CN105481981B - 靶向vegf双特异性抗体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明在Bevacizumab及全人源单克隆抗体B5E3基础上构建一个针对VEGF两个表位的双特异性抗体Bev‑B5E3BsAb，实验表明其不与Bevacizumab竞争结合VEGF，推测其表位是不同于Bevacizumab的新表位。同时，与其两亲本单克隆抗体相比，能够更为有效地结合VEGF。此外，体外实验中显现出更强地抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的能力；动物实验表明其能够显著抑制肿瘤的生长。因此，该双特异抗体可望发展成为用于肿瘤以及眼科疾病治疗或诊断新型抗体制剂。

Description

靶向VEGF双特异性抗体及其用途
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类抗人靶向血管内皮生长因子(VEGF)双特异性抗体和其在制备抗肿瘤药物以及在制备诊断或治疗眼科疾病的试剂或药物中的用途。
背景技术
恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，近年来其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，往往预后不佳。目前临床上所采用的三大常规治疗方法：化疗、放疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在一定局限性，其疗效难以进一步提高。
血管生成对肿瘤的生长和转移有着重要作用，肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长阶段转变为有血管的快速增殖阶段，从而促进肿瘤增殖、侵袭。新生血管的生长和成熟是一个复杂的多因子和多信号传导过程的结果，其中涉及到很多血管生成因子，其中最主要的是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)。VEGF能与细胞表面的血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growthfactor receptor；VEGFR)结合，该类受体包括3种高亲和力的酪氨酸激酶受体，即FLT1/VEGFR1、FLK1/KDR/VEGFR2和FLT4/VEGFR3，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能，可以促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞浸润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移。
靶向VEGF抗体在抗肿瘤治疗中有如下优势：靶点直接暴露于血液中，便于药物直接作用；可抑制肿瘤的转移；靶点基因表达稳定，不易产生抗药性；有下游放大效应；无需考虑肿瘤的组织学特性；不良反应相对较少。大量结果证，VEGF在促进肿瘤血管生成过程中起重要作用，阻断VEGF被认为是当前最为有效的抗肿瘤治疗方法之一。如Genentech公司的贝伐单抗(Avastin,bevacizumab)是抗人VEGF的人源化抗体(Cancer Res 1997；57:4593-9)，已于2004年2月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌。它通过抑制VEGF的活性，包括内皮细胞增强血管通透性活性、促有丝***活性和其他促血管生成活性，从而抑制新生血管的形成，减少肿瘤的血供、氧供和其他营养物质的供应而抑制肿瘤生长。
视网膜血管***和脉络膜血管***是组成视网膜的重要组成部分。创伤或疾病而引起的血管壁结构或功能的异常改变是导致视力下降或视力丧失的主要原因。例如，糖尿病视网膜病变是由于糖尿病而导致的视网膜血管增生，进而造成视网膜脱落，为患者视力丧失的主要原因。在眼睛受伤或手术后的恢复过程中也可能造成视网膜内新生血管的生长。这一类视网膜血管增生也是造成视力下降或眼睛失明的重要原因(Nature 438:932-938,2005)。年龄相关的黄斑变性(AMD)是一种由视网膜中心区的细胞或组织退化和血管增生而引起的疾病。可分为干性和湿性两种。其中湿性AMD是脉络膜新生血管形成的最常见形式，是引起患者眼睛失明的主要原因。
很多研究表明一旦眼睛视网膜的感光细胞由于营养不足而开始萎缩(称作“缺血性萎缩”)，VEGF在视网膜内的浓度便开始升高，从而促使新生血管生长。这一过程称为“新生血管的形成”。在眼内，新生的血管形态上与正常血管不同，官腔不规则，管壁多为渗漏。这种高通透性或渗漏的血管的异常增生常导致视网膜上产生疤痕，并进一步可发生脱落从而影响到视力。
研究表明湿性AMD病人的脉络膜组织中有高水平的VEGF表达(Invest.Opthal.Vis.Sci 37:855-868,1996；Microvascular Res.64:162-169,2002)。由于VEGF表达水平与湿性AMD之间的相关性，VEGF可以被用作诊断AMD的生化指标(Br.J.Opthalmol.88:809-815,2004)。糖尿病性黄斑水肿是一种糖尿病相关眼并发症，会导致患者视力模糊、严重视力丧失甚至失明。糖尿病是导致美国成人失明的主要原因，在美国糖尿病性黄斑水肿影响到约56万糖尿病患者，而有报报道称有视力问题的糖尿病患者数高达近400万人。而VEGF提高血管渗透性的蛋白，引起糖尿病患者眼毛细血管泄漏和黄斑水肿。雷尼株单抗(Lucentis,ranibizumab)是Genentech公司开发的一个靶向VEGF的单克隆抗体，它已于2006年6月被美国食品药品管理局(FDA)批准用于治疗新生血管型年龄相关黄斑变性。并于2012年8月，美国FDA批准了雷尼珠单抗一个新适应证，即以每月(约28d)1次玻璃体内注射0.3mg(制剂规格为6mg/ml,取其0.05ml)方案治疗糖尿病患者的糖尿病性黄斑水肿所致视力损害。糖尿病性黄斑水肿的现标准治疗方法为激光手术，但此虽可减缓患者的视力丧失和帮助稳定视力，却几乎不能恢复已丧失了的视力。雷尼珠单抗属抗体片段类VEGF抑制剂，无疑雷尼珠单抗为该类病人带来了希望。
进入上世纪90年代以后，抗体库技术的出现使人源化抗体的制备达到了一个全新的水平，它绕过了以往单抗研制过程中必需的杂交瘤途径，甚至不需要经过免疫，更为重要的是，它使人们长期以来期望获得治疗性人源抗体的梦想成为了现实，因而显示出强大的生命力。噬菌体抗体库是最早出现也是目前应用最为广泛的抗体库。噬菌体展示是由Smith(Science,1985,228(4705):1315-1317)首先建立起来的一种将外源蛋白基因与噬菌体的衣壳蛋白基因相融合后使外源蛋白表达呈现于噬菌体表面的技术。噬菌体抗体库就是利用了以上原理使不同特异性的抗体表达在不同的噬菌体表面而用抗原对它们进行筛选(Science,1989,246(4935):1275-1281；Proc Natl Acad Sci USA,1991,88(18):7978-7982；Human Antibodies,1997,8(4):155-168)。用于构建噬菌体抗体库的靶细胞可以是杂交瘤细胞、免疫的人B细胞或未经免疫的人B细胞。未经免疫的人B淋巴细胞是目前应用最多的靶细胞，它库容量大，理论上含有所有的人源抗体基因。
噬菌体抗体库的筛选就是模拟体内抗体亲和力成熟的过程，用固相化抗原吸附表面表达特异性抗体的噬菌体库，然后洗脱游离的噬菌体，用抗原吸附的噬菌体感染宿主菌增殖扩增后再进行多轮的“吸附－洗脱－扩增”直至筛选到特异的人源抗体。大容量抗体库的建立是获得高亲和力人源抗体的关键，如果构建的噬菌体抗体库容量大于1010，那就可能从中筛选得到高亲和力(≥109M-1)的特异性抗体。
在临床试验中已有联合运用两种单克隆临床前实验的报道，但这种联合应用单克隆抗体的却有很多限制性。例如，联合应用两种单克隆抗体的的安全性和效果需要分别去评价，由此产生的长周期，高昂的开发费用限制其研制进程，而双特异性抗体恰好解决了这一瓶颈。此外，部分双特异抗体还能获得其亲本单克隆抗体所不具备的一些新的特性：如往往具有比原亲本抗体更低的解离速度，更强的封闭作用等。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种靶向血管内皮生长因子双特异性抗体或抗体片段；第二个目的在于提供编码这些抗体或抗体片段的基因序列以及能够对基因进行表达的载体；第三个目的在于挖掘这些抗体或抗体片段的用途。
为了实现本发明的第一个目的，本发明提供了一种双特异性抗体Bev-B5E3BsAb，其具有包含高变区CDR1、CDR2、CDR3、CDR4、CDR5、CDR6的重链可变结构域以及包含高变区CDR1＇、CDR2＇、CDR3＇、CDR4＇、CDR5＇、CDR6＇的轻链可变结构域。其中，CDR1的氨基酸序列为：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr-Gly；CDR2的氨基酸序列为：Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro；CDR3的氨基酸序列为：Ala-Lys-Tyr-Pro-His-Tyr-Tyr-Gly-Ser-Ser-His-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val；CDR4的氨基酸序列为：Gly-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Ala；CDR5的氨基酸序列为：Ile-Ile-Pro-Ile-Phe-Gly-Thr-Ala；CDR6的氨基酸序列为：Ala-Arg-His-Trp-Gly-Tyr-Asp-Ala-Phe-Asp-Ile；CDR1＇的氨基酸序列为：Gln-Asp-Ile-Ser-Asn-Tyr；CDR2＇的氨基酸序列为：Phe-Thr-Ser；CDR3＇的氨基酸序列为：Gln-Gln-Tyr-Ser-Thr-Val-Pro-Trp-Thr；CDR4＇的氨基酸序列为：Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Ser-Tyr；CDR5＇的氨基酸序列为：Gly-Ala-Ser；CDR6＇的氨基酸序列为：Gln-Gln-Tyr-Gly-Ser-Ser-Pro-Tyr-Thr。
该双特异性抗体Bev-B5E3BsAb选自抗VEGF的双特异性抗体以及所述双特异性抗体片段中的任意一种，双特异性抗体片段为双特异性抗体的Fab片段或F(ab’)2片段。
双特异性抗体Bev-B5E3BsAb的抗体片段上述双特异性抗体Bev-B5E3BsAb的Fab片段或F(ab’)2片段。
上述人源化抗体由噬菌体展示技术而得到。本发明所述的人源化抗VEGF抗体及其功能性片段除具备上述抗VEGF抗体及其功能性片段的有利特性外，还以高亲和力结合人VEGF蛋白。
在不实质性影响抗体活性的前提下，本领域技术人员可以对本发明的序列替换、添加和/或缺失一个或更多个(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或更多个)氨基酸，以获得所述抗体或其功能性片段之序列的变体。它们都被视为包括在本发明保护的范围内。如在可变区将具有类似性质的氨基酸进行替换。本发明所述变体的序列可以与其来源序列有至少有95％、96％、97％、98％或99％的一致性。本发明所述的序列一致性可以使用序列分析软件测量。例如使用缺省参数的计算机程序BLAST，尤其是BLASTP或TBLASTN。
本发明的抗体可以是全长的(例如，IgG1或IgG4抗体)或可仅包含抗原结合部分(例如，Fab、F(ab’)2或scFv片段)，或可以被修饰以影响功能。在一些应用中，进行修饰以除去不期望的糖基化位点可以是有用的，或在寡糖链上不存在岩藻糖部分。在另一些应用中，可进行半乳糖基化修饰。
本文所使用的术语“功能性片段”尤其是指抗体片段如Fv、scFv(sc指单链)、Fab、F(ab’)2、Fab’、scFv-Fc片段或者双抗体(diabody)或者通过化学修饰或通过掺入脂质体中应能够增加半衰期的任何片段，所述化学修饰例如添加聚(亚烷基)二醇如聚乙二醇(“聚乙二醇化，PEG化”)(被称为Fv-PEG、scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab′)2-PEG或Fab′-PEG的聚乙二醇化片段)(“PEG”为聚乙二醇)，所述片段具有VEGF结合活性。优选地，所述功能片段将由其来源抗体的重链或轻链可变区的部分序列构成或者包含它们，所述部分序列足以保留与其来源抗体相同的结合特异性和充分的亲和力，对于VEGF，优选至少等于其来源抗体亲和力的1/100，在更优选方式中至少等于1/10。这种功能片段将包含最少5个氨基酸，优选其来源的抗体序列的10、15、25、50和100个连续氨基酸。
为了实现本发明的第二个目的，本发明人还提供了如SEQ ID NO.9所示的编码重链可变区核苷酸序列，如SEQ ID NO.11所示的编码轻链可变区核苷酸序列。
本领域技术人员可以将编码本发明所述抗VEGF抗体的DNA分子克隆到载体中，进而转化宿主细胞。因此，本发明还提供了一种重组DNA载体，其含有编码本发明所述抗VEGF抗体的DNA分子。优选地，所述重组DNA载体是一种表达载体，本领域技术人员将所述抗体的DNA分子克隆到表达载体中，转化宿主细胞，通过诱导表达获得抗体。本发明的表达载体含有编码抗VEGF抗体的重链可变区、轻链可变区和/或恒定区的DNA序列。然而，也可以分别构建两种表达载体，一种含有重链可变区和恒定区，另一种含有轻链可变区和恒定区，一同转染哺乳动物。在一个优选的实施方案中，所述表达载体进一步含有启动子和编码分泌信号肽的DNA序列，以及至少一种用于筛选的抗药基因。
本发明所述宿主细胞可以为原核宿主细胞、真核宿主细胞或噬菌体。所述原核宿主细胞可以为大肠杆菌、枯草杆菌、链霉菌或奇异变形菌等。所述真核宿主细胞，可以为如巴斯德毕赤酵母、酿酒酵母、裂殖酵母、木霉等真菌，如草地粘虫等昆虫细胞，如烟草等植物细胞，如BHK细胞、CHO细胞、COS细胞、骨髓瘤细胞等哺乳动物细胞。在一些实施方案中，本发明所述宿主细胞优选为哺乳动物细胞，更优选BHK细胞、CHO细胞、NSO细胞或COS细胞。
为了实现本发明的第三个目的，本发明所提供的抗体或其功能性片段具有以下特性的至少一种：能够以高亲和力阻断VEGF和KDR的相互作用；抗肿瘤治疗；用于眼科疾病的治疗。因此，双特异性抗体Bev-B5E3BsAb或其抗体片段能够用于制备抗肿瘤药物以及制备诊断或治疗眼科疾病的试剂或药物，这些药物或诊断试剂还包含可药用赋形剂、稀释剂与载体中的任意一种。
其中，术语“药物组合物”表示组合在一起以实现某种特定目的的至少一种药物以及任选地可药用载体或辅料的组合。在某些实施方案中，所述药物组合物包括在时间和/或空间上分开的组合，只要其能够共同作用以实现本发明的目的。例如，所述药物组合物中所含的成分(例如根据本发明的抗体、核酸分子、核酸分子组合和/或偶联物)可以以整体施用于对象，或者分开施用于对象。当所述药物组合物中所含的成分分开地施用于对象时，所述成分可以同时或依次施用于对象。优选地，所述可药用载体是水、缓冲水溶液、等渗盐溶液如PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)、葡萄糖、甘露醇、右旋糖苷、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、0.3％甘油、透明质酸、乙醇或聚亚烷基二醇如聚丙二醇、甘油三酯等。
所用可药用载体的类型尤其依赖于根据本发明的组合物是否配制为用于口服、鼻、皮内、皮下、肌内或静脉施用。根据本发明的组合物可包含润湿剂、乳化剂或缓冲液物质作为添加剂。
本文使用的术语“抗肿瘤药物”旨在表示由VEGF表达所导致或者以VEGF表达为症状/特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述肿瘤包括但不限于肺癌(lung cancer)，非小细胞肺癌(non small cell lungcancer(NSCL))，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌(bone cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancer of the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovariancancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancer of the anal region)，胃癌(stomachcancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(colon cancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宫癌(uterine cancer)，输卵管癌(carcinoma of the fallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子***(carcinoma of the cervix)，***癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma of the vulva)，霍奇金病(Hodgkin′sDisease)，食管癌(cancer of the esophagus)，小肠癌(cancer of the smallintestine)，内分泌***癌(cancer of the endocrine system)，甲状腺癌(cancer ofthe thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of soft tissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，***癌(cancer of the penis)，***癌(prostatecancer)，膀胱癌(cancer of the bladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of the kidney orureter)，肾细胞癌(renal cell carcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliary cancer)，中枢神经***(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axis tumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastoma multiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，和埃文斯肉瘤(Ewing’ssarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。
本文使用的术语“眼科疾病的治疗”旨在表示由VEGF表达所导致或者以VEGF表达为症状/特征的疾病或病症。在一些实施方案中，所述眼科疾病包括但不限于眼内新血管综合征(intraocular neovascular syndrome)，增殖性视网膜病(proliferativeretinopathies)，年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration(AMD))，糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy)。
此外，本文所使用的“治疗有效量”是指足以显示其对于所施用对象益处的剂量。施用的实际量，以及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自身情况和严重程度。治疗的处方(例如对剂量的决定等)最终是全科医生及其他医生的责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法以及对于医生来说已知的其它因素。
除非另有定义，本文使用的所有科技术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。关于本领域的定义及术语，专业人员具体可参考Current Protocols in MolecularBiology Ausubel)。氨基酸残基的缩写是本领域中所用的指代20个常用L-氨基酸之一的标准3字母和/或1字母代码。
发明作用与效果
本发明在上述Bevacizumab及全人源单克隆抗体B5E3基础上构建一个针对VEGF两个表位的双特异性抗体Bev-B5E3BsAb，实验表明其不与Bevacizumab竞争结合VEGF，推测其表位是不同于Bevacizumab的新表位。同时，与其两亲本单克隆抗体相比，能够更为有效地结合VEGF。此外，体外实验中显现出更强地抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的能力；动物实验表明其能够显著抑制肿瘤的生长。因此，该双特异抗体可望发展成为用于肿瘤以及眼科疾病治疗或诊断新型抗体制剂。
附图说明
图1为VEGF抗体与VEGF结合活性检测结果图；
图2为VEGF抗体阻断VEGF与KDR的结合的试验结果图；
图3为双特异性抗体Bev-B5E3BsAb抑制HUVEC细胞增殖实验的结果图；
图4为双特异性抗体Bev-B5E3BsAb体内抑制肿瘤生长的实验结果图。
具体实施方式
以下结合实施例来对本发明进行进一步的说明，但不应理解为对本发明的限制。
实施例不包括对传统方法的详细描述，如：Overlapping PCR反应，限制性酶切反应，将基因***到质粒载体，将质粒引入宿主细胞的方法等。这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，例如Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Mole-cular Cloning：A Laboratory Manual，2ndedition，Cold spring Harbor Laboratory Press。且下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、靶向VEGF全人源单克隆抗体B5E3的制备
(1)人抗体轻、重链恒定区基因的克隆
用淋巴细胞分离液(GE公司产品)分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell,1980,22：197-207)和文献(NucleicAcids Research，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物，采用RT-PCR反应扩增抗体重链和轻链恒定区基因。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，测序验证后确认获得了正确的克隆。将人抗体的重链和轻链恒定区基因分别连接到表达载体中分别构建了载体IgG-AbVec质粒(为含有抗体重链恒定区核苷酸的载体，由本室构建并保存)和Igκ-AbVec质粒(为含有抗体轻链恒定区核苷酸的载体，由本室构建并保存)，测序验证后确认获得了正确的克隆。其中，重链恒定区(CH)的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2显示，轻链恒定区(CL)的核苷酸序列和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4显示。
(2)cDNA的制备
收集50例健康人的外周血各20ml，混合，用淋巴细胞分离液(Sigma-aldrich公司)分离单个核细胞。用Trizol试剂(Invitrogen公司)从分离的人外周血淋巴细胞中提取细胞的总RNA。用cDNA反转录试剂盒(Invitrogen公司)反转录出cDNA。以上步骤按照厂家提供的说明书进行。
(3)引物设计
参考文献(Immunotechnology,1998,3:271-278)设计并合成克隆人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的VHBack，VHFor，VLBack和VLFor引物。VHBack，VHFor，VLBack和VLFor的序列请见(Immunotechnology,1998,3:271-278)。其中在VHBack引物的5’端加上含有Sfi I位点的序列atg gcc cag ccg gcc atg gcc，在VHFor引物的5’端加上序列gcc aga acc acc gcc gcc gga gcc acc acc gcc，在VLBack引物的5’端加上序列tccggc ggc ggt ggt tct ggc gga ggc gga tct，在VLFor引物的5’端加上含有Not I位点的序列atg cgg ccg c。
(4)噬菌体抗体库的构建及筛选
采用步骤(2)中的cDNA和步骤(3)中的引物，利用recombinant Phage antibodysystem试剂盒(Amersham Biosciences公司)构建噬菌体单链抗体库，然后用特异性抗原对文库进行淘选。抗体库构建和淘选方法参照recombinant Phage antibody system试剂盒说明书进行，用于淘选的特异性抗原“重组人VEGF165蛋白”购自R&D公司。经多次淘选抗体库后获得了一株抗人VEGF单链抗体B5E3ScFv，测序后获得其基因序列。SEQ ID NO:5和SEQID NO:6分别显示了B5E3ScFv重链可变区VH的核苷酸序列和氨基酸序列。SEQ ID NO:7和SEQID NO:8分别显示了B5E3ScFv轻链可变区VL的核苷酸序列和氨基酸序列。
(5)全人源抗体B5E3真核细胞中的表达载体的构建
以B5E3ScFv基因为模版，通过PCR合成全人源抗体重链可变区基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟。并使此全人源抗体重链可变区基因的5'端含有限制酶位点AgeI和信号肽基因序列,3'端含有限制酶位点SalI。信号肽基因序列为(ATGGGATGGTCATGTATCATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTC)。最后琼脂糖凝胶电泳分离PCR扩增产物，回收目的条带并克隆到IgG-AbVec载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆即为全人源重链真核表达载体IgG-AbVec-B5E3。
以B5E3ScFv基因为模板，通过PCR合成全人源化抗体轻链可变区基因，反应条件为：95℃15分钟；94℃50秒，58℃50秒，72℃50秒，30个循环；72℃10分钟，得到PCR产物B5E3VLCL，其5'端含有有限制酶位点AgeI和信号肽基因序列,3'端含有限制酶位点BsiwI。信号肽基因序列为(ATCCTTTTTCTAGTAGCAACTGCAACCGGTGTACATTCA)。经琼脂糖凝胶电泳纯化回收目的条带并克隆到Igκ-AbVec载体中，筛选阳性克隆测序。挑选测序正确的克隆即为全人源重链真核表达载体Igκ-AbVec-B5E3。
(6)全人源抗体B5E3在真核细胞中的表达
于3.5cm组织培养皿中接种3×105CHO-K1细胞(ATCC CRL-9618)，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒IgG-AbVec-B5E34μg，质粒Igκ-AbVec-B5E36μg)和20μL Lipofectamine 2000 Reagent(Invitrogen公司产品)按Lipofectamine2000 Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418(Invitrogen公司产品)和250μg/ml Zeocin(Invitrogen公司产品)的DMEM培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：Goat Anti Human IgG(Fc)(KPL公司)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2h，加入待测的抗性克隆培养上清或标准品Human myelomaIgG1(Sigma)，37℃温育2h，加入Goat Anti Human IgG-HRP((Southern BiotechnologyAssociates公司)进行结合反应，37℃温育1h，加入TMB显色液于37℃作用5min，最后用HCL终止反应，酶标仪在波长450nm读值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化全人源抗体B5E3。将纯化抗体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。
实施例2、靶向VEGF全人源双特异性抗体Bev-B5E3BsAb的制备
(1)、双特异性抗体重链可变区、轻链可变区序列获得以及重组表达载体的构建
采用Overlapping PCR的方法，将Bevacizumab重链可变区的C端通过Linker短肽“ASTKGPSVFPLAP(核苷酸序列为：GCT AGC ACC AAG GGA CCT TCT GTG TTC CCT CTG GCCCCT)”与B5E3抗体重链可变区的N端相连，引入限制性内切酶Age I和限制性内切酶Sal I位点，构成Bev-B5E3BsAb双特异性抗体的重链可变区，其核苷酸序列及氨基酸序列分别为SEQID NO:9和SEQ ID NO:10，将Bev-B5E3BsAb重链可变区克隆入IgG-AbVec载体构成其重链表达载体IgG-AbVec-Bev-B5E3BsAb。同样方法，将Bevacizumab轻链可变区的C端通过Linker短肽“TVAAPSVFIFPP(核苷酸序列为：ACC GTG GCT GCC CCT AGC GTG TTC ATC TTC CCTCCT)”与B5E3抗体轻链可变区的N端相连，并引入限制性内切酶Age I和限制性内切酶Bsiw I位点，构成Bev-B5E3BsAb双特异性抗体的轻链可变区，其核苷酸序列及氨基酸序列分别为SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12，将Bev-B5E3BsAb轻链可变区克隆入Igκ-AbVec载体构成其轻链表达载体Igκ-AbVec-Bev-B5E3BsAb。
(2)双特异性抗体Bev-B5E3BsAb表达及纯化
于3.5cm细胞培养皿中接种5×105CHO-K1细胞，将细胞培养至90％-95％融合时进行转染，具体步骤如下：取5μg质粒IgG-AbVec-Bev-B5E3BsAb、5μg质粒Igκ-AbVec-Bev-B5E3BsAb及20μLLipofectamine 2000 Reagent，按Lipofectamine 2000 Reagent试剂盒说明书进行转染。转染进行24h后，将细胞培养基换为含600μg/mL G418的DMEM培养基筛选抗性克隆。
将筛选得到的稳定表达抗体的CHO-K1细胞株用无血清培养基EX-CELL302扩大培养，用Protein A Sepharose 4 Fast Flow纯化***，按说明书亲和纯化得到双特异性抗体Bev-B5E3BsAb。将纯化得到的双特异性抗体用PBS进行透析，最后用紫外吸收法测定Bev-B5E3BsAb抗体的含量。
采用聚丙烯酰氨凝胶电泳方法，鉴定抗体的结构。纯化后的抗体分别在非还原和还原条件下用聚丙烯酰氨凝胶电泳检测其分子量大小。电泳结果显示：在还原条件下，Bev-B5E3BsAb抗体呈现为分子量大小约65KDa和35KDa的重链和轻链条带。在非还原条件下，Bev-B5E3BsAb抗体呈现出分子量约为200KDa的单一条带。
由此可以推测出针对VEGF的双特异性抗体Bev-B5E3BsAb的结构：该抗体由两条相同的轻链和两条相同的重链组成，轻链由轻链可变区和轻链恒定区组成，重链由重链可变区和重链恒定区组成，其中一条轻链分别与一条重链通过二硫键连接，形成两个半分子，两个半分子的两条重链之间通过二硫键连接形成所述抗体。至此，我们构建并表达出完整的双特异性抗体Bev-B5E3BsAb。
实施例3、VEGF抗体与VEGF的结合活性检测
将VEGF(R&D公司产品)用0.05mmol/L碳酸钠.碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成2ug/ml，50ul/孔，4℃包被过夜。10％脱脂奶室温封闭2h后，加入不同浓度的对照IgG、Bevacizumab(Roche公司产品)、B5E3及D2F6，50u l/孔，每个浓度取3个平行孔，室温孵育2h。弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好的HRP标记的羊抗人IgG单抗(KPL公司产品)，50u1/孔，室温孵育45min。PBS充分洗涤后，TMD显色后，置酶标仪(Elx型自动酶标比色仪，美国BIO-TEK公司)中测定450nm吸光度(OD450)值。实验结果如图1所示，实验结果表明：全人源抗体B5E3和D2F6均能够结合VEGF蛋白，但结合能力稍弱于与Bevacizumab。
实施例4、VEGF抗体阻断VEGF与KDR的结合试验
血管内皮生长因子受体KDR(VEGFR2)主要分布在血管内皮细胞,也分布在造血干细胞、巨噬细胞等细胞表面，其作用是介导VEGF的血管内皮细胞增生,趋化内皮细胞和增加血管通透性等功能，是VEGF的主要功能受体。将血管内皮生长因子受体KDR(VEGFR2)蛋白用0.05mmol/L碳酸钠.碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成2ug/ml，100ul/孔，4℃包被过夜。10％脱脂奶粉室温封闭2h后，加入不同浓度的抗体与400ng/ml的VEGF混合液，100ul/孔，每个浓度取3个平行孔，室温孵育2h。弃上清液，PBS洗涤5次，加入按效价稀释好的BiotinylatedhVEGF purified Goat lgG(R&D，BAF293)，100μL/孔，室温孵育2h。PBS充分洗涤后，加入按效价稀释好的streptavidin-HRP(R&D，DY998)，37℃避光孵育45min，TMD显色后，置酶标仪中测定450nm吸光度(A450)值。实验结果如图2所示，结果表明：Bevacizumab能够有效阻断VEGF与KDR的结合,但B5E3和D2F6抗体均不能有效阻断VEGF与KDR的结合。
实施例5、双特异性抗体Bev-B5E3BsAb抑制HUVEC细胞增殖实验
我们利用Bev-B5E3BsAb抗体对人脐静脉内皮细胞HUVEC细胞增殖抑制实验进一步验证双特异性抗体Bev-B5E3BsAb抗体的功能。取生长状态良好的HUVEC细胞(购自ATCC)，调整细胞浓度为5×104/ml，接种于96孔细胞培养板，100μL/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后换无血清培养基，继续培养48h，加入不同浓度梯度的抗体与终浓度各为200ng/ml的VEGF混合液，继续培养24h，加入cck-8试剂，继续孵育3h，置酶标仪中测定450nm吸光度(A450)值。
图3为双特异性抗体Bev-B5E3BsAb抑制HUVEC细胞增殖实验的结果图。如图3-A所示，Bevacizumab与对照IgG相比能够有效抑制HUVEC细胞增殖，与Bevacizumab相比全人源抗体B5E3抑制HUVEC细胞增殖能力很弱，Bevacizumab与B5E3抗体组合对HUVEC的增殖抑制活性与Bevacizumab相似。令人惊奇的是，双特异性抗体Bev-B5E3BsAb抑制HUVEC细胞增殖的活性明显强于Bevacizumab(*P<0.01,t检验)。如图3-B所示，Bevacizumab与对照IgG相比能够有效抑制HUVEC细胞增殖，与Bevacizumab相比全人源抗体D2F6抑制HUVEC细胞增殖能力很弱。Bevacizumab与D2F6抗体组合对HUVEC的增值抑制活性与Bevacizumab相似，双特异性抗体Bev-D2F6BsAb抑制HUVEC细胞增殖的活性亦与Bevacizumab相似。
实施例6、VEGF抗体体内抑制肿瘤生长实验
为检测VEGF抗体体内抑瘤活性,首先用LM3细胞(人肝癌细胞)，接种于到雌性SCID小鼠(第二军医大学实验动物中心)右胁侧皮下，接种肿瘤当天给予各VEGF抗体25mg/kg及同型无关对照蛋白,然后隔天皮下注射持续4周。6周后，每3天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积。与体外实验结果相似，如图4-A所示，Bevacizumab与对照IgG相比能够有效抑制LM3细胞瘤体生长，与Bevacizumab相比全人源抗体B5E3抑制抑制LM3细胞瘤体生长能力很弱，Bevacizumab与B5E3抗体组合对瘤体抑制活性与Bevacizumab相似。然而，双特异性抗体Bev-B5E3BsAb抑制LM3细胞瘤体生长活性明显强于Bevacizumab(*P<0.01,t检验)。如图4-B所示，Bevacizumab与对照IgG相比能够有效抑制LM3细胞瘤体生长，与Bevacizumab相比全人源抗体D2F6抑制LM3细胞瘤体生长能力很弱。Bevacizumab与D2F6抗体组合对LM3细胞瘤体生长抑制活性与Bevacizumab相似，双特异性抗体Bev-D2F6BsAb抑制HUVEC细胞增殖的活性亦与Bevacizumab相似。B5E3和D2F6抑制LM3细胞瘤体生长的活性相似，但它们分别与Bevacizumab组成的双特异抗体的抑制活性却有显著差异，我们推测这可能是由于B5E3和D2F6这两个抗体的表位不同，导致它们各自与Bevacizumab组成的双特异抗体的功能出现差异。
Bev-B5E3BsAb具有比Bevacizumab明显增强的抑制HUVEC的活性，可望发展成为用于实体瘤治疗的新的抗体制剂。
实施例的作用与效果
上述实施例具体阐述了针对VEGF两个表位的双特异性抗体Bev-B5E3BsAb的构建过程，并通过具体实验表明其不与Bevacizumab竞争结合VEGF，进而推测出其表位是不同于Bevacizumab的新表位的结论。同时，与其两亲本单克隆抗体相比，双特异性抗体Bev-B5E3BsAb能够更为有效地结合VEGF。此外，体外实验中其显现出更强地抑制人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)增殖的能力，动物实验也表明双特异性抗体Bev-B5E3BsAb能够显著抑制肿瘤的生长。因此，该双特异抗体可望发展成为用于肿瘤以及眼科疾病治疗或诊断新型抗体制剂。

Claims (6)

1.一种靶向VEGF双特异性抗体Bev-B5E3 BsAb，其特征在于，具有：
重链可变结构域，包含高变区CDR1、CDR2、CDR3 、CDR4、CDR5、CDR6；以及
轻链可变结构域，包含高变区CDR1＇、CDR2＇、CDR3＇、CDR4＇、CDR5＇、CDR6＇，
其中，所述CDR1的氨基酸序列为：Gly-Tyr-Thr-Phe-Thr-Asn-Tyr- Gly；
所述CDR2的氨基酸序列为：Ile-Asn-Thr-Tyr-Thr-Gly-Glu-Pro；
所述CDR3的氨基酸序列为：Ala-Lys-Tyr-Pro-His-Tyr-Tyr-Gly-Ser -Ser-His-Trp-Tyr-Phe-Asp-Val；
所述CDR4的氨基酸序列为：Gly-Gly-Thr-Phe-Ser-Ser-Tyr-Ala；
所述CDR5的氨基酸序列为：Ile-Ile-Pro-Ile-Phe-Gly-Thr-Ala；
所述CDR6的氨基酸序列为：Ala-Arg-His-Trp-Gly-Tyr-Asp-Ala- Phe-Asp-Ile；
所述CDR1＇的氨基酸序列为：Gln-Asp-Ile-Ser-Asn-Tyr；
所述CDR2＇的氨基酸序列为：Phe-Thr-Ser；
所述CDR3＇的氨基酸序列为：Gln-Gln-Tyr-Ser-Thr-Val-Pro-Trp -Thr；
所述CDR4＇的氨基酸序列为：Gln-Ser-Val-Ser-Ser-Ser-Tyr；
所述CDR5＇的氨基酸序列为：Gly-Ala-Ser；
所述CDR6＇的氨基酸序列为：Gln-Gln-Tyr-Gly-Ser-Ser-Pro-Tyr- Thr，
所述重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，所述轻链可变区氨基酸序列如SEQID NO.12所示。
2.一种针对VEGF的抗体片段，其特征在于：
所述抗体片段为权利要求1所述的双特异性抗体Bev-B5E3 BsAb的Fab片段或F(ab’)2片段。
3.一种编码权利要求1所述的靶向VEGF的双特异性抗体Bev-B5E3 BsAb的基因，其特征在于：
编码所述重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示。
4.一种表达载体，其特征在于：
所述表达载体含有至少一个拷贝的权利要求3所述的基因。
5.权利要求1所述的靶向VEGF的双特异性抗体Bev-B5E3 BsAb在制备抗肿瘤药物以及在制备诊断或治疗眼科疾病的试剂或药物中的用途。
6.权利要求2所述的靶向VEGF的抗体片段在制备抗肿瘤药物以及在制备诊断或治疗眼科疾病的试剂或药物中的用途。
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