CN1259961A - 人源化抗体和制备人源化抗体的方法 - Google Patents

人源化抗体和制备人源化抗体的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN1259961A
CN1259961A CN98805910A CN98805910A CN1259961A CN 1259961 A CN1259961 A CN 1259961A CN 98805910 A CN98805910 A CN 98805910A CN 98805910 A CN98805910 A CN 98805910A CN 1259961 A CN1259961 A CN 1259961A
Authority
CN
China
Prior art keywords
residue
seq
antibody
replaced
district
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN98805910A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1191276C (zh
Inventor
J·A·韦尔斯
M·巴卡
L·G·普雷塔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Genentech Inc
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=25264594&utm_source=***_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1259961(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of CN1259961A publication Critical patent/CN1259961A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1191276C publication Critical patent/CN1191276C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/005—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies constructed by phage libraries
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/569—Single domain, e.g. dAb, sdAb, VHH, VNAR or nanobody®
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本发明描述了针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化抗体。还描述了快速产生和鉴定可提高人源化抗体与其相关抗原结合力的构架突变的方法。在一优选例中,非人CDR被移植于人VLkI－VHIII构架上。还对一小组关键构架残基进行随机诱变,然后在丝状噬菌体表面上单价展示所产生的抗体分子文库。再用亲和力选择法鉴别出最佳构架序列。还可任选地用匹配非人亲代抗体的残基来替换位于VL－VH界面处的游标残基,从而对选出的抗体进一步突变。该方法可用于任何非人抗体。由此提供了人源化抗体。

Description

人源化抗体和制备人源化抗体的方法
发明领域
本发明涉及人源化抗体和制备人源化抗体的方法。具体地讲，本发明涉及用单价噬菌体展示***来制备人源化抗体的方法，以及对单一人构架的一小组关键构架残基进行随机诱变而产生的抗体变异体。更具体地讲，本发明涉及对结合血管内皮生长因子(VEGF)的鼠抗体进行人源化。
发明背景
单克隆抗体(mAb)作为治疗剂有巨大的潜力，尤其是它们可用于调节血管生成***。例如，在某些情况下当新的毛细血管从现有小血管的壁上形成时可能需要调节(例如)血管生成***。在受伤或感染之后，血管生成通常很重要，以便能够在受损组织附近刺激毛细血管的急速生长。然而，血管生成在肿瘤生长中也很重要，因为为了持续生长，肿瘤必须诱导形成进入肿瘤块的毛细血管网。
某些调节血管生成的生长因子已得到鉴定。特别令人感兴趣的是血管内皮生长因子(VEGF)，它似乎是某些肿瘤获得丰富血液供应所依靠的物质(Molecular Biology of the Cell，3版，Alberts等人，Garland Publishing，1154页(1994))。因此，例如抗VEGF的单克隆抗体，出于多种原因是很有用的，包括用于调节血管生成而且更具体地讲可用作抗肿瘤剂。一种阻断VEGF受体结合的鼠抗-VEGF单克隆抗体A4.6.1已有描述。表明，该抗体可抑制促细胞有丝***的信号传导(Kim等人，生长因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993))。
包括上述抗-VEGF抗体在内的大多数单克隆抗体，来自于小鼠或其他非人动物来源，这限制了其临床效力。具体地讲，身体常常会发生反应，对非人类抗体产生免疫原性应答反应，这样这种抗体会在发生治疗效果之前就被快速地从身体***中清除掉。除了施用于人时非人类单克隆抗体具有免疫原性之外，还会因效应子功能的弱招募性而导致其他限制。
作为克服这些缺陷的一种巧妙手段，可通过一种已知的抗体“人源化”过程而将非人单克隆抗体的抗原结合特性赋予人抗体。人源化抗体含有移植在人抗体构架上、来自亲代或相应的非人mAb的6个互补决定区(CDR)(抗体分子的抗原结合位点)的氨基酸序列。因此，非人抗体的人源化通常被称为“CDR移植”。在这种人源化抗体中非人序列的含量低(约5％)，已表明可有效地降低其免疫原性并延长施用于人的抗体的血清半衰期。其中，人源化的单克隆抗体(“嵌合的免疫球蛋白”)在美国专利No.4,816,567中有描述。
不幸的是，单纯地移植CDR序列常常会产生与抗原的结合力远弱于亲代非人mAb的人源化抗体。为了恢复高亲和力，抗体必须进一步地进行基因工程改造以微调抗原结合环的结构。这是通过用亲代鼠抗体的匹配序列来替换抗体可变区的构架区域中的关键残基而实现的。这些构架残基常涉及支持CDR环的构象，尽管某些构架残基本身可能直接与抗原接触。已进行了研究，注意到某些构架残基对CDR构象的重要性，并编纂了所有可能影响抗原结合的构架残基的全面清单(Chothia等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224，487(1992)；Foote等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224，489(1992))。该全面清单包括近30种对CDR结构有潜在贡献的“游标”(vernier)残基。虽然通过编辑人源化抗体内整套游标残基从而与相应的亲代非人序列匹配，可能会导致更高的抗原亲和力，然而这通常是不利的，因为添加非人序列的元件有导致免疫原性增大的危险。因此，从治疗角度出发，宜将构架的改变限定在能够提供高亲和力人源化抗体的最小改变范围内。
因此，需要鉴别一小套足以优化结合的改变，然而预计所需的改变会因各人源化抗体而有所不同。为了实现所需结果，一种方法是，通过构建一组变异体，此变异体中的“可疑”构架残基被其鼠对应残基所取代，来鉴别突变的合适组合。这些变异体应各自独立地制备并测试对抗原的结合情况，然后将其与发现的有满意结合亲和力的其他变异体组合。然而，这种方法涉及对各个定点诱变、分离和筛选的重复循环，因费时费力而不理想。
作为一种简化抗体人源化的手段，已经开发出了多种不同方法。参见，例如Queen等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86，10029(1989)；Kettleborough等人，蛋白质工程(Protein Eng.)4，773(1991)；Tempest等人，Biotechnology 9，266(1991)；Padlan，分子免疫学(Mol.Immunol.)28，489(1991)；Roguska等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)91，969(1994)；Studnicka等人，蛋白质工程(Protein Eng.)7，805(1994)；Allen等人，免疫学杂志(J.Immunol.)135，368(1985)；Carter等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992)；Presta等人，免疫学杂志(J.Immunol.)15l，2623(1993)；Eigenbrot等人，蛋白质(Proteins)18，49(1994)；Shalaby等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)175，217(1992)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，(5th)，Public Health Service，NIH，Bethesda，MD(1991)和Rosok等人，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)271，22611(1996)。本发明的目的是提供一种通用的快速选择构架突变的方法，它可改进人源化抗体与其相关抗原的结合，其中取消了目前根据多轮的各个定点诱变和筛选的构架优化方法。
另一目的是提供快速地使抗体人源化的方法，它提供低免疫原性的抗体而且采用单一的人构架作为通用性支架。
本发明的另一目的是提供人源化抗体，与构架未改变的最初人源化抗体相比、该抗体经突变具有更高的抗原亲和力。
本发明的另一目的是提供人源化抗体，它具有更低的清除速率因而能在全身施用后在体内保留更长时间，这样对于全身施用可用更低剂量就可实现治疗效果。
本发明的另一目的是提供人源化的针对VEGF的单克隆抗体。
发明概述
本发明提供了一种针对血管内皮生长因子(VEGF)的人源化抗体。最初的人源化的抗-VEGF具有最丰富的人亚类共有序列的构架，即VLκ亚组I(V1κI)和VH亚组III(VHIII)，其上移植有非人的抗-VEGF抗体的CDR。对该初始构建物上的关键构架残基进行随机诱变，产生了本文所述的人源化抗-VEGF抗体，它与构架未改变的最初人源化抗体相比具有高125倍的抗原亲和力。一个额外的突变可使结合力再提高6倍。这种人源化抗-VEGF抗体可通过本文所述的方法再生产，或者通过在给出本文提供的序列信息的情况下用传统重组技术再生产。
本文还提供了一种快速产生和鉴别构架突变的方法，它提高了人源化抗体对其相关抗原的结合力。在一优选实例中，非人CDR被移植于人的V1κI-VHIII构架。还对一小套关键构架残基进行了随机诱变，然后在丝状噬菌体的表面上将形成的抗体分子文库单价展示出来。接着，根据亲和力的选择方法来鉴别最佳的构架序列。任选地，被选出的抗体可以进一步突变，以便用匹配非人亲代抗体的的残基来替换位于VL-VH界面的游标残基。
本文所述的方法可用于任何非人抗体。因此，本发明提供了人源化抗体。
附图简述
图1描述了小鼠抗体A4.6.1(SEQ ID NO：6和9分别是VL和VH区)、人源化的A4.6.1变异抗体hu2.0(SEQ ID NO：7和10分别是VL和VH区)和人源化的A4.6.1变异抗体hu2.10(SEQ ID NO：8和11分别是VL和VH区)的氨基酸序列。序列编号根据Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，(5th)，Public HealthService，NIH，Bethesda，MD(1991)，并且错配用星号(A4.6.1 vs hu2.0)或点(hu2.0 vs hu2.10)表示。变异抗体hu2.0仅含有鼠抗体的CDR序列(粗体)，它被移植于人轻链κ亚组I，重链亚组III构架上。变异抗体hu2.10是用本文所述的噬菌体分拣试验而获得的共有人源化克隆。
图2显示了随机诱变所针对的构架残基。
图3显示了噬菌体表面展示Fab-pIII融合蛋白的噬菌粒构建物。此噬菌粒构建物编码融合于一部分M13基因III外被蛋白的人源化A4.6.1抗体Fab片段。该融合蛋白包括Fab，Fab在重链的羧基未端连于一个谷氨酰胺残基(受SupE E.coli的琥珀密码子的抑制)，然后连于基因III蛋白的C末端区域(残基249-406)。转入F+大肠杆菌，然后用M13KO7辅助噬菌体进行超感染，这样产生了噬菌粒颗粒，其中一小部分展示出单一拷贝的融合蛋白。
发明详述
A.定义
“抗体(Ab)”和“免疫球蛋白(Ig)”是有相同结构特征的糖蛋白。抗体表现出对特异抗原的结合特异性，而免疫球蛋白包括抗体和其它缺乏抗原特异性的抗体样分子。后一类多肽可在由(例如)淋巴***低水平地产生，而骨髓瘤可高水平地产生。
“天然抗体”和“天然免疫球蛋白”是约150000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型重链之间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。据信特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面(Clothia等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)186，651(1985)；Novotny等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82，4592(1985))。
术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中被称为互补决定区(CDR)或称为高变区的三个节段中。可变区中较高度保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β-折叠构型，由三个CDR连结。这些CDR形成连接β折叠结构的环并且在某些情况下是β折叠结构的一部分。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等人，同上)。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是表现出不同的效应子功能，例如参与抗体依赖的细胞毒性。
木瓜蛋白酶消化抗体产生了两个相同的抗原结合片段(称为“Fab”片段，每个片段有一个抗原结合位点)以及一个残余的“Fc”片段(该名称反映了其容易结晶的能力)。用胃蛋白酶处理产生了一个F(ab′)2片段，该片段有两个抗原结合位点，并仍能与抗原交联。
“Fv”是最小的抗体片段，它含有全部抗原识别和结合位点。该区域由非共价紧密结合的一个重链和一个轻链可变区的二聚物组成。在该构型中，各可变区中的三个CDR相互作用，在VH-VL二聚物表面上界定了抗原结合位点。6个CDR共同地赋予抗体抗原结合特异性。然而，即使是单一可变区(或Fv的一半，它只包含对抗原有特异性的三个CDR)也能识别并结合抗原，只是其亲和力比完整的结合位点低。
“Fab”片段含有轻链的恒定区和重链的第一个恒定区(CH1)。Fab′片段与Fab片段的不同之处在于，在重链CH1区的羧基端添加有几个残基(包括来自铰链区的一个或多个半胱氨酸)。Fab′-SH在本文表示恒定区的半胱氨酸残基携带了游离巯基的Fab′。F(ab′)2抗体片段最初是以Fab′片段对的形式产生的，在其间有铰链半胱氨酸。抗体片段的其它化学偶联方式也是已知的。
脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的轻链，可根据其恒定区的氨基酸序列归类为明显不同的两类(称为kappa(κ)和lambda(λ))中的一类。
根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG-1，IgG-2，IgG-3和IgG4；以及IgA-1和IgA-2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ和μ。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。
术语“抗体”被最广义地使用，并且具体地包括：单一的单克隆抗体(包括促效的和拮抗的抗体)、具有多表位特异性的抗体复合物、以及抗体片段(例如Fab、F(ab′)2、和Fv)，只要它们表现出所需的生物活性即可。
本文所用的术语“单克隆抗体”指从一类基本均一抗体获得的抗体，即该群体中包含的各抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变之外。单克隆抗体是高特异性的，针对单个抗原位点。而且，与常规的(多克隆)抗体制剂(它通常是包括针对不同的决定簇(表位)的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的一个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的优点还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，没有被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性-即从基本均一的抗体群中获得的，而不应被解释成需要用任何特殊方法来生产抗体。例如，用于本发明的单克隆抗体可用杂交瘤方法(由Kohler等，Nature，256：495(1975)首先提出)制得，或可用重组DNA方法(例如参见美国专利No.4,816,567)制得。
“嵌合”抗体(免疫球蛋白)是这样的抗体，其中重链和/或轻链的一部分与某一特定物种的抗体对应序列相同或同源，或是属于特定的抗体类别或亚类，而链的其余部分则与另一物种的抗体对应序列相同或同源、或是属于另一种抗体类别或亚类，以及这种抗体的片段，只要该片段具有所需的生物活性即可(美国专利No.4,816,567)。
“人源化”形式的非人(如鼠)抗体是嵌合的免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv，Fab，Fab′，F(ab′)2或抗体的其它抗原结合序列)，它们含有非人免疫球蛋白的最小序列。对于大多数情况，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)，其中受者互补决定区(CDR)的残基被非人源(供者抗体)(例如有所需特异性、亲和力和活性的小鼠、大鼠或兔抗体)的CDR残基所代替。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv构架残基被对应的非人残基代替。另外，人源化的抗体可包括既不存在于受者抗体、又不存在于导入的CDR或构架序列中的残基。这些修饰能进一步提高和优化抗体的性能。通常，人源化抗体包含了基本上所有的(至少一个、通常两个)可变区，其中所有或基本上所有的CDR区对应于非人免疫球蛋白的CDR区，而所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最好还包括免疫球蛋白(通常是人免疫球蛋白)恒定区(Fc)的至少一部分。更详细的情况可参见Jones等人，Nature，321：522-525(1986)；Reichmann等人，Nature，332：323-329(1988)；和Presta，Curr.Op.Struct.Biol.，2：593-596(1992)。
“在人中无免疫原性”指施用时一旦治疗有效量的人源化抗体与人体的适当组织接触，基本上不表现出对人源化抗体的敏感性和耐受性状态。
如本文所用，“血管内皮细胞生长因子”或“VEGF”指在美国专利NO5,332,671中所定义的哺乳动物生长因子，包括在图1中所示的人氨基酸序列。天然VEGF的生物活性也可由其类似物或变异物所具有，该类似物或变异物能够促进血管内皮细胞的选择性生长但是不促进牛角膜内皮细胞、晶状体内皮细胞、肾上腺皮质细胞、BHK-21成纤维细胞或角化细胞的生长，或拥有能够与针对相应天然VEGF的至少一个表位的抗体发生免疫交叉反应的免疫表位。
“定点诱变”是本领域的标准技术，它是用一合成的寡核苷酸引物进行的，该寡核苷酸引物除了有限的错配(提供了所需的突变)之外互补于待诱变的单链噬菌体DNA。简而言之，合成的寡核苷酸被用作引物来指导合成互补于噬菌体的链，然后将形成的双链DNA转入支持噬菌体的宿主细菌中。将转化细菌的培养物接种于琼脂顶部中，让携带噬菌体的单个细胞形成噬菌斑。理论上，50％的新噬菌斑所含的噬菌体具有突变形式的单链；而50％具有原始的序列。用激酶化的合成引物与噬菌斑杂交，杂交所用温度允许准确匹配的杂交但是与原始链的错配足以防止杂交。然后，选出与探针杂交的噬菌斑并培养，回收DNA。
“表达***”指含有操作性连接的所需编码序列和控制序列的DNA序列，从而使得用这些序列转化的宿主能够产生所编码的蛋白质。为了实现转化，表达***可被包含在载体中；然而，有关DNA然后也可整合入宿主的染色体中。
本文所用的术语“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，而且所有这些名称均包括子代。因此，术语“转化体”或“转化细胞”包括原代细胞及其衍生的培养物(不论传代多少次)。还应理解，由于有意或无意的突变，所有子代也许在DNA内容上并不精确相同。它包括了筛选出的、具有与原始转化细胞相同功能的突变型子代。当采用不同的命名时，可以从上下文中明显看出。
“质粒”的命名是以小写的“p”后跟大写字母和/或数字来表示。本文中的最初质粒来源是购得、可在没有限制的情况下从公共途径获得、或可根据已公开的程序用上述质粒构建而得。另外，其他等价的质粒是本领域中已知的，并且对一般的技术人员而言是显而易见的。
“亲和结合”指抗体上的单个抗原结合位点与单个表位之间的非共价键相互作用力的总和。低亲和力的抗体与抗原的结合弱并且倾向于易解离，而高亲和力的抗体与抗体的结合牢得多并且结合可维持更长。
“转化”意味着将DNA引入某个生物体，从而使该DNA或作为染色体外的元件或通过整合到染色体上而被复制。取决于所用的宿主细胞，用适合该细胞的标准技术进行转化。用氯化钙进行的钙处理法(如Cohen美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)69，2110(1972)和Mandel等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)53，154(1970)中所述)，一般可以用于原核或其他含有基本细胞壁屏障的细胞。对于没有细胞壁的哺乳动物细胞，优选的是Graham和van der Eb(病毒学(Virology)52：456(1978))的磷酸钙沉淀法。哺乳动物细胞宿主***转化的总体情况，已经描述于1983年8月16日授于Axel的美国专利No.4,399,216中。转化入酵母通常是按Van Solingen等人，J.Bact.130：946(1977)和Hsiao等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)76：3829(1979)的方法进行。然而，其他将DNA引入细胞的方法，如核内注射、电穿孔、原生质体融合等也可使用。
限制酶消化后，DNA片段的“回收”或“分离”是指通过聚丙烯酰胺或琼脂糖凝胶电泳使消化产物分开，根据与已知分子量的标记DNA片段比较电泳迁移率来鉴别目的片段，切下含有所需片段的凝胶块，并将凝胶与DNA分开。这个程序已普遍知晓。例如，可参见Lawn等人，核酸研究(Nucleic.Acids Res.)9：6103[1981]以及Goeddel等人，核酸研究(Nucleic Acids Res.)，8：4057[1980]。
“连接”指二个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程。除非另外说明，连接可用已知的缓冲液和条件来进行，对于每0.5毫克大约等摩尔量的待连接的DNA使用10单位T4 DNA连接酶(“连接酶”)。
术语“控制序列”指在特定宿主生物体中表达操作性相连的编码序列所必需的DNA序列。例如，适用于原核细胞的控制序列包括启动子、任选的操纵基因序列、核糖体结合位点以及其他可能目前还不甚了解的序列。已知真核细胞可采用启动子、聚腺苷酸化信号和增强子。
当核酸与另一核酸序列置于功能上相关位置时，则核酸是“可操作地连接的”或“操作性相连的”。例如，前序列(presequense)或分泌性前导序列的DNA是与多肽的DNA操作性相连的，如果它被表达成参与多肽分泌的前蛋白原(preprotein)；启动子或增强子是与编码序列操作性相连的，如果它影响到编码序列的转录；或者，核糖体结合位点是与编码序列操作性相连的，如果它的位置能够促进翻译。通常，“可操作地连接”或“操作性相连”指相连的DNA序列是毗邻的，而在分泌性前导序列情况下，是毗邻的并处于同一阅读框。然而，增强子不必毗邻。可通过方便的限制性位点处的连接来实现连接。如果这样的位点不存在，则可按常规实践采用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文所用，“代表性编号”指在一具体序列中残基的位置编号以及在不同序列中的相应位置编号。对应的位置编号是序列(通常是人抗体构架序列)中的当用于构建人源化抗体时与代表性编号位置在功能上等价的位置。
通常，术语“氨基酸”指所有天然存在的L-α-氨基酸。然而，在某些实施例中，在本发明的多肽或肽中也可存在D-氨基酸以便有利于构象的限制。下面是单字符或三字符表示的氨基酸。Asp    D        天冬氨酸         Ile     I        异亮氨酸Thr    T        苏氨酸           Leu     L        亮氨酸Ser    S        丝氨酸           Tyr     Y        酪氨酸Glu    E        谷氨酸           Phe     F        苯丙氨酸Pro    P        脯氨酸           His     H        组氨酸Gly    G        甘氨酸           Lys     K        赖氨酸Ala    A        丙氨酸           Arg     R        精氨酸Cys    C        半胱氨酸         Trp     W        色氨酸Val    V        缬氨酸           Gln     Q        谷氨酰胺Met    M        甲硫氨酸         Asn     N        天冬酰胺
术语“氨基酸序列变异体”指与天然氨基酸序列相比在氨基酸序列中有某些差异的分子
取代性变异体是在天然序列中至少有一个氨基酸残基被除去并且在同一位置上***一个不同氨基酸而形成的变异体。取代可以是单个，即分子中只有一个氨基酸被取代；也可以是多个，即在同一分子中有两个或多个氨基酸被取代。
杂交宜在“严谨条件”下进行。“严谨条件”指(1)在低离子强度和高温下进行洗涤，如50℃，0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1％十二烷基磺酸钠，或者(2)在杂交过程中使用甲酰胺等变性剂，如42℃下50％(v/v)的甲酰胺和0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mMpH6.5的磷酸钠缓冲液及750mMNaCl、75mM柠檬酸钠。另一例子是42℃下用50％甲酰胺、5×SSC(0.75M NaCl，0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH6.8)、0.1％焦磷酸钠、5×Denhardt’s溶液，超声处理的鲑精DNA(50微克/毫升)、0.1％SDS和10％硫酸葡聚糖，并在42℃下用0.2×SSC和0.1％SDS洗涤。另一例子是用10％硫酸葡聚糖、2×SSC(氯化钠/柠檬酸钠)和50％甲酰胺的缓冲液在55℃进行杂交，然后用含EDTA的0.1×SSC在55℃进行高严谨度的洗涤。当提供了一核酸分子的核酸序列时，能够在上述条件下与其杂交的其他核酸分子被认为在序列范围之内。
在描述氨基酸序列时，应理解可以通过用合成或突变方法重建氨基酸序列来再生产这些序列。或者，应理解，可用重组技术从而回收编码这些氨基酸序列的DNA。可如下回收DNA：用编码所需氨基酸序列的DNA形成文库。再根据氨基酸序列来产生探针。然后分离与探针杂交的DNA并进行分析，以确定DNA编码的产物是否是所需产物。通常，可用DNA(或RNA)来转化细胞，并进行表达研究。
B.使抗体人源化的通用方法学
本文所述的方法可用于使任何抗体人源化。类似地，应理解此处具体所述的人源化抗体(人源化的抗-VEGF抗体)可以用本文描述的方法或传统的DNA重组技术再生产。具体地讲，因为关键的构架残基突变本文已作描述，因此再生产具有相同突变的人源化抗体而不使用单价噬菌体展示***。相反，编码所述氨基酸序列的DNA可用传统的DNA重组技术合成或再生产。然后，该DNA产物可以被表达、鉴别和回收。或者，可用本领域已知的方法对抗体进行定点诱变，或者可以合成具有本文所述突变的抗体。
一种特别优选的生产本文所述人源化抗体的方法涉及以下步骤：制备用于单价展示具有CDR序列的Fab片段的抗体噬菌粒载体，其中CDR序列通过定点诱变被移植到编码人VLκI-Cκ1轻链和人VHIII-CHtlγ重链Fd的载体上；通过对一小套选定的关键构架残基进行随机诱变而构建抗体Fab噬菌粒文库；表达和纯化人源化Fab片段；选择人源化的Fab变异体；和测定结合亲和力。这些步骤并不必须以任何特定的次序进行。这些步骤在以下“具体实施例”中有具体描述，但是通常可如下进行：
制备用于单价展示Fab片段的抗体噬菌粒载体
首先，选择需人源化的抗体并鉴定其互补决定区(CDR)。抗体的CDR序列可根据Kabat等人(同上)的序列定义加以鉴定。将CDR序列通过定点诱变移植到编码人VLκI-Cκ1轻链和人VHIII-CHlγ重链Fd的载体上。然后，将Fab编码序列亚克隆入噬菌粒载体。该构建物编码最初的人源化抗体，其中重链的C末端被精确地融合于噬菌体外被蛋白的羧基部分。较佳地，选出可在大肠杆菌的supE抑制型菌株中表达两种分泌性重链或重链-基因III融合蛋白的噬菌粒载体。
构建抗体Fab噬菌粒文库
根据将大量非人抗体在人VLκI-VHIII构架上人源化所获得的累积结果，认为优化抗原结合所需的构架变化局限于某些亚组的残基。参见Carter等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992)；Presta等人，免疫学杂志(J.Immunol.)151，2623(1993)；Eigenbrot等人，蛋白质(Proteins)18，49-62(1994)；Shalaby等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)175，217(1992)。因此，选出了一个新的残基组用于随机化处理。这些被鉴别出的关键构建残基的随机化，可使所需的Fab变异体文库展示在丝状噬菌体表面。具体地讲，VL残基4和71以及VH残基24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94被选定为对抗原结合至关重要的关键构架残基，并定点随机诱变。
人源化Fab片段的表达和纯化
本领域已知的各种不同的方法可用于表达和纯化片段。如本文所述，用噬菌粒pMB419或其变异噬菌粒来转化大肠杆菌34B8菌株(一种非抑制型菌株)。使单菌落在5毫升含50微克/毫升羧苄青霉素的2YT培养基中37℃生长过夜。将这些培养物稀释于200毫升含20微克/毫升羧苄青霉素的AP5培养液中(该培养基描述于Chang等人，Gene，55，189(1987))，然后30℃孵育26小时。细胞以4000×g离心沉淀，-20℃冷冻至少2小时。然后将细胞沉淀重悬浮于5毫升含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.6)中，4℃振摇90分钟，然后10,000×g离心15分钟。将上清液加至1毫升链球菌G蛋白-Sepharose柱(Pharmacia生产的柱)上，用10毫升10mM MES(pH5.5)洗涤。结合的Fab片段用2.5毫升100mM乙酸洗脱并立刻用0.75毫升1M Tris-HCl，pH8.0中和。Fab制剂的缓冲液被换成PBS，然后用CENTRICON-30浓缩器(Amicon生产)浓缩。在G蛋白纯化之后，典型的Fab产量约为1毫克/升培养物。纯化的Fab样品用电喷射质谱法进行特性分析，而浓度用氨基酸分析确定。
选择人源化Fab变异体
将纯化的标记抗原包被微量滴定板。弃去包被溶液，封闭各孔，然后加入噬菌粒原液。过了一段时间后，洗涤各孔，然后洗脱结合的噬菌体并测定效价。从包被VEGF的孔中洗脱下剩余噬菌体并使其繁殖，以用于下一轮选择。该过程可重复数次以获得所需数目的克隆。例如，可选出几十个各种克隆并测序。
测定VEGF结合亲和力
测定人源化变异体与VEGF结合的结合常数和解离常数。分析结合曲线，并选出具有最高亲和力的变异体。
人源化抗-VEGF抗体的给药
人源化抗-VEGF抗体的给药，可根据Kim等人，生长因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993)中所述的鼠抗-VEGF的数据来制造。具体地讲，Kim等人表明，低至每周施用给药2次10微克VEGF抗体可导致肿瘤生长明显被抑制。在抗体剂量为50-100微克时获得了最大的效果。
下列实施例只是为了说明目前已知的实施本发明的最佳方式，不应认为本发明受到该实施例的细节的限制。
具体实施例I
构建噬菌粒载体和最初的人源化抗-VEGF
鼠抗-VEGF单克隆抗体A4.6.1早已由Kim等人描述，生长因子(Growth Factors)7，53(1992)；Kim等人，自然(Nature)362，841(1993)中。A4.6.1的第一个人源化Fab变异体hu2.0是这样构建的：对编码人VLκI-Cκ1轻链和人VHIII-CHlγ1重链Fd片段的质粒pAK2的含脱氧尿苷的模板进行定点诱变(Carter等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992))。根据Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，(5th)，Public Health Service，National Instistutes of Health，Bethesda，MD(1991)中的序列定义，选出被移植的A4.6.1的CDR序列，除了CDR-H1之外，我们将CDR-H1延伸出去以便包括序列和结构序列，即VH残基26-35(Chothia等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196，901(1987))。将Fab编码序列亚克隆入噬菌粒载体phGHamg3(Bass and Wells，Proteins，8，309(1990)；Lowman等人，Biochem.30，10832(1991))。该构建物pMB4-19编码最初的人源化A4.6.1的Fab(即hu2.0)，其中重链的C末端被精确地融合于M13基因III外被蛋白的羧基部分。pMB4-19这个构建物的构建与pDH188(一种早已描述过的用于单价展示Fab片段的质粒(Garrard等人，Biotechn.9：1373-1377(1991)))相似。pMB4-19与pDH188之间的明显区别包括更短的M13基因III片段(密码子249-406)以及使用紧跟在抗体重链Fd片段之后的琥珀终止密码子。这样可以在大肠杆菌的supE抑制型菌株中表达分泌的重链或重链-基因III融合蛋白两种物质。
在图1中显示了最初的人源化A4.6.1 Fab片段(hu2.0)，其中A4.6.1的CDR被移植枝于人的VLκI-VHIII构架上。Hu2.0的VL区(结构域)示于SEQ ID NO：7中，而Hu2.0的VH区示于SEQ ID NO：10中。
除了被移植的CDR之外，所有的残基都保留与人序列相同。该最初的人源化抗体与VEGF的结合力如此之弱，以致于无法检测。根据其他弱结合的人源化A4.6.1变异体的相对亲和力(数据未示出)，hu2.0的结合KD估计大于7μM。这与嵌合Fab构建物(由鼠A4.6.1的完整VL和VH区和人的恒定区所构成)的1.6nM亲和力形成了反差。因此，hu2.0与VEGF的结合比嵌合抗体下降了至少4000倍。
设计抗-VEGF Fab噬菌粒文库
为了优化在使用人VLκI-VHIII构架时的抗原结合性，选出优化所需的构架变化组，并示于表1和图2。按照Kunkel等人，Methods Enzymol.204，125(1991)的方法，通过定点诱变构建人源化A4.6.1噬菌粒文库。制备用作诱变模板的pMB4-19的衍生质粒，它在VH的密码子24、37、67和93处含有TAA终止三联体密码(所有的序列编号按照Kabat等人，同上)。这种修饰可防止以后野生型序列所造成的背景污染。定点随机变化的目标密码子是4和71(轻链)，以及24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94(重链)。
表1：对于抗原结合至关重要以及作为定点随机变化目标的关键性构架残基
构架残基 人VLκI，VHIII共有残基   鼠A4.6.1残基 随机变化a
VL  4     Met     Met  Met，Leu
 71     Phe     Tyr  Phe，Tyr
VH  24     Ala     Ala  Ala，Val，Thr
 37     Val     Val  Val，Ile
 67     Phe     Phe  Phe，Val，Thr，Leu，Ile，Ala
 69     Ile     Phe  Ile，Phe
 71     Arg     Leu  Argb，Leub
 73     Asp     Thr  Aspb，Thrb
 75     Lys     Ala  Lysb，Alab
 76     Asn     Ser  Asnb，Serb
 78     Leu     Ala  Leu，Ala，Val，Phe
 93     Ala     Ala  Ala，Val，Leu，Ser，Thr
 94     Arg     Lys  Arg，Lys
a在噬菌粒文库中的氨基酸多样性
bVH 71、73、75、76被随机化以产生全鼠(L71/T73/A75/S76)或全人(R71/D73/K75/N76)的VHIII四联体(tetrad)
在设计人源化A4.6.1噬菌粒文库时的一个着眼点是，定点随机化的目标残基是广泛分布于VL和VH序列中的。合成的寡核苷酸长度方面的限制，要求这些构架位置中各点同时进行随机化只能通过使用多个寡核苷酸而实现。然而，随着寡核苷酸总数的增加，诱变的效率(即掺入了所有诱变寡核苷酸序列的突变体的比例)会下降。为了巧妙地克服这一问题，在文库构建中引入两个特征。第一个特征是制备4个不同的、编码每种可能的VL构架组合的诱变模板。由于轻链构架的多样性很有限(仅4种不同序列)，这是简单可行的，但是其优点是不再需要使用来自诱变策略的两种寡核苷酸。第二，两个126碱基的寡核苷酸用更小的合成片段预组装成。这样可以用一个长寡核苷酸而不是用两个较短的寡核苷酸随机诱变VH密码子67、69、71、73、75、76、93和94。因此，最终的随机诱变策略是在4种不同模板上同时采用仅两种寡核苷酸。
更具体地说，为了用一个诱变寡核苷酸来使重链密码子67、69、71、73、75、76、93和94随机化，2个126-聚物的寡核苷酸先通过模板协助式酶连接法用60-聚物和66-聚物的片段预组装成。具体地讲，将1.5nmol 5′磷酸化的寡核苷酸GAT TTC AAA CGT CGT  NYT ACT  WTT TCT AGA GAC AAC TCC AAA AAC ACA  BYT TACCTG CAG ATG AAC(SEQ ID NO：12)或与GAT TTC AAA CGT CGT  NYT ACT  WTT TCTTTA GAC  ACC TCC  GCA  AGC ACA  BYT TAC CTG CAG ATG AAC(SEQ ID NO：1)与1.5nmol AGC CTG CGC GCT GAG GAC ACT GCC GTC TAT TAC TGT  DYA  ARG TAC CCCCAC TAT TAT GGG(SEQ ID NO：2)混合。随机化的密码子带下划线，而N表示A/G/T/C；W表示A/T；B表示G/T/C；D表示G/A/T；R表示A/G；而Y表示C/T(“/”表示“或”)。然后，加入1.5nmol模板寡核苷酸CTC AGC GCG CAG GCTGTT CAT CTG CAG GTA(SEQ ID NO：3)(具有与SEQ ID NO：12和1的5′端以及SEQID NO：3的3′端的互补序列)，使其与连接接头处的各末端杂交。向该混合物中，加入Taq连接酶(New England Biolabs的耐热连接酶)和缓冲液，反应混合物经过40轮热循环(95℃1.25分钟和50℃5分钟)，从而使模板寡核苷酸在连接的和未连接的接头之间循环。产物126-聚物寡核苷酸在6％尿素/TBE聚丙烯酰胺凝胶上纯化，然后以缓冲液从聚丙烯酰胺胶上提取出来。将两个126-聚物产物等比例地混合，乙醇沉淀，最后溶解在10mM Tris-HCl，1mM EDTA中。将混合的126-聚物寡核苷酸产物标记为504-01。
这样，在两个步骤中实现对选定构架密码子(VL的4、71；VH的67、69、71、73、75、76、93和94)的随机诱变。首先，通过制备修饰的pMB4-19模板的另外3个衍生模板而实现VL的随机化。轻链的构架密码子4和71，用两个诱变寡核苷酸GCT GAT ATC CAG TTG ACC CAG TCC CCG(SEQ ID NO：13)和TCT GGG ACGGAT  TAC ACT CTG ACC ATC(SEQ ID NO：4)单个地或成对地予以替换。从每个新的衍生模板制备含脱氧尿苷的模板。与最初的模板一起，这4个构建物编码轻链构架序列4种可能组合中的每种组合(见表1)。
用寡核苷酸504-01(2种126-聚物寡核苷酸的混合物)以及CGT TTG TCC TGTGCA RYT TCT GGC TAT ACC TTC ACC AAC TAT GGT ATG AAC TGG  RTC CGT CAG GCCCCG GGT AAG(SEQ ID NO：5)，并使用刚才所述的4种模板中的一种模板，使重链构架密码子随机诱变。将4种文库电穿孔导入大肠杆菌XL-1 BLUECELLS(Stratagene生产的标记细胞)并合并。各种转化子的总数估计＞1.2×108，比文库中的DNA序列最大数约大1500倍。
用这个策略，轻链残基4和71以及重链残基24、37、67、78和93中的每一个残基可部分地被随机改变，从而可以选出鼠A4.6.1、人VLκI-VHIII序列、或在其他人和鼠构架中常发现的序列(表1)。注意：这些残基的随机变化局限于在人VLκI-VHIII共有序列或A4.6.1构架序列之间作出选择。当然，若包含在其他人和鼠构架序列中常见的额外氨基酸，就有可能因额外的多样性而选出结合更牢固的变异体。
某些重链构架残基是根据人VHIII和鼠A4.6.1根据序列而以两元方式进行随机化的。残基VH71、73、75和76位于毗邻抗原结合位点的发夹环中。VH71和73的侧链大部分被包埋在正规的抗体结构中，而它们在使CDR-H2和CDR-H3构型成形方面的潜在作用是众所周知的。Kettleborough等人，蛋白质工程(ProteinEng.)4，773(1991)；Carter等人，美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89，4285(1992)；Shalaby等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)175，217(1992)。另一方面，尽管VH745和76的侧链是暴露于溶剂的(图2)，但是仍然观察到这两个残基也能影响抗原结合性(Eigenbrot等人，蛋白质(Proteins)18，49(1994))，推测是由于在某些抗体-抗原复合物中直接的抗原接触。因为在序列上靠近且可能相互依赖，需将VH71、73、75和76整块地随机变化，这样这种四联体只有两种可能的组合可供选择：或者是全人VHIII，或者是全鼠A4.6.1序列。最后，VH残基69和94也被随机变化，但仅提供VHIII和A4.6.1序列。在早先的抗体人源化过程中，VH69和94不作替换，但是因为它们在VHIII共有序列和A4.6.1序列之间有差别(图1)而且已注意到对合适的CDR构型有潜在重要性(Foote等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)224，489(1992))，因此它们也被包括在该随机诱变策略中。
在噬菌粒表面上展示的人源化A4.6.1 Fab文库
已开发了各种不同的***用于在丝状噬菌体表面上功能性地展示抗体片段(Winter等人，Ann.Rev.Immunol.12，433(1994))。它们包括以融合于M13噬菌体基因III或基因VII外被蛋白的融合蛋白形式，来展示Fab或单链Fv(scFv)片段。本文所选的***与Garrard等人，Biotechn.9：1373-1377(1991)所述的***相似，其中Fab片段以基因III融合物形式被单价地展示(图3)。该***有两个显著特征。具体地讲，与scFv不同，Fab片段没有形成二聚体物质的倾向，而二聚体的存在会因亲合效应而阻碍选出最强的结合物。此外，被展示蛋白质的单价性消除了第二种亲合效应的潜在来源，而原本在每个噬菌粒颗粒上存在一个蛋白的多个拷贝时会产生这种亲合效应(Bass and Wells，Proteins，8，309(1990)；Lowman等人，Biochem.30，10832(1991))。
使展示人源化A4.6.1 Fab片段的噬菌粒颗粒，在大肠杆菌XL-1 Blue细胞中繁殖。简而言之，使携带随机化pMB4-19构建物的细胞，在25毫升含50微克/毫升羧苄青霉素和约1010 M13KO7辅助噬菌体的2YT培养基中，37℃生长过夜(Viera andMessing，Methods Enzymol.153，3[1987])。噬菌粒原液通过用聚乙二醇盐水溶液沉淀培养上清液而加以纯化，然后重悬于100微升PBS中(约1014噬菌粒/毫升)。
选择人源化的A4.6.1 Fab变异体
将纯化的VEGF121(100微升，10微克/毫升PBS)包被微量滴定板孔，4℃过夜。弃去包被溶液，用6％脱脂奶封闭该孔和未包被的孔1小时，并用含0.05％吐温20(洗涤剂)的PBS洗孔。然后每孔加入噬菌粒原液10微升(用含1％BSA和0.05％吐温20的20mMTris(pH7.5)稀释至100微升)。2小时后洗涤各孔，然后用100微升0.1M甘氨酸(pH2.0)洗脱结合的噬菌体并用25微升1M Tris pH8.0中和。取一等份用于洗脱噬菌体数目的滴定。从VEGF包被孔上洗脱下的其余噬菌体被繁殖，以用于下一轮选择循环。总计进行了8轮选择，之后20个克隆可以被选出并测序(Sanger等人，PNAS USA，74，5463(1977))。
因此，根据与VEGF的结合性选出人源化的A4.6.1 Fab噬菌粒文库的变异体。通过比较VEGF包被的和未包被的微量滴定板孔中所洗脱出的噬菌体效价，确定功能性噬菌粒的富集程度，在7轮亲和力淘选之内富集程度是增加的。在又一轮挑选之后，对20个克隆进行测序以鉴定在每个随机化位点处选出的优选构架残基。这些结果总结于表2，揭示出在所选的克隆之间有强共有序列。20个克隆中的10个有相同的DNA序列，命名为h2.10。在13个被随机化的构架位置中，在hu2.10中选出了8个取代(VL71；VH37、71、73、75、76、78和94)。有趣的是，选出的残基VH37(Ile)和78(Val)既不是人VHIII的也不是鼠A4.6.1序列的。这个结果提示，通过将多样性扩展至靶定的人和亲代鼠构架序列之外，可以使某些构架位置受益。
              表2从人源化A4.6.1噬菌粒Fab文库中选出的序列
变异体 残基取代
VL VH
4  71  24  37  67  69  71  73  75  76  78  93  94
鼠A4.6.1 M  Y  A  V  F  F  L  T  A  S  A  A  K
Hu2.0(CDR移植) M  F  A  V  F  I  R  N  K  N  L  A  R
噬菌体选择克隆
Hu2.1(2) - Y  -  I  -  -  -  -  -  -  V  -  K
Hu2.2(2) L Y  -  I  -  -  -  -  -  -  V  -  K
Hu2.6(1) L -  -  I  T  -  L  T  A  S  V  -  K
Hu2.7(1) L -  -  I  T  -  -  -  -  -  V  -  K
Hu2.10(10) - Y  -  I  -  -  L  T  A  S  V  -  K
Hu2.0和鼠A4.6.1抗体之间的区别用下划线标出。对于每种噬菌体选出序列相同的克隆数目在括号中标出。在噬菌体选出的克隆序列中的破折号表示选出的是人VlкI-VHIII构架序列(即与hu2.0中相同)。
在被分析的其余10种克隆中，有另外4种独特的氨基酸序列：hu2.1、hu2.2、hu2.6和hu2.7。除了hu2.10之外，所有这些克隆在位置VH37(Ile)、78(Val)和94(Lys)处含有相同的构架取代，但是在位置24和93保留了人VHIII共有序列。4个克隆丢失了轻链编码序列，在噬菌体ELISA试验(Cunningham等人，EMBO J.13，2508(1994))中测试时不结合于VEGF。我们偶然注意到了其他Fab噬菌粒文库中有丢失轻链或重链序列的情况(未公开数据)，而且这些克隆是以更高的表达为基础而假设地选出的。通过减少选择循环次数或者通过在固相培养基上繁殖文库，常可最大程度减少这种人为现象。
测定VEGF的结合亲和力
通过表面胞质团共振法(surface plasmon resonance)(Karlsson等人，J.Immun.Methods 145，229(1991))，在Pharmacia BIAcore仪器上测定了人源化A4.6.1 Fab变异体与VEGF121结合的结合常数(kon)和解离常数(koff)。VEGF121通过伯氨基而共价固定于生物传感器芯片上。人源化A4.6.1 Fab变异体的结合性的测定，是通过将Fab(以PBS/0.05％TWEEN-20(去污剂)配)溶液以20微升/分钟的流速流过芯片。在每次结合测量之后，用5微升50mM盐酸水溶液以3微升/分钟速度洗涤，从而将残留的Fab从固定化的配体上脱下。用简单的单价结合模式(BIAevalution软件2.0版；Pharmacia)，通过非线性回归法分析结合曲线。
用摇瓶在大肠杆菌中表达噬菌体选出的变异体hu2.1、hu2.2、hu2.6、hu2.7和hu2.10，然后用G蛋白亲和层析从周质提取物中纯化得到Fab片段。这5种克隆的Fab回收产率在0.2(hu2.6)-1.7毫克/升(hu2.1)之间。这些变异体对抗原(VEGF)的亲和力用表面胞质团共振法在BIAcore仪器上测定，示于表3。
         表3人源化A4.6.1 Fab变异体的VEGF结合亲和力
变异体     kon     koff     KD   KD(A4.6.1)/KD(突变体)
  M-1s-1/104     104S-1     NM
鼠A4.6.1嵌合体      5.4     0.85     1.6
 Hu2.0      ND     ND  ＞7000**     ＞4000
噬菌体选出的克隆
 Hu2.1     0.70     18     260     170
 Hu2.2     0.47     16     340     210
 Hu2.6     0.67     4.5     67     40
 Hu2.7     0.67     24     360     230
 Hu2.10     0.63     3.5     55     35
 *Hu2.10V     2.0     1.8     9.3     5.8
*Hu2.10V＝具有VL Leu46→Val突变的Hu2.10；估计在Biacore结合测量值中的误差为±25％；**太弱以致于无法测量，更低结合的估计值
这一结合数据的分析揭示，在5种被测试的变异体中，共有序列的克隆hu2.10对VEGF具有最高亲和力。因此，我们的Fab噬菌粒文库选择性富集了结合最牢的克隆。计算出的hu2.10的KD是55nM，至少比没有构架变化的hu2.0(KD＞7μM)结合牢固125倍。其他4种选出的变异体都表现出与VEGF的弱结合，最弱的(hu2.7)低至KD为360nM。有趣的是，hu2.6的KD是67nM，只比hu2.10略低，但是在20个被测序克隆中仅有一个这样的克隆。这可能是因为表达和展示的水平较低，正如表达该变异体的可溶性Fab时一样。然而，尽管表达率较低，该变异体仍可用作人源化抗体。
人源化变异体hu2.10的进一步改进
尽管抗原亲和性已比最初的人源化变异体有了大幅提高，hu2.10与VEGF的结合仍比含有鼠A4.6.1 VL和VH区的嵌合Fab片段弱35倍。这种相当大的差别提示，可通过额外的突变使人源化构架进一步优化。在Foote等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196，901(1992)所鉴别的游标残基中，仅残基VL46、VH2和VH48在A4.6.1和人VlκI-VHIII构架之间是不同的(图1)但在我们的噬菌粒文库中没有被随机变化。人源化A4.6.1 Fv片段的分子模型显示，VL46位于VL-VH界面处而且可能影响CDRH3的构型。此外，该氨基酸在大多数Vlκ构架中几乎总是亮氨酸(Kabat等人，同上)，但是在A4.6.1中是缬氨酸。因此，在hu2.10的基础上在该位置进行了Leu→Val取代。对该新变异体hu2.10V的结合动力学分析表明，与VEGF结合的KD又提高了6倍。这样，hu2.10V的KD(9.3nM)就在嵌合体KD的6倍之内。与VL46相反，将VH2或VH48残基用鼠A4.6.1的相应残基进行替换时，未见hu2.10结合亲和力的提高。
有趣的是，最后变化之前的亲和力部分提高，是因为提高了结合速率常数(kon)，这提示VL46可能在使抗体结构预先形成更适合结合抗原的构型方面起作用。影响抗原亲和力的其他突变主要是因为结合的解离速率常数(koff)发生变化。HU2.1和HU2.10的比较揭示，用A4.6.1序列替换VH残基71、73、75、76导致亲和力提高5倍。将VL71转变为A4.6.1序列(Phe→Tyr)对结合的影响可忽略不计(HU2.2对HU2.7)，而在VL4位上具有亮氨酸的变异体的结合力比那些具有甲硫氨酸(在A4.6.1和人 构架中的天然存在的残基)的变异体稍差(＜2倍)(HU2.2对HU2.1)。对此处未示出的其他人源化A4.6.1变异体的比较揭示，VH94 Arg→Lys改变导致KD提高5倍，这或者是因为该残基直接与抗原接触，或者是因为其在维持CDR-H3合适构型中在结构方面起作用。变异体HU2.6与共有序列的克隆hu2.10相比有3个序列差别，但是仍有类似的KD，因而提示这3个取代对抗原结合只有很少影响。在VL4和71处保守性变化的可忽略不计的影响与其他变异体的结合数据是一致的，而VH67的变化(Phe→Thr)对结合的影响很小。
结束语
上面描述的内容详细地说明了具体化的方法，它们可用于实施本发明。在详细描述了这些具体方法之后，本领域技术人员会充分知晓如何设计其他可靠方法，从而通过应用本发明的成果来获得同样信息。因此，无论文中前面的描述如何详细，都不应理解为限制其总体范围；相反，本发明范围仅由所附权利要求的法律结构所确定。在本文中提及的所有文献都明白地纳入本文作为参考。
                          序列表(1)一般信息：(i)申请人：GENENTECH，INC.(ii)发明名称：人源化抗体和制备人源化抗体的方法(iii)序列数目：14(iv)通信地址：
   (A)收信人：Flehr Hohbach Test Albritton & Herbert
   (B)街道：Four Embarcadero Center，Suite 3400
   (C)城市：San Francisco
   (D)州：California
   (E)国家：美国
   (F)邮编：94111(v)计算机可读形式：
   (A)记录介质类型：软盘
   (B)计算机：IBM PC兼容型
   (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS
   (D)软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30(vi)本申请资料：
   (A)申请号：PCT HEREWITH
   (B)申请日：02-4月-1998
   (C)分类：(vi)本申请资料：
   (A)申请号：08/833,504
   (B)申请日：07-4月-1997
   (C)分类：(viii)律师/代理人信息：
   (A)姓名：Dreger Walter H
   (B)登记号：24,190
   (C)参考/案卷号：A-64254(ix)通讯信息：
   (A)电话：(415)781-1989
   (B)传真：(415)398-3249(2)SEQ ID NO：1：(i)序列特征：
   (A)长度：66碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTTTA GACACCTCCG CAAGCACABY TTACCTGCAG  60ATGAAC                                                             66(2)SEQ ID NO：2：(i)序列特征：
   (A)长度：60碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：AGCCTGCGCG CTGAGGACAC TGCCGTCTAT TACTGTDYAA RGTACCCCCA CTATTATGGG  60(2)SEQ ID NO：3：(i)序列特征：
   (A)长度：30碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(基因组)(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：CTCAGCGCGC AGGCTGTTCA TCTGCAGGTA                                   30(2)SEQ ID NO：4：(i)序列特征：
   (A)长度：27碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：TCTGGGACGG ATTACACTCT GACCATC                                      27(2)SEQ ID NO：5：(i)序列特征：
   (A)长度：75碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：CGTTTGTCCT GTGCARYTTC TGGCTATACC TTCACCAACT ATGGTATGAA CTGGRTCCGT  60CAGGCCCCGG GTAAG                                                   75(2)SEQ ID NO：6：(i)序列特征：
   (A)长度：107氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Ile Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
         20                  25                  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Val Leu Ile
     35                  40                  45Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
             85                  90                  95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
         100                 105(2)SEQ ID NO：7：(i)序列特征：
  (A)长度：107氨基酸
  (B)类型：氨基酸
  (C)链型：未知
  (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
         20                  25                  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
     35                  40                  45Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
 50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
             85                  90                  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
         100                 105(2)SEQ ID NO：8：(i)序列特征：
   (A)长度：107氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知   (ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly1               5                   10                  15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
        20                  25                  30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
    35                  40                  45Tyr Phe Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50                  55                  60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65                  70                  75                  80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Thr Val Pro Trp
            85                  90                  95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
        100                 105(2)SEQ ID NO：9：(i)序列特征：
   (A)长度：123氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：Glu Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Gln Pro Gly Glu1               5                   10                  15Thr Val Arg Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
        20                  25                  30Gly Met Asn Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Lys Trp Met
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50                  55                  60Lys Arg Arg Phe Thr Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser Thr Ala Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Ile Ser Asn Leu Lys Asn Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys
            85                  90                  95Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
        100                 105                 110Trp Gly Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO：10：(i)序列特征：
   (A)长度：123氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                   10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
        20                  25                  30Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50                  55                  60Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95Ala Arg Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
        100                 105                 110Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO：11：(i)序列特征：
   (A)长度：123氨基酸
   (B)类型：氨基酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：蛋白质(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly1               5                   10                  15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
        20                  25                  30Gly Met Asn Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
    35                  40                  45Gly Trp Ile Asn Thr Tyr Thr Gly Glu Pro Thr Tyr Ala Ala Asp Phe
50                  55                  60Lys Arg Arg Phe Thr Ile Ser Leu Asp Thr Ser Ala Ser Thr Val Tyr65                  70                  75                  80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
            85                  90                  95Ala Lys Tyr Pro His Tyr Tyr Gly Ser Ser His Trp Tyr Phe Asp Val
        100                 105                 110Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
    115                 120(2)SEQ ID NO：12：   (i)序列特征：
   (A)长度：66碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：GATTTCAAAC GTCGTNYTAC TWTTTCTAGA GACAACTCCA AAAACACABY TTACCTGCAG  60ATGAAC                                                             66(2)SEQ ID NO：13：(i)序列特征：
   (A)长度：27碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知(ii)分子类型：DNA(xi)序列描述：SEQ ID NO：13：GCTGATATCC AGTTGACCCA GTCCCCG                                      27(2)SEQ ID NO：14：(i)序列特征：
   (A)长度：6072碱基对
   (B)类型：核酸
   (C)链型：未知
   (D)拓扑结构：未知   (ii)分子类型：DNA(ix)FEATURE：
   (A)名称/关键符号：混合特征
   (B)位置：459..460
   (D)其他信息：/注意＝＂轻链开始于碱基No.459.＂(ix)FEATURE：
   (A)名称/关键符号：混合特征
   (B)位置：1101..1102
   (D)其他信息：/注意＝＂轻链终止于碱基No.1101.＂(ix)FEATURE：
   (A)名称/关键符号：混合特征
   (B)位置：1254..1255
   (D)其他信息：/注意＝＂重链开始于碱基No.1254.＂(ix)FEATURE：
   (A)名称/关键符号：混合特征
   (B)位置：2424..2425
   (D)其他信息：/注意＝＂重链终止于碱基No..2424.＂(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：GAATTCAACT  TCTCCATACT  TTGGATAAGG  AAATACAGAC  ATGAAAAATC  TCATTGCTGA       60GTTGTTATTT  AAGCTTTGGA  GATTATCGTC  ACTGCAATGC  TTCGCAATAT  GGCGCAAAAT      120GACCAACAGC  GGTTGATTGA  TCAGGTAGAG  GGGGCGCTGT  ACGAGGTAAA  GCCCGATGCC      180AGCATTCCTG  ACGACGATAC  GGAGCTGCTG  CGCGATTACG  TAAAGAAGTT  ATTGAAGCAT      240CCTCGTCAGT  AAAAAGTTAA  TCTTTTCAAC  AGCTGTCATA  AAGTTGTCAC  GGCCGAGACT      300TATAGTCGCT  TTGTTTTTAT  TTTTTAATGT  ATTTGTAACT  AGAATTCGAG  CTCGGTACCC      360GGGGATCCTC  TAGAGGTTGA  GGTGATTTTA  TGAAAAAGAA  TATCGCATTT  CTTCTTGCAT      420CTATGTTCGT  TTTTTCTATT  GCTACAAACG  CGTACGCTGA  TATCCAGATG  ACCCAGTCCC      480CGAGCTCCCT  GTCCGCCTCT  GTGGGCGATA  GGGTCACCAT  CACCTGCAGC  GCAAGTCAGG      540ATATTAGCAA  CTATTTAAAC  TGGTATCAAC  AGAAACCAGG  AAAAGCTCCG  AAAGTACTGA      600TTTACTTCAC  CTCCTCTCTC  CACTCTGGAG  TCCCTTCTCG  CTTCTCTGGA  TCCGGTTCTG      660GGACGGATTA  CACTCTGACC  ATCAGCAGTC  TGCAGCCAGA  AGACTTCGCA  ACTTATTACT      720GTCAACAGTA  TAGCACCGTG  CCGTGGACGT  TTGGACAGGG  TACCAAGGTG  GAGATCAAAC      780GAACTGTGGC  TGCACCATCT  GTCTTCATCT  TCCCGCCATC  TGATGAGCAG  TTGAAATCTG      840GAACTGCTTC  TGTTGTGTGC  CTGCTGAATA  ACTTCTATCC  CAGAGAGGCC  AAAGTACAGT      900GGAAGGTGGA  TAACGCCCTC  CAATCGGGTA  ACTCCCAGGA  GAGTGTCACA  GAGCAGGACA      960GCAAGGACAG  CACCTACAGC  CTCAGCAGCA  CCCTGACGCT  GAGCAAAGCA  GACTACGAGA     1020AACACAAAGT  CTACGCCTGC  GAAGTCACCC  ATCAGGGCCT  GAGCTCGCCC  GTCACAAAGA     1080GCTTCAACAG  GGGAGAGTGT  TAAGCTGATC  CTCTACGCCG  GACGCATCGT  GGCCCTAGTA     1140CGCAACTAGT  CGTAAAAAGG  GTATCTAGAG  GTTGAGGTGA  TTTTATGAAA  AAGAATATCG     1200CATTTCTTCT  TGCATCTATG  TTCGTTTTTT  CTATTGCTAC  AAACGCGTAC  GCTGAGGTTC     1260AGCTGGTGGA  GTCTGGCGGT  GGCCTGGTGC  AGCCAGGGGG  CTCACTCCGT  TTGTCCTGTG     1320CAGCTTCTGG  CTATACCTTC  ACCAACTATG  GTATGAACTG  GATCCGTCAG  GCCCCGGGTA     1380AGGGCCTGGA  ATGGGTTGGA  TGGATTAACA  CCTATACCGG  TGAACCGACC  TATGCTGCGG     1440ATTTCAAACG  TCGTTTTACT  ATTTCTTTAG  ACACCTCCGC  AAGCACAGTT  TACCTGCAGA     1500TGAACAGCCT  GCGCGCTGAG  GACACTGCCG  TCTATTACTG  TGCAAAGTAC  CCCCACTATT     1560ATGGGAGCAG  CCACTGGTAT  TTCGACGTCT  GGGGTCAAGG  AACCCTGGTC  ACCGTCTCCT     1620CGGCCTCCAC  CAAGGGCCCA  TCGGTCTTCC  CCCTGGCACC  CTCCTCCAAG  AGCACCTCTG     1680GGGGCACAGC  GGCCCTGGGC  TGCCTGGTCA  AGGACTACTT  CCCCGAACCG  GTGACGGTGT     1740CGTGGAACTC  AGGCGCCCTG  ACCAGCGGCG  TGCACACCTT  CCCGGCTGTC  CTACAGTCCT     1800CAGGACTCTA  CTCCCTCAGC  AGCGTGGTGA  CCGTGCCCTC  CAGCAGCTTG  GGCACCCAGA     1860CCTACATCTG  CAACGTGAAT  CACAAGCCCA  GCAACACCAA  GGTCGACAAG  AAAGTTGAGC     1920CCAAATCTTG  TGACAAAACT  CACCTCTAGA  GTGGCGGTGG  CTCTGGTTCC  GGTGATTTTG     1980ATTATGAAAA  GATGGCAAAC  GCTAATAAGG  GGGCTATGAC  CGAAAATGCC  GATGAAAACG     2040CGCTACAGTC  TGACGCTAAA  GGCAAACTTG  ATTCTGTCGC  TACTGATTAC  GGTGCTGCTA     2100TCGATGGTTT  CATTGGTGAC  GTTTCCGGCC  TTGCTAATGG  TAATGGTGCT  ACTGGTGATT     2160TTGCTGGCTC  TAATTCCCAA  ATGGCTCAAG  TCGGTGACGG  TGATAATTCA  CCTTTAATGA     2220ATAATTTCCG  TCAATATTTA  CCTTCCCTCC  CTCAATCGGT  TGAATGTCGC  CCTTTTGTCT     2280TTAGCGCTGG  TAAACCATAT  GAATTTTCTA  TTGATTGTGA  CAAAATAAAC  TTATTCCGTG     2340GTGTCTTTGC  GTTTCTTTTA  TATGTTGCCA  CCTTTATGTA  TGTATTTTCT  ACGTTTGCTA     2400ACATACTGCG  TAATAAGGAG  TCTTAATCAT  GCCAGTTCTT  TTGGCTAGCG  CCGCCCTATA     2460CCTTGTCTGC  CTCCCCGCGT  TGCGTCGCGG  TGCATGGAGC  CGGGCCACCT  CGACCTGAAT     2520GGAAGCCGGC  GGCACCTCGC  TAACGGATTC  ACCACTCCAA  GAATTGGAGC  CAATCAATTC    2580TTGCGGAGAA  CTGTGAATGC  GCAAACCAAC  CCTTGGCAGA  ACATATCCAT  CGCGTCCGCC    2640ATCTCCAGCA  GCCGCACGCG  GCGCATCTCG  GGCAGCGTTG  GGTCCTGGCC  ACGGGTGCGC    2700ATGATCGTGC  TCCTGTCGTT  GAGGACCCGG  CTAGGCTGGC  GGGGTTGCCT  TACTGGTTAG    2760CAGAATGAAT  CACCGATACG  CGAGCGAACG  TGAAGCGACT  GCTGCTGCAA  AACGTCTGCG    2820ACCTGAGCAA  CAACATGAAT  GGTCTTCGGT  TTCCGTGTTT  CGTAAAGTCT  GGAAACGCGG    2880AAGTCAGCGC  CCTGCACCAT  TATGTTCCGG  ATCTGCATCG  CAGGATGCTG  CTGGCTACCC    2940TGTGGAACAC  CTACATCTGT  ATTAACGAAG  CGCTGGCATT  GACCCTGAGT  GATTTTTCTC    3000TGGTCCCGCC  GCATCCATAC  CGCCAGTTGT  TTACCCTCAC  AACGTTCCAG  TAACCGGGCA    3060TGTTCATCAT  CAGTAACCCG  TATCGTGAGC  ATCCTCTCTC  GTTTCATCGG  TATCATTACC    3120CCCATGAACA  GAAATTCCCC  CTTACACGGA  GGCATCAAGT  GACCAAACAG  GAAAAAACCG    3180CCCTTAACAT  GGCCCGCTTT  ATCAGAAGCC  AGACATTAAC  GCTTCTGGAG  AAACTCAACG    3240AGCTGGACGC  GGATGAACAG  GCAGACATCT  GTGAATCGCT  TCACGACCAC  GCTGATGAGC    3300TTTACCGCAG  GATCCGGAAA  TTGTAAACGT  TAATATTTTG  TTAAAATTCG  CGTTAAATTT    3360TTGTTAAATC  AGCTCATTTT  TTAACCAATA  GGCCGAAATC  GGCAAAATCC  CTTATAAATC    3420AAAAGAATAG  ACCGAGATAG  GGTTGAGTGT  TGTTCCAGTT  TGGAACAAGA  GTCCACTATT    3480AAAGAACGTG  GACTCCAACG  TCAAAGGGCG  AAAAACCGTC  TATCAGGGCT  ATGGCCCACT    3540ACGTGAACCA  TCACCCTAAT  CAAGTTTTTT  GGGGTCGAGG  TGCCGTAAAG  CACTAAATCG    3600GAACCCTAAA  GGGAGCCCCC  GATTTAGAGC  TTGACGGGGA  AAGCCGGCGA  ACGTGGCGAG    3660AAAGGAAGGG  AAGAAAGCGA  AAGGAGCGGG  CGCTAGGGCG  CTGGCAAGTG  TAGCGGTCAC    3720GCTGCGCGTA  ACCACCACAC  CCGCCGCGCT  TAATGCGCCG  CTACAGGGCG  CGTCCGGATC    3780CTGCCTCGCG  CGTTTCGGTG  ATGACGGTGA  AAACCTCTGA  CACATGCAGC  TCCCGGAGAC    3840GGTCACAGCT  TGTCTGTAAG  CGGATGCCGG  GAGCAGACAA  GCCCGTCAGG  GCGCGTCAGC    3900GGGTGTTGGC  GGGTGTCGGG  GCGCAGCCAT  GACCCAGTCA  CGTAGCGATA  GCGGAGTGTA    3960TACTGGCTTA  ACTATGCGGC  ATCAGAGCAG  ATTGTACTGA  GAGTGCACCA  TATGCGGTGT    4020GAAATACCGC  ACAGATGCGT  AAGGAGAAAA  TACCGCATCA  GGCGCTCTTC  CGCTTCCTCG    4080CTCACTGACT  CGCTGCGCTC  GGTCGTTCGG  CTGCGGCGAG  CGGTATCAGC  TCACTCAAAG    4140GCGGTAATAC  GGTTATCCAC  AGAATCAGGG  GATAACGCAG  GAAAGAACAT  GTGAGCAAAA    4200GGCCAGCAAA  AGGCCAGGAA  CCGTAAAAAG  GCCGCGTTGC  TGGCGTTTTT  CCATAGGCTC    4260CGCCCCCCTG  ACGAGCATCA  CAAAAATCGA  CGCTCAAGTC  AGAGGTGGCG  AAACCCGACA    4320GGACTATAAA  GATACCAGGC  GTTTCCCCCT  GGAAGCTCCC  TCGTGCGCTC  TCCTGTTCCG    4380ACCCTGCCGC  TTACCGGATA  CCTGTCCGCC  TTTCTCCCTT  CGGGAAGCGT  GGCGCTTTCT    4440CATAGCTCAC  GCTGTAGGTA  TCTCAGTTCG  GTGTAGGTCG  TTCGCTCCAA  GCTGGGCTGT    4500GTGCACGAAC  CCCCCGTTCA  GCCCGACCGC  TGCGCCTTAT  CCGGTAACTA  TCGTCTTGAG    4560TCCAACCCGG  TAAGACACGA  CTTATCGCCA  CTGGCAGCAG  CCACTGGTAA  CAGGATTAGC    4620AGAGCGAGGT  ATGTAGGCGG  TGCTACAGAG  TTCTTGAAGT  GGTGGCCTAA  CTACGGCTAC    4680ACTAGAAGGA  CAGTATTTGG  TATCTGCGCT  CTGCTGAAGC  CAGTTACCTT  CGGAAAAAGA    4740GTTGGTAGCT  CTTGATCCGG  CAAACAAACC  ACCGCTGGTA  GCGGTGGTTT  TTTTGTTTGC    4800AAGCAGCAGA  TTACGCGCAG  AAAAAAAGGA  TCTCAAGAAG  ATCCTTTGAT  CTTTTCTACG    4860GGGTCTGACG  CTCAGTGGAA  CGAAAACTCA  CGTTAAGGGA  TTTTGGTCAT  GAGATTATCA    4920AAAAGGATCT  TCACCTAGAT  CCTTTTAAAT  TAAAAATGAA  GTTTTAAATC  AATCTAAAGT    4980ATATATGAGT  AAACTTGGTC  TGACAGTTAC  CAATGCTTAA  TCAGTGAGGC  ACCTATCTCA    5040GCGATCTGTC  TATTTCGTTC  ATCCATAGTT  GCCTGACTCC  CCGTCGTGTA  GATAACTACG    5100ATACGGGAGG  GCTTACCATC  TGGCCCCAGT  GCTGCAATGA  TACCGCGAGA  CCCACGCTCA    5160CCGGCTCCAG  ATTTATCAGC  AATAAACCAG  CCAGCCGGAA  GGGCCGAGCG  CAGAAGTGGT    5220CCTGCAACTT  TATCCGCCTC  CATCCAGTCT  ATTAATTGTT  GCCGGGAAGC  TAGAGTAAGT    5280AGTTCGCCAG  TTAATAGTTT  GCGCAACGTT  GTTGCCATTG  CTGCAGGCAT  CGTGGTGTCA    5340CGCTCGTCGT  TTGGTATGGC  TTCATTCAGC  TCCGGTTCCC  AACGATCAAG  GCGAGTTACA    5400TGATCCCCCA  TGTTGTGCAA  AAAAGCGGTT  AGCTCCTTCG  GTCCTCCGAT  CGTTGTCAGA    5460AGTAAGTTGG  CCGCAGTGTT  ATCACTCATG  GTTATGGCAG  CACTGCATAA  TTCTCTTACT    5520GTCATGCCAT  CCGTAAGATG  CTTTTCTGTG  ACTGGTGAGT  ACTCAACCAA  GTCATTCTGA    5580GAATAGTGTA  TGCGGCGACC  GAGTTGCTCT  TGCCCGGCGT  CAACACGGGA  TAATACCGCG    5640CCACATAGCA  GAACTTTAAA  AGTGCTCATC  ATTGGAAAAC  GTTCTTCGGG  GCGAAAACTC    5700TCAAGGATCT  TACCGCTGTT  GAGATCCAGT  TCGATGTAAC  CCACTCGTGC  ACCCAACTGA    5760TCTTCAGCAT  CTTTTACTTT  CACCAGCGTT  TCTGGGTGAG  CAAAAACAGG  AAGGCAAAAT    5820GCCGCAAAAA  AGGGAATAAG  GGCGACACGG  AAATGTTGAA  TACTCATACT  CTTCCTTTTT    5880CAATATTATT  GAAGCATTTA  TCAGGGTTAT  TGTCTCATGA  GCGGATACAT  ATTTGAATGT    5940ATTTAGAAAA  ATAAACAAAT  AGGGGTTCCG  CGCACATTTC  CCCGAAAAGT  GCCACCTGAC    6000GTCTAAGAAA  CCATTATTAT  CATGACATTA  ACCTATAAAA  ATAGGCGTAT  CACGAGGCCC    6060TTTCGTCTTC  AA                                                            6072

Claims (20)

1.一种人源化抗体，其特征在于，非人抗体的互补决定区CDR被接枝到含VLκ亚组I(V1κI)和VH亚组III(VHIII)的人构架上，其中在VL区中代表性编号残基4和71中至少一个残基被与该位置上氨基酸不同的氨基酸所取代，而且在VH区中代表性编号残基24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94中至少3个残基被与该位置上氨基酸不同的氨基酸所取代。
2.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，该抗体针对血管内皮生长因子。
3.如权利要求2所述的人源化抗体，其特征在于，VL区具有SEQ ID NO：8所示的序列而VH区具有SEQ ID NO：11所示的序列。
4.如权利要求3所述的人源化抗体，其特征在于，在SEQ ID NO：8中，残基46亮氨酸被缬氨酸所取代。
5.如权利要求3所述的人源化抗体，其特征在于，在SEQ ID NO：8中，残基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代；残基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代；而且在SEQ ID NO：11中，残基67苯丙氨酸被苏氨酸所取代。
6.如权利要求2所述的人源化抗体，其特征在于，VL区具有SEQ ID NO：7所示的序列而VH区具有SEQ ID NO：10所示的序列，其中在SEQ ID NO：7中残基71苯丙氨酸被酪氨酸所取代，而且在SEQ ID NO：10中残基37缬氨酸被异亮氨酸所取代，残基78亮氨酸被缬氨酸所取代，而残基94精氨酸被赖氨酸所取代。
7.如权利要求6所述的人源化抗体，其特征在于，在SEQ ID NO：7中残基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代。
8.如权利要求7所述的人源化抗体，其特征在于，在SEQ ID NO：7中残基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代，而且在SEQ ID NO：10中残基67苯丙氨酸被苏氨酸所取代。
9.一种使非人抗体人源化的方法，其特征在于，它包括步骤：
将非人抗体的互补决定区CDR移植到含VLκ亚组I(V1κI)和VH亚组III(VHIII)的人构架上；
对VL区中残基4和71中至少一个残基用与该位置上氨基酸不同的氨基酸进行取代；
对在VH区中残基24、37、67、69、71、73、75、76、78、93和94中至少3个残基用与该位置上氨基酸不同的氨基酸进行取代。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，该抗体针对血管内皮生长因子。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，VL区具有SEQ ID NO：8所示的序列而VH区具有SEQ ID NO：11所示的序列。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO：8中，残基46亮氨酸被缬氨酸所取代。
13.如权利要求11所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO：8中，残基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代；残基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代；而且在SEQ ID NO：11中，残基67苯丙氨酸被苏氨酸所取代。
14.如权利要求10所述的方法，其特征在于，VL区具有SEQ ID NO：7所示的序列而VH区具有SEQ ID NO：10所示的序列，其中在SEQ ID NO：7中残基71苯丙氨酸被酪氨酸所取代，而且在SEQ ID NO：10中残基37缬氨酸被异亮氨酸所取代，残基78亮氨酸被缬氨酸所取代，而残基94精氨酸被赖氨酸所取代。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO：7中残基4甲硫氨酸被亮氨酸所取代。
16.如权利要求15所述的方法，其特征在于，在SEQ ID NO：7中残基71酪氨酸被苯丙氨酸所取代。
17.如权利要求10所述的方法，其特征在于，还包括步骤：
在噬菌粒上展示取代的VL和VH区；
测定VEGF是否结合于取代的VL和VH区；
选择结合于VEGF的人源化抗体。
18.一种通过抑制促有丝***信号传导而抑制肿瘤生长方法，其特征在于，通过将权利要求1所述的人源化抗体施用于肿瘤。
19.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，该抗体由在高严谨条件下与具有SEQ ID NO：14所示序列的核酸分子杂交的核酸分子所编码。
20.如权利要求1所述的人源化抗体，其特征在于，由具有SEQ ID NO：14所示序列的核酸分子编码。
CNB98805910XA 1997-04-07 1998-04-03 人源化抗体和制备人源化抗体的方法 Expired - Lifetime CN1191276C (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US83350497A 1997-04-07 1997-04-07
US08/833,504 1997-04-07

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1259961A true CN1259961A (zh) 2000-07-12
CN1191276C CN1191276C (zh) 2005-03-02

Family

ID=25264594

Family Applications (6)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009101470179A Expired - Lifetime CN101665536B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN200910147016A Pending CN101838328A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971402A Expired - Lifetime CN101210050B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CNB98805910XA Expired - Lifetime CN1191276C (zh) 1997-04-07 1998-04-03 人源化抗体和制备人源化抗体的方法
CN201410411945.2A Pending CN104231078A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971417A Expired - Lifetime CN101210051B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体

Family Applications Before (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN2009101470179A Expired - Lifetime CN101665536B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN200910147016A Pending CN101838328A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971402A Expired - Lifetime CN101210050B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410411945.2A Pending CN104231078A (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体
CN2007101971417A Expired - Lifetime CN101210051B (zh) 1997-04-07 1998-04-03 抗-血管内皮生长因子的抗体

Country Status (22)

Country Link
EP (6) EP3260468A1 (zh)
JP (1) JP4191258B2 (zh)
KR (2) KR100794454B1 (zh)
CN (6) CN101665536B (zh)
AT (4) ATE541586T1 (zh)
AU (1) AU740738B2 (zh)
BR (1) BRPI9809388B8 (zh)
CA (1) CA2286397C (zh)
CY (3) CY1111345T1 (zh)
DE (3) DE69841815D1 (zh)
DK (4) DK2301580T3 (zh)
ES (4) ES2349559T3 (zh)
HK (7) HK1025338A1 (zh)
IL (3) IL132239A0 (zh)
LT (1) LTC0973804I2 (zh)
NO (3) NO325823B1 (zh)
NZ (1) NZ500077A (zh)
PT (5) PT1695985E (zh)
SI (5) SI1695985T1 (zh)
TR (1) TR199902818T2 (zh)
WO (1) WO1998045332A2 (zh)
ZA (2) ZA982907B (zh)

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1903880B (zh) * 2006-08-02 2010-05-12 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗肿瘤血管内皮生长因子vegf-e抗原及其编码基因与应用
CN102051396A (zh) * 2009-11-04 2011-05-11 无锡天演生物技术有限公司 雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用
CN102863533A (zh) * 2010-06-21 2013-01-09 中国科学技术大学 抗体人源化改造方法
CN101148474B (zh) * 2006-09-21 2014-06-11 上海杰隆生物工程股份有限公司 人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法
WO2015085847A1 (zh) * 2013-12-12 2015-06-18 上海恒瑞医药有限公司 Pd-1抗体、其抗原结合片段及其医药用途
CN105481981A (zh) * 2016-01-27 2016-04-13 中国人民解放军第二军医大学 靶向vegf双特异性抗体及其用途
CN105602960A (zh) * 2010-12-31 2016-05-25 生物蛋白有限公司 抗体的快速人源化
CN113795514A (zh) * 2019-05-09 2021-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体的方法

Families Citing this family (197)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6582959B2 (en) 1991-03-29 2003-06-24 Genentech, Inc. Antibodies to vascular endothelial cell growth factor
TR199903123T2 (xx) 1997-04-07 2000-05-22 Genentech, Inc. Anti-Vegf antikorlar�.
US20070059302A1 (en) 1997-04-07 2007-03-15 Genentech, Inc. Anti-vegf antibodies
US6884879B1 (en) 1997-04-07 2005-04-26 Genentech, Inc. Anti-VEGF antibodies
US20020032315A1 (en) 1997-08-06 2002-03-14 Manuel Baca Anti-vegf antibodies
AU740738B2 (en) * 1997-04-07 2001-11-15 Genentech Inc. Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies
IL138488A0 (en) 1998-03-17 2001-10-31 Genentech Inc Polypeptides homologous to vegf and bmp1
ATE384792T1 (de) 1998-11-18 2008-02-15 Genentech Inc Antikörpervarianten mit höheren bindungsaffinitäten im vergleich zu parentalen antikörpern
US20030035798A1 (en) * 2000-08-16 2003-02-20 Fang Fang Humanized antibodies
US6703020B1 (en) 1999-04-28 2004-03-09 Board Of Regents, The University Of Texas System Antibody conjugate methods for selectively inhibiting VEGF
US6416758B1 (en) 1999-04-28 2002-07-09 Board Of Regents, The University Of Texax System Antibody conjugate kits for selectively inhibiting VEGF
US6346249B1 (en) * 1999-10-22 2002-02-12 Ludwig Institute For Cancer Research Methods for reducing the effects of cancers that express A33 antigen using A33 antigen specific immunoglobulin products
DK1283214T3 (da) 2000-04-21 2007-06-11 Fuso Pharmaceutical Ind Hidtil ukendte kollektiner
CA2648048A1 (en) 2000-06-23 2002-01-03 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
EP2275549A1 (en) 2000-06-23 2011-01-19 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of disorders involving angiogenesis
US20050123925A1 (en) 2002-11-15 2005-06-09 Genentech, Inc. Compositions and methods for the diagnosis and treatment of tumor
AU2003216250A1 (en) * 2002-02-11 2003-09-04 Genentech, Inc. Antibody variants with faster antigen association rates
AU2003243651B2 (en) 2002-06-17 2008-10-16 The Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Specificity grafting of a murine antibody onto a human framework
US7575893B2 (en) 2003-01-23 2009-08-18 Genentech, Inc. Methods for producing humanized antibodies and improving yield of antibodies or antigen binding fragments in cell culture
RU2005136988A (ru) 2003-05-30 2006-06-10 Дженентек, Инк. (Us) Лечение антителами против vegf
JP2007528723A (ja) * 2003-08-22 2007-10-18 メディミューン，インコーポレーテッド 抗体のヒト化
US7736850B2 (en) 2003-12-02 2010-06-15 Institute Pasteur Strain of SARS-associated coronavirus and applications thereof
DE602005018325D1 (de) 2004-02-19 2010-01-28 Genentech Inc Antikörper mit korrigierten cdr
EP1771474B1 (en) 2004-07-20 2010-01-27 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
US8604185B2 (en) 2004-07-20 2013-12-10 Genentech, Inc. Inhibitors of angiopoietin-like 4 protein, combinations, and their use
EP2324848A3 (en) 2004-10-21 2011-09-14 Genentech, Inc. Method for treating intraocular neovascular diseases
UA96139C2 (uk) 2005-11-08 2011-10-10 Дженентек, Інк. Антитіло до нейропіліну-1 (nrp1)
DK1973950T3 (en) 2006-01-05 2014-12-15 Genentech Inc ANTI-EphB4 ANTIBODIES AND METHODS FOR USING SAME
JP5368110B2 (ja) 2006-01-20 2013-12-18 ジェネンテック， インコーポレイテッド 抗エフリンｂ２抗体とその使用方法
AR059851A1 (es) 2006-03-16 2008-04-30 Genentech Inc Anticuerpos de la egfl7 y metodos de uso
TW200812615A (en) 2006-03-22 2008-03-16 Hoffmann La Roche Tumor therapy with an antibody for vascular endothelial growth factor and an antibody for human epithelial growth factor receptor type 2
WO2007137984A2 (en) * 2006-05-25 2007-12-06 Glaxo Group Limited Modified humanised anti-interleukin-18 antibodies
CL2007001623A1 (es) 2006-06-06 2008-01-18 Genentech Inc Anticuerpo anti-dll4; polinucleotido que lo codifica; vector y celula huesped que comprenden dicho polinucleotido; metodo para elaborar el anticuerpo e inmunojugado; metodo de deteccion de dll4 y metodo diagnostico de un trastorno asociado a dll4; composicion que comprende al anticuerpo.
PL2056874T3 (pl) 2006-08-21 2013-02-28 Hoffmann La Roche Leczenie nowotworu przeciwciałem przeciw VEGF
BRPI0720552A2 (pt) 2006-12-19 2014-01-07 Genentech Inc Antagonistas específicos de vegf para terapia adjuvante e neoadjuvante e o tratamento de tumores em estágio precoce
UA99292C2 (uk) 2007-05-17 2012-08-10 Дженентек, Інк. Антитіло, яке специфічно зв'язується з нейропіліном-2в (nrp2b)
MX2009012282A (es) 2007-05-17 2009-11-25 Genentech Inc Estructuras cristalinas de fragmentos de neuropilina y complejos de neuropilina-anticuerpos.
PE20090321A1 (es) 2007-06-04 2009-04-20 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch1 nrr, metodo de preparacion y composicion farmaceutica
EP3441402A1 (en) 2007-10-30 2019-02-13 Genentech, Inc. Antibody purification by cation exchange chromatography
ES2554812T3 (es) 2007-11-09 2015-12-23 Genentech, Inc. Composiciones de antagonistas de quinasa 1 de tipo receptor de activina y métodos de uso
TWI468417B (zh) 2007-11-30 2015-01-11 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ抗體
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
MX347972B (es) * 2008-06-25 2017-05-22 Esbatech Alcon Biomed Res Unit Anticuerpos estables y solubles que inhiben el vegf.
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
CN110317272A (zh) 2008-10-14 2019-10-11 霍夫曼-拉罗奇有限公司 免疫球蛋白变体及其用途
US8901076B2 (en) 2008-11-03 2014-12-02 Molecular Partner AG Binding proteins inhibiting the VEGF-A receptor interaction
HUE032693T2 (en) 2008-11-22 2017-10-30 Hoffmann La Roche Use of anti-vegf antibody in combination with chemotherapy to treat breast cancer
EP2382472B1 (en) 2008-12-23 2015-05-06 F.Hoffmann-La Roche Ag Methods and compositions for diagnostic use in cancer patients
AU2010230563A1 (en) 2009-04-02 2011-09-22 Roche Glycart Ag Multispecific antibodies comprising full length antibodies and single chain Fab fragments
EP2427496A4 (en) * 2009-04-03 2013-05-15 Vegenics Pty Ltd ANTI-VEGF-D ANTIBODIES
US20100256340A1 (en) 2009-04-07 2010-10-07 Ulrich Brinkmann Trivalent, bispecific antibodies
EP2427479B1 (en) 2009-05-07 2018-11-21 The Regents of The University of California Antibodies and methods of use thereof
CN102459338A (zh) 2009-05-08 2012-05-16 霍夫曼-拉罗奇有限公司 人源化抗egfl7抗体及其使用方法
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
SG177265A1 (en) * 2009-06-17 2012-02-28 Abbott Biotherapeutics Corp Anti-vegf antibodies and their uses
AU2010273585B2 (en) 2009-07-13 2015-04-23 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
TW201106972A (en) 2009-07-27 2011-03-01 Genentech Inc Combination treatments
SG178177A1 (en) 2009-07-31 2012-03-29 Genentech Inc Inhibition of tumor metastasis using bv8- or g-csf-antagonists
TW201431558A (zh) 2009-08-15 2014-08-16 建南德克公司 用於治療先前治療過之乳癌之抗-血管新生療法
CA2773662A1 (en) 2009-09-11 2011-03-17 Genentech, Inc. Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer agent
NZ701769A (en) 2009-09-16 2016-06-24 Genentech Inc Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
ES2530732T3 (es) 2009-09-17 2015-03-05 Hoffmann La Roche Procedimientos de diagnóstico para el cáncer de pulmón
WO2011056497A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Activin receptor type iib compositions and methods of use
WO2011056502A1 (en) 2009-10-26 2011-05-12 Genentech, Inc. Bone morphogenetic protein receptor type ii compositions and methods of use
TWI505836B (zh) 2009-12-11 2015-11-01 Genentech Inc 抗－ｖｅｇｆ－ｃ抗體及其使用方法
SG181834A1 (en) 2009-12-21 2012-07-30 Genentech Inc Antibody formulation
PL2516465T3 (pl) 2009-12-23 2016-11-30 Przeciwciała anty-bv8 i ich zastosowania
FR2955773B1 (fr) 2010-02-01 2017-05-26 Commissariat A L'energie Atomique Complexe moleculaire de ciblage des antigenes vers les cellules presentatrices d'antigene et ses applications pour la vaccination
KR20180028561A (ko) 2010-02-23 2018-03-16 제넨테크, 인크. 난소암의 치료를 위한 항혈관신생 요법
TWI426920B (zh) 2010-03-26 2014-02-21 Hoffmann La Roche 雙專一性、雙價抗－ｖｅｇｆ／抗－ａｎｇ－２抗體
TW201138821A (en) 2010-03-26 2011-11-16 Roche Glycart Ag Bispecific antibodies
AR081361A1 (es) 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
WO2011153243A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Anti-angiogenesis therapy for treating gastric cancer
WO2011153224A2 (en) 2010-06-02 2011-12-08 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of cancer
NZ605449A (en) 2010-07-09 2015-03-27 Genentech Inc Anti-neuropilin antibodies and methods of use
KR20130126576A (ko) 2010-07-19 2013-11-20 에프. 호프만-라 로슈 아게 항암요법에 반응할 가능성이 증가된 환자를 확인하는 방법
SG187119A1 (en) 2010-07-19 2013-02-28 Hoffmann La Roche Method to identify a patient with an increased likelihood of responding to an anti-cancer therapy
AR082693A1 (es) 2010-08-17 2012-12-26 Roche Glycart Ag Terapia de combinacion de un anticuerpo anti-cd20 afucosilado con un anticuerpo anti-vegf
CN103068846B9 (zh) 2010-08-24 2016-09-28 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 包含二硫键稳定性Fv片段的双特异性抗体
KR20130124513A (ko) 2010-11-15 2013-11-14 파이브 프라임 테라퓨틱스, 인크. 가용성 fgfr1 융합 단백질의 상승된 투약량에 의한 암 치료
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
WO2012092539A2 (en) 2010-12-31 2012-07-05 Takeda Pharmaceutical Company Limited Antibodies to dll4 and uses thereof
CA2824824A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Monovalent antigen binding proteins
CA2825081A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 Birgit Bossenmaier Antigen binding proteins
MX354359B (es) 2011-03-29 2018-02-28 Roche Glycart Ag Variantes de fragmento cristalizable (fc) de los anticuerpos.
AU2012236166A1 (en) 2011-04-01 2013-11-14 Genentech, Inc. Combinations of AKT inhibitor compounds and chemotherapeutic agents, and methods of use
CN108341863A (zh) 2011-04-20 2018-07-31 阿塞勒隆制药公司 内皮糖蛋白多肽及其用途
WO2012151317A1 (en) 2011-05-03 2012-11-08 Genentech, Inc. Vascular disruption agents and uses thereof
WO2012172054A1 (en) 2011-06-16 2012-12-20 Scil Proteins Gmbh Modified multimeric ubiquitin proteins binding vegf-a
WO2013009767A2 (en) 2011-07-12 2013-01-17 Epitomics, Inc. Facs-based method for obtaining an antibody sequence
RU2014109985A (ru) 2011-08-17 2015-09-27 Дженентек, Инк. Ингибирование ангиогенеза в рефрактерных опухолях
WO2013082511A1 (en) 2011-12-02 2013-06-06 Genentech, Inc. Methods for overcoming tumor resistance to vegf antagonists
MX2014009565A (es) 2012-02-10 2014-11-10 Genentech Inc Anticuerpos monocatenarios y otros heteromultimeros.
BR112014018964A2 (pt) 2012-03-13 2020-05-12 F. Hoffmann-La Roche Ag Anticorpo anti-vegf e uso de um anticorpo anti-vegf
SG11201407859YA (en) 2012-05-31 2014-12-30 Genentech Inc Methods of treating cancer using pd-l1 axis binding antagonists and vegf antagonists
KR20150023889A (ko) 2012-06-27 2015-03-05 에프. 호프만-라 로슈 아게 2 개 이상의 상이한 결합 단위를 함유하는 맞춤-제작된 고도로 선별적이고 다중-특이적인 표적화 단위의 선별 및 제조 방법 및 이의 용도
RU2015100656A (ru) 2012-06-27 2016-08-20 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Способ получения конъюгатов fc-фрагмента антитела, включающих по меньшей мере одну связывающую группировку, которая специфически связывается с мишенью, и их применения
WO2014009465A1 (en) 2012-07-13 2014-01-16 Roche Glycart Ag Bispecific anti-vegf/anti-ang-2 antibodies and their use in the treatment of ocular vascular diseases
SG11201500903XA (en) 2012-08-07 2015-03-30 Genentech Inc Combination therapy for the treatment of glioblastoma
EP2916835A4 (en) 2012-11-12 2016-07-27 Redwood Bioscience Inc COMPOUNDS AND METHOD FOR PRODUCING A CONJUGATE
JP2016505528A (ja) 2012-11-16 2016-02-25 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア タンパク質の化学修飾のためのピクテ−スペングラーライゲーション
US9310374B2 (en) 2012-11-16 2016-04-12 Redwood Bioscience, Inc. Hydrazinyl-indole compounds and methods for producing a conjugate
FR2998579B1 (fr) 2012-11-27 2015-06-19 Commissariat Energie Atomique Methode pour obtenir des anticorps humains specifiques d'un antigene par immunisation in vitro
US20140154255A1 (en) 2012-11-30 2014-06-05 Abbvie Biotherapeutics Inc. Anti-vegf antibodies and their uses
CN113045660B (zh) * 2013-03-13 2023-09-01 伊麦吉纳博公司 与cd8的抗原结合构建体
CA2906057A1 (en) 2013-03-13 2014-10-02 Genentech, Inc. Antibody formulations
MX2015015426A (es) 2013-05-23 2016-06-10 Five Prime Therapeutics Inc Metodos de tratamiento de cancer.
CN104341504B (zh) 2013-08-06 2017-10-24 百奥泰生物科技(广州)有限公司 双特异性抗体
US10456470B2 (en) 2013-08-30 2019-10-29 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
US10617755B2 (en) 2013-08-30 2020-04-14 Genentech, Inc. Combination therapy for the treatment of glioblastoma
MX2016003593A (es) 2013-10-11 2016-06-02 Hoffmann La Roche Anticuerpos de cadena ligera variable comun intercambiada de dominio multiespecifico.
KR102354787B1 (ko) 2013-10-25 2022-01-24 악셀레론 파마 인코포레이티드 섬유화 질환을 치료하기 위한 엔도글린 펩티드
ES2875878T3 (es) 2013-11-18 2021-11-11 Formycon Ag Composición farmacéutica de un anticuerpo anti-VEGF
CN105744935B (zh) 2013-11-27 2022-09-30 雷德伍德生物科技股份有限公司 肼基-吡咯并化合物及用于生成缀合物的方法
AU2014368696A1 (en) 2013-12-20 2016-06-02 F. Hoffmann-La Roche Ag Humanized anti-Tau(pS422) antibodies and methods of use
JOP20200094A1 (ar) 2014-01-24 2017-06-16 Dana Farber Cancer Inst Inc جزيئات جسم مضاد لـ pd-1 واستخداماتها
JOP20200096A1 (ar) 2014-01-31 2017-06-16 Children’S Medical Center Corp جزيئات جسم مضاد لـ tim-3 واستخداماتها
KR20220126813A (ko) 2014-03-14 2022-09-16 노파르티스 아게 Lag-3에 대한 항체 분자 및 그의 용도
JP2017516458A (ja) 2014-03-24 2017-06-22 ジェネンテック， インコーポレイテッド ｃ−ｍｅｔ拮抗剤による癌治療及びｃ−ｍｅｔ拮抗剤のＨＧＦ発現との相関
EP3126386A1 (en) 2014-03-31 2017-02-08 F. Hoffmann-La Roche AG Combination therapy comprising anti-angiogenesis agents and ox40 binding agonists
US20170232199A1 (en) 2014-05-12 2017-08-17 Formycon Ag Pre-Filled Plastic Syringe Containing a VEGF Antagonist
KR102486180B1 (ko) 2014-06-06 2023-01-11 레드우드 바이오사이언스 인코포레이티드 항-her2 항체-메이탄신 컨쥬게이트 및 이것의 사용 방법
US9840553B2 (en) 2014-06-28 2017-12-12 Kodiak Sciences Inc. Dual PDGF/VEGF antagonists
WO2016011052A1 (en) 2014-07-14 2016-01-21 Genentech, Inc. Diagnostic methods and compositions for treatment of glioblastoma
WO2016025645A1 (en) 2014-08-12 2016-02-18 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with il-2, a therapeutic antibody, and an immune checkpoint blocker
EP3646879B1 (en) 2014-08-12 2024-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Synergistic tumor treatment with integrin-binding-fc-fusion protein and an immune checkpoint inhibitor
EP3659621A1 (en) 2014-09-13 2020-06-03 Novartis AG Combination therapies for cancer
EP3193932B1 (en) 2014-09-15 2023-04-26 F. Hoffmann-La Roche AG Antibody formulations
BR112017006664A2 (pt) 2014-10-03 2017-12-26 Novartis Ag terapias de combinação
MA41044A (fr) 2014-10-08 2017-08-15 Novartis Ag Compositions et procédés d'utilisation pour une réponse immunitaire accrue et traitement contre le cancer
US9988452B2 (en) 2014-10-14 2018-06-05 Novartis Ag Antibody molecules to PD-L1 and uses thereof
EP3209769B1 (en) 2014-10-24 2020-08-05 The Board of Trustees of the Leland Stanford Junior University Compositions and methods for inducing phagocytosis of mhc class i positive cells and countering anti-cd47/sirpa resistance
CN107172879B (zh) 2014-11-10 2021-11-05 豪夫迈·罗氏有限公司 抗白细胞介素-33抗体及其用途
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
WO2016100882A1 (en) 2014-12-19 2016-06-23 Novartis Ag Combination therapies
CN107109491A (zh) 2014-12-23 2017-08-29 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗和诊断化学疗法抗性癌症的组合物和方法
KR20180025888A (ko) 2015-06-08 2018-03-09 제넨테크, 인크. 항-ox40 항체 및 pd-1 축 결합 길항제를 사용하여 암을 치료하는 방법
EP3313877B1 (en) 2015-06-24 2020-06-03 H. Hoffnabb-La Roche Ag Humanized anti-tau(ps422) antibodies and methods of use
EP3878465A1 (en) 2015-07-29 2021-09-15 Novartis AG Combination therapies comprising antibody molecules to tim-3
PL3317301T3 (pl) 2015-07-29 2021-11-15 Novartis Ag Terapie skojarzone zawierające cząsteczki przeciwciał przeciw lag-3
EP4137158A1 (en) 2015-08-07 2023-02-22 Imaginab, Inc. Antigen binding constructs to target molecules
KR102440160B1 (ko) 2015-10-30 2022-09-02 제넨테크, 인크. 항-HtrA1 항체 및 이의 사용 방법
RS63125B1 (sr) 2015-11-03 2022-05-31 Janssen Biotech Inc Antitela koja se specifično vezuju za pd-1 i njihova upotreba
US20190209697A1 (en) 2015-11-05 2019-07-11 The Regents Of The University Of California Cells labelled with lipid conjugates and methods of use thereof
CA3005132A1 (en) 2015-11-18 2017-05-26 Sio2 Medical Products, Inc. Pharmaceutical package for ophthalmic formulations
RU2734958C2 (ru) 2015-11-18 2020-10-26 Формикон Аг Предварительно заполненная фармацевтическая упаковка, содержащая жидкий состав на основе антагониста vegf
US20180326126A1 (en) 2015-11-18 2018-11-15 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
AU2016369537B2 (en) 2015-12-17 2024-03-14 Novartis Ag Antibody molecules to PD-1 and uses thereof
WO2017117464A1 (en) 2015-12-30 2017-07-06 Kodiak Sciences Inc. Antibodies and conjugates thereof
US10576128B2 (en) 2016-01-26 2020-03-03 Formycon Ag Liquid formulation of a VEGF antagonist
MX2018012492A (es) 2016-04-15 2019-06-06 Genentech Inc Métodos para monitorear y tratar el cáncer.
AU2017248766A1 (en) 2016-04-15 2018-11-01 Genentech, Inc. Methods for monitoring and treating cancer
WO2018009811A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Genentech, Inc. Use of human epididymis protein 4 (he4) for assessing responsiveness of muc 16-positive cancer treatment
CN109890982B (zh) 2016-07-08 2023-07-07 基因泰克公司 通过nrf2及其下游目标基因的表达状态和突变状态诊断和治疗癌症的方法
EP3496752B1 (en) 2016-08-12 2022-05-18 Genentech, Inc. Combination therapy with a mek inhibitor, a pd-1 axis inhibitor, and a vegf inhibitor
AU2017315076B2 (en) * 2016-08-23 2020-10-08 Medimmune Limited Anti-VEGF-A antibodies and uses thereof
AU2018207303A1 (en) 2017-01-10 2019-07-25 xCella Biosciences, Inc. Combination tumor treatment with an integrin-binding-Fc fusion protein and immune modulator
US10350266B2 (en) 2017-01-10 2019-07-16 Nodus Therapeutics, Inc. Method of treating cancer with a multiple integrin binding Fc fusion protein
CA3052670A1 (en) 2017-03-01 2018-09-07 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for cancer
CA3063995A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Sio2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
WO2018217995A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
EP3641812A1 (en) 2017-06-22 2020-04-29 Novartis AG Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2018237173A1 (en) 2017-06-22 2018-12-27 Novartis Ag ANTIBODY MOLECULES DIRECTED AGAINST CD73 AND CORRESPONDING USES
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
EP3731864A1 (en) 2017-12-29 2020-11-04 F. Hoffmann-La Roche SA Anti-vegf antibodies and methods of use
CR20200392A (es) 2018-03-09 2020-11-17 Agenus Inc Anticuerpos anti-cd73 y métodos de uso de los mismos
EP3782618A4 (en) 2018-04-16 2022-01-26 OnQuality Pharmaceuticals China Ltd. METHOD OF PREVENTING OR TREATING SIDE EFFECTS OF CANCER THERAPY
WO2019224718A2 (en) 2018-05-24 2019-11-28 Janssen Biotech, Inc. Psma binding agents and uses thereof
TW202015726A (zh) 2018-05-30 2020-05-01 瑞士商諾華公司 Ｅｎｔｐｄ２抗體、組合療法、及使用該等抗體和組合療法之方法
WO2019232244A2 (en) 2018-05-31 2019-12-05 Novartis Ag Antibody molecules to cd73 and uses thereof
WO2020081767A1 (en) 2018-10-18 2020-04-23 Genentech, Inc. Diagnostic and therapeutic methods for sarcomatoid kidney cancer
WO2020109343A1 (en) 2018-11-29 2020-06-04 F. Hoffmann-La Roche Ag Combination therapy for treatment of macular degeneration
US20220185875A1 (en) 2019-03-18 2022-06-16 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Bispecific antibody specifically bound to vegf and ang2
AR118720A1 (es) 2019-04-19 2021-10-27 Janssen Biotech Inc Métodos para tratar el cáncer de próstata con un anticuerpo anti-psma / cd3
WO2020226986A2 (en) 2019-05-03 2020-11-12 Genentech, Inc. Methods of treating cancer with an anti-pd-l1 antibody
DE112019005626T5 (de) 2019-08-09 2021-08-05 Anhui Biox Vision Biological Technology Co., Ltd. Anti-VEGF-Anti-PD1 bispezifischer Antikörper mit einer neuen Struktur
US20220348651A1 (en) 2019-09-18 2022-11-03 Novartis Ag Entpd2 antibodies, combination therapies, and methods of using the antibodies and combination therapies
AU2020364071A1 (en) 2019-10-10 2022-05-26 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
IL296256A (en) 2020-03-13 2022-11-01 Genentech Inc Antibodies against interleukin-33 and uses thereof
CN113461824A (zh) 2020-03-31 2021-10-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种构建多特异性抗体的平台
WO2021202959A1 (en) 2020-04-03 2021-10-07 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods for cancer
FR3110838B1 (fr) 2020-05-28 2022-06-24 Commissariat Energie Atomique Complexe immunomodulateur et ses applications pour la thérapie
WO2022003568A1 (en) 2020-06-30 2022-01-06 Dcprime B.V. Use of leukemia-derived cells in ovarian cancer vaccines
CN114106190A (zh) 2020-08-31 2022-03-01 普米斯生物技术(珠海)有限公司 一种抗vegf/pd-l1双特异性抗体及其用途
CA3201521A1 (en) 2020-11-13 2022-05-19 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising a krasg12c inhibitor and a vegf inhibitor for treating solid tumors
JP2024506249A (ja) 2021-01-22 2024-02-13 メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ 腫瘍ワクチン接種の方法
US20240059789A1 (en) 2021-01-28 2024-02-22 Janssen Biotech, Inc. Psma binding proteins and uses thereof
JP2024510989A (ja) 2021-03-12 2024-03-12 メンドゥス・ベスローテン・フェンノートシャップ ワクチン接種方法及びｃｄ４７遮断薬の使用
WO2022232503A1 (en) 2021-04-30 2022-11-03 Genentech, Inc. Therapeutic and diagnostic methods and compositions for cancer
TW202309078A (zh) 2021-07-02 2023-03-01 美商建南德克公司 治療癌症之方法及組成物
CN117715936A (zh) 2021-07-28 2024-03-15 豪夫迈·罗氏有限公司 用于治疗癌症的方法和组合物
WO2023080900A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Genentech, Inc. Methods and compositions for classifying and treating kidney cancer
WO2024062082A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2024062072A2 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use
WO2024062076A1 (en) 2022-09-21 2024-03-28 Domain Therapeutics Anti-ccr8 monoclonal antibodies and their therapeutic use

Family Cites Families (59)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
USRE30985E (en) 1978-01-01 1982-06-29 Serum-free cell culture media
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
WO1981001145A1 (en) 1979-10-18 1981-04-30 Univ Illinois Hydrolytic enzyme-activatible pro-drugs
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
GB8516415D0 (en) 1985-06-28 1985-07-31 Celltech Ltd Culture of animal cells
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US4927762A (en) 1986-04-01 1990-05-22 Cell Enterprises, Inc. Cell culture medium with antioxidant
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
GB8705477D0 (en) 1987-03-09 1987-04-15 Carlton Med Prod Drug delivery systems
US4975278A (en) 1988-02-26 1990-12-04 Bristol-Myers Company Antibody-enzyme conjugates in combination with prodrugs for the delivery of cytotoxic agents to tumor cells
US5204244A (en) 1987-10-27 1993-04-20 Oncogen Production of chimeric antibodies by homologous recombination
JP3040121B2 (ja) 1988-01-12 2000-05-08 ジェネンテク，インコーポレイテッド 増殖因子レセプターの機能を阻害することにより腫瘍細胞を処置する方法
AU632065B2 (en) 1988-09-23 1992-12-17 Novartis Vaccines And Diagnostics, Inc. Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
WO1990004788A1 (en) * 1988-10-28 1990-05-03 Genentech, Inc. Method for identifying active domains and amino acid residues in polypeptides and hormone variants
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5147638A (en) 1988-12-30 1992-09-15 Oklahoma Medical Research Foundation Inhibition of tumor growth by blockade of the protein C system
US5332671A (en) 1989-05-12 1994-07-26 Genetech, Inc. Production of vascular endothelial cell growth factor and DNA encoding same
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
GB8928874D0 (en) * 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
IE921169A1 (en) * 1991-04-10 1992-10-21 Scripps Research Inst Heterodimeric receptor libraries using phagemids
WO1994004679A1 (en) * 1991-06-14 1994-03-03 Genentech, Inc. Method for making humanized antibodies
LU91067I2 (fr) * 1991-06-14 2004-04-02 Genentech Inc Trastuzumab et ses variantes et dérivés immuno chimiques y compris les immotoxines
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
ES2241710T3 (es) 1991-11-25 2005-11-01 Enzon, Inc. Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno.
DE69333082T2 (de) 1992-02-11 2004-05-06 Cell Genesys, Inc., Foster City Erzielen von homozygotem durch zielgerichtete genetische ereignisse
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
BR9207175A (pt) * 1992-10-28 1995-12-12 Genentech Inc Composição contendo antagonista de fator de crescimento de célula endotelial vascular sequência aminoácida de anticorpo monoclonal polipeptídeo e método de tratamento de tumor em mamífero
WO1994011026A2 (en) 1992-11-13 1994-05-26 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human b lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of b cell lymphoma
US5840301A (en) * 1994-02-10 1998-11-24 Imclone Systems Incorporated Methods of use of chimerized, humanized, and single chain antibodies specific to VEGF receptors
DK0751992T3 (da) * 1994-03-08 2006-03-06 Human Genome Sciences Inc Karendotelvækstfaktor 2
US5534615A (en) 1994-04-25 1996-07-09 Genentech, Inc. Cardiac hypertrophy factor and uses therefor
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
AU740738B2 (en) * 1997-04-07 2001-11-15 Genentech Inc. Humanized antibodies and methods for forming humanized antibodies

Cited By (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1903880B (zh) * 2006-08-02 2010-05-12 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所 抗肿瘤血管内皮生长因子vegf-e抗原及其编码基因与应用
CN101148474B (zh) * 2006-09-21 2014-06-11 上海杰隆生物工程股份有限公司 人源人血管内皮生长因子单克隆抗体及其制备方法
CN102051396A (zh) * 2009-11-04 2011-05-11 无锡天演生物技术有限公司 雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用
WO2011054150A1 (zh) * 2009-11-04 2011-05-12 无锡天演生物技术有限公司 利用重叠pcr定点突变的方法及其在筛选单克隆抗体中的应用
CN102051396B (zh) * 2009-11-04 2014-07-16 无锡天演生物技术有限公司 雁阵式定域随机突变方法及其在单抗分子进化技术中的应用
CN102863533A (zh) * 2010-06-21 2013-01-09 中国科学技术大学 抗体人源化改造方法
CN102863533B (zh) * 2010-06-21 2013-12-11 中国科学技术大学 抗体人源化改造方法
CN105602960A (zh) * 2010-12-31 2016-05-25 生物蛋白有限公司 抗体的快速人源化
CN105602960B (zh) * 2010-12-31 2021-03-19 生物蛋白有限公司 抗体的快速人源化
EA035037B1 (ru) * 2013-12-12 2020-04-21 Шанхай Хэнжуй Фармасьютикал Ко., Лтд. Антитело к pd-1, его антигенсвязывающий фрагмент и их медицинское применение
US10344090B2 (en) 2013-12-12 2019-07-09 Shanghai Hangrui Pharmaceutical Co., Ltd. PD-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
WO2015085847A1 (zh) * 2013-12-12 2015-06-18 上海恒瑞医药有限公司 Pd-1抗体、其抗原结合片段及其医药用途
US11365255B2 (en) 2013-12-12 2022-06-21 Suzhou Suncadia Biopharmaceuticals Co., Ltd. PD-1 antibody, antigen-binding fragment thereof, and medical application thereof
CN105481981B (zh) * 2016-01-27 2019-03-19 中国人民解放军第二军医大学 靶向vegf双特异性抗体及其用途
CN105481981A (zh) * 2016-01-27 2016-04-13 中国人民解放军第二军医大学 靶向vegf双特异性抗体及其用途
CN113795514A (zh) * 2019-05-09 2021-12-14 豪夫迈·罗氏有限公司 制备抗体的方法

Also Published As

Publication number Publication date
NO2017039I2 (no) 2018-08-28
SI1787999T1 (sl) 2010-12-31
EP1695985A3 (en) 2006-11-22
LTPA2007004I1 (lt) 2019-12-27
KR20010006115A (ko) 2001-01-26
SI1695985T1 (sl) 2011-06-30
BRPI9809388B8 (pt) 2021-05-25
EP2301580B1 (en) 2012-01-18
CY1111345T1 (el) 2015-08-05
NO2019045I1 (no) 2019-12-11
JP4191258B2 (ja) 2008-12-03
ES2380575T3 (es) 2012-05-16
EP2338915A2 (en) 2011-06-29
HK1204329A1 (zh) 2015-11-13
TR199902818T2 (xx) 2000-05-22
PT2301580E (pt) 2012-05-02
DK1695985T3 (da) 2011-06-14
ATE476664T1 (de) 2010-08-15
CN101210050A (zh) 2008-07-02
ES2256935T3 (es) 2006-07-16
EP2301580A1 (en) 2011-03-30
CN101838328A (zh) 2010-09-22
SI0973804T1 (sl) 2007-06-30
HK1149501A1 (en) 2011-10-07
PT971959E (pt) 2006-05-31
EP1695985A2 (en) 2006-08-30
KR100794454B1 (ko) 2008-01-16
DE69832970D1 (de) 2006-02-02
CA2286397A1 (en) 1998-10-15
BR9809388B1 (pt) 2013-06-04
DE69832970T2 (de) 2006-08-10
DE69841815D1 (de) 2010-09-16
ATE314395T1 (de) 2006-01-15
DK1787999T3 (da) 2010-11-15
PT1695985E (pt) 2011-06-06
SI2301580T1 (sl) 2012-05-31
EP2338915A3 (en) 2011-10-12
CN101665536A (zh) 2010-03-10
EP2336190A3 (en) 2011-10-05
EP2301580A9 (en) 2011-09-14
ES2361267T3 (es) 2011-06-15
CN101665536B (zh) 2013-07-03
EP0971959B1 (en) 2005-12-28
CY1111520T1 (el) 2015-08-05
AU7102398A (en) 1998-10-30
CN101210051A (zh) 2008-07-02
CN101210051B (zh) 2012-12-26
EP1695985B1 (en) 2011-03-09
NZ500077A (en) 2001-10-26
ATE501170T1 (de) 2011-03-15
CN101210050B (zh) 2010-12-08
HK1139425A1 (en) 2010-09-17
IL175906A (en) 2010-05-31
NO2017039I1 (no) 2017-08-01
IL175906A0 (en) 2006-10-05
KR100856995B1 (ko) 2008-09-04
ZA982908B (en) 1999-01-21
NO325823B1 (no) 2008-07-21
PT1787999E (pt) 2010-11-11
DK0971959T3 (da) 2006-05-15
CN104231078A (zh) 2014-12-24
EP3260468A1 (en) 2017-12-27
HK1114622A1 (en) 2008-11-07
CA2286397C (en) 2011-02-15
NO994870D0 (no) 1999-10-06
HK1095334A1 (en) 2007-05-04
JP2001502922A (ja) 2001-03-06
CN1191276C (zh) 2005-03-02
DE69842174D1 (de) 2011-04-21
NO994870L (no) 1999-12-06
IL132240A (en) 2006-09-05
LTC0973804I2 (lt) 2020-04-27
ZA982907B (en) 1998-10-09
ES2349559T3 (es) 2011-01-05
BR9809388A (pt) 2000-06-13
IL132239A0 (en) 2001-03-19
KR20010006116A (ko) 2001-01-26
PT973804E (pt) 2007-03-30
CY1112757T1 (el) 2016-02-10
HK1114621A1 (en) 2008-11-07
AU740738B2 (en) 2001-11-15
WO1998045332A3 (en) 1998-12-03
DK2301580T3 (da) 2012-05-14
WO1998045332A2 (en) 1998-10-15
EP2336190A2 (en) 2011-06-22
EP0971959A1 (en) 2000-01-19
ATE541586T1 (de) 2012-02-15
HK1025338A1 (en) 2000-11-10
SI0971959T1 (sl) 2006-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1259961A (zh) 人源化抗体和制备人源化抗体的方法
KR100870353B1 (ko) 항-ｖｅｇｆ 항체
US20230235038A1 (en) Interleukin-17 (il-17) antagonistic antibodies
JP7116685B2 (ja) ヒト化抗ｐａｃａｐ抗体及びそれらの使用
JP2009108086A (ja) 生物学的製品
WO1997047732A2 (en) Hexameric fusion proteins and uses therefor
CN110305211A (zh) Gipr抗体及其与glp-1的融合蛋白质，以及其药物组合物和应用
CN115181182B (zh) 一种人源化的抗cd25的单域抗体及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
CX01 Expiry of patent term

Granted publication date: 20050302

CX01 Expiry of patent term