CN1630665B

CN1630665B - 抗Aβ抗体及其用途

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Publication number: CN1630665B
Application number: CN038040336A
Authority: CN
Inventors: M·巴德罗夫; B·宝曼; M·布洛克豪斯; W·休伯; T·克莱茨克马; C·劳宁; H·洛茨西尔; C·诺德斯泰特; C·罗斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG; Morphosys AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG; Morphosys AG
Priority date: 2002-02-20
Filing date: 2003-02-20
Publication date: 2013-09-18
Anticipated expiration: 2023-02-20
Also published as: BRPI0307837B1; US8329886B2; ZA200406604B; EP2368907B1; RU2004128259A; AU2003218995A1; JP4383888B2; HRP20040712B1; US20050169925A1; AR038568A1; IL163563A; IL163563A0; ES2590684T3; PL372269A1; NO336112B1; KR101038828B1; JP2009171972A; EP2368907A3; HUE030591T2; EP2368907A2

Abstract

本发明涉及能特异识别β-A4肽的2个区域的抗体分子，其中第一个区域包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列AEFRHDSGY或其片断且第二个区域包括SEQ IDNO：2所示的氨基酸序列VHHQKLVFFAEDVG或其片断。此外，揭示了编码发明抗体分子的核酸分子和载体及含所述核酸分子的宿主。另外，本发明提供组合物，优选药物或诊断组合物，包括发明化合物以及发明抗体分子、核酸分子、载体或宿主的特定用途。

Description

抗Aβ抗体及其用途

本发明涉及能特异识别β-A4肽的2个区域的抗体分子，其中第一个区域包括SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列AEFRHDSGY或其片断且第二个区域包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列VHHQKLVFFAEDVG或其片断。此外，揭示了编码发明抗体分子的核酸分子和载体及含所述核酸分子的宿主。另外，本发明提供组合物，优选药物或诊断组合物，包括发明化合物以及发明抗体分子、核酸分子、载体或宿主的特定用途。

本说明书正文引用了一些文献。本文所引用的各文献(包括任何厂商说明书、规程等)纳入本文供参考。

约70％的所有痴呆病例是由于阿尔茨海默氏病，此病与对识别关键的大脑区域的选择性操作和神经回路相关。阿尔茨海默氏病的特征是神经纤维缠结，特别是海马的锥形神经元和多种淀粉样斑，主要含淀粉样沉积物的致密核和缓和晕。

胞外神经炎性斑含有大量占优势的纤维肽，名为“淀粉样β”、“A-β”、“Aβ4”、“β-A4”或“Aβ”；参见Selkoe(1994)，Ann.Rev.Cell Biol.10，373-403，Koo(1999)，PNAS第96卷，9989-9990页，US 4,666,829或Glenner(1984)，BBRC 12，1131。此淀粉样β衍生自“阿尔茨海默氏前体蛋白/β-淀粉样前体蛋白”(APP)。APPs是整合膜糖蛋白(参见Sisodia(1992)，PNAS第89卷，6075页)且是通过血浆膜蛋白酶α-分泌酶在Aβ序列中内切蛋白酶解切割的(参见Sisodia(1992)，在上述引文中)。此外，进一步的分泌酶活性，尤其是β-分泌酶和γ-分泌酶活性导致胞外释放淀粉样β(Aβ)，Aβ包括39个氨基酸(Aβ39)、40个氨基酸(Aβ40)、42个氨基酸(Aβ42)或43个氨基酸(Aβ43)；参见Sinha(1999)，PNAS 96，11094-1053；Price(1998)，Science 282，1078到1083；WO 00/72880或Hardy(1997)，TINS 20，154。

注意到Aβ有一些天然产生的形式，其中人类形式指上述Aβ39、Aβ40、Aβ41、Aβ42和Aβ43。最主要形式Aβ42具有氨基酸序列(从N-末端开始)：DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO：27)。在Aβ41、Aβ40、Aβ39中，分别缺失C-末端氨基酸A、IA和VIA。在Aβ43-形式中，另外的苏氨酸残基包括在上述序列的C-末端(SEQ ID NO：27)。

成核Aβ40纤维所需的时间显著长于成核Aβ42纤维；参见Koo，在上述引文中和Harper(1997)，Ann.Rev.Biochem.66，385-407。综述于Wagner(1999)，J.Clin.Invest.104，1239-1332。Aβ42更常发现与神经炎必斑相关并认为在体外原纤维形成更多。也提示Aβ42作为有序非晶体Aβ肽的成核依赖性聚合中的“晶种”；Jarrett(1993)，Cell 93，1055-1058。

要强调的是修饰APP加工和/或产生含蛋白质沉积的胞外斑不仅从阿尔茨海默氏的病理学中知道，也从患其它神经和/或神经变性疾病的患者中知道。这些疾病包括唐氏综合症、淀粉样变荷兰型的遗传性脑出血、帕金森氏病、ALS(肌萎缩侧索硬化)、克-雅氏病、HIV-相关痴呆和运动神经病。

为防止、治疗和/或改善与淀粉样斑病理沉积相关的紊乱和/或疾病，必须开发方式和方法干扰β-淀粉样斑形成，能防止Aβ聚集和/或用于解聚已形成的淀粉样沉积物或淀粉样-β聚集体。

因此，考虑到修饰和/或病理淀粉样生物学的严重缺陷，高度需要治疗淀粉样相关疾病的方式和方法。尤其需要有效药物干扰病理淀粉样聚集或能解聚聚集的Aβ。此外，需要诊断方法检测淀粉样斑。

因而，本发明的技术问题是满足本文上述需要的。

因此，本发明涉及能特异识别β-A4/Aβ4肽的2个区域的抗体分子，其中第一个区域包括氨基酸序列AEFRHDSGY(SEQ ID NO：1)或其片断且第二个区域包括氨基酸序列VHHQKLVFFAEDVG(SEQ ID NO：2)或其片断。

在本发明中，术语“抗体分子”涉及完整免疫球蛋白分子，优选IgMs、IgDs、IgEs、IgAs或IgGs，更优选IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4以及部分这种疫球蛋白分子，像Fab-片段或V_L-、V_H-或CDR-区。此外，术语涉及修饰和/或改变的抗体分子，像嵌合和人源化抗体。术语也涉及修饰和/或改变的单克隆或多克隆抗体以及重组或合成产生/合成的抗体。术语也涉及完整抗体以及抗体片段/其部分，像分离的轻和重链Fab、Fab/c、Fv、Fab’、F(ab’)₂。术语“抗体分子”也包括抗体衍生物、生物功能抗体和抗体构建物，像单链Fvs(scFv)或抗体-融合蛋白。本文下面提供关于本发明术语“抗体分子”的更多细节。

根据本发明的术语“特异识别”指抗体分子能与本文所定义β-A4的2个区域的至少2个氨基酸特异相互作用和/或结合。所述术语涉及抗体分子的特异性，即它分辨本文所定义β-A4肽的特定区域的能力，不是β-A4肽的相关区，不是APP-相关蛋白/肽/(不相关)测试肽。因此，特异性可通过本领域已知方法和本文所示和所述方法来实验确定。这些方法包括但不限于蛋白质印迹、ELISA-、RIA-、ECL-、IRMA-测试和肽扫描。这些方法也包括确定K_D-值，如所附例子所示。肽扫描(肽点)测定)常规用于绘制多肽抗原中的线性表位图谱。多肽的一级序列在肽相互重叠的活化纤维素上连续合成。通过抗体测试识别某些肽，测试其检测或识别特定抗原/表位的能力，通过常规显色(具辣根过氧化物酶的二抗和4-氯奈酚和过氧化氢)、化学发光反应或本领域已知类似方法评估。在化学发光反应的情况中，可定量反应。如果抗体与一组重叠肽反应，能推出反应所需氨基酸的最小序列；参见说明性的实施例6和附加表2。

相同测定可揭示反应肽的2个远缘簇，指示识别抗原多肽中的不连续即构象表位(Geysen(1986)，Mol.Immunol.23，709-715)。

除了肽点测定，可完成标准ELISA测定。如附加例子所证明，小六肽可偶联蛋白质并包被免疫板且与待测试抗体反应。评分可通过标准显色(如有辣根过氧化物酶的二抗和有过氧化氢的四甲基联苯胺)完成。一些孔中的反应通过光密度评分，例如在450nm。典型背景(＝阴性反应)可以是0.1OD，典型阳性反应可以是1OD。这意味着阳性/阴性差异(比例)能超过10倍。更多细节在附加例子中给出。另外，下文给出定量方法确定特异性和“特异识别”本文所定义β-A4肽的2个区域的能力。

术语“β-A4肽的2个区域”涉及的2个区域由SEQ ID NOs：1和2中所示氨基酸序列定义，涉及β-A4肽的N-末端氨基酸2到10和12到25。本发明中的术语“β-A4肽”涉及本文上述的Aβ39、Aβ41、Aβ43，优选Aβ40和Aβ42。Aβ42也描述于附加SEQ ID NO：27。注意到术语“β-A4肽的2个区域”也涉及“表位”和/或“抗原决定簇”，包括本文定义的β-A4肽的2个区域或其部分。根据本发明，所述β-A4肽的2个区域在β-A4肽的一级结构中被至少1个氨基酸分开(在氨基酸序列水平上)，优选至少2个氨基酸，更优选至少3个氨基酸，更优选至少4个氨基酸，更优选至少5个氨基酸，更优选至少6个氨基酸，更优选至少9个氨基酸且最优选至少12个氨基酸。如本文所示和附加例子所证明，发明抗体/抗体分子检测/相互作用和/或结合本文定义的β-A4肽的2个区域，其中所述2个区域被至少1个氨基酸分开(在氨基酸序列一级结构水平上)且其中分开所述2个区域/“表位”的序列可包括超过10个氨基酸，优选14个氨基酸，更优选15个氨基酸或16个氨基酸。例如，MSR-3Fab(作为发明的抗体分子)识别检测/相互作用β-A4肽上的2个区域，其中所述第一个区域包括氨基酸3和4(EF)且所述第二个区域包括氨基酸18到23(VFFAED)。因此，待检测/识别区域/表位间的分开序列在一级氨基酸序列结构上长度为13个氨基酸。类似地，MSR#3.4H7 IgG1是获得自MSR-3的最佳和成熟抗体且包括于IgG1-构架中，检测/相互作用/结合β-A4的2个表位/区域，包括本文所定义β-A4的第一个区域位置1到4(DAEF)和第二个区域位置19到24(FFAEDV)。因此，MSR#3.4H7 IgG1识别/检测/相互作用/结合2个表位/区域，它们在一级氨基酸序列水平上被14个氨基酸分开。如附加例子中所详述，亲和力成熟与单价发明的Fab片段转变成全长IgG1抗体可导致肽点、ELISA测定等中检测到的表位/区域的一些扩大。因而，发明的抗体分子能同时和单独识别β-A4肽/Aβ4的2个区域，其中所述区域包括SEQ ID NO：1中所示的氨基酸序列(或其部分)和SEQ IDNO：2中所示的氨基酸序列(或其部分)。然而，由于如本文所详述的可能扩大表位，也检测/识别序列SEQ ID NO：1和2邻近的氨基酸，即另外的氨基酸是待检测/识别的2个区域部分。因此，也认为例如本文所定义Aβ(1-42)的第一个氨基酸即D(天冬氨酸)是待检测/识别的1个表位部分或者检测/识别位于SEQ ID NO：2中所定义区域Aβ(1-42)后的氨基酸。所述另外氨基酸可以是例如在SEQ ID NO：27(βA4/Aβ(1-42))26位上的氨基酸，即S(丝氨酸)。

术语也涉及构象表位或不连续表位，由所述2个区域或其部分组成；也参见Geysen(1986)，在上述引文中。在本发明中，构象表位由2个或多个一级序列中分开的不连续氨基酸序列定义，当多肽折叠成天然蛋白时，这些氨基酸序列在表面集合(Sela，(1969)Science 166，1365和Laver，(1990)Cell 61，553-6)。认为本发明的抗体分子特异结合构象/结构表位/与之相互作用，表位由本文所述β-A4的2个区域或其部分组成和/或包括它们，如本文下面所示。认为本发明“抗体分子”包括对氨基酸延伸同时且独立的双重特异性，氨基酸延伸包含(a)β-A4的氨基酸2到10(或其部分)和(b)氨基酸延伸包含氨基酸12到25(或其部分)(SEQ ID NO：27)。这些延伸的片段或部分包括至少2个氨基酸，更优选至少3个。优选片段或部分在SEQ ID NO：27的第一个区域/延伸即氨基酸序列AEFRHD、EF、EFR、FR、EFRHDSG、EFRHD或HDSG和SEQ ID NO：27的第二个区域/延伸即氨基酸序列HHQKL、LV、LVFFAE、VFFAED VFFA或FFAEDV中。如上所述，所述片段也可包括另外的氨基酸或可以是本文所定义片段部分。特定例子是DAE、DAEF、FRH或RHDSG。

本领域描述了一些特异识别Aβ肽的抗体。获得这些抗体主要通过用Aβ1-40或Aβ1-42或其片段免疫动物，使用标准技术。根据发表的数据，用完整Aβ肽(1-40或1-42)免疫产生的单克隆抗体专一识别Aβ的N-末端附近的表位。此外，例子是抗体BAP-1和BAP-2(Brockhaus，未发表)，它们通过用Aβ1-40免疫小鼠产生并识别较大Aβ肽中的氨基酸4-6；参见附加实施例7、表2和实施例12、表7。识别Aβ中部的抗体通过用较小肽免疫获得。例如，抗体4G8通过用Aβ肽1-24免疫产生且专一识别序列17-24(Kim，(1988)Neuroscience Research Communications 2，121-130)。许多其它单克隆抗体通过用Aβ衍生的片段免疫小鼠产生，识别Aβ1-40和Aβ1-42的C末端的抗体广泛用于通过ELISA、蛋白质印迹和免疫组化分析区别和定量生物液体和组织中的相应Aβ肽(Ida等，(1996)J.Biol.Chem.271，22908-22914；Johnson-Wood等.，(1997)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1994)，1550-1555；Suzuki等.，(1994)，Science 264，1336-1340；Brockhaus(1998)，Neuro Rep.9，1481-1486)。BAP-17是小鼠单克隆抗体，通过用Aβ片段35-40免疫小鼠产生。它特异识别Aβ1-40的C-末端(Brockhaus(1998)Neuroreport 9，1481-1486)。

据信用T-细胞依赖抗原(通常是弱免疫原)免疫需要在抗原呈递细胞的内体中蛋白酶剪切抗原。免疫后体内选择高亲和性抗体通过辅助T细胞接触抗原呈递细胞来驱动。抗原呈递细胞仅呈递短肽而不是尺寸大的多肽。因此，这些细胞有复杂(但熟知)机制以内吞抗原、在内体中降解抗原、用合适的MHC II型分子结合选择肽并将肽-MHC复合体输出到细胞表面。在那里发生抗原被T细胞特异识别，目标是辅助成熟B细胞。接受大部分T细胞帮助的B细胞有最佳机会发展成抗体分泌细胞并增殖。这显示通过蛋白水解来加工抗原是体内产生高亲和性抗体反应的一个重要步骤且可解释N-末端Aβ表位在现有单克隆和多克隆抗体现有技术中的优势，这些抗体由免疫获得。

相反，选择本发明抗体/抗体分子通过Fab表达噬菌体物理粘附抗原来驱动。参与此体外选择过程的抗原没有降解。选择并增殖的噬菌体表达对抗原有最高亲和性的Fab。附加例子中使用的合成文库用于选择根据本发明的特定抗体分子，特别适合避免对单个、连续表位的任何偏性，它们通常发现于获得自免疫B细胞的文库。

注意到现有技术没有描述识别Aβ4的2个单独区域的抗体分子，特异识别不连续/构象表位和/或能同时且独立识别Aβ4的2个区域/表位。

当治疗开始于年轻动物即神经病理开始前，用Aβ1-42接种过度表达突变人APP_V717F(PDAPP小鼠)的转基因小鼠几乎完全防止脑中淀粉样沉积，而在年长动物中观察到已形成斑减少，提示斑的抗体-介导的清除(Schenk等.，(1999)，Nature400，173-177)。通过此免疫过程产生的抗体抗Aβ4的N-末端反应，Aβ4的N-末端涵盖氨基酸3-7周围的表位(Schenk等.，(1999)，在上述引文中；WO 00/72880)。用Aβ1-42主动免疫在不同的阿尔茨海默氏病转基因模型中也减少行为损伤和记忆丧失(Janus等.，(2000)Nature 408，979-982；Morgan等.，(2000)Nature 408，982-985)。随后用外周施用抗体即被动免疫的研究证实抗体在APP转基因小鼠(PDAPP小鼠)中能进入中枢神经***、修饰斑和诱导清除先前存在的淀粉样斑(Bard等.，(2000)Nat.Med.6，916-919；WO 00/72880)。在这些研究中，在体内和活体外有最有效的单克隆抗体(触发外源小胶质细胞中的吞噬作用)识别Aβ4N-末端表位1-5(mab 3D6，IgG2b)或3-6(mab 1OD5，IgG1)。同样，用Aβ1-42免疫后分离自小鼠、兔或猴子的多克隆抗体表现出类似的N-末端表位特异性且也有效触发吞噬作用和体内斑清除。相反，高亲和性结合Aβ1-40或Aβ1-42的C-末端特异抗体不在活体外测定中诱导吞噬作用且在体内不有效(WO 00/72880)。单克隆抗体m266(WO 00/72880)抗Aβ13-28(Aβ的中央结构域)且表位图谱确定抗体特异性涵盖Aβ序列中的氨基酸16-24。此抗体不很好地结合聚集的Aβ和淀粉样沉积物并仅与可溶性(单体)Aβ反应，即性质类似于另一种识别相同表位的熟知且可商业购买的单克隆抗体(4G8；Kim，(1988)Neuroscience Research Communications 2，121-130；商业购买自SignetLaboratories Inc.Dedham，MA USA)。

在体内，近来发现m266抗体在外周施用后显著降低PDAPP小鼠中的Aβ沉积(DeMattos，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98，8850-8855)。然而，与N-末端特异抗体相反，m266在体内不修饰淀粉样斑，因此假设减少脑Aβ负担是通过抗体-诱导CNS和血浆Aβ间平衡的转移，导致外周中获得自脑的Aβ的积聚，稳固地络合m266(DeMattos，(2001)在上述引文中)。

本发明抗体/抗体分子同时(例如本文所述由βA4的N-末端和中央区域形成的结构/构象表位)且单独结合N-末端和中央表位，将N-末端特异抗体和中央表位-特异抗体的性质与(例如在附加实验部分中确证的肽点测定)单个分子中的中央表位特异性抗体结合。本发明所述具有双重表位特异性的抗体被认为在体内更有效，尤其在医学和诊断情况中，例如减少淀粉样斑负担或淀粉样发生或淀粉样沉积物和斑的检测。熟知在Aβ4聚集和淀粉样沉积构象变化发生过程中尽管中央表位在可溶性Aβ4中易接近，它似乎隐藏于聚集或纤维性Aβ4中并反应性较小。中央/中间表位-特异性抗体m266在体内有效的事实说明中和可溶性Aβ4也能是关键参数。由于双重表位特异性，本发明抗体/抗体分子能以类似效率结合纤维性和可溶性Aβ4，从而可与淀粉样斑相互作用以及中和可溶性Aβ4。本文在发明抗体分子中使用的术语“同时且单独结合Aβ4的N-末端和中央/中间表位”涉及本文所述抗体/抗体分子可检测和/或同时结合2种表位，即同时(例如如本文所述，由βA4的N-末端表位(或(a)其部分)和中央表位(或(a)其部分)形成的构型/结构表位)和相同抗体分子，然而它们也能以单独方式检测/结合各定义的表位，如例子中所示肽点分析证明。

直接应用抗体到脑后体内清除PDAPP小鼠中的淀粉样斑不取决于IgG亚型且可包括非Fc-介导的机制，即斑清除中没有活性的小胶质参与(Bacskai，(2001)，《第31届神经科学学会年会摘要》(Abstract Society for Neuroscience 31^st AnnualMeeting)，2001年11月10-15日，圣迭戈)。此观察与Bard(2000)，在上述引文中较早研究中假定的相反。

在另一个研究中，发现抗Aβ1-28和Aβ1-16肽的抗体在体外有效解集Aβ纤维，而对Aβ13-28特异的抗体在此测定中活性小得多(Solomon，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94，4109-4112)。还报导了通过抗Aβ1-28抗体(AMY-33)防止Aβ聚集(Solomon，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，452-455)。在相同研究中，抗Aβ片段8-17的抗体6F/3d稍干扰Zn²⁺-诱导的Aβ聚集，但对由其它聚集诱导剂诱导的自身积聚没有效果。

这些体外测定中多种抗体的功效与它们表位在Aβ聚集中的易接近性相关。N-末端被暴露且N-末端特异抗体明显诱导解聚，而中央区域和C-末端被隐藏且不易接近，因此抗这些表位的抗体的有效性小得多。

关于表位对抗体易接近性的研究显示在聚集的Aβ中N-末端表位被暴露并与BAP-1抗体反应，而中间和中央表位确实保持隐性，即没有观察到4G8抗体的结合。然而在单体Aβ中，2种表位明显且被2种现有技术的抗体同等识别。

相反，在本发明中，惊讶地发现本文所述抗体分子识别2种不连续氨基酸序列，例如Aβ肽上的构象表位。根据本发明的2种“不连续氨基酸序列”指分别形成N-末端和中央/中间表位的所述2种氨基酸序列在β-A4一级结构上被至少2个氨基酸分开，这些氨基酸不是任一表位的部分。

抗体Fab(＝抗原互补位)的结合区域占据约30×30大小的分子表面(Laver，Cell61(1990)，553-556)。这足以接触15到22个氨基酸残基，残基可存在于一些表面环上。由发明抗体分子识别的不连续表位类似一种构象，其中N-末端(残基2到10或其部分)和中间Aβ肽序列(残基12到25或其部分)邻近。仅在此构象内获得最大数量的抗原-抗体接触和最低自由能状态。

在能量计算基础上提示不以线性序列排列而在表位表面上分散的5-6个残基的较小亚群促使大部分结合能量而周围残基仅构成互补阵列(Laver(1990)在上述引文中)。

发明抗体/抗体分子能结合聚集的Aβ并与AD病人脑中的淀粉样斑强烈反应(如附加例子中所证明)。此外，它们能解聚/分解淀粉样积聚。

未被理论约束，认为构象/结构表位(包括本文所述Aβ4的2个区域或其部分)在聚集的Aβ中部分暴露。然而，已知中间/第二个表位/区域的主要部分单独在这些Aβ聚集中不能自由接近(在中间表位-特异抗体4G8和m266反应性差的基础上)。另一方面，鉴于上述考虑，可能中间区域的一个或几个残基是构象表位的组成并结合来自N-末端区域的残基，易为本发明抗体接近，从而显著地促使抗体-Aβ4相互作用的结合能量。因此，有聚集Aβ中构象表位的发明抗体分子的反应性独特并与现有技术中所述α-Aβ4抗体明显不同。而如本文上面所指出，发明抗体/抗体分子的进一步独特特征是它们同时和独立结合/识别β-A4上2个分离表位的能力，如本文和附加例子中所定义。

在发明的一个较佳实施方案中，发明的抗体分子中由所述抗体特异识别的β-A4的至少2个区域形成构象/结构表位或不连续表位；参见Geysen(1986)，在上述引文中；Ghoshal(2001)，J.Neurochem.77，1372-1385；Hochleitner(2000)，J.Imm.164，4156-4161；Laver(1990)，在上述引文中。术语“不连续表位”指发明中非线性表位，从来自多肽链远距离部分的残基中集合。当多肽链折叠成3维结构以形成构象/结构表位时，这些残基集合于表面。本发明提供β-A4内优选、未预期的表位，使发明产生能与这些表位特异相互作用的特异抗体分子。这些发明抗体/抗体分子提供基础用于提高功效、减少副作用的可能性。然而如上所指出，发明的抗体也能单独与各定义的β-A4的2个区域/表位反应，例如在附加例子中记载的肽点测定中。

因此，本发明提供独特工具，可用于体内和体外解聚集合的Aβ纤维和/或能稳定和/或中和单体Aβ的构象表位并从而能防止病理Aβ聚集。

此外，认为发明的抗体在阿尔茨海默氏的脑中淀粉样斑边缘结合Aβ沉积物并有效溶解病理初原纤维和纤维。

在一个较佳实施方案中，发明的抗体分子识别本文所定义Aβ4的2个区域内至少2个连续氨基酸，更优选所述抗体分子识别第一个区域和第二个区域中的氨基酸序列，第一个区域中的氨基酸序列包括氨基酸：AEFRHD、EF、EFR、FR、EFRHDSG、EFRHD或HDSG且第二个区域中的氨基酸序列包括氨基酸：HHQKL、LV、LVFFAE、VFFAED、VFFA或FFAEDV。更多片段或扩大部分包括：DAE、DAEF、FRH或RHDSG。

特别优选的是本发明抗体分子包括由SEQ ID NO：3、5或7所示核酸分子编码的可变V_H-区或SEQ ID NOs：4、6或8所述氨基酸序列显示的可变V_H-区。

SEQ ID NOs：3和4所示序列分别描述发明V_H-区、亲代抗体MSR-3的编码区和氨基酸序列，SEQ ID NOs：5和6的序列分别描述发明V_H-区、亲代抗体MSR-7的编码区和氨基酸序列，SEQ ID NOs：7和8分别描述发明V_H-区、亲代抗体MSR-8的编码区和氨基酸序列。因此，发明也提供抗体分子，包括由SEQ ID NO所示核酸分子编码的V_L-区，SEQ ID NO选自SEQ ID NO：9、11或13，或包括SEQ ID NOs：10、12或14所示氨基酸序列显示的可变V_L-区。SEQ ID NOs：9和10对应于MSR-3的V_L-区，SEQ ID NOs：11和12对应于MSR-7的V_L-区，SEQ ID NOs：13和14对应于MSR-8的V_L-区。

如附加例子所示，亲代抗体MSR-3、-7和-8用于进一步产生最佳化抗体分子，分子具有甚至更好的性质和/或结合亲和性。说明了一些对应和可能的策略度示于附加例子中。

如附加例子所示的最优化策略产生了多种发明的最佳抗体。这些最佳化抗体与它们的亲代抗体共享V_H-区的CDR-3结构域。而原始构架区(如附图1所示)保持相同，在成熟/最佳化抗体分子中，CDR1、CDR2和/或V_L CDR3-区改变。最佳化抗体分子的说明性、修饰序列目的示于附表1。因此，最佳化抗体分子在本发明范围中，它们获得自本文所示MSR-3、-7和-8且能与本文所定义β-A4肽的2个区域特异反应/特异识别。CDR-区可用于产生更多的发明抗体/抗体分子，优选CDR1s，更优选CDR1s和CDR2s，最优选CDR1s、CDR2s和CDR3s，通过本领域已知的CDR-移植方法；参见Jones(1986)，Nature 321，522-515或Riechmann(1988)，Nature 332，323-327。最优选发明抗体/抗体分子以及抗体片段或衍生物获得自本文所示亲代抗体并如上所述与至少1个所述亲代抗体共享V_H-区的CDR-3结构域。如下所示，也认为产生的交叉-克隆抗体是本发明最佳/成熟的抗体/抗体分子。因此，优选抗体分子也包括或也可获得自抗体/抗体分子，特征是任何SEQ ID NOs：32到45中所示V_H-区或可包括任何SEQ ID NOs：60到87所定义CDR3-区。在一个特定实施方案中，本发明最佳化抗体分子分别包括SEQIDNOs：88/89和90/91所示V_H-区和V_L-区或其部分。其部分可以是CDR-区，优选CDR3-区。最佳类型的特别优选抗体包括特征示于SEQ ID NOs：92或93的H-CDR3和/或特征示于SEQ ID NOs：94或95的L-CDR3。

优选发明抗体/抗体分子的特征是它们与β-A4和/或来自所述β-A4的肽特异反应。例如，ELISA测试中的光密度，如附加例子所示可被确定且光密度比例能用于确定亲代或最佳化抗体的特异反应性。因此，发明的优选抗体在ELISA测试中与β-A4反应以达到光密度，在450nm测量时比没有β-A4所测光密度高10倍，即10倍高于背景。光密度测量优选在显色反应开始后几分钟(如1、2、3、4、5、6或7分钟)进行以最优化信号与背景比例。

在一个特定较佳实施方案中，发明的抗体分子包括至少1个由SEQ ID NOs：15、17或19所示核酸分子编码的V_H-区的CDR3或至少1个由SEQ ID NOs：16、18或20所示V_L-区的CDR3氨基酸序列和/或所述抗体分子包括至少1个由SEQ ID NOs：21、23或25所示核酸分子编码的V_H-区的CDR3或至少1个由SEQ ID NOs：22、24或26所示V_H-区的CDR3氨基酸序列。最优选抗体包括至少1个本文所定义V_H-区的CDR3。上文所述CDR3结构域涉及发明的例证性亲代抗体分子MSR-3、-7或-8。然而，如附表1、8或10所示，通过附加例子所示方法可获得的成熟和/或最佳化抗体分子能包括修饰的V_H-、V_L-、CDR1、CDR2和CDR3区。因此，发明的抗体分子优选选自MSR-3、-7和-8或者MSR-3、-7或-8的亲和力-成熟形式。MSR-3、-7和-8的亲和力-成熟形式以及交叉-克隆形式包括抗体分子，抗体分子包含表1或8所示CDR1、CDR2和/或CDR3区或者特征示于任何SEQ ID NOs：15到20、21到26、60到74、75到87、92和93或94和95。发明的抗体最优选包括至少1个CDR，优选CDR1，更优选CDR2，最优选CDR3，如附表1、8所示或如附表10所证明。

注意到亲和力-成熟技术在本领域已知，描述于附加例子和Knappik(2000)，J.Mol.Biol.296，55；Krebs(2000)，J.Imm.Meth.254，67-84；WO 01/87337；WO01/87338；US 6,300,064；EP 96929278.8和下文所引用的更多参考文献。

在发明的一个更佳实施方案中，抗体分子是完整抗体(免疫球蛋白，像IgG1、IgG2、IgG2b、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgD或IgE)、F(ab)-、Fabc-、Fv-、Fab’-、F(ab’)₂-片段、单链抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、二价抗体-构建物、抗体-融合蛋白、交叉克隆抗体或合成抗体。

也认识到免疫球蛋白基因的遗传变体。遗传变体如免疫球蛋白重G链亚类1(IgG1)可包括CH1结构域中的G1m(17)或G1m(3)同种异型标记或者CH3结构域中的G1m(1)或G1m(非-1)同种异型标记。发明的抗体分子也包括修饰或突变抗体，像突变IgG，具有提高或减弱的Fc-受体结合或补体活化。还设想用常规方法产生发明的抗体，例如用肽免疫哺乳动物(优选小鼠)产生特异性抗体，肽包含如本文定义的βA4的2个区域，例如N-末端和中央区/表位包含(a)βA4的氨基酸2到10(或(a)其部分)和(b)氨基酸延伸包含β-A4(SEQ ID No.27)的氨基酸12到25(或(a)其部分)。因此，本领域技术人员可产生抗这一种肽的单克隆抗体，且可筛选得到具有同时和单独结合/与N-末端和中央区/表位反应能力的抗体。在附加例子中提示了相应的筛选方法。

如附加例子所示，发明抗体/抗体分子能容易地和优先地重组构建和表达。发明的抗体分子包括至少1个本文所定义MSR-3、MSR-7或MSR-8亲代抗体或来自所述亲代抗体的亲和力-成熟/最佳化抗体的CDRs，更优选至少2个，优选至少3个，更优选至少4个，更加优选至少5个且最优选至少6个。注意到在发明的重组产生的抗体中也包括6个以上CDRs。本领域技术人员可容易地使用附加例子中给出的信息以推出亲代以及亲和力最佳化抗体的相应CDRs。通过亲代抗体的成熟/最优化获得的最佳化抗体例子示于附表1。发明的成熟/最佳化抗体分子是例如MSR 7.9H7，其特征也由本文所附序列确定，序列包括SEQ ID NOs：88到95且描述MSR 7.9H7的V_H-区(SEQ ID NOs：88和89)、MSR 7.9H7的V_L-区(SEQ ID NOs：90和91)、MSR 7.9H7的H-CDR3(SEQ ID NOs：92和93)以及MSR 7.9H7的L-CDR3(SEQ ID NOs：94和95)。例证性抗体分子7.9H7获得自亲代抗体MSR7且是本发明最佳/成熟抗体分子的特别优选发明例子。此抗体分子可根据本发明进一步修饰，例如以交叉克隆形式，参见下文和附加例子。

如附加例子所证明，发明的抗体也包括交叉克隆抗体，即抗体包括来自一个或多个本文所述亲代或亲和力-最佳化抗体的不同抗体区(如CDR区)。这些交叉克隆抗体可以是一些不同构架中的抗体，其中最优选构架是IgG-构架，甚至更优选在IgG1-、IgG2a或IgG2b-构架中。特别优选所述抗体构架是哺乳动物，最优选人构架。轻和重链上的结构域有相同的一般结构且各结构域包括4个构架区，其序列相对保守，由称为互补决定区(CDR1-3)的3个超变结构域连接。

如本文所用，“人构架区”涉及的构架区与天然产生的人免疫球蛋白的构架区大体相同(约85％或更高，通常90-95％或更高)。抗体的构架区即组成轻和重链的组合构架区用于安置和排列CDRs。CDRs主要用于结合抗原的表位。注意到本文所述的交叉克隆抗体不但存在于优选的(1)抗体构架，而且在免疫球蛋白构架中可引入抗体分子包括来自本文所述的亲代抗体MSR-3、-7或-8或衍生自所述亲代抗体的成熟抗体。优选的构架是IgG1、IgG2a和IgG2b。最优选是人构架和人IgG1构架。

如附加例子所示，能通过本领域已知遗传工程将完整轻链从最佳供体克隆转移到最佳受体克隆。最佳供体克隆的例子是例如L-CDR1(L1)且最佳受体克隆的例子是H-CDR2(H2)。表位特异性可通过结合克隆而保守，克隆具有相同的H-CDR-3区。更多细节在说明性实施例13中给出。

发明的优选交叉克隆抗体分子选自MS-R3.3H1×3.4L9、MS-R#3.4H1×3.4L9、MS-R#3.4H3×3.4L7、MS-R#3.4H3×3.4L9、MS-R#3.4H7×3.4L9、MS-R#3.4H7×3.4L7、MS-R#3.6H5×3.6L1、MS-R#3.6H5×3.6L2、MS-R#3.6.H8×3.6.L2、MS-R#7.2H2×7.2L1、MS-R#7.4H2×7.2L1、MS-R#7.4H2×7.12L2、MS-R#7.9H2×7.2L1(L1)、MS-R#7.9H2×7.12L1、MS-R7.9H2×7.12L2、MS-R#7.9H2×7.12L2(L1+2)、MS-R#7.9H4×7.11.L2、MS-R#7.11H1×7.2L1、MS-R#7.11H1×7.11L1、MS-R#7.11H2×7.2L1(L1)、MS-R#7.11H2×7.9L1(L1)、MS-R#7.11H2×7.12L1或MS-R#8.1H1×8.2L1。

交叉克隆抗体的产生也描述于附加例子中。上述优选交叉克隆抗体/抗体分子是获得自本文所示亲代抗体的最佳/成熟抗体分子，尤其来自MSR-3和MSR-7，另外，交叉克隆抗体分子/抗体的更多特征性CDR-序列和V-区在所附SEQ ID NOs：32、33、46和47(MSR3.6H5×3.6.L2；V_H-，V_L-区)；34、35、48和49(MSR3.6H8×3.6.L2；V_H-，V_L-区)；36、37、50和51(MSR7.4H2×7.2.L1；V_H-，V_L-区)；38、39、52和53(MSR7.9H2×7.12.L2；V_H-，V_L-区)；40、41、54和55(MSR#7.9H4×7.12.L2；V_H-，V_L-区)；42、43、56和57(MSR#7.11H1×7.11.L1；V_H-，V_L-区)；以及44、45、58和59(MSR#7.11H1×7.2.L1；V_H-，V_L-区)中给出。这些特别优选的交叉克隆抗体分子的对应CDR3区描述于SEQ ID NOs：60到87。对于更多MSR抗体分子，V_H-、V_L-、CDR区可从附表8或10和所附序列列表中推出，尤其是SEQ ID NOs：32到95用于MS-R抗体/抗体分子#3.6H5×3.6L2、#3.6H8×3.6L2、#7.4H2×7.2L1、#7.9H2×7.12L2、#7.9H4×7.12L2、#7.11H1×7.11L1、#7.11H1×7.2L1和#7.9H7或SEQ ID NOS：294到413用于MSR-R抗体/抗体分子#3.3H1×3.4L9、#3.4H1×3.4L9、#3.4H3×3.4L7、#3.4H3×3.4L9、#3.4H7×3.4L9、#3.4H7×3.4L7、#3.6H5×3.6L1、#7.2H2×7.2L1、#7.4H2×7.12L2、#7.9H2×7.2L1、#7.9H2×7.12L1、#7.11H2×7.2L1、#7.11H2×7.9L1、#7.11H2×7.12L1或#8.1H1×8.2L1。

因此，除了以上定义的V_H-区，发明的优选抗体分子可包括如SEQ ID Nos：294到323中任一定义的V_H-区。类似地，除了以上定义的V_H-区，SEQ ID Nos：324到353描述优选的V_L-区可包括在发明的抗体分子中。相应的CDR-3区是以上定义的，以及附加的序列示于SEQ ID Nos：354到413。

发明的抗体分子可通过本领域已知重组方法容易地产量生产，参见例如Bentley，Hybridoma 17(1998)，559-567；Racher，Appl.Microbiol.Biotechnol.40(1994)，851-856；Samuelsson，Eur.J.Immunol.26(1996)，3029-3034。

在理论上，在可溶性β-A4(单体/寡聚)中，N-末端和中间表位对于抗体相互作用易接近且本发明抗体分子能单独结合N-末端或中间表位，但在这些情况下不获得最大亲和力。然而，更可能通过同时结合2种表位获得与抗体互补位的最佳接触，即类似于和聚集的β-A4相互作用。因此，本发明抗体是独特的抗Aβ抗体，因为它们结合聚集的β-A4(通过与N-末端和中间表位相互作用)且同时能稳定和中和可溶性β-A4中的构象表位。这些抗体与现有技术的抗体不同。

最优选本发明抗体分子与Aβ或其定义片段有亲和力，K_D值低于2000nM，优选低于100nM，更优选低于10nM，最优选低于1nM。测量这种亲和力可通过例子所述和本领域已知方法完成。这些方法包括但不限于BIACORE^TM-测定(www.biacore.com；Malmquist(1999)，Biochem.Soc.Trans 27，335-340)和用标记抗体或标记Aβ的固相测定。

发明的抗体分子优选能修饰/与体外(死后)脑切片中的淀粉样斑反应/结合切片来自患淀粉样-相关疾病的患者，像阿尔茨海默氏病。发明抗体/抗体分子优选防止体内以及体外测定中的Aβ聚集，如附加例子所述。类似地，本发明的抗体分子优选在例子所示体内和/或体外测定中解聚Aβ聚集。发明抗体/抗体分子的能力用于医学情况，尤其用于本文以下所述药物组合物。

发明也提供编码本文所定义发明抗体分子的核酸分子。

所述核酸分子可以是天然核酸分子以及重组核酸分子。因此，发明的核酸分子可以是天然来源、合成或半合成。它可包括DNA、RNA以及PNA且它可以是它们的杂合体。

对于本领域技术人员显然的是调节序列能加入发明的核酸分子。例如，可使用启动子、转录增强子和/或能诱导表达发明多核苷酸的序列。合适的诱导***是例如四环素-调节的基因表达，如Gossen和Bujard(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89(1992)，5547-5551)和Gossen等.(Trends Biotech.12(1994)，58-62)所述，或是***-诱导型基因表达***，如Crook(1989)EMBO J.8，513-519所述。

此外，进一步目的是核酸分子可包含例如硫酯键和/或核苷酸类似物。所述修饰可用于稳定核酸分子抗细胞中的内和/或外切核酸酶。所述核酸分子能由适当载体转录，载体所含嵌合基因能在细胞中转录所述核酸分子。在此方面，也要理解的是发明的多核苷酸可用于“基因寻靶”或“基因治疗”方法。在另一个实施方案中，标记所述核酸分子。检测核酸分子的方法在本领域熟知，如DNA和RNA印迹、PCR或引物延伸。此实施例可用于基因治疗期间确定成功引入发明的核酸分子的筛选方法。

发明的核酸分子可以是重组产生的嵌合核酸分子，包括单独或组合的任何上述核酸分子。发明的核酸分子优选是载体的一部分。

因此本发明也涉及包含本发明核酸分子的载体。

本发明的载体可以是例如质粒、粘粒、病毒、噬菌体或另外使用的载体如常规用于遗传工程的，且可包括更多基因如标记基因，能在合适的宿主细胞和合适的条件下选择所述载体。

另外，除了发明的核酸序列，本发明的载体可包括表达控制元件，能在合适的宿主中适当表达编码区。这种控制元件对技术人员已知并可包括启动子、剪接盒、翻译起始密码子、翻译和***位点用于将***引入载体。

发明的核酸分子优选可操作连接于所述表达控制序列，能在真核或原核细胞中表达。

确保在真核和原核细胞中表达的控制元件对本领域技术人员熟知。如上文所述，它们通常包括确保转录起始的调节序列和确保转录终止及稳定转录物的任选多腺苷酸信号。其它调节元件可包括转录以及翻译增强子和/或天然相联或异源启动子区域。允许在例如哺乳动物宿主细胞中表达的可能调节元件包括CMV-HSV胸苷激酶启动子、SV40、RSV-启动子(劳氏肉瘤病毒)、人延伸因子1α-启动子、糖皮质激素-诱导型MMTV-启动子(莫洛尼小鼠肿瘤病毒)、金属硫蛋白-或四环素诱导型启动子、或增强子，像CMV增强子或SV40-增强子。对于在神经细胞中表达，可使用神经丝-、PGDF-、NSE-、PrP-或thy-1-启动子。所述启动子在本领域已知，描述于Charron(1995)，J.Biol.Chem.270，25739-25745。对于在原核细胞中表达，描述了多种启动子，包括例如tac-lac-启动子或trp启动子。除了用于转录起始的元件，这些调节元件也可包括多核苷酸下游的转录终止信号，如SV40-poly-A位点或tk-poly-A位点。在此方面，合适的表达载体在本领域已知，如Okayama-Berg cDNA表达载体pcDV1(Pharmacia)、pRc/CMV、pcDNA1、pcDNA3(In-vitrogene)、pSPORT1(GIBCO BRL)、pX(Pagano(1992)Science 255，1144-1147)，酵母双杂交载体如pEG202和dpJG4-5(Gyuris(1995)Cell75，791-803)，或原核表达载体如lambda gtll或pGEX(Amersham-Pharmacia)。除了本发明的核酸分子，载体可进一步包括编码分泌信号的核酸序列。这些序列对于本领域技术人员熟知。此外，取决于所用表达***，能指导发明肽到细胞区室的前导序列可加入发明核酸分子的编码序列并在本领域熟知。前导序列在翻译、起始和终止序列的适当阶段集合，优选前导序列能指导翻译蛋白或其蛋白质分泌到周质空间或胞外基质。任选地，异源序列可编码融合蛋白，包括赋予所需特征的C-或N-末端鉴定肽，如稳定或简化表达重组产物的纯化。一旦载体掺入到适当宿主中，宿主维持于适合高水平表达核酸序列的条件下维持，任意地，接着能收集和纯化发明的抗体分子或其片断。因此发明也涉及宿主/宿主细胞，它们包括本文定义的载体。这种宿主可用于加工以获得发明的抗体/抗体分子以及用于医学/药物配置。所述宿主细胞也可包括转导或转染的神经元细胞，像神经元干细胞，优选成体神经元干细胞。这种宿主细胞能用于移植治疗。

另外，本发明载体也可以是表达、基因转移或基因靶向载体。基因治疗是在通过活体外或体内技术将治疗基因导入细胞的基础上，它是基因转移最重要应用之一。用“神经抗体”技术产生了表达抗神经生长因子的中和抗体的转基因小鼠；Capsoni，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(2000)，6826-6831和Biocca，Embo J.9(1990)，101-108。用于体外或体内基因治疗的合适载体、方法或基因传递***描述于文献且对本领域技术人员已知；参见例如Giordano，Nature Medicine 2(1996)，534-539；Schaper，Circ.Res.79(1996)，911-919；Anderson，Science 256(1992)，808-813，Isner，Lancet 348(1996)，370-374；Muhlhauser，Circ.Res.77(1995)，1077-1086；Onodua，Blood 91(1998)，30-36；Verzeletti，Hum.Gene Ther.9(1998)，2243-2251；Verma，Nature 389(1997)，239-242；Anderson，Nature 392(Supp.1998)，25-30；Wang，Gene Therapy 4(1997)，393-400；Wang，NatureMedicine 2(1996)，714-716；WO 94/29469；WO 97/00957；US 5,580,859；US5,589,466；US 4,394,448或Schaper，《生物技术的当前观点7》(Current Opinionin Biotechnology 7)(1996)，635-640和本文所引用参考文献。所述载体和/或基因传递***也描述于神经组织/细胞(参见

J.Virology 71(1997)6641-6649)或下丘脑(参见Geddes，Front Neuroendocrinol.20(1999)，296-316或Geddes，Nat.Med.3(1997)，1402-1404)中的基因治疗方法。用于神经细胞/组织的更多合适基因治疗构建物在本领域已知，例如Meier(1999)，J.Neuropathol.Exp.Neurol.58，1099-1110。发明的核酸分子和载体可设计用于指导引入或经脂质体、病毒载体(如腺病毒、逆转录病毒)、电穿孔、弹导(如基因抢)或其它传递***导入细胞。另外，杆状病毒***能用作发明核酸分子的真核表达***。导入和基因治疗方法应优选表达发明的功能性抗体分子，因而所述表达抗体分子特别用于治疗、改善和/或防止神经疾病，疾病与异常淀粉样合成、集合和/或聚集相关，像阿尔茨海默氏病等。

因此，本发明的核酸分子和/或上述本发明载体/宿主可特别用作药物组合物。所述药物组合物能用于基因治疗方法。在此方面，本发明的核酸分子和/或载体可用于调节、改变和/或修饰(细胞)表达和/或浓缩本发明抗体分子或其片段。

对于基因治疗应用，编码本发明肽或其片段的核酸可克隆到基因传递***如病毒，病毒用于感染或在感染细胞或生物体中改善疾病或赋予治疗效果。

本发明也涉及用发明载体转染或转化的宿主细胞或携带发明载体的非人宿主，即宿主细胞或宿主用根据发明的核酸分子或含这种核酸分子的载体遗传修饰。术语“遗传修饰”指除了其天然基因组，宿主细胞或宿主包括根据发明的核酸分子或载体，它被导入细胞或宿主或者导入其先驱物/亲代之一。核酸分子或载体可存在于遗传修饰的宿主细胞或宿主，作为基因组外的单独分子且优选作为能复制的分子或者可稳定整合到宿主细胞或宿主的基因组中。

本发明的宿主细胞可以是任何原核或真核细胞。合适的原核细胞一般用于克隆像大肠杆菌或枯草芽孢杆菌。此外，真核细胞包括例如真菌或动物细胞。合适的真菌细胞的例子是酵母细胞，优选酵母属且最优选酿酒酵母种。合适的动物细胞是例如昆虫细胞、脊椎动物细胞，优选哺乳动物细胞如HEK293、NSO、CHO、MDCK、U2-OSHela、NIH3T3、MOLT-4、Jurkat、PC-12、PC-3、IMR、NT2N、Sk-n-sh、CaSki、C33A。这些宿主细胞如CHO-细胞可提供翻译后修饰给发明的抗体分子，包括去除前导肽、折叠和集合H(重)和L(轻)链、以正确侧向糖基化分子和分泌功能分子。本领域已知的更多合适细胞系获得自细胞系存放处，像美国模式培养物保藏所(ATCC)。根据本发明，更认为原代细胞/细胞培养物可作为宿主细胞发挥功能。所述细胞特定获得自昆虫(像果蝇或蠊属种的昆虫)或哺乳动物(像人、猪、小鼠或大鼠)。所述宿主细胞也可包括来自和/或获得自细胞系如成神经细胞瘤细胞系的细胞。上述原代细胞在本领域熟知并包括原代星形胶质细胞、(混合的)脊髓培养物或海马培养物。

在一个更佳实施方案中，用本发明载体转化的宿主细胞是神经元细胞、神经元干细胞(如成体神经元干细胞)、脑细胞或从其中衍生的细胞(系)。然而，含本发明核酸分子的CHO-细胞可特别用作宿主。这种细胞能在表达分子即本发明的抗体分子上提供正确的二级修饰。这些修饰包括糖基化和磷酸化。

宿主可以是非人的哺乳动物，最优选小鼠、大鼠、绵羊、小牛、狗、猴子或猿。所述哺乳动物对于发展治疗也许是不可缺少的，优选治疗上述神经性和/或神经变性疾病。此外，本发明的宿主可特别用于产生发明的抗体分子(或其片段)。认为所述抗体分子(或其片段)分离自所述宿主。认为本文所述核酸分子和/或载体掺入序列中用于转基因表达。将发明的核酸分子作为转基因导入非人宿主且它们随后的表达可用于产生发明的抗体。例如，在转基因动物的牛奶中表达这种转基因提供了获得定量的发明抗体分子的方法；参见US 5,741,957、US 5,304,489或US 5,849,992。此方面有用的转基因包括发明的核酸分子，例如本文所述抗体分子轻和重链的编码序列，可操作连接于乳腺特异基因的启动子和/或增强子结构，像酪蛋白或β-乳球蛋白。

发明也提供方法用于制备发明的抗体分子，包括在能合成所述抗体分子的条件下培养本文所述宿主细胞并从所述培养物中回收所述抗体分子。

发明也涉及的组合物包括发明抗体分子或由上文所述方法产生的、编码发明抗体分子的核酸分子，载体包括所述核酸分子或上文定义的宿主细胞以及任选的更多单独或组合分子，如能干扰淀粉样斑形成或能解聚已形成淀粉样斑的分子。如本文所用，术语“组合物”包括至少1个发明的化合物。这种组合物优选是药物或诊断组合物。

组合物可以是固体或液体形式，可以是粉末、片剂、溶液或气雾剂形式。所述组合物可包括一个或多个发明的抗体/抗体分子或发明的核酸分子、载体或宿主。也认为所述组合物包括至少2个发明的抗体分子或编码所述抗体分子的核酸分子，优选3个，更优选4个，最优选5个。所述组合物也可包括最佳的发明抗体/抗体分子，它们通过下文和附加例子所述方法获得。

优选所述药物组合物任选包括药学上可接受载体和/或稀释剂。本文所述药物组合物可特别用于治疗神经性和/或神经变性疾病。所述疾病包括但不限于阿尔茨海默氏病、肌萎缩侧索硬化(ALS)、淀粉样变荷兰型的遗传性脑出血、唐氏综合症、HIV-相关痴呆、帕金森氏病和与衰老相关的神经元疾病。认为发明的药物组合物是淀粉样斑形成的有效抑制剂或解聚淀粉样斑的有效刺激剂。因此，本发明提供含发明化合物的药物组合物用于治疗与病理APP蛋白酶解和/或淀粉样斑形成相关的疾病/紊乱。

合适的药物载体、赋形剂和/或稀释剂的例子在本领域熟知并包括磷酸缓冲盐水溶液、水、乳剂如油/水乳剂、多种类型的润湿剂、无菌溶液等。包括这种载体的组合物可通过熟知的常规方法制成。这些药物组合物能以合适的剂量施用给受试者。施用合适的组合物可通过不同方式实现，如静脉内、腹膜内、皮下、肌肉内、局部、皮内、鼻内或支气管内施用。所述施用特别优选通过注射和/或传递到脑动脉中的位点或直接到脑组织中完成。发明组合物也可直接施用到靶位点，如通过弹导传递到外部或内部靶位点，像脑。剂量方案由参与的医师和临床因素确定。如医学领域熟知的，任何病人的剂量取决于许多因素，包括病人体型、体表面积、年龄、待施用的特定化合物、性别、施用时间和途径、总体健康和其它同时施用的药物。蛋白质药物活性物质的存在量可在1ng和10mg/kg体重每剂量间；然而考虑低于或高于此示范范围的剂量，尤其考虑上述因素。如果方案是连续输注，范围也应在1μg到10mg单位每千克体重每分钟。

进展能通过定期评估监控。发明组合物可局部或全身施用。注意到外周施用的抗体能进入中枢神经***，参见Bard(2000)，Nature Med.6，916-919。肠胃外施用制品包括无菌水或非水溶液、悬浮液和乳剂。非水溶剂的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水、醇/水溶液、乳剂或悬浮液，包括盐水和缓冲基质。肠胃外载体包括氯化钠溶液、林格右旋糖、右旋糖和氯化钠、乳酸盐林格溶液或不挥发性油。静脉内载体包括流体和营养补充物、电解液补充物(如以林格右旋糖为基础)等。防腐剂和其它添加剂也可存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。此外，发明的药物组合物可包括更多试剂，取决于药物组合物的预期用途。所述试剂可以是作用于中枢神经***的药物，像神经保护因子、胆碱脂酶抑制剂、M1毒蝇碱受体的拮抗剂、激素、抗氧化剂、炎症抑制剂等。所述药物组合物特别优选包括更多试剂，如神经递质和/或神经递质的取代分子、维生素E或α-硫辛酸。

药物组合物以及本发明方法或所述发明的用途能用于治疗所有类型的疾病，这些疾病迄今未知或涉及或取决于病理APP聚集或病理APP加工。它们可特别用于治疗阿尔茨海默氏病和其它疾病，其中淀粉样-β的胞外沉积物似乎发挥作用。它们需要用于人，尽管动物治疗也包括在本文所述方法、用途和组合物中。

在发明的一个较佳实施方案中，上文所述本发明组合物是诊断组合物，进一步包括任选的合适检测方法。诊断组合物包括至少1个上述发明化合物。

所述诊断组合物可包括发明的化合物，特别且优选本发明以可溶形式/液相的抗体分子，但也认为所述化合物结合/附着和/或连接固体支持物。

固体支持物能用于结合本文定义的诊断组合物使用或本发明化合物可直接结合所述固体支持物。这些支持物在本领域熟知并包括商业购买的柱材料、聚苯乙烯珠、胶乳珠、磁性珠、胶态金属颗粒、玻璃和/或硅片和表面、硝化纤维条、膜、薄片、duracytes、孔和反应槽壁、塑料管等。发明化合物，特别是本发明抗体可结合许多不同载体。熟知载体的例子包括玻璃、聚苯乙烯、聚氯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、葡聚糖、尼龙、直链淀粉、天然和修饰的纤维素、聚丙烯酰胺、琼脂糖和磁铁矿。为了发明目的，载体性质可以是可溶或不溶。上面鉴定了适当标记和标记方法且进一步在下文描述。固定/固相化所述发明化合物的合适方法熟知，包括但不限于离子、疏水、共价相互作用等。

发明的诊断组合物特别优选用于检测和/或定量APP和/或APP-加工产物(像淀粉样-β)，或用于检测和/或定量病理和/或(遗传)修饰的APP-切割面。

如附加例子所示，本发明化合物特别是发明的抗体分子，特别用作诊断试剂通过间接免疫荧光检测阿尔茨海默氏病患者脑切片中的真人淀粉样斑。

用于诊断组合物的所述本发明化合物优选可检测标记。多种技术可用于标记生物分子，对本领域技术人员熟知并认为在本发明范围内。这种技术例如描述于Tijssen，《酶免疫测定的实践和理论》(Practice and theory of enzyme immuno assays)，Burden，RH和von Knippenburg(主编)，15卷(1985)，《分子生物学的基本方法》(Basic methods in molecular biology)；Davis LG，Dibmer MD；Battey Elsevier(1990)，Mayer等.，(主编)《细胞和分子生物学的免疫化学方法》(Immunochemicalmethods in cell and molecular biology)Academic Press，London(1987)，或丛书《酶学方法》(Methods in Enzymology)，Academic Press，Inc.。

有许多不同标记和标记方法对本领域普通技术人员已知。能用于本发明的标记类型的例子包括酶、放射性同位素、胶态金属、荧光化合物、化学发光化合物和生物发光化合物。

常用标记包括荧光染料(像荧光素、若丹明、德克萨斯红等)、酶(像辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、碱性磷酸酶)、放射性同位素(像³²P或¹²⁵I)、生物素、洋地黄毒苷、胶态金属、化学-或生物发光化合物(像二氧杂环丁烷、荧光醇或吖啶)。标记过程在本领域熟知，像酶或生物素酰基的共价偶联、碘化、磷酸化、生物素酰化等。

检测方法包括但不限于放射自显影、荧光显微镜、直接和间接酶反应等。常用检测测定包括放射性同位素或非放射性同位素方法。这些包括蛋白质印迹、重叠测定、RIA(放射免疫测定)和IRMA(免疫放射测定)、EIA(酶免疫测定)、ELISA(酶联免疫吸附测定)、FIA(荧光免疫测定)和CLIA(化学发光免疫测定)。

此外，本发明提供发明的抗体分子的用途或由本发明方法产生的抗体分子，使用发明的核酸分子、载体或宿主以制备药物或诊断组合物用于预防、治疗和/或诊断与淀粉样生成和/或淀粉样斑形成相关的疾病。另外优选的是，本文所述化合物(尤其是发明的抗体分子)用于预防和/或治疗与改良成异常App-/或淀粉样生成相关的神经病状。抗体分子如以(基因工程的)免疫球蛋白形式，像IgG构架尤其是IgG1构架中的抗体，或以嵌合抗体、双特异性抗体、单链Fvs(ScFvs)或双特异性scFvs等的形式用于制备药物组合物。如附加例子中所证明，抗体分子也用于诊断情况，由于发明的抗体分子/检测Aβ4和/或淀粉样沉积物/斑特异地相互作用。

因此，本发明化合物的用途是使用药物组合物制品用于神经性疾病，这需要改善例如分解β-淀粉样斑淀粉样(斑)清除或抗β-淀粉样斑形成的被动免疫。如附加例子所示，发明的抗体分子特别用于防止Aβ聚集和解聚已形成的淀粉样集合。因此，发明的抗体用于减少病理性淀粉样沉积物/斑，用于清除淀粉性斑/斑前体，以及用于神经元保护。尤其认为发明的抗体分子用于体内预防淀粉样斑，以及体内清除先存在的淀粉样斑/沉积物。此外，发明的抗体分子可用于抗Aβ4的被动免疫方法。通过包含Fc部分的本发明医用抗体可获得Aβ4/Aβ4沉积物的清除。所述抗体的Fc部分特别用于Fc-受体介导的免疫应答，例如吸引巨噬细胞(吞噬细胞和/或小胶质细胞)和/或辅助细胞。对于Fc部分相关的免疫应答的介导，发明的抗体分子优选在(人)IgG1-构架中。如本文所讨论，用发明的抗体分子、编码相同或其部分的核酸分子、发明的载体或本发明的宿主细胞治疗的优选受试者是人。也设想了其它构架像抗体分子的用于发明的IgG2a-或IgG2b-构架。

特别设想了在小鼠配置中以IgG2a和IgG2b形式的免疫球蛋白构架，例如科学使用发明的抗体分子，如对表达(人)野生型或突变的App、App-片段和/或Aβ4的转基因小鼠的测试。

上述与淀粉样生成和/或淀粉样斑形成相关的疾病包括但不限于痴呆、阿尔茨海默氏病、运动神经病、帕金森氏病、ALS(肌萎缩侧索硬化)、痒病、HIV-相关痴呆以及克-雅氏病、淀粉样变病荷兰型的遗传性脑出血或唐氏综合症和与衰老相关的神经元疾病。发明的抗体分子和本文提供的组合物也用于。改善和/或预防与淀粉样生成和/或淀粉样斑形成有关的炎性过程。

因此，本发明也提供方法治疗、防止和/或延迟神经性和/或神经变性疾病，包括施用有效量的发明抗体分子、发明核酸分子和/或上文定义组合物给受试者的步骤，受试验者患所述神经性和/或神经变性疾病和/或受试者易患所述神经性和/或神经变性疾病。

而在另一个实施方案中，本发明提供的试剂盒包括至少1个抗体分子、至少1个核酸分子、至少1个载体或至少1个发明的宿主。有利的是，本发明试剂盒进一步包括任选缓冲液、贮存溶液和/或剩余试剂或进行医学、科学或诊断测定和目标所需材料。此外，部分发明试剂盒能单独包装于小瓶或瓶或组合容器或多容器单位。

本发明试剂盒可有利地用于完成发明方法并能作为研究工具或医学工具用于本文所指多种应用，如诊断试剂盒。另外，发明的试剂盒可包含适一科学、医学和/或诊断目的的检测方法。制造试剂盒优选遵循本领域技术人员已知的标准过程。

发明也提供方法用于最优化本工文定义的抗体分子，包括步骤：

(a)构建多种获得自抗体的Fab抗体片段的文库，包含至少1个由SEQ ID NOs：21、23或25所示核酸分子编码的V_H-区的CDR3或至少1个由SEQ ID NOs：22、24或26所示V_H-区的CDR3氨基酸序列。

(b)通过抗Aβ/Aβ4淘冼测试所得Fab最优化文库；

(c)鉴定最佳克隆；

(d)表达选择的最佳克隆。

最优化发明的抗体/抗体分子也在附加例子中证明并可包括选择对本文所定义β-A4的一个或两个区域/表位的亲和性较高或选择表达改进等。在一个实施方案中，对β-A4的一个或两个区域/表位的所述选择包括选择对(a)含β-A4的氨基酸2到10(或(a)其部分)的氨基酸延伸和/或(b)含β-A4的氨基酸12到25(或(a)其部分)(SEQ ID No.27)的氨基酸延伸的高亲和力。

本领域技术人员能容易地用本发明讲授完成发明方法。抗体的最优化方案在本领域已知。这些最优化方案包括本文所示和所述的CDR步行诱变并描述于Yang(1995)，J.Mol.Biol.25，392-403；Schier(1996)，J.Mol.Biol.263，551-567；Barbas(1996)，Trends.Biotech 14，230-34或Wu(1998)，PNAS 95，6037-6042；Schier(1996)，Human Antibodies Hybridomas 7，97；Moore(1997)，J.Mol.Biol.272，336。

“淘洗”-技术也在本领域已知，参见例如Kay(1993)，Gene 128，59-65。此外，出版物像Borrebaeck(1995)，《抗体工程》“Antibody Engineering”，OxfordUniversity，229-266；McCafferty(1996)，《抗体工程》，Oxford University Press；Kay(1996)，《实验室手册》(A Laboratory Manual)，Academic Press提供最优化方案，可根据本发明修改。

最优化方法可进一步包括步骤，其中最佳克隆进一步通过盒诱变来最优化，如附加例子所示。

最优化本文所述抗体分子的方法进一步示于附加例子，亲代抗体/抗体分子的亲和力成熟能特异识别β-A4肽/Aβ4/Aβ4/Aβ4的2个区域。

上文所述方法步骤(b)中的所述Aβ/Aβ4优选是聚集的Aβ/Aβ4。可完成所述淘洗(如附加例子所述)而增加结合的严紧性。增加严紧性可通过减少Aβ/Aβ4浓度或提高(测定)温度。通过淘洗测试最佳文库对技术人员已知且描述于Kay(1993)，在上述引文中。步骤(c)中的鉴定根据最低K_D-值排列来完成。

所述步骤(c)中的鉴定最优选通过Koff-排列完成。Koff-排列对技术人员已知且描述于Schier(1996)，在上述引文中；Schier(1996)，J.Mol.Biol.255，28-43或Duenas(1996)，Mol.Immunol.33，279-286。此外，Koff-排列描述于附加例子。可如附加例子所述测定非标准条件的常数。

如上文所述，可表达鉴定的克隆以进一步评估。表达能用附加例子所示的已知方法完成。表达可产生表达的Fab-片段、scFvs，双特异性免疫球蛋白、双特异性抗体分子、Fab-和/或Fv融合蛋白或完整抗体像IgGs，特别是IgG1。

最佳化抗体特别是最佳化Fabs或最佳化IgGs，优选IgG1s，可通过附加例子所示方法测试。这种方法包括但不限于测试结合亲和力、确定K_D-值、肽点分析、ELISA-测定、RIA测定、CLIA-测定、(免疫)组织学研究(例如染色淀粉样斑)、解聚测定或抗体-依赖的β-A4吞噬。

在本发明又一个实施方案中，提供一种方法其中通过交叉克隆产生最佳化抗体。此方法也描述于附加例子并包括单独结合最佳化CDR-区的步骤，例如通过单独结合来自成熟克隆的最佳化H-CDR2和L-CDR2，克隆有H-CDR3，优选相同的H-CDR3。

在一个较佳实施方案中，发明涉及方法用于制备药物组合物，包括步骤：

(a)根据本文所述和附加例子所示方法最优化抗体；

(b)用生理上可接受载体制成最佳化抗体/抗体分子，如上文所述。

因此，发明也提供由本文所述方法制备的药物组合物并包括更多最佳化抗体分子，抗体分子能特异识别β-A4肽/Aβ4/Aβ4/Aβ4的2个区域，如上文所述。

本文引用的示范序列：

SEQ ID NO：1

AEFRHDSGY

β-A4肽的第一个区域，“N-末端区域/表位”

SEQ ID NO：2

VHHQKLVFFAEDVG

β-A4肽的第二个区域，“中央/蹭区域/表位”

SEQ ID NO：3

MS-Roche#3的VH-区(核酸序列)

CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC(SEQ ID NO：3)

SEQ ID NO：4

MS-Roche#3的VH-区(氨基酸序列)

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：4)

SEQ ID NO：5

MS-Roche#7的VH-区(核酸序列)

CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC(SEQ ID NO：5)

SEQ ID NO：6

MS-Roche#7的VH-区(氨基酸序列)

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：6)

SEQ ID NO：7

MS-Roche#8的VH-区(核酸序列)

CAGGTGCAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCGATTAGCGGTAGCGGCGGCAGCACCTATTATGCGGATAGCGTGAAAGGCCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTCTTTCTCGTGGTTATAATGGTTATTATCATAAGTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCAGC(SEQ ID NO：7)

SEQ ID NO：8

MS-Roche#8的VH-区(氨基酸序列)

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLLSRGYNGYYHKFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：8)

SEQ ID NO：9

MS-Roche#3的VL-区(核酸序列)

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGGTTTATAATCCTCCTGTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：9)

SEQ ID NO：10

MS-Roche#3的VL-区(氨基酸序列)

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQVYNPPVTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：10)

SEQ ID NO：11

MS-Roche#7的VL-区(核酸序列)

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCTTTCAGCTTTATTCTGATCCTTTTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO.11)

SEQ ID NO：12

MS-Roche#7的VL-区(氨基酸序列)

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCFQLYSDPFTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：12)

SEQ ID NO：13

MS-Roche#8的VL-区(核酸序列)

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGAGCGTGAGCAGCAGCTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGCTTTCTTCTTTTCCTCCTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：13)

SEQ ID NO：14

MS-Roche#8的VL-区(氨基酸序列)

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQLSSFPPTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：14)

SEQ ID NO：15

MSR-3V_L-区的CDR3(核酸序列)

CAG CAG GTT TAT AAT CCT CCT GTT

(SEQ ID NO：15)

SEQ ID NO：16

MSR-3V_L-区的CDR3(氨基酸序列)

QQVYNPPV(SEQ ID NO：16)

SEQ ID NO：17

MSR-7V_L-区的CDR3(核酸序列)

TTT CAG CTT TAT TCT GAT CCT TTT

(SEQ ID NO：17)

SEQ ID NO：18

MSR-7V_L-区的CDR3(氨基酸序列)

FQLYSDPF(SEQ ID NO.18)

SEQ ID NO：19

MSR-8V_L-区的CDR3(核酸序列)

CAG CAG CTT TCT TCT TTT CCT CCT

(SEQ ID NO.19)

SEQ ID NO：20

MSR-8V_L-区的CDR3(氨基酸序列)

QQLSSFPP(SEQ ID NO：20)

SEQ ID NO：21

MSR-3V_H-区的CDR(核酸序列)

CTT ACT CAT TAT GCT CGT TAT TAT CGT TAT TTT GAT GTT

(SEQ ID NO：21)

SEQ ID NO：22

MSR-3V_H-区的CDR(氨基酸序列)

LTHYARYYRYFDV(SEQ ID NO：22)

SEQ ID NO：23

MSR-7V_H-区的CDR(核酸序列)

GGT AAG GGT AAT ACT CAT AAG CCT TAT GGT TAT GTTCGT TAT TTT

(SEQ ID NO：23)

SEQ ID NO：24

MSR-7V_H-区的CDR(氨基酸序列)

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：24)

SEQ ID NO：25

MSR-8V_H-区的CDR(核酸序列)

CTT CTT TCT CGT GGT TAT AAT GGT TAT TAT CAT AAGTTT GAT GTT

(SEQ ID NO.25)

SEQ ID NO：26

MSR-8V_H-区的CDR(氨基酸序列)

LLSRGYNGYYHKFDV(SEQ ID NO：26)

SEQ ID NO：27Aβ4(氨基酸1到42)

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA(SEQ ID NO：27)

SEQ ID NO：28引物

5’-GTGGTGGTTCCGATATC-3′(SEQ ID NO：28)

SEQ ID NO：29引物

5′-AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAGAACGGTTA-3′(SEQ ID NO：29)

SEQ ID NO：30引物

5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′(SEQ ID NO：30)

SEQ ID NO：31引物

5′-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3′(SEQ ID NO：31)

SEQ ID NO：32MS-Roche#3.6H5×3.6L2的VH；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTTCTGAGTCTGGTAAGACTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQID NO：32)

SEQ ID NO.33：MS-Roche#3.6H5×3.6L2的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISESGKTKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：33)

SEQ ID NO：34MS-Roche#3.6H8×3.6L2的VH区；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTTCTGAGTATTCTAAGTTTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTCTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQID NO：34)

SEQ ID NO：35MS-Roche#3.6H8×3.6L2的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISEYSKFKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARLTHYARYYRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：35)

SEQ ID NO：36MS-Roche#7.4H2×7.2L1的VH区；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATTATAATGGTGCTCGTATTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQ ID NO：36)

SEQ ID NO：37MS-Roche#7.4H2×7.2L1的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINYNGARIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：37)

SEQ ID NO：38MS-Roche#7.9H2×7.12L2的VH区；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTGATGGTAATCGTAAGTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQ ID NO：38)

SEQ ID NO：39MS-Roche#7.9H2×7.12L2的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINADGNRKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：39)

SEQ ID NO：40MS-Roche#7.9H4×7.12L2的VH区；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTGTTGGTATGAAGAAGTTTTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQ ID NO：40)

SEQ ID NO：41MS-Roche#7.9H4×7.12L2的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINAVGMKKFYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：41)

SEQ ID NO：42MS-Roche#7.11H1×7.11L1的VH区；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTATTAATGCTGCTGGTTTTCGTACTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQ ID NO：42)

SEQ ID NO.43MS-Roche#7.11H1×7.11L1的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGINAAGFRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：43)

SEQ ID NO：44MS-Roche#7.11H1×7.2L1的VH区；DNA；人工序列

CAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGGCAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGGTGAGCGGTATTAATGCTGCTGGTTTTCGTACTTATTATGCTGATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA(SEQ ID NO：44)

SEQ ID NO：45MS-Roche#7.11H1×7.2L1的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSGINAAGFRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：45)

SEQ ID NO：46MS-Roche#3.6H5×3.6L2的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTTTCTTTCTCGTTATTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGACTTATAATTATCCTCCTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：46)

SEQ ID NO：47MS-Roche#3.6H5×3.6L2的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFLSRYYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTYNYPPTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：47)

SEQ ID NO：48MS-Roche#3.6H8×3.6L2的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTTTCTTTCTCGTTATTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCAGCAGACTTATAATTATCCTCCTACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：48)

SEQ ID NO：49MS-Roche#3.6H8×3.6L2的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQFLSRYYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCQQTYNYPPTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：49)

SEQ ID NO：50MS-Roche#7.4H2×7.2L1的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTATGTTGATCGTACTTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGATTTATTCTTTTCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：50)

SEQ ID NO：51MS-Roche#7.4H2×7.2L1的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQYVDRTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQIYSFPHTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：51)

SEQ ID NO：52MS-Roche#7.9H2×7.12L2的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGCGTTTTTTTTATAAGTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTCTGGTTCTTCTAACCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCTTCAGCTTTATAATATTCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：52)

SEQ ID NO：53MS-Roche#7.9H2×7.12L2的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRFFYKYLAWYQQKPGQAPRLLISGSSNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQLYNIPNTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：53)

SEQ ID NO：54MS-Roche#7.9H4×7.12L2的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGCGTTTTTTTTATAAGTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTCTGGTTCTTCTAACCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGGTTTATTATTGCCTTCAGCTTTATAATATTCCTAATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：54)

SEQ ID NO：55MS-Roche#7.9H4×7.12L2的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRFFYKYLAWYQQKPGQAPRLLISGSSNRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCLQLYNIPNTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：55)

SEQ ID NO：56MS-Roche#7.11H1×7.11L1的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGCGTATTCTTCGTATTTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGGTTTATTCTCCTCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：56)

SEQ ID NO：57MS-Roche#7.11H1×7.11L1的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQRILRIYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQVYSPPHTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：57)

SEQ ID NO：58MS-Roche#7.11H1×7.2L1的VL区；DNA；人工序列

GATATCGTGCTGACCCAGAGCCCGGCGACCCTGAGCCTGTCTCCGGGCGAACGTGCGACCCTGAGCTGCAGAGCGAGCCAGTATGTTGATCGTACTTATCTGGCGTGGTACCAGCAGAAACCAGGTCAAGCACCGCGTCTATTAATTTATGGCGCGAGCAGCCGTGCAACTGGGGTCCCGGCGCGTTTTAGCGGCTCTGGATCCGGCACGGATTTTACCCTGACCATTAGCAGCCTGGAACCTGAAGACTTTGCGACTTATTATTGCCAGCAGATTTATTCTTTTCCTCATACCTTTGGCCAGGGTACGAAAGTTGAAATTAAACGTACG(SEQ ID NO：58)

SEQ ID NO：59MS-Roche#7.11H1×7.2L1的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQYVDRTYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCQQIYSFPHTFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：59)

SEQID NO：60MS-Roche#3.6H5×3.6L2的HCDR3区；DNA；人工序列

CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：60)

SEQ ID NO：61MS-Roche#3.6H5×3.6L2的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

LTHYARYYRYFDV(SEQ ID NO：61)

SEQID NO：62MS-Roche#3.6H8×3.6L2的HCDR3区；DNA；人工序列

CTTACTCATTATGCTCGTTATTATCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：62)

SEQID NO：63MS-Roche#3.6H8×3.6L2的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

LTHYARYYRYFDV(SEQ ID NO：63)

SEQID NO：64MS-Roche#7.4H2×7.2L1的HCDR3区；DNA；人工序列

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：64)

SEQ ID NO：65MS-Roche#7.4H2×7.2L1的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：65)

SEQ ID NO：66MS-Roche#7.9H2×7.12L2的HCDR3区；DNA；人工序列

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：66)

SEQ ID NO：67#MS-Roche 7.9H2×7.12L2的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：67)

SEQ ID NO：68MS-Roche#7.9H4×7.12L2的HCDR3区；DNA；人工序列

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：68)

SEQ ID NO：69MS-Roche#7.9H4×7.12L2的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：69)

SEQ ID NO：70MS-Roche#7.11H1×7.11L1的HCDR3区；DNA；人工序列

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：70)

SEQ ID NO：71MS-Roche#7.11H1×7.11L1的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：71)

SEQ ID NO：72MS-Roche#7.11H1×7.2L1的HCDR3区；DNA；人工序列

GGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTGATGTT(SEQ ID NO：72)

SEQ ID NO：73MS-Roche#7.11H1×7.2L1的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：73)

SEQ ID NO：74MS-Roche#3.6H5×3.6L2的LCDR3区；DNA；人工序列

CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT(SEQ ID NO：74)

SEQ ID NO：75MS-Roche#3.6H5×3.6L2的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

QQTYNYPP(SEQ ID NO：75)

SEQ ID NO：76MS-Roche#3.6H8×3.6L2的LCDR3区；DNA；人工序列

CAGCAGACTTATAATTATCCTCCT(SEQ ID NO：76)

SEQ ID NO：77MS-Roche#3.6H8×3.6L2的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

QQTYNYPP(SEQ ID NO：77)

SEQ ID NO：78MS-Roche#7.4H2×7.2L1的LCDR3区；DNA；人工序列

CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT(SEQ ID NO：78)

SEQ ID NO：79MS-Roche#7.4H2×7.2L1的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

QQIYSFPH(SEQ ID NO：79)

SEQ ID NO：80MS-Roche#7.9H2×7.12L2的LCDR3区；DNA；人工序列

CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT(SEQ ID NO：80)

SEQ ID NO：81MS-Roche#7.9H2×7.12L2的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

LQLYNIPN(SEQ ID NO：81)

SEQ ID NO：82MS-Roche#7.9H4×7.12L2的LCDR3区；DNA；人工序列

CTTCAGCTTTATAATATTCCTAAT(SEQ ID NO：82)

SEQ ID NO：83MS-Roche#7.9H4×7.12L2的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

LQLYNIPN(SEQ ID NO：83)

SEQ ID NO：84MS-Roche#7.11H1×7.11L1的LCDR3区；DNA；人工序列

CAGCAGGTTTATTCTCCTCCTCAT(SEQ ID NO：84)

SEQ ID NO：85MS-Roche#7.11H1×7.11L1的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

QQVYSPPH(SEQ ID NO：85)

SEQ ID NO：86MS-Roche#7.11H1×7.2L1的LCDR3区；DNA；人工序列

CAGCAGATTTATTCTTTTCCTCAT(SEQ ID NO：86)

SEQ ID NO：87MS-Roche#7.11H1×7.2L1的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

QQIYSFPH(SEQ ID NO：87)

SEQ ID NO：88MS-Roche#7.9H7的VH区；DNA；人工序列

Caggtgcaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgcggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagtgggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtgataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgcgcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctggtgacggttagctca(SEQ ID NO：88)

SEQ ID NO：89MS-Roche#7.9H7的prot VH区；蛋白质/1；人工序列

QVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：89)

SEQ ID NO：90MS-Roche#7.9H7的VL区；DNA；人工序列

Gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgcagagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgcgtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggcacggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatatgcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacg(SEQ ID NO：90)

SEQ ID NO：91MS-Roche#7.9H7的prot VL区；蛋白质/1；人工序列

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGTKVEIKRT(SEQ ID NO：91)

SEQ ID NO：92MS-Roche#7.9H7的HCDR3区；DNA；人工序列

Ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt(SEQ ID NO：92)

SEQ ID NO：93MS-Roche#7.9H7的prot HCDR3区；蛋白质/1；人工序列

GKGNTHKPYGYVRYFDV(SEQ ID NO：93)

SEQ ID NO：94MS-Roche#7.9H7的LCDR3区；DNA；人工序列

Cttcagatttataatatgcctatt(SEQ ID NO：94)

SEQ ID NO：95MS-Roche#7.9H7的prot LCDR3区；蛋白质/1；人工序列

LQIYNMPI(SEQ ID NO：95)

更多说明性序列描述于所附序列列表且也示于附表，特别是表1、8和10。

图显示：

图1-Fab1文库的序列概括

编号方式是根据VBASE，除了VLλ位置9中的间距。在VBASE中，间距设于位置10(Chothia等.，1992)。在序列概括中，指示所有保持不变的CDR3残基。用于HuCAL-Fab1文库的对应序列可发现于附加的序列列表。

A：氨基酸序列

B：DNA序列

图2Fab展示载体18_Fab

载体图谱和DNA序列，包括限制性酶切位点

图3Fab表达载体

x9_Fab

载体图谱和DNA序列，包括限制性酶切位点

图4亲代Fab片段MS-Roche-3、MS-Roche-7和MS-Roche 8的序列

A：氨基酸序列

B：DNA序列

图5：来自人颞皮层的恒冷切片的淀粉样斑的间接免疫荧光。斑用MS-R#3.2Fab(上侧组)和MS-R#7.4Fab(下侧组)标记，在严格封闭条件下以20μg/ml(左侧组)和5μg/ml(右侧组)。结合的MS-R Fab通过山羊抗-人-Cy3来显示。

图6：来自人颞皮层的恒冷切片的淀粉样斑的间接免疫荧光。斑用MS-R#3.3IgG1(上侧组)和MS-R#7.12IgG1(下侧组)标记，在严格封闭条件下以0.05μg/ml(左侧组)和0.01μg/ml(右侧组)。结合的MS-R IgG1抗体通过山羊抗-人(H+L)-Cy3来显示。

图7：来自人颞皮层的恒冷切片的淀粉样斑的间接免疫荧光，最终亲和力成熟后使用抗体。斑用MS-R#7.9.H7IgG1(MAB 31，顶部组)、MS-R#7.11.H1×7.2.L1IgG1(MAB11，中间组)和MS-R#3.4.H7，底部组)标记。抗体在严格封闭条件下以0.05μg/ml(左侧组)和0.01μg/ml(右侧组)使用。结合的MS-R IgG1抗体通过山羊抗-人(H+L)-Cy3来显示。

标度：8,5mm＝150μm.

图8：聚合测定。抗Aβ抗体防止生物素酰化的Aβ掺入预形式的Aβ聚集物。

图9：解聚测定。抗Aβ抗体诱导生物素酰化的Aβ从聚集Aβ中释放。

图10：静脉内注射1mg MS-Roche IgG#7.9.H2×7.12.L2后，在APP/PS2双重转基因小鼠中的淀粉样斑的体内修饰。小鼠用磷酸缓冲盐水灌注，3天后杀死。存在结合淀粉样斑的人IgG通过共焦显微镜在标记后显示，用山羊抗-人IgG-Cy3缀合物(b组)标记来自前皮层的恒冷切片。相同切片用抗-Aβ小鼠单克隆抗体(BAP-2-Alexa488缀合物，a组)复染以呈现淀粉样斑的位置。显示单独的红(B组)和绿(A组)通道、合并图像(D组)共定位的(C组)信号。

标度：1cm＝50μm

图11：静脉内注射1mg MS-Roche IgG#7.9.H4×7.12.L2后在APP/PS2双重转基因小鼠中的淀粉样斑体内修饰。实验条件和染色过程与图10所述相同。

标度：1.6cm＝50μm

图12：静脉内注射1mg MS-Roche IgG#7.11.H1×7.2.L1(MAB11)后，在APP/PS2双重转基因小鼠中的淀粉样斑的体内修饰。实验条件和染色过程与图10所述相同。

标度：1,4cm＝70μm

图13：第0、3和6天静脉内注射2mg MS-Roche IgG#7.9.H7(MAB 31)后在APP/PS2双重转基因小鼠中的淀粉样斑的体内修饰。小鼠用磷酸缓冲盐水灌注，9天后杀死。存在结合淀粉样斑的人IgG通过共焦显微镜在标记后显示，用山羊抗-人IgG-Cy3缀合物(B组)标记来自前皮层的恒冷切片。相同切片用抗-Aβ小鼠单克隆抗体(BAP-2-Alexa488缀合物，a组)复染以呈现淀粉样斑的位置。显示单独的红(B组)和(A组)绿通道、合并图像(d组)和共定位的(C组)信号。

标度：1.6cm＝80μm(A、B、C组)

1.0cm＝50μm

图14：第0、3和6天静脉内注射2mg MS-Roche IgG#7.11.H1×7.2.L1(MAB 11)后，在APP/PS2双重转基因小鼠中的淀粉样斑的体内修饰。实验条件和染色过程与图13所述相同。

比例：1,6cm＝80μm

图15：抗Aβ抗体与细胞表面APP的结合分析。通过流式细胞仪分析结合人APP-转染的HEK293细胞和非转染对照细胞的抗体。

实施例阐述发明。

实施例1：构建和筛选人组合抗体文库(-Fab1)

克隆

-Fab1

-Fab1是以Fab抗体片段形式的充分合成、模式人抗体文库。

-Fab1以单链形式从抗体文库开始集合(

-scFv；Knappik，(2000)，J.Mol.Biol.296，57-86)。

Vλ位置1和2.原始

主基因用它们的真实N-末端构建：VLλ1：QS(CAGAGC)，VLλ2：QS(CAGAGC)，和VLλ3：SY(AGCTAT)。含这些氨基酸的序列示于WO 97/08320。在

文库构建中，头2个氨基酸变成DI以促进文库克隆(EcoRI位点)。所有

文库包含5’-末端有EcoRV位点GATATC(DI)的VLλ基因。所有

κ基因(主基因和文库中所有基因)在5’-末端包含DI(图1A和B)。

VH位置1.原始主基因用它们的真实N-末端构建：VH1A、VH1B、VH2、VH4和有Q(＝CAG)作为第一个氨基酸的VH6、VH3和有E(＝GAA)作为第一个氨基酸的VH5。含这些氨基酸的序列示于WO 97/08320。在构建-Fab1文库中，所有VH基因中VH的1位上的氨基酸变成Q(CAG)(图1A和B)。

设计CDR文库

Vκ1/Vκ3位置85.由于盒诱变过程用于导入CDR3文库(Knappik，(2000)，在上述引文中)，Vκ1和Vκ3的85位可以是T或V。因此，在

-scFv1文库构建中，Vκ1和Vκ3的85位变化如下：原始Vκ1，85T(密码子ACC)；Vκ1文库85T或85V(TRIM密码子ACT或GTT)；原始Vκ3，85v(密码子GTG)；Vκ3文库，85T或85V(TRIM密码子ACT或GTT)；同样应用于-Fab1。

CDR3设计.所有保持不变的CDR3残基示于图1A和B。

CDR3长度.设计的CDR3长度分布如下。变化的残基在图1中以括号(x)显示。VκCDR3有8个氨基酸残基(位置89到96)(偶尔7-10个残基)，Q89、S90和D92固定；VH CDR3有5到28个氨基酸残基(位置95到102)(偶尔4-28个残基)，D101固定。

-Fab1克隆到噬菌粒表达载体18_Fab1(图2)。此载体包括Fd片段，其phoA信号序列在C-末端融合丝状噬菌体的截短基因III蛋白，进一步包括有ompA信号序列的轻链VL-CL。两个链都在lac操纵子控制下。恒定结构域Cλ Cκ和CH1是合成基因，与的模块***完全相容(Knappik，(2000)，在上述引文中)。

完整VH-链(MunI/StyI-片段)被含β-内酰胺酶转录单位(bla)的1205bp模拟物片段取代，从而促进制备载体片段和选择完全去除VH的随后步骤。

VH-取代后，VLλ通过EcoRI/DraIII去除且VLκ通过EcoRI/BslWI去除并用细菌碱性磷酸酶(bap)基因片段(1420bp)取代。

由于轻链的可变性低于重链，克隆开始于轻链文库。VL_λ和VL_κ轻链文库在L-CDR3中多样化，产生的轻链文库用于

-scFv文库(Knappik，(2000)，在上述引文中)，它们也用于克隆

-Fab1。在λthey的情况中，λthey由λ1-、λ2-和λ3-

-构架组成且总可变性为5.7×10⁶。VL_λ片段用引物5’-GTGGTGGTTCCGAT ATC-3′(SEQ ID NO：28)和5′-AGCGTCACACTCGGTGCGGCTTTCGGCTGGCCAAG AACGGTTA-3′(SEQ ID NO：29)通过15个PCR循环(Pwo-聚合酶)扩增。PCR产物用EcoRV/DraIII消化并凝胶纯化。在VL_λ-文库的情况中，bap-模拟物用EcoRV/DraIII从文库载体中去除。2μg凝胶纯化的载体用3倍摩尔过量VL_λ-链在16℃连接16小时，连接混合物在800μl大肠杆菌TOP10F细胞(Invitrogen)中电穿孔，产生总共4.1×10⁸个单独菌落。转化子在2×YT/1％葡萄糖/34μg/ml氯霉素/100μg/ml氨苄青霉素中扩增约2000倍，收集并在-80℃贮存于20％(w/v)甘油中。

κ文库包括κ1-、κ2-、κ3-和κ4-

主基因，总可变性为5.7×10⁶。获得VL_κ-链是通过EcoRV/BS1WI限制性消化并凝胶纯化。在VL_κ-文库的情况中，bap-模拟物用EcoRV/BslWI从文库载体中去除。2μg凝胶纯化的载体混合5倍摩尔过量的VL_κ-链。连接和转化入大肠杆菌TOP10F细胞(Invitrogen)如VL_λ-链所述进行，产生总共1.6×10⁸个单独菌落。

制备2个轻链文库的DNA且bla-模拟物用MunI/StyI去除，从而产生2个载体用于***VH亚文库。-scFv的VH文库用于产生

-Fab1。

-scFv的VH文库由主基因VH1A/B-6组成，2个VH-CDR3三核苷酸文库盒的区别在于单独的CDR3长度，各VH-文库结合VL_κ-和VL_λ-1文库。为产生

-Fab1，制备来自这些VH-文库的DNA且保持原始可变性。DNA用MunI/StyI消化并凝胶纯化。5倍摩尔过量的VH-链用3μgVL_λ-文库载体和3μgVL_κ-文库载体在22℃连接4小时。连接混合物在1200μl大肠杆菌TOP10F细胞(Invitrogen)中电穿孔用于各载体，产生总共2.1×10¹⁰个单独菌落。转化子在2×YT/1％葡萄糖/34μg/ml氯霉素/10μg/ml四环素中扩增约4000倍，收集并在-80℃贮存于20％(w/v)甘油中。

作为质量控制，单个克隆的轻和重链分别用5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′(SEQ ID NO：30)和5′-TACCGTTGCTCTTCACCCC-3′(SEQ ID NO：31)测序。

噬菌粒拯救、噬菌体扩增和纯化

-Fab1在2×TY培养茎中扩增，培养茎含34μg/ml氯霉素、10μg/ml四环素和1％葡萄糖(2×TY-CG)。在37℃以约0.5的OD₆₀₀辅助噬菌体感染(VCSM13)后，离心和重悬浮于2×TY/34μg/ml氯霉素/50μg/ml卡那霉素，细胞在30℃过夜生长。噬菌体从上清中PEG-沉淀(Ausubel，(1998)，《精编分子生物学实验掼》(Currentprotocols in molecular biology).John Wiley & Sons，Inc.，New York，USA)，重悬浮于PBS/20％甘油并贮存于-80℃。2轮淘洗间的噬菌体扩增如下进行：对数中期TG1-细胞用洗脱的噬菌体感染并平板培养于LB-琼脂上，LB-琼脂补充1％葡萄糖和34μg/ml氯霉素。30℃过夜生长后，刮下菌落，调节至OD₆₀₀为0.5并如上所述加入辅助噬菌体。

实施例2：固相淘洗

MaxiSorp^TM微量滴定板F96(Nunc)的孔涂布100μl 2.5μM人Aβ(1-40)肽(Bachem)，肽溶解于含NaN₃(0.05％v/v)的TBS，密封平板在37℃培养3天，其中肽易在平板上聚集。用TBS中的5％无脂干燥乳封闭后，如上纯化的1-5×10¹²个

-Fab噬菌体在20℃加入1小时。一些洗涤步骤之后，通过用500mM NaCl、100mM甘氨酸(pH2.2)的pH-洗脱来洗脱结合的噬菌体，随后用1M TRIS-Cl(pH7)中和。进行3轮淘洗，如上所述各轮间进行噬菌体扩增，洗涤严格性逐轮增加。

实施例3：亚克隆选择的Fab片段用于表达

选择的

-Fab片段的Fab-编码***物亚克隆到表达载体

x7_FS以促进迅速表达可溶性Fab。选择的

-Fab克隆的DNA制备物用XbaI/EcoRI消化，因此切掉编码Fab的***(ompA-VL和phoA-Fd)。将纯化的***物亚克隆到XbaI/EcoRI切割的载体

x7，此载体先前携带scFv***，产生名为

x9_Fab1的Fab表达载体(图3)。此载体中表达的Fab携带2个C-末端标记(FLAG和Strep)用于检测和纯化。

实施例4：通过ELISA鉴定Aβ-结合Fab片段

MaxiSorp^TM微量滴定板F384(Nunc)的孔涂布20μl 2.5μM人Aβ(1-40)肽(Bachem)，肽溶解于含NaN₃(0.05％v/v)的TBS，密封平板在37℃培养3天，其中肽倾易于在平板上聚集。单独Fab的表达用1mM IPTG在22℃诱导16小时。可溶性Fab通过BEL裂解(硼酸、NaCl、EDTA和含缓冲液pH8的溶菌酶)提取并用于ELISA。Fab片段用碱性磷酸酶-缀合的山羊抗Fab抗体(Dianova/Jackson Immuno Research)检测。在340nm激发后，加入AttoPhos荧光底物(Roche Diagnostics)后，读出在535nm的发射。

实施例5：抗体片段的最优化

为最优化选择的Aβ结合抗体片段的结合亲和力，一些Fab片段MS-Roche-3(MSR-3)、MS-Roche-7(MSR-7)和MS-Roche-8(MSR-8)(图4)用于构建Fab抗体片段文库，通过来自

文库的所有CDR3不同的κ链κ1-3的库取代亲代VLκ3链(Knappik et al.，2000)。

Fab片段MS-Roche-3、7和8经XbaI/EcoRI从

x9_FS克隆到

18以产生18_Fab1(图2)，

18是以噬菌粒为基础的载体，用于噬菌体展示Fab片段。κ链库通过XbaI/SphI限制性酶切位点克隆到

18_Fab1。

所得Fab最优化文库通过淘洗筛选，淘洗抗实施例2所述包被固体支持物的聚集的人Aβ(1-40)肽。

最佳克隆在Biacore测定中通过koff-排列鉴定，如实施例8所述。进一步确定最佳克隆MS-Roche-3.2、3.3、3.4、3.6、7.2、7.3、7.4、7.9、7.11、7.12、8.1、8.2的特征且与起始片段MS-Roche-3、MS-Roche-7和MS-Roche-8相比，显示改进的亲和性和生物活性(图4)。所列CDRs指

以共有区为基础的抗体基因VH3kappa3。Fab片段MS-Roche-7.12通过克隆亲代克隆MS-R7的HCDR3到-Fab文库来获得，文库在所有6个CDR区有多样性，使用的设计过程与Knappik等.，2000所述用于CDR3盒的相同。设计的文库盒强烈偏向于已知氨基酸的自然分布并遵循由Allazikani确立的规范CDR构象概念(Allazikani等.，1997)。然而与

主基因相反，克隆MS-Roche 7.12在VL链的49位包含氨基酸S(参见附表1)。

第一轮亲和力成熟后，最佳Fabs显示改进的特征超过起始MS-Roche-3、MS-Roche-7和MS-Roche-8克隆(图4)。成熟Fabs与Aβ1-40和Aβ1-42的结合亲和力显著增加，产生的K_D值范围在22-240nM，与亲代克隆的850-1714nM相比(表3)。免疫组化分析人AD脑切片中的淀粉样斑也显示成熟克隆的染色分布显著增加，即获得更好的信号与背景比例且阳性斑染色以相对低浓度的成熟Fabs检测(图5)。

为进一步最优化，获得自L-CDR3最佳MS-Roche-3、-7和-8(表1；图4)的一组抗体片段的VH CDR2区和VL CDR1区通过盒诱变用三核苷酸-定向诱变(

等.，1994)来最优化。因此，构建以三核苷酸为基础的HCDR2盒和以三核苷酸为基础的LCDR1盒，所用设计过程与Knappik等.，2000所述用于CDR3盒的相同。设计文库盒强烈偏向于已知氨基酸的自然分布并遵循由Allazikani确立的规范CDR构象概念(Allazikani等.，1997)。用于最优化初始选择抗体片段的方案通过自然免疫反应中观察到的体细胞高变来模拟亲和力成熟的过程。

如上所述单独筛选所得文库，产生H-CDR2或L-CDR1区中的最佳克隆。所有克隆如上鉴定，通过在Biacore中koff-排列后对Aβ1-40-纤维的koff改进且与对应亲代克隆相比，对Aβ1-40或Aβ-42或2者的亲和力提高(表3)。表1包含亲代的序列特征以及最佳克隆的序列。所列CDRs指

以共有区为基础的抗体基因VH3kappa3。

例如，L-CDR3最优化后(MS-Roche-7.9)，MS-Roche-7亲代Fab对Ab1-40的亲和力增加35倍，从1100nM到31nM，且H-CDR2最优化后(MS-Roche-7.9H2)进一步提高到5nM，如表3所示。

H-CDR2和L-CDR1最优化过程不仅增加亲和力，而且使一些克隆在AD脑切片中的淀粉样斑染色有显著改进，特别如用MS-Roche 7.9H2和7.9H3所见。

实施例6

免疫球蛋白表达载体的构建

重链克隆.pcDNA3.1+(invitrogen)的多克隆位点被去除(NheI/ApaI)，与用于设计的限制性位点相容的填充片段被***用于连接前导序列(NheI/EcoRI)、VH-结构域(MunI/)和免疫球蛋白恒定区(BlpI/ApaI)。前导序列(EMBL 83133)装有Kozak序列(Kozak，1987)。人IgG(PIR A02146)、IgG4(EMBL K01316)和血清IgA1(EMBL J00220)的恒定区切成长度约70个碱基的重叠寡核苷酸。引入沉默突变以去除与

设计不相容的限制性位点。寡核苷酸通过重叠延伸-PCR来剪接。

在从Fab亚克隆到IgG中，Fab的VH DNA序列通过Mfe I/Blp I切掉并连接入IgG载体，载体经EcoR I/Blp I打开。EcoR I(g/aattc)和Mfe I(c/aattg)共享相容粘性末端(aatt)，连接入IgG表达载体后，Fab中原始Mfe I位点的DNA序列从c/aattg变为g/aattg，从而破坏Mfe I和EcoR I位点，因此也导致从Q(密码子：caa)变为E(密码子：gaa)。

轻链克隆.pcDNA3.1/Zeo+(Invitrogen)的多克隆位点被2个不同填充片段取代。κ-填充片段提供限制性位点用于***κ-前导区(NheI/EcoRV)、

-scFv Vκ-结构域(EcoRV/BsiWI)和κ-链恒定区(BsiWI/ApaI)。λ-填充片段中的对应限制性位点是NheI/EcoRV(λ-前导区)、EcoRV/HpaI(Vλ-结构域)和HpaI/ApaI(λ-链恒定区)κ-前导区(EMBL Z00022)以及λ-前导区(EMBL J00241)都装有Kozak序列。人κ-(EMBL L00241)和λ-链(EMBL M18645)的恒定区通过上述重叠延伸-PCR装配。

产生表达IgG的CHO-细胞.CHO-K1细胞用IgG重和轻链表达载体的等摩尔混合物共转染。双重抗性转染子用600μg/ml G418和300μg/ml零霉素(Invitrogen)选择，接着有限稀释。通过捕获-ELISA评估单克隆上清的IgG表达。阳性克隆在RPMI-1640培养基中扩增，培养基补充10％超低IgG-FCS(Life Technologies)。上清pH调至8.0并无菌过滤后，溶液进行标准蛋白A柱层析(Poros 20A，PE Biosystems)。

实施例7：用十肽的肽点分析

下列涵盖Aβ(1-42)的氨基酸序列分成43个重叠十肽，十肽有1个氨基酸的移码。

ISEVKM¹DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGVVI⁴²ATVIV(SEQ ID NO：414)。因此，所包括的DAEF RHDSGYEVHH QKLVFFAEDVGSNKGAIIGL MVGGVVIA(SEQ ID NO：27)代表Aβ4/β-A4肽的氨基酸1到42。

43个十肽由商业供应商(Jerini BioTools，Berlin)合成，N-末端乙酰化且C-末端共价附着纤维素薄片(“肽点”)。纤维素薄片在摇台上用封闭缓冲液(50mM TrisHCl、140mM NaCl、5mM NaEDTA、0.05％NP40(Fluka)、0.25％明胶(Sigma)、1％牛血清白蛋白部分V(Sigma)，pH7.4)中的单克隆抗体(2μg/ml)孵育2小时。薄片在摇台上用TBS(10mM Tris.HCl、150mM NaCl，pH7.5)洗3次3分钟。然后用阴极缓冲液(25mM Tris碱、40mM 6-氨基己酸、0.01％SDS、20％甲醇)弄湿并转至半干印迹堆，肽侧面向等大小的PVDF膜(Biorad)。

半干印迹堆由新弄湿的滤纸(Whatman No.3)组成，比肽薄片稍大。

3张纸用阴极缓冲液弄湿

肽薄片

用甲醇弄湿的PVDF膜薄片

3张纸用阳极缓冲液1(30mM Tris碱、20％甲醇)弄湿

3张纸用阳极缓冲液2(0.3mM Tris碱、20％甲醇)弄湿

转移以阴极和阳极间0.8mA/cm²的电流密度进行40分钟，足以从纤维素薄片中洗脱大部分抗体并使其沉积在PVDF膜上。然后PVDF膜换成第2张PVDF膜且再转移40分钟以确保从纤维素薄片中完全洗脱。

PVDF膜在封闭缓冲液中浸10分钟。然后HRP-标记的抗人Ig H+L(Pierce)以1∶1000稀释加入，膜在摇台上孵育1小时。它用TBST(有0.005％吐温20的TBS)洗3×10分钟。将膜浸入溶液来显色，溶液由溶于9ml甲醇的3mg 4-氯萘酚和41ml PBS(20mM磷酸钠、150mM NaCl，pH7.2)、10μl 30％过氧化氢(Merck)组成。显出蓝黑斑点后，膜用水充分洗涤并干燥。

抗体-反应性肽点排布通过视觉检查透明点基质来产生。所讨论抗体的表位定义为反应性肽中的最小氨基酸序列。为比较起见，小鼠单克隆抗体(BAP-2、BAP-1、BAP-17、BAP-21、BAP-24和4G8)以同样方式分析，除了使用HRP-标记的抗小鼠Ig代替抗人Ig。

注意到单价Fab片段的亲和力成熟和转变成全长IgG1抗体通常导致表位识别序列有些扩大，如肽点和ELISA分析所示。这可能涉及在抗体-抗原相互作用区域中补充更多接触点作为亲和力成熟的结果，或涉及较强结合最小表位从而也能检测与邻近氨基酸的弱相互作用。当衍生自Aβ的肽用全长IgG抗体探测时，也许是后一种情况。如用于肽点分析的表2所示，当比较亲代Fabs和相应充分成熟的IgG抗体时，N-末端和中间表位的识别序列延伸至3个氨基酸。然而，要牢记修饰十肽以在C-末端氨基酸上共价附着，且由于位阻因而此氨基酸可能不易接边全长抗体。如果是这种情况，最后的C-末端氨基酸对表位识别序列没有明显影响，在本发明所用肽点分析中需要考虑通过C-末端上的1个氨基酸减少最小识别序列的可能性。

抗体	位置	位置
			MSR-3Fab	3-4	18-23
MSR-7Fab	3-5	19-24
			MSR-8Fab	4-5	18-21
MSR-9Fab	(1)3-9	18-24
			MSR-10Fab	(4-10)	19-20
MSR-11Fab	3-7	(18-20)
			MSR-26Fab	3-5	(16)-19-23
MSR-27Fab	(3)6-9	13-18(20)
			MSR-29Fab		14-16(20)
MSR-37Fab	(4-6)	(19-24)
			MSR-41Fab	3-7	(17-21)
MSR-42Fab	(4-9)	(18-24)
			MSR 3.4.H7 IgG1	1-3	19-26
MSR 7.9.H2 IgG1	1-4	19-24
			MSR 7.9.H7 IgG1	4-6	19-26
MSR 7.2.H2×7.2.L1 IgG1	(1-4)5-9	18-26
			MSR 7.11.H1×7.2.L1 IgG1	4-6	19-26

			BAP-2	4-6
4G8		19-20(23)
			BAP-21		32-34
BAP-24		38-40
			BAP-1	4-6
BAP-17		38-40

表2：肽点分析纤维素薄片上Fabs和全长IgG抗体与十肽的结合。数字指来自Aβ1-40序列的必需氨基酸，它们必须存在于十肽以最佳结合抗体。弱肽反应性且因此对表位有弱的影响由括号表示。

实施例8：通过表面胞质基因组共振(SPR)确定MS-R Fab和MS-R IgG1抗体体外结合Aβ1-40和Aβ1-42纤维的K_D值

抗Aβ抗体(Fabs和IgG1)结合纤维状Aβ通过表面胞质基因组共振(SPR)在线测量，确定分子相互作用的亲和力如Johnson，Anal.Biochem.1991，198，268-277和Richalet-Sécordel，Anal.Biochem.1997，249，165-173所述。Biacore2000和Biacore3000仪器用于这些测量。体外产生Aβ1-40和Aβ1-42纤维通过合成肽以200μg/ml浓度在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.0)中37℃孵育3天。电镜分析确定2种肽的纤维结构，Aβ1-40显示主要较短(＜1微米)纤维且Aβ1-42显示主要较长(＞1微米)纤维。假定这些纤维代表人AD脑中聚集的Aβ肽，比无定形集合与无结构沉淀的不定混合物更紧密。纤维以1∶10稀释并直接偶联“先锋传感芯片F1”，如厂商说明手册(BIAapplication手册，AB版，Biacore AB，Uppsala，1998)所述。在开始的实验中发现选择的MS-Roche Fabs的反应动力学显著不同，因此须相应选择数据分析模式。对于动力学慢的结合物，K_D值通过曲线拟合时间依赖性传感器反应来计算，即来自k_关/k_开比例。动力学快的结合物通过拟合平衡时浓度依赖性传感器反应(吸收-等温线)来分析。K_D值从Biacore传感图计算，用蛋白质测定法确定的总Fab浓度为基础。对于获得自第1和第2个亲和力成熟循环的克隆，各制品中活性Fab含量在Biacore中确定，根据Christensen《分析生物化学》(Analytical Biochemistry)(1997)249，153-164所述方法。简要地，在分析物溶液的不同流速的质量限制条件下测量联合阶段中蛋白质与Aβ1-40纤维的时间依赖性结合，纤维固定于Biacore芯片。认识质量限制的条件通过在测量通道的芯片表面上固定大量Aβ纤维(2300个反应单位)和以相对低的分析物浓度工作，即160nM(以总Fab蛋白浓度为基础)。

初步筛选HuCAL文库中鉴定的选择MS-Roche克隆的K_D值的总结和第1和第2个亲和力成熟循环后它们对应的成熟衍生物示于表3。在第1个亲和力成熟循环中重链CDR3(VH-CDR3)保持不变且最优化集中于轻链CDR3(VL-CDR3)的多样性。在第2个亲和力成熟循环中，进行了VL-CDR1和VH-CDR2的多样化。一些来自第1个成熟循环的结合物转变成全长人IgG1抗体，根据实施例6所述MorphoSys开发的技术和上述Biacore中确定的K_D值。全长IgG1结合Aβ1-40和Aβ1-42的K_D值示于表4。

鉴定第2个成熟循环后来自L-CDR1以及H-CDR2文库的成熟衍生物并可组合轻和重链。交叉克隆策略描述于实施例13。交换完整轻链LCDR1或L-CDR1+2。所选交叉克隆Fabs的K_D值示于表8。

一些来自第1和第2个成熟循环及来自交叉克隆结合物的Fabs根据实施例6所述MorphoSys开发的技术转变成全长人IgG1抗体。IgG结合Aβ1-40和Aβ1-42纤维的K_D值在Biacore中确定。简要地，使用逐步形成二价复合体的动力学模型，K_D值通过斯卡查德类型分析平衡结合来计算。由于联合过程在低抗体浓度很低(到达平衡几小时)，平衡结合数据通过外推联合曲线到长时间间隔来获得。

形成单价和二价复合体的开和关速度经曲线拟合过程确定并用于外推。在这些R_eq值基础上，进行斯卡查德分析且确定形成单价和二价复合体的K_D值。数据总结于表5。从曲线斯卡查德图获得较高(二价)和较低(单价)亲和相互作用用于MS-R IgGs，MS-R IgGs获得自第2个亲和力成熟循环和交叉克隆。这2种亲和力代表表5所示范围的较低和较高K_D值。

表3

表3：Biacore中确定的MS-R Fab结合Aβ1-40和Aβ1-42纤维的K_D值。对于获得自第1和第2个亲和力成熟循环的克隆，校正值用于本文所述各样品中活性Fab的存在量。^a，从平衡时浓度依赖性传感器反应计算的值；n.d.，未确定。

表4：

表4：Biacore中确定的MS-R IgG1结合Aβ1-40和Aβ1-42纤维的K_D值。第1个亲和力成熟循环后从所选MS-R Fabs中获得IgGs。校正值用于本文所述各样品中活性MS-R IgGs的存在量。

表5：Biacore中确定的MS-R IgG1结合Aβ1-40和Aβ1-42纤维的K_D值。IgGs获得自第1和第2个亲和力成熟循环后所选的MS-R Fabs和交叉克隆的Fabs。校正值用于本文所述各样品中活性MS-R IgGs的存在量。2个赋予MS-R IgGs的K_D值获得自第2个亲和力成熟步骤且交叉克隆的结合物代表较高和较低亲和相互作用，如曲线斯卡查德图所计算。有了一些另外的MS-R IgGs(例如MS-R IgG 7.9.H2×7.12.L2和MS-RIgG 7.9.H4×7.12.L2)，获得复曲线斯卡查德图，因此不能确定K_D值。

实施例9：通过间接免疫荧光染色阿尔茨海默氏病患者脑切片中真人淀粉样斑

通过免疫组化分析测试所选MS-Roche Fabs和全长IgG1对β-淀粉样斑的结合。来自人颞皮层(从诊断为阿尔茨海默氏病阳性患者死后获得)未固定组织的恒冷切片通过间接免疫荧光标记，使用不同浓度的MS-Roche Fabs或全长人IgG1抗体。Fabs和IgG1抗体分别用缀合Cy3的山羊抗人亲和纯化的F(ab‘)₂片段和缀合Cy3的山羊抗人(H+L)显示。二级试剂都获得自Jackson Immuno Research。对照包括不相关Fab和单独二抗，它们都给出阴性结果。用所选MS-Roche Fabs和MS-Roche IgG1抗体染色斑的典型例子示于图5到7。

实施例10：聚合测定：防止Aβ聚集

当在含水缓冲液中孵育几天时，合成的Aβ自发聚集和形成纤维状结构，与阿尔茨海默氏病患者脑中的淀粉样沉积物类似。我们开发了体外测定用于测量生物素酰化的Aβ掺入预形成的Aβ聚集体以分析抗Aβ抗体和其它Aβ-结合蛋白如清蛋白的Aβ-中和潜能(Bohrmann等.，1999，J.Biol.Chem.274，15990-15995)。小分子对Aβ聚集的效果也可在此测定中分析。

实验过程：

NUNC Maxisorb微量滴定板(MTP)用Aβ1-40和Aβ1-42的1∶1混合物(各2μM，100μl每孔)37％涂布3天。在这些条件下，高度聚集、纤维状Aβ被吸收和固定于孔的表面。然后取出涂布溶液且平板在室温干燥2-4小时。(干燥板可贮存于-20℃)。剩余结合部位通过加入300μl/孔磷酸缓冲盐水封闭，盐水含0.05％吐温20(T-PBS)和1％牛血清白蛋白(BSA)。室温孵育1-2小时后，平板用1×300μl T-PBS洗。加入20mM Tris-HCl中的20nM生物素酰化的Aβ1-40溶液、含0.05％NaN₃的150mM NaClpH7.2(TBS)和连续稀释的抗体(100μl/孔)，平板在37℃孵育过夜。用3×300μl T-PBS洗后，链霉抗生物素蛋白-POD缀合物(Roche Molecular Biochemicals)在含1％BSA的T-PBS中1∶1000稀释，加入(100μl/孔)并在室温孵育2小时。孔用3×300μl T-PBS洗并加入100μl/孔的新制备四甲基联苯胺(TMB)溶液。[制备TMB溶液：10ml 30mM柠檬酸pH4.1(用KOH调节)+0.5ml TMB(1ml丙酮中的12mg TMB+9ml甲醇)+0.01ml 35％H₂O₂]。通过加入100μl/孔1N H₂SO₄终止反应且吸光度在微量滴定板读数器中450nm读。

结果：

图8显示MS-Roche IgG1抗体防止生物素酰化的Aβ1-40掺入预形成的Aβ1-40/Aβ1-42聚集体中。当用实施例7所述肽点技术分析时，这些全长人IgGs的Aβ-中和能力类似于小鼠单克隆抗体BAP-1，BAP-1通过标准免疫过程产生并特异识别Aβ肽的氨基酸残基4-6。小鼠单克隆抗体BAP-2也专一地与氨基酸4-6反应(Brockhaus，未发表)，它在此测定中活性显著小。用Aβ1-40C-末端特异抗体BAP-17甚至发现更低活性(Brockhaus，Neuroreport 9(1998)，1481-1486)且单克隆抗体4G8识别Aβ序列中17位和24位间的表位(Kim，1988，Neuroscience Research Communication，第2卷，121-130)。浓度达10μg/ml的BSA不影响生物素酰化的Aβ的掺入并作为负对照。然而，在较高浓度即＞100μg/ml，已报导BSA抑制生物素酰化的Aβ掺入预形成的Aβ纤维中(Bohrmann，(1999)J Biol Chem 274(23)，15990-5)，表明BSA与Aβ的相互作用没有高亲和性。

实施例11：解聚测定：从聚集的Aβ中释放生物素酰化的Aβ

在类似实验方案中，我们测试了MS-Roche IgG抗体诱导聚集的Aβ解聚的潜力。生物素酰化的Aβ1-40首先掺入预形成的Aβ1-40/Aβ1-42纤维中，然后用多种抗Aβ抗体处理。生物素酰化的Aβ的释放用聚合测定中所述相同测定法测量。

实验过程：

NUNC Maxisorb微量滴定板(MTP)用聚合测定中所述Aβ1-40和Aβ1-42的1∶1混合物涂布。为掺入生物素酰化的Aβ，涂布的平板用TBS中200μl/孔20nM生物素酰化的Aβ1-40在37℃过夜孵育，TBS含0.05％NaN₃。平板用3×300μl/孔T-PBS洗，抗体在含0.05％NaN₃的TBS中连续稀释，加入并于37℃孵育3小时。洗平板并如上所述分析生物素酰化的Aβ1-40的存在。

结果：

图9A到D显示发明的抗体诱导聚集的Aβ的解聚，通过释放掺入的生物素酰化的Aβ1-40来测量。MS-R抗体和小鼠单克隆抗体BAP-1活性类似，而BAP-2、BAP-17和4G8抗体从大量固定的Aβ聚集体中释放生物素酰化的Aβ的效率明显较小。BAP-1明显不同于MS-R抗体，差异在于其与细胞表面全长APP的反应性(见图15)，有这种性质的抗体像BAP-1不用于治疗应用，因为可能诱导潜在的自身免疫反应。有趣的是注意到尽管BAP-2对聚集的Aβ中暴露的氨基酸残基4-6有特异性，它在此测定中活性明显较低，表明不是所有N-末端特异抗体事先在从预形成的聚集体中释放Aβ上同样有效。MS-Roche IgGs在解聚活性方面明显优于BAP-2。此测定中BAP-17(C-末端特异)和4G8(氨基酸残基16-24-特异)的相对低效率是由于这2种表位在聚集的Aβ中的隐蔽性质。在聚合测定中已指出这里所用浓度BSA对聚集的Aβ没有效果。

MS-R抗体获得自第2个亲和力成熟循环和交叉克隆的结合物，抗体在解聚测定中一般显示较高效率(图9A与图9B和C比较)，这与这些抗体的结合亲和力增加一致(见表3-5)。已报导单克隆抗体AMY-33和6F/3D在一些实验条件下体外防止Aβ聚集(Solomon，(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，452-455；AMY-33和6F/3D抗体分别获得自Zymed Laboratories Inc.，San Francisco(定货号13-0100)和Dako DiagnosticsAG，Zug，Switzerland(定货号M08721))。如图9D所证明，这些抗体在解聚测定中都完全失活。

实施例12：通过ELISA对肽缀合物进行表位分析

下列七肽(单字母编码)通过固相合成获得并通过液相层析用本领域已知技术纯化。

AEFRHDC

EFRHDSC

FRHDSGC

RHDSGYC

HDSGYEC

DSGYEVC

SGYEVHC

YEVHHQC

EVHHQKC

VHHQKLC

HHQKLVC

HQKLVFC

QKLVFFC

KLVFFAC

LVFFAEC

VFFAEDC

FFAEDVC

FAEDVGC

AEDVGSC

EDVGSNC

DVGSNKC

VGSNKGC

GSNKGAC

CSNKGAI

CNKGAII

CKGAIIG

CGLMVGG

CMVGGW

CGGWIA

肽溶解于DMSO以达到10mM浓度。

牛清蛋白(无BSA的必需脂肪酸，Sigma批号112F-9390)溶解于0.1M碳酸氢钠至10mg/ml，通过每ml加入50μl 26mg/ml溶液来活化，溶液是DMSO中的N-琥珀酰亚胺基-马来酰亚胺丙酸值(NSMP，Pierce)。室温反应15分钟后，活化的BSA通过在PBS中凝胶过滤(NAP-10，Pharmacia)来纯化，0.1％叠氮化钠作为溶剂。50μl NSMP活化的BSA(6.7mg/ml)用50μl PBS、0.1％叠氮化钠稀释且加入10μl肽溶液(DMSO中1mM)。作为负对照，模拟处理活化的BSA而不加肽。室温4小时后，通过加入10μl 10mM半胱氨酸来终止反应。缀合反应混合物的等分样品用0.1M碳酸氢钠缓冲液1∶100稀释并立即注满ELISA平板(Nunc免疫平板)的孔(100μl)。4℃放置16小时后，100μl封闭缓冲液(如上)加入各孔并再孵育30分钟。平板用2×300μl/孔TBST(如上)洗且用100μl抗体充满，抗体以10μg/ml或2μg/ml在封闭缓冲液中。平板在4℃放置16小时并用2×300μl TBST洗。加入100μl/孔HRP-缀合的抗人Ig H+L(Pierce，用封闭缓冲液1∶1000稀释)并在环境温度孵育1小时。平板用3×300ul/孔TBST洗。通过加入100μl四甲基联苯胺/过氧化氢试剂开始显色。加入100μl/孔1M硫酸5分钟后终止反应且通过光读数器(微量滴定板读数器3550 BioRad)在450nm测量光密度。为比较起见，小鼠单克隆抗体以同样方式分析，除了使用HRP-标记的抗小鼠Ig作为显色剂而不是抗人Ig。

使用上述获得自Aβ的特定七肽，完成上文所述特定ELISA-测试。发明的抗体优选包括抗体，当它们与A-β衍生物肽(AEFRHD；A-β的氨基酸2到7)的反应性与非相关蛋白质/肽(像BSA)相比时，光密度测量显示信号与背景比高于“10”。最优选对应反应的光密度比例高于“5”，有至少1个下列3种Aβ衍生的肽：(VFFAED；Aβ的氨基酸18到23)或(FFAEDV；Aβ的氨基酸19到24)或(LVFFAE；Aβ的氨基酸17到22)。

发明的亲代和/或成熟抗体的相应结果示于下列2个表：

表6：MS-R Fabs与BSA-缀合的Aβ七肽2-7(AEFRHD)、17-22(LVFFAE)、18-23(VFFAED)和19-24(FFAEDV)的反应性。给出ELISA读出的比例(光密度)，用肽-缀合和非-缀合的BSA获得。也指明用17-22、18-23、19-24肽所得相对于2-7肽的信号强度。

表7：MS-R IgGs和小鼠单克隆抗体BAP-1、BAP-2、4G8、6E10 Amy-33和6F/3D与BSA-缀合的Aβ七肽2-7(AEFRHD)、17-22(LVFFAE)、18-23(VFFAED)和19-24(FFAEDV)的反应性。给出ELISA读出的比例(光密度)，用肽-缀合和非-缀合的BSA获得。也指明用17-22、18-23、19-24肽所得相对于2-7肽的信号强度。*此抗体对序列8-17特异且不识别N-末端或中间表位序列。

实施例13：通过交叉克隆组合最佳化的H-CDR2和L-CDR1

HuCAL文库的模块设计可在一简单克隆步骤中交换2个不同Fab编码基因的互补决定区(CDRs)。为进一步改进亲和性，来自成熟克隆有相同H-CDR3的单独最佳化的H-CDR2和L-CDR1被组合，因为很可能此组合会进一步获得亲和力(Yang等.，1995，J.Mol.Biol.254，392-403；Schier等.，1996b，J.Mol.Biol.263，551-567；Chen等.，1999，J.Mol.Biol.293，865-881)。完整轻链或其片段从L-CDR1最佳化供体克隆转至H-CDR2最佳化受体克隆。如果供体和受体克隆都携带相同H-CDR3序列，仅组合它们。所有供体和受体克隆携带VH3-Vκ3构架。

这通过将完整轻链从L-CDR1-最佳化供体克隆转至H-CDR2-最佳化受体克隆来完成。仅通过组合有相同H-CDR3的克隆保存表位特异性。如果交换发生在有相同L-CDR3的克隆间，H-CDR2-最佳化克隆通过轻链交换仅获得最佳化L-CDR1。如果待组合的克隆的L-CDR3不同，除了最佳化L-CDR1，H-CDR2-最佳化克隆获得另一种L-CDR3(L-CDR2保持HuCAL共有序列(Knappik等.，2000))，当MS-Roche#7.12的衍生物用作轻链供体时，L-CDR1，2和3在H-CDR2-最佳化受体克隆中交换。使用3种不同的克隆策略：

1)完整抗体轻链片段用限制性内切酶XbaI和SphI从质粒1(如pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H1_FS)中切去，由此所得载体主链然后连接质粒2(如pMx9_Fab_MS-Roche#7.2.L1_FS)的轻链片段，此片段通过XbaI和SphI消化产生。由此产生一个新的质粒(命名：pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H1×7.2.L1_FS)，编码亲代克隆#7.2.L1的L-CDR1、2、3和亲代克隆#7.11.H1的H-CDR1、2、3。

2)L-CDR1编码片段用限制性内切酶XbaI和Acc65I从质粒1(如pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2_FS)中切去，由此所得载体主链然后连接质粒2(如pMx9_Fab_MS-Roche#7.12.L1_FS)的L-CDR1片段，此片段通过XbaI和Acc65I消化产生。由因此产生一个新的质粒(命名：pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2×7.12.L1(L-CDR1)_FS)，编码亲代克隆#7.12.L1的L-CDR1，而L-CDR2、3和H-CDR1、2、3获得自亲代克隆#7.11.H2。

3)L-CDR1和L-CDR2编码片段用限制性内切酶XbaI和BamHI从质粒1(如pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2_FS)中切去，由此所得载体主链然后连接质粒2(如pMx9_Fab_MS-Roche#7.12.L1_FS)的L-CDR1和L-CDR2片段，此片段通过XbaI和BamHI消化产生。由此产生一个新的质粒(命名：pMx9_Fab_MS-Roche#7.11.H2×7.12.L1(L-CDR1+2)_FS)，编码亲代克隆#7.12.L1的L-CDR1和L-CDR2，而L-CDR3和H-CDR1、2、3获得自亲代克隆#7.11.H2。不同克隆策略以及序列供体和受体克隆的说明性例子在表8中给出。

大规模表达和纯化后，它们的亲和性在Aβ(1-40)纤维上确定。此外，所选交叉克隆的MS-R Fab/抗体的K_D值在附表9中给出。

表9：Biacore中确定的交叉克隆MS-R Fab结合Aβ1-40和Aβ1-42纤维的K_D值。交叉克隆Fabs的制备描述于实施例13。K_D值通过动力学曲线拟合确定并校正用于本文所述各样品中活性Fab的存在量。一些Fabs另外通过大小排阻层析纯化或准备超离心以去除聚集的物质。H-CDR2-成熟受体克隆(L1)仅从L-CDR1改进供体克隆中接受L-CDR1；H-CDR2-成熟受体克隆(L1+2)从L-CDR1改进供体克隆中接受L-CDR1+2。

实施例14：通过共焦激光扫描显微镜和共定位分析揭示阿尔茨海默氏病的小鼠模型中的体内淀粉样斑修饰

选择的MS-R IgG1抗体在APP/PS2双重转基因小鼠(参考文献：Richards等.，Soc.Neurosci.Abstr.，27卷，程序号5467，2001)中测试体内淀粉样斑修饰。抗体(1mg/小鼠)i.v.施用，3天后脑用盐水灌注并准备用于冷冻切片。在另一个研究中，小鼠接受较高浓度的抗体，即在第0、3和6天i.v.注射2mg且在第9天杀死。通过双标记间接免疫荧光在未固定冷冻切片上评估抗体结合淀粉样斑的存在，使用缀合任一Cy3的山羊抗人IgG(H+L)(#109-165-003，Jackson Immuno Research)，接着用BAP-2-Alexa488免疫缀合物。通过共焦激光显微镜完成成像且通过IMARIS和COLOCALIZATION软件(Bitplane，Switzerland)处理图像以定量检测共定位。典型例子示于图10-14。发现所有测试的MS-R抗体在体内淀粉样斑的免疫修饰中阳性，尽管注意到一些可变性。

实施例15：研究HEK293细胞表面上不同单克隆抗体与淀粉样前体蛋白(APP)的结合：

APP在中枢神经***中广泛表达。抗体结合细胞表面APP可导致补体活化和健康脑区域中的细胞破坏。因此，治疗的A-β抗体必须对APP没有反应性。抗A-β的N-末端结构域的高亲和性抗体(如BAP-1、BAP-2)识别也在APP构架中的各表位。相反，抗中间表位的抗体(如4G8)和发明的抗体令人惊讶地不能识别细胞表面APP。因此，体内修饰A-β但不是APP的发明抗体优于非选择性抗体。

流式细胞仪的方法在本领域熟知。流式细胞仪测量荧光的相对单位(FL1-H)表明各抗体的细胞表面结合。与未转染的HEK293细胞相比，转染APP的HEK293上的荧光转移表明与细胞表面APP的不需要反应。例如，与未转染HEK293细胞(虚线)相比，抗N-末端结构域的抗体BAP-1和BAP-2显示在HEK293/APP(粗线)中的FL-1信号显著转移。4G8抗体(对中间A-β表位特异)和所有发明的抗体(对N-末端和中间A-β表位特异)没有显示明显的荧光转移。HE293/APP和HEK293细胞间的本底荧光差异是由于不同的细胞大小。FACScan仪器与CellquestPro软件包(都是Becton Dickinson)联合使用。

实施例16：涉及发明抗体分子的鉴定SEQ ID NOs的列表

附表10涉及本文所定义序列，用于一些特定的发明抗体分子。

Claims

1.一种能特异识别β-A4肽/Aβ4的2个区域的抗体分子，其特征在于，第一个区域包括SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列AEFRHDSGY或其片断且第二个区域包括SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列VHHQKLVFFAEDVG或其片断，

其中所述抗体分子包含：

SEQ ID NO：4所示的V_H区和SEQ ID NO：10所示的V_L区；或

SEQ ID NO：6所示的V_H区和SEQ ID NO：12所示的V_L区；或

SEQ ID NO：8所示的V_H区和SEQ ID NO：14所示的V_L区；或

SEQ ID NO：33所示的V_H区和SEQ ID NO：47所示的V_L区；或

SEQ ID NO：35所示的V_H区和SEQ ID NO：49所示的V_L区；或

SEQ ID NO：37所示的V_H区和SEQ ID NO：51所示的V_L区；或

SEQ ID NO：39所示的V_H区和SEQ ID NO：53所示的V_L区；或

SEQ ID NO：41所示的V_H区和SEQ ID NO：55所示的V_L区；或

SEQ ID NO：43所示的V_H区和SEQ ID NO：57所示的V_L区；或

SEQ ID NO：45所示的V_H区和SEQ ID NO：59所示的V_L区；或

SEQ ID NO：89所示的V_H区和SEQ ID NO：91所示的V_L区；或

SEQ ID NO：295所示的V_H区和SEQ ID NO：325所示的V_L区；或

SEQ ID NO：297所示的V_H区和SEQ ID NO：327所示的V_L区；或

SEQ ID NO：299所示的V_H区和SEQ ID NO：329所示的V_L区；或

SEQ ID NO：301所示的V_H区和SEQ ID NO：331所示的V_L区；或

SEQ ID NO：303所示的V_H区和SEQ ID NO：333所示的V_L区；或

SEQ ID NO：305所示的V_H区和SEQ ID NO：335所示的V_L区；或

SEQ ID NO：307所示的V_H区和SEQ ID NO：337所示的V_L区；或

SEQ ID NO：309所示的V_H区和SEQ ID NO：339所示的V_L区；或

SEQ ID NO：311所示的V_H区和SEQ ID NO：341所示的V_L区；或

SEQ ID NO：313所示的V_H区和SEQ ID NO：343所示的V_L区；或

SEQ ID NO：315所示的V_H区和SEQ ID NO：345所示的V_L区；或

SEQ ID NO：317所示的V_H区和SEQ ID NO：347所示的V_L区；或

SEQ ID NO：319所示的V_H区和SEQ ID NO：349所示的V_L区；或

SEQ ID NO：323所示的V_H区和SEQ ID NO：353所示的V_L区。

2.如权利要求1所述的抗体分子，其特征在于，

所述抗体分子包含：

SEQ ID NO：3所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：9所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：5所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：11所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：7所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：13所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：32所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：46所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：34所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：48所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：36所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：50所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：38所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：52所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：40所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：54所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：42所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：56所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：44所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：58所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：88所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：90所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：294所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：324所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：296所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：326所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：298所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：328所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：300所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：330所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：302所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：332所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：304所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：334所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：306所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：336所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：308所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：338所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：310所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：340所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：312所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：342所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：314所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：344所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：316所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：346所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：318所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：348所示的核酸分子编码的V_L区；或

SEQ ID NO：322所示的核酸分子编码的V_H区和SEQ ID NO：352所示的核酸分子编码的V_L区。

3.如权利要求1所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子识别β-A4的2个区域内至少2个连续氨基酸。

4.如权利要求1或2所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子识别第一个区域和第二个区域中的氨基酸序列，第一个区域中的氨基酸序列包括：AEFRHD、EF、EFR、FR、EFRHDSG、EFRHD或HDSG且第二个区域中的氨基酸序列包括：HHQKL、LV、LVFFAE、VFAED、VFFA或FFAEDV。

5.权利要求1所述的抗体分子，其特征在于，所述抗体分子是完整抗体(免疫球蛋白)、F(ab)-片断、F(ab)₂-片段、单链抗体、嵌合抗体、CDR-移植抗体、二价抗体-构建物、合成抗体或交叉克隆抗体。

6.如权利要求1所述的抗体分子，其特征在于，所述β-A4的至少2个区域来自构象表位或不连续表位。

7.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的抗体分子。

8.一种载体，其特征在于，所述载体包括权利要求7所述的核酸分子。

9.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞包括权利要求8所述的载体。

10.一种制备权利要求1所述抗体分子的方法，其特征在于，所述方法包括在能合成所述抗体分子和从所述培养物中回收所述抗体分子的条件下，培养权利要求9所述的宿主细胞。

11.一种组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述抗体分子或由权利要求10所述方法产生的抗体分子。

12.如权利要求11所述的组合物，其特征在于，所述组合物是药物或诊断组合物。

13.使用权利要求1所述的抗体分子或由权利要求10所述方法产生的抗体分子、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于，用于制备药物组合物以预防和/或治疗与淀粉样生成和/或淀粉样斑形成相关的疾病。

14.使用权利要求1所述的抗体分子或由权利要求10所述方法产生的抗体分子，其特征在于，用于制备诊断组合物以检测与淀粉样生成和/或淀粉样斑形成相关的疾病。

15.使用权利要求1所述的抗体分子或由权利要求10所述方法产生的抗体分子，其特征在于，用于制备药物组合物以分解β-淀粉样斑。

16.使用权利要求1所述的抗体分子或由权利要求10所述方法产生的抗体分子，其特征在于，用于制备药物组合物以被动免疫抗β-淀粉样斑形成。

17.如权利要求15或16所述的用途，其特征在于，所述疾病是痴呆、阿尔茨海默氏病、运动神经病、唐氏综合症、克-雅氏病、淀粉样变病荷兰型的遗传性脑出血、帕金森氏病、HIV-相关痴呆、ALS或与衰老相关的神经元疾病。

18.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的抗体分子、权利要求7所述的核酸分子、权利要求8所述的载体或权利要求9所述的宿主细胞。

19.一种权利要求1所述的抗体分子的最优化方法，其特征在于，所述方法包括步骤：

(a)构建多种获得自权利要求1所述的抗体的Fab抗体片段文库；

(b)通过抗Aβ/Aβ4淘洗测试所得Fab最优化文库；

(c)鉴定最佳化克隆；和

(d)表达选择的最佳化克隆。

20.如权利要求19所述的方法，其特征在于，所述方法进一步包括步骤(a)由此最佳化克隆通过盒诱变进一步最优化。

21.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(b)中所述Aβ/Aβ4是聚集的Aβ/Aβ4。

22.如权利要求19所述的方法，其特征在于，步骤(c)中所述鉴定是通过koff-排列完成的。