgaaac ggcccccggc ggcgagtgcg    1380

tcccaggcgc tgagcaagtg gaaggcgttg aacacgccgc gcaagatcga gcgcgacccg    1440

atgaacattc cggcgggggt ttga                                           1464

Claims (24)

1、一种海因酶基因，其特征在于，所述海因酶基因来源于Jannaschia sp.CCS1。

2、如权利要求1所述的海因酶基因，其特征在于，所述基因编码的氨基酸具有SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列。

3、如权利要求1或2所述的海因酶基因，其特征在于，所述的基因具有SEQ ID NO：3所示的DNA序列。

4、如权利要求1-3任一项所述的海因酶基因编码的氨基酸。

5、如权利要求4所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

6、如权利要求5所述的氨基酸，其特征在于，所述氨基酸由具有SEQ ID NO：3所示的DNA序列的海因酶基因所编码。

7、一种重组质粒，其特征在于，所述重组质粒具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列。

8、如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQ ID NO：3所示的DNA序列。

9、如权利要求7所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括：pET***，pSU***，pTrc***，pMW***，pKK***，RSF1010。

10、如权利要求9所述的重组质粒，其特征在于，载体为pET28a。

11、如权利要求1-3任一项所述的海因酶基因的应用，其特征在于，用于制备海因酶。

12、如权利要求11所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建重组质粒；

B、转化宿主菌；

C、发酵培养，获得海因酶。

13、如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述重组质粒具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列。

14、如权利要求13所述的重组质粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQ ID NO：3所示的DNA序列。

15、如权利要求14所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括：pET***，pSU***，pTrc***，pMW***，pKK***，RSF1010。

16、如权利要求15所述的重组质粒，其特征在于，载体为pET28a。

17、如权利要求11或12所述的应用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

18、如权利要求1-3任一项所述的海因酶基因用于制备D-对羟基苯甘氨酸的应用。

19、如权利要求18所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

A、构建重组质粒；

B、转化宿主菌；

C、发酵培养，制备海因酶发酵液；

D、利用发酵液将D，L-对羟基苯海因底物转化为D-对羟基苯甘氨酸。

20、如权利要求19所述的应用，其特征在于，所述重组质粒具有编码SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的海因酶基因和一种载体DNA序列。

21、如权利要求20所述的重组质粒，其特征在于，所述海因酶基因具有SEQ ID NO：3所示的DNA序列。

22、如权利要求21所述的重组质粒，其特征在于，所述载体包括：pET***，pSU***，pTrc***，pMW***，pKK***，RSF1010。

23、如权利要求22所述的重组质粒，其特征在于，载体为pET28a。

24、如权利要求18或19所述的应用，其特征在于，所述的海因酶具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

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