BR112012005668A2 - '' linhagem celular, anticorpo, uso de um anticorpo, kit, método de detecção de um anticorpo terapêutico, método de determinação imunológica de um anticorpo terapêutico, composição de anticorpo, uso de uma composição de anticorpo'' - Google Patents

Abstract

LINHAGEM CELULAR, ANTICORPOS, USOS DE UM ANTICORPO, KIT, MÉTODO PARA DETECTAR UM ANTICORPO TERAPÊUTICO, MÉTODO PARA DETERMINAR IMUNOLOGICAMENTE UM ANTICORPO TERAPÊUTICO, COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO E USO DE UMA COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO. São relatadas no presente as linhagens celulares DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008, bem como os anticorpos obtidos das linhagens celulares e o uso de um anticorpo obtido das linhagens celulares em um imunoensaio. Também são relatados anticorpos que se ligam a lgG humano ou de chimpanzé e que não se ligam a lgG canino e de sagui e anticorpos que se ligam especificamente a um lgG1 que compreende um domínio constante de cadeia leve kappa.

Description

"LINHAGEM CELULAR, ANTICORPOS, USOS DE UM ANTICORPO, KIT, MÉTODO PARA DETECTAR UM ANTICORPO TERAPÊUTICO, MÉTODO

PARA DETERMINAR IMUNOLOGICAMENTE UM ANTICORPO TERAPÊUTICO, COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO E USO DE UMA 5 COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO" São relatados no presente anticorpos que se ligam especificamente à região constante de um fragmento de Fab lgG de anticorpos humanos e de chimpanzés da classe lgG e seu uso em imunoensaios.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Desde o desenvolvimento dos primeiros anticorpos monoclonais por Koehler e Milstein em 1974, muitos esforços vêm sendo dedicados ao desenvolvimento de anticorpos que sejam apropriados para terapia em seres humanos. Os primeiros anticorpos monoclonais que se tornaram disponíveis haviam sido desenvolvidos em ratos e camundongos. Nos últimos dez anos, um número cada vez maior de anticorpos monoclonais humanos ou anticorpos monoclonais humanizados chegou ao mercado. Exemplos bem conhecidos incluem, por exemplo, Herceptin® e MabThera® da F. Hoffmann-La Rache AG, Basileia.

Uma quantidade muito significativa de anticorpos monoclonais humanos ou humanizados encontra-se em investigação e necessita ser estudada em animais experimentais, antes de poder ser considerada a entrada em seres humanos para os primeiros propósitos de teste. Necessitam ser estudados critérios importantes como a biodisponibilidade e liberação de anticorpos, apenas para mencionar dois deles. Muitos desses estudos necessitam da quantificação do anticorpo terapêutico nos antecedentes dos próprios anticorpos do animal experimental. Na maior parte dos casos, são utilizados mamíferos como animais experimentais. A toxicologia frequentemente é determinada em primeiro lugar em roedores como ratos ou camundongos. Nos estágios mais avançados de desenvolvimento de drogas, especialmente antes da introdução da droga em seres humanos, até macacos necessitam ser incluídos nesses estudos clínicos prévios.

Os mamíferos normalmente contêm cerca de dez a cerca de trinta 5 miligramas de anticorpos por mililitro na circulação. Anticorpos monoclonais terapêuticos tipicamente necessitam ser testados com níveis de soro que variam de cerca de um nanograma por mililitro a cerca de cem microgramas por mililitro. O anticorpo terapêutico necessita, portanto, ser detectado contra um antecedente de anticorpos de animais experimentais que se encontram em quantidade de mais de cerca de cem vezes a dez milhões de vezes.

A detecção de um anticorpo terapêutico humano ou humanizado nos antecedentes de um anticorpo de animal experimental representa uma tarefa muito significativa para o farmacologista. A detecção de um anticorpo humano ou humanizado torna-se cada vez mais difícil quanto mais o animal de teste for relacionado a H. sapiens.

Em WO 2008/031532, é relatado um ensaio de anticorpo antidrogas. A detecção de um anticorpo terapêutico em animais experimentais é relatada em WO 2006/066912. Em US 5.332.665, são relatados anticorpos monoclonais de alta afinidade específicos para espécies.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO É relatado em primeiro lugar um epítopo de conformação sobre anticorpos da classe G de imunoglobulina de seres humanos e chimpanzés que não estão presentes em animais experimentais comumente utilizados. Em segundo lugar, são relatados anticorpos anti-lgG humanos sem reação cruzada e anticorpos anti-lgG de chimpanzés que se ligam a esse epítopo. Em terceiro lugar, são relatados ensaios utilizando esses anticorpos.

Um aspecto relatado no presente é um anticorpo que se liga a lgG humano ou de chimpanzés (imunoglobulina da subclasse G) e não se liga a lgG canino e de saguis.

Em uma realização, o anticorpo não se liga a lgG canino, de macacos Rhesus, saguis, babuínos e cinomolgo. Em outra realização, o anticorpo liga-se especificamente a lgG humano e de chimpanzés. Em uma 5 realização adicional, o valor K0 de ligação a lgG humano ou de chimpanzé é de 1o-9 mol/1 ou menos, determinado por meio de ressonância de plasma de superfície e o valor Ko de ligação a lgG canino, de macacos Rhesus, saguis, babuínos e cinomolgos é de 1o-6 mol/1 ou mais. Em uma realização, o valor K0 de ligação a lgG humano ou de chimpanzés é de 1o-9 mol/1 a 1o-13 mol/1. Em 1o outra realização, o valor Ko de ligação a lgG canino, de macacos Rhesus, saguis, babuínos e cinomolgos não pode ser determinado por meio de ressonância de plasma de superfície. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Outro aspecto relatado no presente é um anticorpo que se liga especificamente a lgG1 (imunoglobulina da subclasse G1) que compreende um domínio constante de cadeia leve kappa.

Em uma realização, o anticorpo liga-se adicionalmente a uma lgG2. Em outra realização, o anticorpo liga-se adicionalmente a uma lgG4. Em outra realização, o anticorpo não se liga a uma lgG3. Em uma realização, o anticorpo não se liga a uma lgG1 que compreende um domínio constante de cadeia leve lambda. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

Os anticorpos relatados no presente obtidos a partir das linhagens celulares DSM ACC3006 (M-1.3.2), DSM ACC3007 (M-1.5.8) e DSM ACC3008 (M-1. 7.1 O) exibem reatividade cruzada reduzida em comparação, por exemplo, com o anticorpo M-R 1OZ8E9 produzido pela linhagem celular DSM ACC2708, ligam-se a diferentes epítopos na região Fab, não são influenciados por um local de glicosilação vizinho e podem ser misturados em um imunoensaio para determinação de anticorpos terapêuticos Fab, pois os locais de ligação de cada um dos anticorpos estão presentes apenas uma vez no fragmento de Fab.

Aspectos individuais conforme relatado no presente são as linhagens celulares DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008, bem s como os anticorpos correspondentes obtidos das linhagens celulares e o uso desses anticorpos em um imunoensaio.

Um aspecto adicional é um kit que compreende: a) um anticorpo obtido da linhagem celular DSM ACC3006, DSM ACC3007, DSM ACC3008 ou DSM ACC2708 em forma biotinilada; 1o b) um anticorpo obtido da linhagem celular DSM ACC3006, DSM ACC3007, DSM ACC3008 ou DSM ACC2708 em forma digoxigenilada.

Outro aspecto relatado no presente é um método de detecção de um anticorpo terapêutico em uma amostra obtida de um animal experimental que compreende as etapas de: a) fornecimento da amostra a ser analisada; b) incubação da amostra com um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo conforme relatado no presente; c) incubação opcional da amostra com um reagente apropriado para detecção seletiva de anticorpo terapêutico ligado a antígeno, ativo ou total; e d) correlação do complexo formado em (b) ou (c) com a concentração do anticorpo terapêutico, opcionalmente por meio de uma curva de calibragem.

Ainda outro aspecto relatado no presente é um método de determinação imunológica de um anticorpo terapêutico em amostras obtidas de um animal experimental utilizando um imunoensaio de ponte de antígenos que compreende um anticorpo de captura e um anticorpo traçador , em que o anticorpo de captura e o anticorpo traçador são ambos selecionados independentemente a partir de anticorpos que se ligam ao mesmo epítopo que um anticorpo conforme relatado no presente.

Em uma realização, o imunoensaio é um imunoensaio em sanduíche. Em outra realização, a conjugação do anticorpo com o seu parceiro 5 de conjugação é realizada por meio de ligação química por meio de grupos N- terminais e/ou E-amino (lisina), grupos E-amino de diferentes lisinas, grupos funcionais carbóxi, sulfidrila, hidroxila e/ou fenólicos da cadeia principal de aminoácidos do anticorpo e/ou grupos de álcool de açúcar da estrutura de carboidratos do anticorpo. Em uma realização adicional, o anticorpo de captura 1o é imobilizado por meio de um par de ligações específico. Em uma realização, o anticorpo de captura é conjugado a biotina e a imobilização é realizada por meio de avidina ou estreptavidina imobilizada. Em ainda outra realização, o anticorpo traçador é conjugado ao marcador detectável por meio de um par de ligações específico. Em uma realização, o anticorpo traçador é conjugado a digoxigenina e a ligação ao marcador detectável é realizada por meio de um anticorpo contra digoxigenina. Em outra realização, o anticorpo terapêutico é Fab. Em uma realização, o animal experimental é selecionado a partir do grupo que compreende os membros das famílias de saguis e micos, macacos do Velho Mundo, lêmures-anões e -ratos, gibões e primatas menores (lesser apes), lêmures verdadeiros e seus cruzamentos. Em uma realização, o animal experimental é selecionado a partir de cães, macacos Rhesus, saguis, babuínos e cinomolgos. Em uma realização, o animal experimental é um macaco Macaca. Em uma realização adicional, o anticorpo que se liga ao anticorpo terapêutico e não se liga à imunoglobulina do animal experimental é um anticorpo conforme relatado no presente. Em uma realização, o anticorpo terapêutico é um anticorpo humano ou humanizado. Em uma realização adicional, o anticorpo humano ou humanizado é um anticorpo monoclonal. Em uma realização, é detectado o anticorpo terapêutico total, em uma outra o anticorpo terapêutico ativo é detectado e, em uma realização adicional, é detectado o anticorpo terapêutico que é ligado ao seu antígeno.

Outro aspecto conforme relatado no presente é o uso de um anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga à imunoglobulina 5 de um animal experimental para determinar a concentração de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno em uma amostra obtida de um animal experimental por meio do qual o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo conforme relatado no presente. Em uma realização, o anticorpo é um anticorpo conforme relatado no presente.

Um aspecto adicional conforme relatado no presente é uma composição de anticorpo que compreende uma mistura do anticorpo produzido pela linhagem celular DSM ACC3006, linhagem celular DSM ACC3007, linhagem celular DSM ACC3008 e/ou linhagem celular DSM ACC2708.

Outro aspecto é o uso de uma composição de anticorpo conforme relatado no presente em um método conforme relatado no presente.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO O anticorpo anti-lgG humano sem reação cruzada indicado como M-R10Z8E9 (obtido a partir da linhagem celular DSM ACC2708) liga-se a um epítopo no domínio CH2 de imunoglobulina humana da classe G perto do local de glicosilação Asn297. Os anticorpos relatados no presente M-1.3.2, M-1.5.8 e M-1. 7.1 O exibem reatividade cruzada reduzida em comparação com o anticorpo M-R10Z8E9, ligam-se a um epítopo diferente na região Fab, não são influenciados por um local de glicosilação vizinho e podem ser misturados em um imunoensaio para determinação de anticorpos terapêuticos, especialmente anticorpos terapêuticos Fab, pois os locais de ligação de cada um dos anticorpos estão presentes no fragmento de Fab.

A expressão "anticorpo terapêutico" indica um anticorpo que é testado em estudos clínicos para aprovação como produto terapêutico humano que pode ser administrado a um indivíduo para o tratamento de doenças. Em uma realização, o anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal. Em uma realização adicional, o anticorpo terapêutico é selecionado a partir de um anticorpo obtido a partir de um primata grande, um anticorpo obtido de um 5 animal transformado com um local de anticorpo humano, um anticorpo monoclonal humano ou um anticorpo monoclonal humanizado. Em uma realização, o anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal humano. Em uma realização adicional, o anticorpo terapêutico é um anticorpo monoclonal humanizado. Anticorpos terapêuticos estão sendo utilizados amplamente para 1o o tratamento de diversas doenças tais como doenças oncológicas (tais como malignidades hematológicas e sólidas, incluindo linfoma não de Hodgkin, câncer de mama e câncer colorretal), doenças imunológicas, doenças nervosas centrais, doenças vasculares ou doenças infecciosas. Esses anticorpos são, por exemplo, anticorpos contra CD20, CD22, HLA-DR, CD33, CD52, EGFR, G250, GD3, HER2, PSMA, CD56, VEGF, VEGF2, CEA, antígeno Levis Y, receptor de IL-6 (IL6R) ou receptor de IGF-1 (IGF1 R).

O termo "anticorpo" engloba as diversas formas de estruturas de anticorpos, incluindo anticorpos inteiros e fragmentos de anticorpos. O anticorpo conforme relatado no presente é, em uma realização, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo quimérico ou um anticorpo com antígeno de células T esgotado. A engenharia genética de anticorpos é descrita, por exemplo, em Morrison, S. L. et ai, Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A.

81 (1984) 6851-6855; US 5.202.238 e US 5.204.244; Riechmann, L. et ai, Nature 332 (1 988) 323-327; Neuberger, M. S. et ai, Nature 314 (1 985) 268-270; Lonberg, N., Nat. Biotechnol. 23 (2005) 1117-1125.

As formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (por exemplo, de roedores) são anticorpos quiméricos que contêm sequências parciais derivadas de um anticorpo não humano e de um anticorpo humano. Na maior parte, os anticorpos humanizados são derivados de um anticorpo humano (anticorpo receptor), em que os resíduos de uma região hipervariável são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo doador) tal como camundongo, rato, coelho ou primata não 5 humano, que possui a especificidade e afinidade desejadas. Em alguns casos, os resíduos de região de estrutura (FR) do anticorpo humano são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender modificações adicionais, tais como resíduos de aminoácidos, que não são encontradas no anticorpo receptor nem no 1o anticorpo doador. Essas modificações resultam em variantes desse anticorpo doador ou receptor, que são homólogas mas não idênticas à sequência parenta! correspondente. Essas modificações são feitas para refinar ainda mais o desempenho do anticorpo.

Geralmente, o anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos dentre pelo menos um, tipicamente dois domínios variáveis, em que todos ou substancialmente todos os laços hipervariáveis correspondem aos de um anticorpo doador não humano e todas ou substancialmente todas as FRs são as de um anticorpo receptor humano. O anticorpo humanizado também compreenderá opcionalmente pelo menos uma parte de uma região constante de anticorpo, tipicamente a de um anticorpo humano.

Métodos de humanização de anticorpos não humanos foram descritos na técnica. Em uma realização, um anticorpo humanizado contém um ou mais resíduos de aminoácidos nele introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Esses resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente denominados resíduos "importados", que são simplesmente retirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo-se o método de Winter e colaboradores,

por meio da substituição de sequências de regiões hipervariáveis pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Consequentemente, esses anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos, em que substancialmente menos de um domínio variável humano intacto tenha sido 5 substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos de regiões hipervariáveis e possivelmente alguns resíduos de região de cadeia principal são substituídos por resíduos de locais análogos em anticorpos de roedores ou primatas não humanos.

A expressão "anticorpo monoclonal", da forma utilizada no presente, designa um anticorpo obtido a partir de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos, exceto por possíveis mutações de ocorrência natural que podem estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos para um único local antigênico. Além disso, ao contrário das preparações de anticorpos policlonais que incluem diferentes anticorpos dirigidos a diferentes locais antigênicos (determinantes ou epítopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado a um único local antigênico sobre o antígeno. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosos por poderem ser sintetizados de forma não contaminada por outros anticorpos. O adjetivo "monoclonal" indica a característica do anticorpo como sendo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos e não deve ser considerado exigindo a produção do anticorpo por meio de qualquer método específico.

A expressão "animal experimental", da forma utilizada no presente, indica os membros das famílias da ordem de primatas que compreende saguis e micos (família dos calitriquídeos), macacos do Novo

Mundo (família dos cebídeos), macacos do Velho Mundo (família dos cercofitecídeos, tais como macacos Macaca), lêmures-anões e -ratos (família dos cheirogaleídeos), lêmures de Madagascar (família dos daubentonídeos), galagos e galagos do Senegal (família dos galagonídeos), gibões e primatas 5 inferiores (família dos hilobatídeos), indris, sifakas e seus parentes (família dos indrídeos), lêmures verdadeiros (família dos lemurídeos), lórises (família dos lorídeos), lêmures esportivos (família dos megaladapídeos) e társios (família dos tarsídeos), bem como seus cruzamentos.

Em uma realização, o animal experimental é selecionado a partir do grupo que compreende os membros das famílias de saguis e micos, macacos do Velho Mundo, lêmures-anões e -ratos, gibões e primatas menores, lêmures verdadeiros e seus cruzamentos. Nesta realização, são excluídos os parentes mais próximos dos seres humanos, os grandes primatas, especialmente o grupo dos chimpanzés, bonobos, gorilas e orangotangos.

O termo "amostra" indica qualquer amostra de tecido ou líquido removida de um animal experimental. Em uma realização, a amostra será uma amostra de líquido como saliva, urina, sangue integral, plasma ou soro. Em uma realização adicional, a amostra será sangue integral, plasma ou soro.

Um "anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo de um animal experimental" ligar-se-á a um anticorpo terapêutico com uma constante de dissociação (= Koiss) de pelo menos 1o-9 mol/1, em uma outra realização com Koiss de pelo menos 1o- 10 mol/1. Ao mesmo tempo, a propriedade de não ligação ao anticorpo do animal experimental é garantida por Koiss de 1o- mol/1 ou pior. Além disso, em uma realização do anticorpo que 7 se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo de um animal experimental possuirá espaço Koiss de pelo menos cem vezes entre a sua reatividade para a imunoglobulina da classe G de um animal experimental e para imunoglobulina da classe G humana ou de chimpanzés, respectivamente.

Geralmente, a expressão "que se liga a" indica que um anticorpo liga-se ao seu antígeno ou ao receptor de anticorpo correspondente, o que se pretender no seu contexto correspondente, com uma constante de dissociação (= K0 = Koiss.) de 1o-9 mol/1 ou menos, em outra realização com Ko de pelo 10 5 menos 1o- mol/1. Ao mesmo tempo, a propriedade de ausência de ligação é garantida por K0 de 1o-7 mol/1 ou mais (tal como 1o- 5 mol/1). Além disso, em uma realização, o anticorpo que se liga a um primeiro anticorpo e não se liga a um segundo anticorpo possuirá espaço K0 de pelo menos cem vezes entre a sua reatividade para a primeira imunoglobulina da classe G e para a segunda imunoglobulina da classe G.

As propriedades de ligação de um anticorpo, especialmente Koiss.

em uma realização, são determinadas por meio de ressonância de plasma de superfície sobre um instrumento BIAcore®. Neste método, as propriedades de ligação são avaliadas por alterações da ressonância de plasma de superfície (SPR). É conveniente ligar o anticorpo sob investigação à fase sólida (denominada floco) e determinar a ligação de um anticorpo monoclonal, um anticorpo policlonal ou mesmo de soro que compreende lgG a esse floco revestido.

O anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo do animal experimental sob investigação pode ser um anticorpo monoclonal, fragmentos desses anticorpos, bem como construções genéticas que compreendem o domínio de ligação desse anticorpo. Qualquer fragmento de anticorpo que retém o critério acima de ligação ao anticorpo terapêutico e de não ligação ao anticorpo do animal experimental pode ser utilizado.

Vários aspectos relacionados à aplicação de um anticorpo terapêutico em um animal experimental podem necessitar ser determinados durante estudos clínicos prévios. Em certos ambientes, pode ser relevante analisar a quantidade total de anticorpo terapêutico presente ou pode ser importante analisar certos fragmentos de um anticorpo terapêutico ou certas modificações de um anticorpo terapêutico, ou a concentração de anticorpo terapêutico ligada a um antígeno, ou a fração de um anticorpo terapêutico ainda capaz de ligar-se a um antígeno. Em uma realização, os anticorpos e 5 métodos relatados no presente podem ser utilizados para detectar o anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno, respectivamente.

A expressão "anticorpo terapêutico total" indica qualquer anticorpo detectado, independentemente se o anticorpo é ativo (ou seja, ainda reativo com o seu antígeno), inativo e/ou ligado a antígeno.

A expressão "anticorpo terapêutico ativo" indica o anticorpo terapêutico presente em um animal experimental que ainda é capaz de ligar o seu antígeno. Esses anticorpos, por exemplo, não possuem ligado o seu antígeno nem nenhuma outra molécula no seu local de ligação de antígenos.

A expressão "anticorpo terapêutico ligado a antígeno" indica o anticorpo terapêutico presente na circulação de um animal experimental que é ligado ao seu antígeno.

Anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno conforme definido acima pode ser detectado diretamente com os anticorpos e em métodos relatados no presente. Além disso, é possível detectar outras formas de anticorpos terapêuticos não ativos, tais como anticorpos terapêuticos ligados a anticorpos antidrogas ou anticorpos anti-idiotípicos ou especialmente anticorpos antidrogas neutralizantes.

Além disso, também é possível determinar indiretamente qualquer "anticorpo terapêutico inativo". Esse anticorpo terapêutico inativo pode ser, por exemplo, um anticorpo terapêutico ligado ao seu antígeno ou o anticorpo terapêutico ligado a um antígeno com reação cruzada ou o anticorpo terapêutico bloqueado por um anticorpo auto ou anti-idiotípico contra o anticorpo terapêutico. No caso em que o anticorpo total representa mais que a soma de anticorpo ativo e anticorpo ligado a antígenos, estará presente uma fração adicional de anticorpo que compreende o anticorpo inativo não ligado ao seu antígeno correspondente.

O anticorpo terapêutico total pode ser detectado, por exemplo, em 5 um chamado sistema de imunoensaio competitivo ou em um chamado sistema de ensaio do tipo sanduíche. Esse ensaio pode ser realizado em uma realização sem etapas de lavagem (imunoensaio homogêneo) ou em uma outra realização com etapas de lavagem (imunoensaio heterogêneo).

Em uma realização, o anticorpo terapêutico total é detectado em um imunoensaio do tipo sanduíche, em que o anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo do animal experimental é utilizado nos dois lados desse ensaio em sanduíche. O anticorpo utilizado em um lado desse sanduíche é ligado ou capaz de ligar-se a uma fase sólida (frequentemente denominado anticorpo de captura), em que o anticorpo no outro lado desse sanduíche é marcado de forma a facilitar a detecção direta ou indireta (o chamado anticorpo de detecção). A quantidade de anticorpo de detecção ligada nesse procedimento de ensaio em sanduíche é diretamente correlacionada à quantidade de anticorpo terapêutico na amostra investigada.

A detecção de anticorpo terapêutico ativo em uma amostra pode ser atingida por meio de procedimentos convenientes do estado da técnica. A detecção de anticorpo terapêutico total ou da fração de anticorpo terapêutico ligada ao seu antígeno é, entretanto, um tanto complicada e necessita de configurações de ensaio bastante diferentes e, especialmente, reagentes específicos para cada um dos diferentes ensaios. Com os anticorpos relatados no presente que estão se ligando a um anticorpo terapêutico e não se ligam ao anticorpo do animal experimental, é possível determinar a fração de anticorpo terapêutico ativo, anticorpo terapêutico total ou anticorpo terapêutico ligado a antígeno em sistemas de teste que são análogos entre si. Este tipo de determinação comparativa de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno deverá apresentar vantagens, pois são realizadas comparações quantitativas entre essas diversas frações de anticorpo terapêutico.

Em uma realização, é configurado um formato de ensaio do tipo 5 sanduíche para detectar o anticorpo terapêutico ativo. Em uma realização adicional, o anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo do animal experimental é utilizado como anticorpo de captura e o lado de detecção desse ensaio em sanduíche faz uso do antígeno em uma forma marcada ou após a ligação do antígeno faz uso de um segundo 1o anticorpo que não se liga ao epítopo reconhecido pelo anticorpo terapêutico ou concorre com ele, em que o segundo anticorpo é especificamente detectável e/ou é marcado de forma que facilita a detecção direta ou indireta.

O anticorpo terapêutico ligado a antígeno em uma realização é detectado em um formato de ensaio do tipo sanduíche, utilizando o anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo do animal experimental como reagente de captura. Na detecção em uma realização, é utilizado um segundo anticorpo que se liga ao antígeno em um epítopo que não concorre com o epítopo do anticorpo terapêutico. O segundo anticorpo é marcado em uma realização de forma a facilitar a detecção direta ou indireta.

Para detecção direta, o grupo de marcação pode ser selecionado a partir de quaisquer grupos marcadores detectáveis conhecidos, tais como tinturas, grupos de marcação luminescente tais como grupos quimioluminescentes, por exemplo ésteres de acridínio ou dioxetanos, ou tinturas fluorescentes, tais como fluoresceína, coumarina, rodamina, oxazina, resorufina, cianina e seus derivados.

Outros exemplos de grupos de marcação são complexos metálicos luminescentes, tais como complexos de rutênio ou európio, enzimas tais como as utilizadas para ELISA ou para CEDIA (lmunoensaio Doador de Enzimas Clonado) e radioisótopos.

Quelatos metálicos que podem ser detectados por meio de eletroquimioluminescência também são, em uma realização, grupos emissores de sinais utilizados como marcadores detectáveis, com preferência específica sendo dada a quelatos de rutênio. Em uma realização, o grupo de marcação é um (bispiridil)32+ quelato de rutênio.

5 Sistemas de detecção indireta compreendem, por exemplo, a marcação do reagente de detecção, tal como o anticorpo de detecção, com um primeiro parceiro de um par de ligação. Exemplos de pares de ligação apropriados são hapteno ou antígeno e anticorpo, biotina ou análogos de biotina tais como aminobiotina, iminobiotina ou destiobiotina/avidina ou estreptavidina, açúcar/lectina, ácido nucleico ou análogo de ácido nucleico/ácido nucleico complementar e receptor/ligante, tal como receptor de hormônio esteroide/hormônio esteroide. Em uma realização, o primeiro membro de pares de ligação é selecionado a partir de hapteno, antígeno e hormônio. Em uma realização, o hapteno é selecionado a partir de digoxina, biotina e seus análogos. O segundo parceiro desse par de ligação, tal como um anticorpo, estreptavidina etc., normalmente é marcado para permitir a detecção direta, por exemplo, pelo marcador mencionado acima.

Em todos os métodos de detecção imunológica acima, são selecionadas condições de reagente que permitem a ligação dos reagentes empregados, por exemplo, para a ligação de um anticorpo ao seu antígeno correspondente. Os técnicos no assunto referem-se ao resultado desse evento de ligação utilizando o termo complexo. O complexo formado em um método de ensaio conforme relatado no presente é correlacionado por procedimentos do estado da técnica à concentração correspondente do anticorpo terapêutico.

Essa correlação pode ser realizada, por exemplo, por meio da preparação e determinação do complexo em uma série de diluição do complexo correspondente com o método conforme relatado no presente e da correlação do resultado obtido com a concentração dos componentes de complexo individuais. Dependendo do reagente de detecção empregado, esta etapa de correlação resultará na concentração de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno.

Como apreciarão os técnicos no assunto, os métodos relatados 5 no presente não apenas revelarão as concentrações de anticorpo terapêutico total, ligado a antígeno, ativo ou mesmo inativo. Devido ao uso de um único reagente, o anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo do animal experimental, nos diferentes ensaios, os valores obtidos podem ser facilmente comparados entre si e mesmo as suas razões podem ser determinadas. Em uma realização adicional, o método do presente refere-se à razão entre anticorpo terapêutico ativo e total. Esta razão pode bem servir de indicador da eficácia de um anticorpo terapêutico.

Durante o curso dos experimentos, revelou-se que um ou mais epítopos que está(ão) presente(s) sobre todas as classes de anticorpo humano e de chimpanzé da classe G não está(ão) presente(s) sobre o anticorpo de nenhum animal experimental. Este(s) epítopo(s) é(são) caracterizado(s) pela sua ligação aos anticorpos produzidos pelas linhagens celulares depositadas DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008. É, portanto, um aspecto conforme relatado no presente um anticorpo produzido pela linhagem celular DSM ACC3006, DSM ACC3007 ou DSM ACC3008.

Como o(s) epítopo(s) reconhecido(s) pelas três linhagens celulares depositadas é(são) exclusivo(s) na região Fab de um anticorpo, um outro aspecto relatado no presente é(são) o(s) epítopo(s) que se liga(m) aos anticorpos obtidos das linhagens celulares depositadas DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008. Em um aspecto conforme relatado no presente, o anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo de um animal experimental é caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um dos anticorpos produzidos pelas linhagens celulares DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008.

Pode-se utilizar, por exemplo, um método no qual a sobreposição de epítopos de dois anticorpos que se ligam ao mesmo antígeno alvo é determinada com a ajuda de um sistema de teste competitivo. Com este 5 propósito, por exemplo com a ajuda de um imunoensaio de enzimas, é testada a extensão à qual o anticorpo em questão concorre com o anticorpo conhecido pela ligação a um antígeno alvo imobilizado, empregando, por exemplo, um anticorpo produzido por uma das linhagens celulares relatadas no presente.

Com este propósito, um antígeno alvo adequadamente imobilizado é incubado com o anticorpo conhecido em forma marcada e um excesso do anticorpo em questão. Por meio de detecção da marcação ligada, pode-se determinar facilmente a extensão à qual o anticorpo em questão pode deslocar o anticorpo conhecido da ligação. Caso haja um deslocamento de mais de 20%, em outra realização de mais de 30%, à mesma concentração ou em deslocamento de mais de 70%, em outra realização de mais de 80%, sob concentrações mais altas, em uma realização no caso de excesso de 103 a 105 vezes do anticorpo em questão, denominado anticorpo conhecido, a sobreposição de epítopos está presente e os dois anticorpos ligam-se ao mesmo epítopo ou a uma parte sobreposta do mesmo epítopo.

A especificidade dos anticorpos obtidos das linhagens celulares depositadas DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008 pode ser exibida em um ELISA em sanduíche, cada qual empregando uma variante biotinilada e outra digoxigenilada dos anticorpos correspondentes e soro de espécies diferentes. No ensaio (vide a Figura 1), anticorpos de captura e de detecção são obtidos da mesma linhagem celular que se liga a epítopos idênticos. Para que um ensaio de detecção e quantificação de lgG humano no soro de um animal experimental seja geralmente aplicável, esse ensaio necessita de um anticorpo anti-lgG humano cujo local de ligação seja independente de qualquer modificação de anticorpo secundário, tal como glicosilação ou desamidação. Caso contrário, seria necessário otimizar o ensaio para detectar e quantificar cada novo anticorpo terapêutico. Além disso, cada um dos anticorpos anti-lgG humanos relatados no presente também é 5 diferente do anticorpo terapêutico analisado e pode ser empregado como padrão de referência e controle positivo. Os resultados de especificidade obtidos com este ensaio são exibidos na Figura 2.

Pode-se observar que os anticorpos relatados no presente são altamente específicos para imunoglobulina humana e de chimpanzé da imunoglobulina classe G e exibem melhor especificidade que o anticorpo M- R1OZ8E9 e não se ligam à imunoglobulina classe G de um animal experimental. Todos os valores dos animais experimentais estão bem abaixo de um valor padrão obtido com ABTS sem a presença de peroxidase.

A especificidade dos anticorpos conforme relatado no presente pode também ser exibida em um experimento de ressonância de plasma de superfície utilizando a tecnologia BIAcore. Nas Figuras 3 a) a c), são exibidos os diagramas de BIAcore dos anticorpos M-1.7.10 (obtido a partir de DSM ACC3008), M-1.3.2 (obtido a partir de DSM ACC3006) e M-1.5.8 (obtido a partir de DSM ACC3007) a partir dos quais pode-se observar que os anticorpos são específicos para imunoglobulina classe G humana e de chimpanzé.

Utilizando experimentos dot blot, demonstrou-se que o(s) epítopo(s) ligado(s) pelos anticorpos conforme relatado no presente é(são) um epítopo de conformação, pois a ligação é imunoglobulina humana desnaturada perdida (Figura 4).

Outro aspecto conforme relatado no presente é um ensaio de quantificação de anticorpos humanos ou seu derivado tal como fragmento de Fab em uma amostra obtida de um animal experimental que compreende um anticorpo biotinilado conforme relatado no presente como anticorpo de captura e um anticorpo digoxigenilado conforme relatado no presente como anticorpo traçador. Na Figura 5, é exibida a configuração de ensaio esquemático e uma curva de calibragem para este ensaio com exemplos de anticorpos conforme relatado no presente (anticorpo de captura: M-1.7.1 O biotinilado, analisado: 5 fragmento de Fab de anticorpo anti-IL 13Ra1 humano, anticorpo traçador: M-

1.3.2 diogoxigenilado). Este ensaio necessita de anticorpos de captura e traçador que se ligam ao fragmento de Fab de lgG humano sobre dois epítopos diferentes. Os anticorpos relatados no presente ligam-se ao menos parcialmente ao domínio de cadeia leve constante de um anticorpo humano ou de chimpanzé da imunoglobulina classe G e, portanto, são apropriados para este ensaio.

Outro aspecto conforme relatado no presente é um ensaio que compreende um anticorpo de captura e traçador que se liga especificamente a epítopos sobre diferentes domínios de lgG humano. Neste ensaio, apenas um anticorpo terapêutico intacto resultará em um resultado de ensaio positivo e um sinal detectável. Em uma realização, o anticorpo de captura e o anticorpo traçador são selecionados independentemente a partir dos anticorpos relatados no presente, por um lado, e do anticorpo M-R10Z8E9, por outro lado. Em um exemplo de ensaio de acordo com este aspecto para provar a integridade estrutural de lgG humano em um animal experimental, emprega-se como anticorpo de captura M-R1 OZ8E9 biotinilado, como analisado um anticorpo anti- IL 13Ra1 e como anticorpo traçador M-1.3.2 digoxigenilado (na Figura 6, é exibida a configuração de ensaio esquemático e uma curva de calibragem para este ensaio).

Um aspecto adicional conforme relatado no presente é um ensaio no qual o anticorpo anti-lgG humano é utilizado como padrão de referência e/ou controle positivo para imitar um anticorpo antidrogas (ADA). Isso pode ser útil durante o desenvolvimento do ensaio para revelar condições de ensaio ideais e robustez do teste, ou seja, para verificar o desempenho do ensaio com diferentes reagentes padrão/controles positivos. Esta configuração é especialmente vantajosa em vista do fato de que um ADA será policlonal e provavelmente dirigido contra ambos, o fragmento de Fab e a parte Fc.

5 Em um aspecto adicional conforme relatado no presente, um dos anticorpos obtidos a partir das linhagens celulares DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM ACC3008 é utilizado como o anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo do animal experimental em um método conforme relatado no presente.

Outro aspecto conforme relatado no presente é o uso de um anticorpo que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga ao anticorpo de um animal experimental para medir a concentração de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno em uma amostra obtida de um animal experimental. Em uma realização, o anticorpo utilizado neste método é selecionado a partir de um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo ou a um epítopo sobreposto conforme reconhecido por um dos anticorpos obtidos da linhagem celular DSM ACC3006, DSM ACC3007 ou DSM ACC3008.

Um aspecto adicional conforme relatado no presente refere-se ao uso de dois anticorpos que se ligam a um anticorpo terapêutico e não se ligam ao anticorpo de um animal experimental para medir a concentração de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno em uma amostra obtida de um animal experimental, em que um dos anticorpos é o anticorpo de captura e um dos anticorpos é o anticorpo traçador. Em uma realização, o anticorpo terapêutico é um fragmento de Fab.

Alternativamente, os anticorpos relatados no presente podem ser utilizados em um conjugado que compreende, como uma parte, uma imunoglobulina de referência de uma classe de imunoglobulina isolada. A imunoglobulina de referência fornece uma região constante específica de classe de imunoglobulina que pode ser ligada especificamente por um anticorpo anticlasse de imunoglobulina, tal como um anticorpo anti-imunoglobulina G humana. Desta forma, a imunoglobulina de referência fornece esse conjugado com um marcador específico de classe de imunoglobulina, que pode ser 5 identificada especificamente por um anticorpo específico de marcador. Caso o marcador seja uma região constante de imunoglobulina G, por exemplo, um anticorpo específico de marcador é um anticorpo anti-imunoglobulina G. Esse conjugado pode ser utilizado como padrão em um imunoensaio ou como um controle positivo em um imunoensaio.

Nos métodos conforme relatado no presente, podem também ser utilizadas diferentes moléculas de captura tais como anticorpos completos, fragmentos de F(ab')2, fragmentos de Fab ou mesmo anticorpos de cadeia isolada.

As linhagens de células de hibridoma preferidas relatadas no presente, MAK<H-IgG>M-1.3.2, MAK<H-IgG>M-1.5.8, MAK<H-IgG>M-1.7.1 O, que expressam os anticorpos M-1.3.2, M-1.5.8 e M-1.7.10, respectivamente foram depositadas, com base no Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento internacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimentos de patentes, junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha: Linhagem Celular Número de Data de Depósito Depósito MAB<h-Fc gama>M-R10Z8E9 DSM ACC2708 22.12.2004 MAK<H-IgG>M-1.3.2 DSM ACC3006 24.09.2009 MAK<H-IgG>M-1.5.8 DSM ACC3007 24.09.2009 MAK<H-IgG>M-1.7.10 DSM ACC3008 24.09.2009 As linhagens celulares e os anticorpos que podem ser obtidos a partir das mencionadas linhagens celulares são aspectos conforme relatado no presente.

Os métodos relatados no presente são exemplificados com um anticorpo contra a proteína a1 receptora de IL 13 (anticorpo anti-IL 13Ra1) conforme relatado em WO 2006/072564, um anticorpo contra o receptor de IL- 5 1R (anticorpo anti-IL 1R) conforme relatado em WO 2005/023872, o anticorpo contra o peptídeo ~-A4 amiloide (anticorpo anti-A~) conforme relatado em WO 2003/070760 ou US 2005/0169925, um anticorpo contra a glicoproteína P- selectina humana (anticorpo anti-P selectina) conforme relatado em WO 2005/100402 ou US 2005/0226876, um anticorpo contra o receptor IL-6 (anticorpo anti-IL6R) conforme relatado em WO 2004/096274 e um anticorpo contra o receptor IGF-1 (anticorpo anti-IGF1 R) conforme relatado em WO 2004/087756 ou em WO 2005/005635 (todos incorporados ao presente como referência).

Os exemplos e figuras a seguir são fornecidos para ajudar na compreensão da presente invenção, cujo escopo verdadeiro é definido nas reivindicações anexas. Compreende-se que podem ser realizadas modificações nos procedimentos descritos sem abandonar o espírito da presente invenção.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS Figura 1: ensaio totalmente genérico de quantificação de anticorpos humanos (lgG humano) em um animal experimental: a) formato de ensaio; b) reagente de captura e detecção: anticorpo M-R1 OZ8E9; c) anticorpo de reagente de detecção e captura M-1.7.10; anticorpos terapêuticos: triângulos vazios: anticorpo anti-IL 13Ra1, quadrados vazios: anticorpo antiabeta, quadrados sólidos: anticorpo anti-IL 1R, triângulos sólidos: anticorpo anti-IL6R.

Figure 2: resultados obtidos com um ensaio que emprega os anticorpos conforme relatado no presente; anticorpos utilizados da esquerda para a direita: M-R10Z8E9, M-1.3.2, M-1.5.8, M-1.7.10.

Figura 3: exemplos de diagramas de ressonância da superfície de plasma de superfície de anticorpos a) M-1.3.2, b) M-1.5.8 e c) M-

1. 7.1 O conforme relatado no presente.

5 Figura 4: Dot Blot de anticorpos anti-lgG humano; como exemplo de anticorpo de referência, foi selecionado um anticorpo contra P- selectina; o anticorpo de referência que sofreu Dot é uma forma nativa (coluna da esquerda) e desnaturada (coluna da direita) sobre uma membrana de nitrocelulose e detectado pelos anticorpos anti-lgG humanos digoxigenilados correspondentes; a) M-R10Z8E9, b) M-1.3.2, c) M-1.5.8, d) M-1.7.10.

Figura 5: ensaio de quantificação de derivados de anticorpos humanos em uma amostra obtida de um animal experimental: a) configuração de ensaio esquemático; b) curva de calibragem.

Figura 6: ensaio para provar a integridade estrutural de lgG humano em um animal experimental: a) configuração de ensaio esquemático; b) curva de calibragem.

Figura 7: seleção de anticorpos sem reatividade cruzada detectável a soro de cinomolgo.

EXEMPLO 1 Preparação do fragmento de F(ab')z de lgG humano (lmunogene): O anticorpo humano com comprimento total da classe G (lgG humano) em 100 mM de tampão citrato de sódio, pH 3,7, foi incubado com pepsina (1 j..lg de pepsina por mg de lgG). A fragmentação foi analisada por meio de filtragem de gel analítica e suspensa após noventa minutos por meio de ajuste do valor de pH em 6,5 por meio da adição de fosfato de potássio.

Após a diálise da mistura contra 1O mM de tampão citrato de sódio com 1O mM de cloreto de sódio, pH 5,5, a solução foi aplicada a uma coluna de cromatografia de SP-sepharose e as frações isoladas eluídas em um gradiente de sal foram analisadas individualmente por meio de filtragem de gel analítica.

O conjunto que contém os fragmentos de anticorpos F(ab')2 foi aplicado a uma matriz de afinidade com anticorpos policlonais imobilizados contra Fcy humano para eliminar quantidades de traços de fragmentos de Fcy. O fluxo foi reunido, 5 concentrado a cerca de 16 mg/ml e finalmente aplicado a uma coluna de filtragem de gel (Superdex 200).

EXEMPLO 2 Geração de anticorpos anti-lgG humano monoclonais: a) Imunização de camundongos: Fêmeas de camundongos NMRI, com oito a doze semanas de idade, foram primeiramente imunizadas por via intraperitoneal com 100 1-1g dos fragmentos de anticorpo F(ab')2 preparados de acordo com o Exemplo 1 misturados com CFA (Adjuvante de Freund Completo). Duas etapas de imunização intraperitoneal adicionais seguidas após seis e dez semanas, cada qual com 100 1-1g dos fragmentos de anticorpo F(ab')2 por camundongo misturados com IFA (adjuvante de Freund incompleto). Em seguida, foram realizadas imunizações de incentivo intravenosas, cada qual com 50 1-Jg de fragmentos de anticorpo F(ab') 2 em PBS (solução salina tamponada com fosfato) três dias antes da fusão.

b) Fusão e clonagem: Células do baço dos camundongos imunizados de acordo com a) foram fundidas com células de mieloma de acordo com Galfré e Milstein (Galfré, G. e Milstein, C., Methods Enzymol. 73 (1981) 3-46). Cerca de 2,1 x 8 10 esplenócitos foram misturados com 4,2 x 107 células de mieloma (P3x63- Ag8.653, ATCC CRL 1580) e centrifugados (dez minutos a 300 x g e 4 oc). As células foram lavadas em seguida por uma vez com o meio de cultivo RPMI 1640 sem FCS (soro de feto de bezerro) e novamente centrifugadas a 400 x g em uma ampola apontada de 50 ml. Em seguida, adicionou-se 1 ml de PEG

(póli(etileno glicol), peso molecular de 4000 g/mol) e realizou-se mistura por meio de pipeta. Após um minuto em banho de água a 37 oc, foram adicionados 5 ml de RPMI 1640 sem FCS em gotas, a suspensão foi misturada, adicionou-se RPMI 1640 com FCS a 10% (v/v) até um volume final de 50 ml e centrifugou-se 5 em seguida. As células sedimentadas foram novamente suspensas em RPMI 1640 com FCS a 10% e colocadas em placas em meio de seleção de hipoxantina azaserina (100 mmol/1 de hipoxantina, 1 IJg/ml de azaserina em RPMI 1640 com FCS a 10%) contendo o fator de crescimento interleucina 6 murina recombinante (Peprotech, 0,5 ng/ml). Após onze dias, os cultivos primários foram testados para determinar a síntese de anticorpos específicos (vide o Exemplo 3). Os cultivos primários que exibem a ligação a fragmentos de anticorpo F(ab') 2 biotinilados bem como lgG normal humano biotinilado foram individualizados por meio de deposição de células isoladas em placas de cultivo celular com 96 cavidades utilizando um citômetro de fluxo (FACSAria, BD Biosciences) em meio que contém o fator de crescimento recombinante interleucina 6 murina (Peprotech, 0,5 ng/ml).

Seguindo este protocolo, foram obtidas as linhagens celulares DSM ACC3006, DSM ACC3007 e DSM AC3008. O anticorpo M-1.7.10 é da classe lgG2a e os anticorpos M-1.5.8 e M-1.3.2 são da classe lgG1.

c) Produção de imunoglobulina As linhagens de células de hibridoma obtidas em b) foram inoculadas em densidades celulares iniciais (células vivas) entre 1,0 x 105 e 2,2 x 105 células por ml em RPMI 1640 suplementado com FCS a 10% e suplementos comumente utilizados e expandidas em um frasco T (Celline, IB) por um período de cerca de três semanas. Nos sobrenadantes de cultivo colhidos, foram obtidas concentrações de 0,7 mg/ml a 1,5 mg/ml de anticorpo monoclonal. A purificação dos anticorpos dos sobrenadantes de cultivo foi realizada de acordo com métodos químicos de proteína padrão, tais como os relatados em Bruck, C. et ai, Methods Enzymol. 121 (1986) 587-596.

EXEMPL03 Ensaios de seleção para detecção de anticorpos anti-lgG humanos: a) Seleção primária de anticorpos que se ligam a lgG 5 humano.

Para determinação da especificidade dos anticorpos nos sobrenadantes de cultivo das células de hibridoma, MTPs (placas de microtítulos) previamente revestidas com estreptavidina recombinante (MicroCoat, Bernried, lote MC 1098) foram revestidas com lgG humanizado biotinilado utilizado para o processo de imunização, 250 ng/ml, ou lgG humano biotinilado, 250 ng/ml, respectivamente, em PBS suplementado com 1% (p/v) de BSA 11 (1 00 ~I por cavidade, incubação por sessenta minutos à temperatura ambiente, com agitação) e lavadas em seguida por três vezes com 0,9% (p/v) de NaCI/0,05% de Tween® 20. Na etapa a seguir, 100 ~I por cavidade da solução de anticorpo a ser testada (sobrenadante de cultivo) foram adicionados e incubados por sessenta minutos à temperatura ambiente, com agitação. Após três etapas de lavagem com 0,9% (p/v) de NaCI e 0,05% de Tween® 20 por cavidade, 100 ~I de um fragmento de F(ab')2 marcado com peroxidase de rabanete silvestre de um anticorpo anti-Fcy de camundongo de carneiro policlonal foram adicionados para detecção de anticorpo de amostra ligado e incubados por sessenta minutos à temperatura ambiente, com agitação. Em seguida, realizou-se lavagem conforme acima. Por fim, foram adicionados 100 ~I por cavidade de ABTS® (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha; catálogo no 1684302). Após incubação por trinta minutos à temperatura ambiente, a extinção (OD) foi medida a 405 e 492 nm (405/492) em um leitor de placas de microtítulos comercial ELISA. Esta seleção gerou uma seleção de anticorpos que se ligam bem a lgG humanizado bem como a lgG humano. Esta seleção de anticorpos foi adicionalmente submetida ao ensaio b).

• b) Seleção de anticorpos com reatividade cruzada mínima a lgG de outras espécies: lgG humano biotinilado foi ligado às cavidades de uma placa de microtítulos revestida com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O 5 excesso de anticorpo não ligado foi removido por meio de lavagem. Em seguida, as amostras e os padrões de referência (tais como anticorpo anti-lgG humano conforme obtido com o Exemplo 2) foram diluídos em tampão e soro de cinomolgo a 10%. Amostras diluídas foram adicionadas à placa e incubadas por sessenta minutos à temperatura ambiente, com agitação. Após a retirada 10 de substâncias não ligadas por meio de lavagem, o lgG humano da primeira etapa em forma digoxigenilada foi adicionado às cavidades da placa e incubado por mais sessenta minutos. Após a lavagem, o anticorpo digoxigenilado ligado foi detectado com um conjugado de anticorpo antidigoxigenina e HRP. A HRP (peroxidase de rabanete silvestre) dos 15 conjugados de anticorpo e enzima catalisa a reação colorida de substrato ABTS. O sinal é medido por meio de um leitor ELISA em comprimento de onda de 405 nm (comprimento de onda de referência: 490 nm). Os valores de absorção de cada amostra de soro foram determinados em três cópias.

Foram selecionados anticorpos com alta reação de ensaio em 20 soro de cinomolgo bem como em tampão (vide a Figura 7). Esta segunda seleção gerou uma seleção de anticorpos que se ligam bem a lgG humano com reatividade cruzada mínima a lgG de outras espécies.

EXEMPL04 Determinação de ligação e especificidade de anticorpos por meio 25 de ressonância de plasma de superfície: Todas as medições foram realizadas com o instrumento BIAcore® T1 00 utilizando um chip CM5. O revestimento deste chip com um anticorpo foi atingido por meio de acoplamento de amina padrão. A menos que indicado em contrário, todas as incubações foram realizadas em tampão de HBS (HEPES, NaCI, pH 7,4) a 25 °C. Uma quantidade saturante de um anticorpo anti-Fc- gama de camundongo de cabra policlonal foi imobilizada por meio de acoplamento de amina sobre uma célula de fluxo do chip CM5. Em seguida, os 5 anticorpos de camundongos monoclonais diferentes dirigidos contra lgG humano foram injetados por sessenta segundos em velocidade de fluxo de 30 IJI/min e foram ligados pelo anticorpo anti-Fc de camundongo. Todos os soros animais foram diluídos em tampão de HBS. A ligação foi analisada por meio de injeção de 1 em 100 de soro diluído e incubação por sessenta segundos em velocidade de fluxo de 30 !JIImin. A dissociação foi medida por meio de lavagem da superfície do chip com tampão HBS por 180 segundos. Utilizando software de avaliação BIA da BIAcore®, foram calculados os valores de constante de dissociação (= K 0 ) com um modelo de adequação Langmuir 1:1.

Para todos os soros animais, este cálculo foi baseado na premissa de que o nível de lgG é de 15 mg/ml. Os valores de sinais oitenta segundos após o início da injeção do anticorpo de teste foram selecionados para comparação da quantidade de lgG ligado (vide a Tabela 1).

TABELA 1 SINAIS DE LIGAÇÃO (RU) E VALORES K 0 PARA LIGAÇÃO DE SOROS ANIMAIS A DIFERENTES ANTICORPOS ANTI-IGG HUMANOS MONOCLONAIS DIFERENTES Anticorpo (---+) M-R10Z8E9 M-1.3.2 Amostra U) (soro) RU ligado K0 mol/1 RU ligado Ko mol/1 Chimpanzé 159 2 ' 21 X 10"10 95,7 1, 12 X 10"09 10 Humanos 151,3 177x10- , 80,1 1,43 X 10"09 Cão 35,5 3,17x1o-a -1,9 sem ligação Macaco Rhesus -1,9 sem ligação -2,3 sem ligação

Anticorpo (-) M-R10Z8E9 M-1.3.2 Amostra U) (soro) Sagui 18,9 2,04 X 10"7 -2 sem ligação Babuíno -1,5 sem ligação -2,2 sem ligação Cinomolgo -1,4 sem ligação -2 sem ligação Anticorpo (-) M-1.5.8 M-1.7.10 Amostra U) (soro)

RU RU ligado Ko mol/1 ligado Ko mol/1 Chimpanzé 109,4 1 29 X 10-09 109,4 1 94 X 10"09 ' ' Humanos 77 1 43 X 10-09 77 7 55 X 10-09 ' ' Cão -2,4 sem ligação -2,4 sem ligação Macaco Rhesus -2,7 sem ligação -2,7 sem ligação Sagui -2,1 sem ligação -2,1 sem ligação Babuíno -2,1 sem ligação -2,1 sem ligação Cinomolgo -2,1 sem ligação -2,1 sem ligação A Tabela 1 demonstra que os três anticorpos anti-lgG humanos não apresentam reação cruzada com soro de outras espécies, exceto chimpanzés. Por outro lado, para M-R10Z8E9, foi detectada uma interação adicional com soro de cães e saguis.

5 EXEMPLO 5 a) Purificação de anticorpo anti-lgG humano monoclonal de camundongo.

O sobrenadante de fermentação das linhagens celulares obtidas no Exemplo 2 foi concentrado em até dez vezes e transferido para um tampão com 20 mM de TRIS, 1 M de sulfato de amônia, pH 9,0, e aplicado a uma coluna de cromatografia de proteína A-sepharose. O eluído obtido com 0,2 M de citrato de sódio, 0,2 M de sulfato de amônio sob pH 5,0 sofreram diálise contra tampão de fosfato, pH 7,5. Os contaminantes de lgG bovino (de FCS no caldo de fermentação) foram separados por meio de imunoadsorção com anticorpos imobilizados contra lgG bovino.

5 b) Preparação de anticorpo anti-lgG humano biotinilado: O anticorpo anti-lgG humano obtido em a) em tampão de fosfato, pH 8,5, foi ajustado até uma concentração de proteína de cerca de 5 mg/ml.

Ácido D-biotinoilaminocaproico e N-hidroxissuccinimida foram dissolvidos em DMSO e adicionados à solução de anticorpos em razão molar de 1:5. A reação 1o foi suspensa após sessenta minutos por meio da adição de L-lisina e o adicional do reagente de marcador foi removido por meio de diálise contra 50 mM de tampão fosfato de potássio, com 150 mM de NaCI, pH 7,5.

c) Preparação de anticorpo anti-lgG humano digoxigenilado: O anticorpo anti-lgG humano obtido em a) em tampão de fosfato, pH 8,5, foi ajustado até uma concentração de proteína de cerca de 5 mg/ml. N- hidroxissuccinmida de ácido digoxigenino 3-0-metilcarbonil-e:-aminocaproico foi dissolvida em DMSO e adicionada à solução de anticorpos em razão molar de 1:4. A reação foi suspensa após sessenta minutos por meio da adição de L- lisina e o adicional do reagente de marcador foi removido por meio de diálise contra 50 mM de tampão fosfato de potássio, com 150 mM de NaCI, pH 7,5.

EXEMPLOS Ensaio totalmente genérico de quantificação de anticorpos humanos (lgG humano) em uma amostra de um animal experimental: Anticorpo M-R1 OZ8E9 biotinilado (placa 1) ou anticorpo M-1.7.1 O (placa 2) foi ligado a placas de microtítulos revestidas com estreptavidina (SA- MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido por meio de lavagem. Amostras/padrões, tais como anticorpo anti-IL 1R, anticorpo anti-IL 13Ra1, anticorpo antiabeta e anticorpo anti-IL6R, reforçados em soro de cinomolgo, foram adicionados em uma série de concentrações à placa e incubados por sessenta minutos à temperatura ambiente com agitação. Após a retirada de anticorpos não ligados por lavagem, foram adicionados 100 IJI de anticorpo digoxigenilado M-R10Z8E9 (placa 1) ou anticorpo M-1.7.10 (placa 2) à placa. Após a lavagem, os anticorpos digoxigenilados ligados foram detectados com um conjugado de anticorpo antidigoxigenina e HRP. Os valores de absorção de cada amostra de soro foram determinados em três cópias (vide a Figura 1).

TABELA 2 DADOS DE OD PARA CAPTURA E DETECÇÃO DE ANTICORPO REAGENTE M-R10Z8E9 Anticorpo anti- Anticorpo Anticorpo Anticorpo ng/ml IL 13Ra1 antiabeta anti-IL 1R anti-IL6R 0,00 0,022 0,023 0,024 0,024 1,56 O, 119 O, 139 0,085 0,105 3,13 0,226 0,264 0,153 O, 190 6,25 0,408 0,482 0,276 0,348 12,50 0,772 0,881 0,546 0,664 25,00 1,229 1,310 0,980 1,084 50,00 1,672 1,707 1,521 1,565 100,00 1,967 1,927 1,877 1,819 TABELA 3 DADOS DE OD PARA CAPTURA E DETECCÃO DE ANTICORPO REAGENTE M-1 .. 7 10 Anticorpo anti- Anticorpo Anticorpo Anticorpo ng/ml IL13Ra1 antiabeta anti-IL 1R anti-IL6R 0,00 0,038 0,036 0,035 0,037 1,56 0,178 0,149 0,187 O, 181

Anticorpo anti- Anticorpo Anticorpo Anticorpo ng/ml IL 13Ra1 antiabeta anti-IL 1R anti-IL6R 3,13 0,325 0,264 0,326 0,312 6,25 0,570 0,472 0,568 0,540 12,50 1,004 0,853 1,013 0,955 25,00 1,592 1,407 1,588 1,498 50,00 1,995 1,923 2,013 1,947 100,00 2,197 2,213 2,209 2,185 EXEMPLO 7 Ensaio de quantificação de derivados de anticorpos humanos (tais como fragmentos de Fab) em uma amostra de um animal experimental: Anticorpo M-1. 7.1 O biotinilado foi ligado a placas de microtítulos 5 revestidas com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido por meio de lavagem. Amostras/padrões, tais como fragmento de anticorpo Fab anti-IGF1 R, reforçados em soro de cinomolgo, foram adicionados às cavidades e incubados por sessenta minutos à temperatura ambiente com agitação. Após a retirada de anticorpos não ligados por meio de lavagem, foram adicionados 100 ~I de anticorpo digoxigenilado M-1.3.2 a cada cavidade da placa. Após a lavagem, os anticorpos digoxigenilados ligados foram detectados com um conjugado de anticorpo antidigoxigenina e HRP. Os valores de absorção de cada amostra de soro foram determinados em três cópias (vide a Figura 5).

TABELA4 0ADOSDE00 ng/ml OD 405 nm SD 0,00 0,042 0,000 1,56 0,047 0,000 ng/ml 00 405 nm SD 3,13 0,057 0,002 6,25 0,103 0,001 12,50 0,247 0,016 25,00 0,694 0,007 50,00 1,535 0,043 100,00 1,882 0,013 EXEMPLO 8 Ensaio para provar a integridade estrutural de lgG humano em uma amostra de animal experimental: Anticorpo M-R 1OZ8E9 biotinilado dirigido contra Fc humano foi 5 ligado a placas de microtítulos revestidas com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido por meio de lavagem. Amostras/padrões, tais como anticorpo anti-IL 13Ra1, reforçados em soro de cinomolgo, foram adicionados à placa e incubados por sessenta minutos à temperatura ambiente com agitação. Após a retirada de anticorpos não ligados por lavagem, foram adicionados 100 1-11 de anticorpo digoxigenilado M-1.3.2 à placa. Após a lavagem, o anticorpo digoxigenilado ligado foi detectado com um conjugado de anticorpo antidigoxigenina e HRP. Os valores de absorção de cada amostra de soro foram determinados em três cópias (vide a Figura 3).

TABELA 5

DADOSDEOD ng/ml OD 405 nm SD 0,00 0,023 0,018 0,78 0,094 0,008 1,56 0,172 0,007 3,13 0,304 0,011 ng/ml 00 405 nm SD 6,25 0,588 0,015 12,50 1,051 0,007 25,00 1,604 0,004 50,00 2,019 0,001 EXEMPLO 9 Ensaio de quantificação de anticorpos humanos (lgG humano) em uma amostra de um animal experimental utilizando uma proteína de fusão Fc (antígeno) em combinação com anticorpos anti-lgG humanos conforme 5 relatado no presente: O domínio extracelular solúvel de um receptor X humano é fundido ao fragmento de Fc de classe de lgG1 humano. A proteína de fusão biotinilada (Bi-X-Fc) foi ligada a placas de microtítulos revestidas com estreptavidina (SA-MTP) na primeira etapa. O excesso de anticorpo não ligado foi removido por meio de lavagem. Em seguida, anticorpo anti-X reforçado em soro de cinomolgo foi ligado ao receptor X humano imobilizado. Após a retirada de substâncias não ligadas por lavagem, o anticorpo anti-X ligado foi detectado com a) anticorpo monoclonal digoxigenilado contra fragmento de Fc humano (anticorpo M-R10Z8E9) ou com b) anticorpo monoclonal digoxigenilado contra fragmento de Fab humano (anticorpo M-1. 7.1 O) seguido por incubação com anticorpo antidigoxigenina marcado com peroxidase de rabanete silvestre. Os valores de absorção de cada amostra de soro foram determinados em três cópias.

EXEMPLO 10 Dot Blot- conformação x epítopo linear: Para determinar se os anticorpos anti-lgG humanos detectam um epítopo de conformação ou um epítopo linear, realizou um analítico Dot Blot.

Durante este teste, a proteína de antígeno (lgG humano) foi manchada em uma membrana de nitrocelulose em uma forma nativa e uma desnaturada. Para receber a forma desnaturada, a proteína de antígeno foi incubada com SDS sobre um agitador a 37 oc por uma noite. As duas formas foram manchadas em uma série de concentração para a membrana. Após a 5 secagem completa da membrana, a superfície foi bloqueada com um tampão de bloqueio (Roti-Biock, Roth, Alemanha) por sessenta minutos à temperatura ambiente com agitação. Após lavagem da membrana, ela foi incubada com uma solução contendo anticorpo digoxigenilado M-R 1OZ8E9 ou um dos três anticorpos diferentes M-1.3.2, M-1.5.8 ou M-1.7.10. Após a lavagem, o 1o anticorpo digoxigenilado ligado foi detectado com um conjugado de anticorpo antidigoxigenina e HRP. O HRP dos conjugados de anticorpo e enzima catalisa a reação de coloração de substrato Azul BM. O sinal pode ser diretamente controlado visualmente e capturado com um scanner.

EXEMPLO 11 Determinação da Ligação e Especificidade de Anticorpos por um Ensaio ELISA de Ponte: Para determinar qual tipo de subclasse de lgG humano é ligada pelos anticorpos anti-humanos pesquisados, foi realizada uma análise ELISA de ponte. Os anticorpos biotinilados M-R1 OZ8E9, M-1.3.2, M-1.5.8 e M-

1. 7.1 O foram ligados à microplaca de títulos de estrepatividina na primeira etapa. Em uma segunda etapa, foram incubados anticorpos de lgG humano de diferentes subclasses. lgG1 kappa humano; lgG1 lambda humano; lgG4 humano; lgG1 humano quimérico; lgG2 humano (lgG2 humano purificado policlonal) e lgG3 humano (lgG3 humano purificado policlonal) foram preparados em uma série de diluição e incubados na microplaca de títulos de estreptavidina, revestida com anticorpo anti-humano biotinilado. Após uma etapa de lavagem, os mesmos anticorpos utilizados para revestimento foram empregados como anticorpos de detecção em forma digoxigenilada. Isso significa que o mesmo clone de anticorpo anti-humano foi utilizado para revestimento e detecção. Uma placa foi revestida, por exemplo, com M-1.7.10 Bi e utilizou-se M-1.7.1 0-Dig para detecção. Após uma etapa de incubação e lavagem, esta etapa foi seguida por incubação com um anticorpo antidigoxigenina marcado com peroxidase de rabanete silvestre. Os valores de absorção de cada amostra de soro foram determinados em três cópias.

TABELA 6

RESUMO DE ANÁLISES ELISA DE PONTE Anticorpo utilizado para revestimento e detecção mAb mAb mAb mAb Amostra M-R10Z8E9 M-1.3.2 M-1.5.8 M-1.7.10 lgG1- kappa ++ ++ ++ ++ lgG1 lambda ++ -- -- -- lgG4 ++ + + ++ lgG1 quimérico ++ + + ++ lgG2 + +- +- ++ lgG3 +- -- -- -- lgG1 kappa Fab -- ++ ++ ++ lgG1 lambda Fab -- -- -- -- ++ ligação forte + ligação +- ligação fraca -- sem ligação

Claims (26)

REIVINDICAÇÕES

1. LINHAGEM CELULAR, caracterizada pelo fato de que é DSM ACC3006, ou DSM ACC3007, ou DSM ACC3008.

2. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que é obtido a 5 partir de uma das linhagens celulares conforme definidas na reivindicação 1.

3. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido na reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que é em um imunoensaio.

4. KIT, caracterizado pelo fato de que compreende: a) um anticorpo obtido da linhagem celular DSM ACC2708, ou 1o DSM ACC3006, ou DSM ACC3007 ou DSM ACC3008 como reagente de captura; b) um anticorpo obtido da linhagem celular DSM ACC2708, ou DSM ACC3006, ou DSM ACC3007 ou DSM ACC3008 como reagente de detecção.

5. MÉTODO PARA DETECTAR UM ANTICORPO TERAPÊUTICO em uma amostra obtida de um animal experimental, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: a) fornecimento da amostra a ser analisada; b) incubação da mencionada amostra com um anticorpo que se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo conforme definido na reivindicação 2• ' c) incubação opcional da mencionada amostra com um reagente apropriado para a detecção seletiva de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno, e d) correlação do complexo formado em (b) ou (c) à concentração do mencionado anticorpo terapêutico.

6. MÉTODO PARA DETERMINAR IMUNOLOGICAMENTE UM ANTICORPO TERAPÊUTICO, em uma amostra obtida de um animal experimental, utilizando um imunoensaio de ponte de antígenos que compreende um anticorpo de captura e um anticorpo traçador, caracterizado pelo fato de que mencionado anticorpo de captura e mencionado anticorpo traçador são ambos selecionados independentemente a partir de anticorpos 5 que se ligam ao mesmo epítopo que um anticorpo conforme definido na reivindicação 2.

7. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que mencionado imunoensaio é um imunoensaio em sanduíche.

8. MÉTODO, de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizado pelo fato de que o anticorpo de captura é conjugado a biotina e imobilização é realizada por meio de avidina ou estreptavidina imobilizadas.

9. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo traçador é conjugado a digoxigenina e ligação ao marcador detectável é realizada por meio de um anticorpo contra digoxigenina.

1O. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 5 a 9, caracterizado pelo fato de que mencionado anticorpo terapêutico é um Fab.

11. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 5 a 1O, caracterizado pelo fato de que mencionado animal experimental é selecionado a partir do grupo que compreende os membros das famílias de saguis e micos, macacos do Velho Mundo, lêmures-anões e -ratos, gibões e primatas menores, lêmures verdadeiros, bem como cruzamentos dos mesmos.

12. MÉTODO, de acordo com uma das reivindicações 5 a 11, caracterizado pelo fato de que mencionado anticorpo terapêutico é um anticorpo humano ou humanizado.

13. USO DE UM ANTICORPO que se liga a um anticorpo terapêutico e não se liga à imunoglobulina de um animal experimental, caracterizado pelo fato de que é para medir a concentração de anticorpo terapêutico total, ativo ou ligado a antígeno em uma amostra obtida de um animal experimental por meio do qual o anticorpo se liga ao mesmo epítopo que um anticorpo conforme definido na reivindicação 2.

14. COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO, caracterizada pelo fato 5 de que compreende uma mistura de anticorpos produzidos pela linhagem celular DSM ACC3006, a linhagem celular DSM ACC3007, a linhagem celular DSM ACC3008.

15. USO DE UMA COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO, conforme definida na reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que é em um método conforme definido em uma das reivindicações 5 a 12.

16. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que se liga a lgG humana ou de chimpanzé e não se liga a lgG canina e de sagui.

17. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga a lgG canina, de macacos Rhesus, de sagui, de babuíno e de cinomolgo.

18. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 16 a 17, caracterizado pelo fato de que o valor K0 para ligação a um lgG humano ou de chimpanzé é 1o-9 mol/1 ou menos e o valor K0 para ligação a lgG canino, de macaco Rhesus, de sagui, de babuíno e de cinomolgo é 1o-6 mol/1 ou mais.

19. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 16 a 18, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

20. ANTICORPO, caracterizado pelo fato de que se liga especificamente a um lgG1 que compreende um domínio constante de cadeia leve kappa.

21. ANTICORPO, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga adicionalmente a um lgG2.

22. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 21, caracterizado pelo fato de que o anticorpo se liga adicionalmente a um lgG4.

23. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga a um lgG3.

24. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o anticorpo não se liga a um lgG1 que compreende um domínio constante de cadeia leve lambda.

25. ANTICORPO, de acordo com uma das reivindicações 20 a 24, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

26. USO DE UM ANTICORPO, conforme definido em uma das reivindicações 16 a 25, caracterizado pelo fato de que é em um método conforme definido em uma das reivindicações 5 a 12.