CN105602960B - 抗体的快速人源化 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于在哺乳动物细胞中产生人源化全长抗体的方法。提供了具有验证的高度框架多样性的人源化变体的文库,而不需要回复突变来保持初始亲和性。将源自模板抗体的合成CDR编码片段文库连接于来自人框架集合(pool)的人框架区编码片段,所述人框架集合仅限于来自功能表达抗体的种系序列。载体包含编码HC框架区4的核酸序列。不需要CDR移植或噬菌体展示。
Description
本申请是申请日为2011年12月28日、中国专利申请号为201180068857.1且发明名称为“抗体的快速人源化”的中国专利申请的分案申请。
发明领域
本公开内容提供了在哺乳动物细胞中产生人源化全长抗体的方法。提供了具有验证的高度框架多样性的人源化变体的文库,而不需要回复突变来保持初始亲和性。将源自模板抗体的合成CDR编码片段文库连接于来自人框架集合(pool)的人框架区编码片段,所述人框架集合仅限于来自功能表达抗体的种系序列。载体包含编码HC框架区4的核酸序列。不需要CDR移植或噬菌体展示。
相关技术的描述
单克隆抗体(MAb)对于特定抗原是单特异性的,并且通过相同的免疫细胞制得,所述免疫细胞是独特母细胞的克隆。传统上,通过将骨髓瘤细胞与脾细胞融合来制得单克隆抗体,所述脾细胞来自已经用所需抗原免疫的小鼠。融合的杂交细胞,或杂交瘤,可以在细胞培养基中无限生长,或可以注入小鼠中,它们在那产生含有抗体富集流体(称为腹水流体)的肿瘤。接着可以从细胞培养基或腹水中纯化抗体。单克隆抗体疗法是使用特异性结合抗原(例如,靶细胞上的细胞表面抗原)的MAb。这可以刺激病人的免疫***来攻击那些细胞。已经研发了MAb来治疗各种疾病,如类风湿性关节炎、多发性硬化和不同类型的癌症。最初,用杂交瘤技术获得了小鼠抗体;然而,小鼠和人免疫***之间的不相似性导致了这些抗体的几个临床失败。尽管如此,FDA批准了少量小鼠MAb来治疗各种病症。Muromonab-CD3(Orthoclone OKT3)是靶向T细胞CD3受体并且在1986年批准用于移植排异的小鼠MAb。Tositumoman(Bexxar)是靶向CD20并且在2003年批准用于治疗非霍奇金淋巴瘤的小鼠Mab。
小鼠单克隆抗体作为人类治疗剂的治疗缺陷是公知的,并且包括体内半衰期短、小鼠重链恒定区介导效应子功能弱;病人对抗体敏感,和产生人抗小鼠抗体(HAMA)应答;和HAMA中和小鼠抗体从而导致失去治疗效率。参见,例如,Williamset al.2010,Humanisingantibodies by CDR grafting(通过CDR移植人源化抗体)。Antibody Engineering(抗体工程),由R.Kontermann和S.Dubel编辑,Springer Lab Manual,319-339。治疗抗体的早期研发中的一个主要障碍是人抗小鼠抗体(HAMA)应答,其在给予小鼠杂交瘤衍生的抗体后在高达约50%的病人中发生,并且损害了所述抗体治疗剂的安全性、功效和半衰期。
一种减少小鼠单克隆抗体的某些缺陷的方法是抗体人源化。抗体人源化的各种技术是已知的。抗体人源化的一种方法是嵌合。在小鼠/人嵌合抗体中,将免疫原性小鼠恒定结构域由人对应部分替代。保留完整的小鼠可变结构域来保持内在的抗原结合亲和性;即,保留来自小鼠抗体的完整Fv区(约66%人)。发现抗体嵌合与小鼠MAb相比能缓和短的体内半衰期,并且赋予抗体人Fc效应子功能。尽管一些小鼠抗体的嵌合导致HAMA应答降低,但其他仍然是免疫原性的。FDA批准了一些嵌合抗体来治疗各种病症。Abciximab(ReoPro),是靶向糖蛋白IIb/IIIa抑制的嵌合抗体,FDA在1994年批准其用于冠心病的治疗。Infliximab(Remicade)是导致TNF-α信号传输抑制的嵌合抗体;1998年首次批准,并且现在用于几种自体免疫疾病的治疗。
第二种称为CDR移植的抗原人源化技术涉及,将完整的小鼠CDR移植至人框架区上,其中重塑的人源化抗体只保留了小鼠抗体的基本结合元件(总序列的5-10%)。例如,参见,Lo,Antibody humanization by CDR grafting(通过CDR移植的抗体人源化)。AntibodyEngineering,Methods and protocols(抗体工程,方法和实验方案)。Benny K.C.Lo编辑,Methods in Molecular Biology,2004,248,135-159。CDR移植描述于美国专利No.5,225,539和US5,585,089中,通过引用将每一篇并入本文中。来自CDR移植的人源化抗体导致治疗抗体的体内耐受性和功效提高。根据Lo 2004,成功CDR移植的关键在于,在重塑的抗体中保留小鼠CDR构造,用于抗原结合。抗体Fv区包含来自轻链(VL)和重链(VH)的可变结构域,并且赋予抗体抗原结合特异性和亲和性。可变结构域采用免疫球蛋白折叠,其中两个反平行的β-层框架支架支持三个超变CDR。不幸的是,CDR移植常常导致负责抗原结合的小鼠CDR环次优的定向。因此,需要重新引入关键的小鼠框架残基作为回复突变,以恢复用于抗原结合的最佳CDR构造。根据Williams等,2010,同上,至少118种抗体已经被人源化。市场上批准的24种抗体中,13种是人源化的,四种是小鼠的,五种是嵌合的,还有两种是人的。销售的人源化抗体全部是通过CDR移植产生的。用于产生最小免疫原性的人源化抗体的另一种技术称为SDR移植。发现一些人源化抗体引发对抗潜在免疫原性小鼠CDR的抗个体基因型(抗-Id)应答。此外,发现了对于抗原结合,不是所有的CDR是同等重要的,乃至必需的。还发现只有约20-33%的CDR残基参与抗原接触。抗原-抗体相互作用中最重要的CDR残基称为特异性决定残基(SDR)。在高可变性的位置发现了SDR,并且可以通过测定抗原-抗体复合物的三维结构或通过抗体-结合位点的遗传操纵来确定。Kashmiriet al.,2004,Developing aminimally immunogenic humanized antibody by SDR grafting(通过SDR移植产生最小致免疫的人源化抗体)。Antibody Engineering,Methods and protocols(抗体工程,方法和实验方案)。Benny K.C.Lo编辑,Methods in Molecular Biology,248,361-376。因此,在CDR区内存在用于蛋白演化的空间,同时保持对目标抗原的亲和性。
存在降低抗体的免疫原性的竞争技术。含有大部分人免疫球蛋白基因座的转基因小鼠(例如,Xenomouse和UltiMAb-Mouse)可以是“全人”抗体的来源。源自人可变区的噬菌体文库的人抗体也不需要人源化,但常常需要进一步突变来获得高结合效力。使用这些其他平台技术,已经产生了相对少量的销售抗体。参见Williams等,2010,同上。
根据Lo 2004,抗体人源化的目的在于将非人物种中产生的单克隆抗体(MAb)改造成给予人时免疫原性较低的一种抗体。然而,研发一种伴随蛋白演化技术的抗体人源化技术来产生具有其他优化特征(如,与小鼠相比对目标抗原的亲和性增强和/或表达提高)的人源化抗体将是有利的。
发明概述
本公开内容提供了专门快速人源化抗体的方法。产生一个或多个全长抗体文库,并且同时针对结合和表达优化对其进行筛选。将抗体文库特意设计成成员数量小,但是高度多样性的。在抗体文库中只使用验证的人框架,其已经由种系序列得到功能表达。在最终文库中特别选择多样性最大的种系序列的子集。在一个方面中,LC和HC框架4的单个序列用于整个文库,并且将编码该框架序列的DNA嵌入载体中。使用连接来重组框架和CDR,由此避免需要多个引物组的重叠PCR。在一个方面中,在制造宿主中表达和筛选文库。在另一个方面中,就抗原亲和性而言,在三至四个月内,鉴定等于或优于供体抗体(例如,小鼠MAb)的抗体。
在一个实施方案中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:合成包含互补性决定区(CDR)片段编码文库和框架(FW)片段编码文库的免疫球蛋白重链(HC)双链DNA片段文库,其中至少一个CDR片段文库源自模板抗体,并且每个FW片段文库来自人框架集合,所述人框架集合获自功能表达的人抗体。
在一个方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:合成包含CDR片段编码文库和FW片段编码文库的免疫球蛋白轻链(LC)双链DNA片段文库,其中至少一个CDR片段文库源自模板抗体,并且每个FW片段文库来自人框架集合,所述人框架集合获自功能表达的人抗体。
在另一个方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括生产人源化抗体的步骤,还包括通过以FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的顺序逐步液相连接重链FW编码片段和CDR编码片段,由HC片段文库组组装,以产生人源化HC可变结构域编码文库。
在进一步的方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括生产人源化抗体的步骤,还包括通过以FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的顺序逐步液相连接轻链FW编码片段和CDR编码片段,由LC片段文库组装,以产生人源化LC可变结构域编码文库。
在另一个方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:将组装的人源化重链可变结构域文库和组装的轻链可变结构域文库克隆至表达载体中,形成人源化文库;将人源化文库转染至细胞中;和在细胞中表达全长人源化抗体,以形成人源化抗体文库。
在进一步的方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:筛选人源化抗体文库,以确定人源化抗体的表达水平;和筛选人源化抗体文库,以确定与模板抗体对抗原的亲和性相比,人源化抗体的抗原亲和性。在一个方面中,人源化抗体与模板抗体相比,表现出相等或更高的对抗原的亲和性。在一个方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:将组装的人源化重链可变结构域文库和组装的轻链可变结构域文库克隆至表达载体中,所述表达载体包含编码HC框架区4的核酸序列。在具体方面中,编码框架4的核苷酸序列源自人重链可变结构域,所述人重链可变结构域源自功能表达的人抗体。
在另一个方面中,载体包含编码LC框架区4的核酸序列。在具体方面中,编码框架4的核苷酸序列源自人轻链可变结构域,所述人轻链可变结构域源自功能表达的人抗体。
在各个方面中,本公开内容提供了生产人源化抗体文库的方法,其中人源化抗体文库的成员数量为10,000,000个成员或更少;1,000,000个成员或更少;或10,000个成员或更少。
在一个方面中,本公开内容提供了生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:将组装的人源化HC可变结构域文库克隆至表达载体中,形成载体-HC可变结构域DNA文库;和将组装的轻链可变结构域文库连接于载体-HC文库,形成人源化文库。在另一个方面中,表达步骤包括由单个启动子表达人源化重链可变结构域和人源化轻链可变结构域两者。
在另一个方面中,本公开内容提供了生产人源化抗体的方法,其包括以下步骤:筛选人源化抗体文库中与模板抗体相比一种或多种其他特征改善的人源化抗体;一种或多种特征选自:平衡离解常数(KD)、稳定性、解链温度(Tm)、pI、溶解度、表达水平、免疫原性降低和效应子功能提高。在具体方面中,提高相对于模板抗体为约1%至500%,或相对于模板抗体为约2倍至1000倍。
在另一个方面中,本公开内容提供了一种生产人源化抗体的方法,其还包括以下步骤:将组装的人源化重链可变结构域文库和组装的轻链可变结构域文库克隆至表达载体中,形成人源化文库;和将人源化文库转染至细胞中;其中细胞选自真核细胞生产宿主细胞系,其选自:3T3小鼠成纤维细胞、BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞;MDCK,狗上皮细胞;Hela人上皮细胞;PtK1鼠袋鼠上皮细胞;SP2/0小鼠浆细胞;和NS0小鼠浆细胞;HEK293人胚肾细胞;COS猴肾细胞;CHO、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞;R1小鼠胚细胞;E14.1小鼠胚细胞;H1人胚细胞;H9人胚细胞;PER C.6人胚细胞;酿酒酵母(S.cerevisiae)酵母细胞;和毕赤酵母细胞。在具体方面中,真核细胞生产宿主细胞系选自CHO-S、HEK293、CHOK1SV或NS0。在另一个方面中,细胞是具有抗体细胞表面展示的真核细胞生产宿主,并且任选地,在真核细胞生产宿主中进行一个或多个筛选步骤。
附图简述
图1显示了模板抗体的快速抗体人源化方法的示意图。
图2显示了来自模板抗体BA001的人源化变体的初级筛选的数据。初级筛选包括与供体抗体相比的变体的高通量ELISA,供体抗体用星号显示。ELISA用于测定抗原结合和定量。
图3显示了与模板抗体BA001相比,就表达和功能而言,头8个证实的人源化抗体变体苗头(hit)。所示的BA001和人源化变体的DNA和蛋白序列描述于美国公开第US2010/0138945号中,通过引用将其并入本文中。
图4显示了与模板抗体相比,人源化抗IL-6抗体的结合亲和性BiaCore表面等离子体共振数据。模板CNTO328(嵌合的、人-小鼠抗体)的数据来自US2006/0257407,通过引用将其并入本文中。BA001也是具有与模板CNTO328相同序列但在不同表达***中制造的模板抗体。获得了人源化变体抗体h1-h8,没有使用另外的亲和性成熟。
图5显示了ELISA的结果,其中人源化抗体变体阻断了模板抗体BA001的抗原结合。
术语的定义
为了便于理解本文提供的实例,将对一些频繁出现的方法和/或术语进行描述。
术语“亲和性成熟”指的是对抗原的免疫应答的平均亲和性的增加。实际上,这可以在重复暴露于抗原后产生。特别优选的取代变体类型涉及取代亲本抗体(例如,人抗体)的一个或多个超变区残基。通常,为进一步研发选择所得到的变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改善的生物特性。用于产生这类取代变体的便利方式涉及使用本文所述的技术或本领域技术人员已知的其他技术的亲和性成熟,例如,所述技术为噬菌体展示(SchierR.,J.Mol.Biol.,263:551-67,1996)。然后如本文中所述的,例如,Biacore分析,筛选变体的生物活性(例如,结合亲和性)。为了鉴定是用于修饰的良好候选物的超变区残基,可以进行丙氨酸扫描诱变,来鉴定明显有助于抗原结合的超变区残基。在一个或多个相关试验中具有优越特性的抗体可以经历进一步的研发。
本文中所用的术语“试剂”表示抗体或抗体文库。通过包含在下文中所述的筛选测定中,评价试剂作为例如抗肿瘤剂、抗炎剂或凋亡调节剂的潜在活性。通过包含在下文中所述的筛选测定中,评价试剂作为特定蛋白相互作用抑制剂(即,选择性地抑制两个预定多肽之间的结合相互作用但基本上不干扰细胞生活力的试剂)的潜在活性。
如本文中所用的术语“氨基酸”指的任何含有氨基(--NH2)和羧基(--COOH)的有机化合物;优选作为自由基,或可替换地,缩合后作为肽键的一部分。本领域应理解“二十个天然编码的多肽-形成α-氨基酸”并且指的是:丙氨酸(ala或A)、精氨酸(arg或R)、天冬酰胺(asn或N)、天冬氨酸(asp或D)、半胱氨酸(cys或C)、谷氨酸(glu或E)、谷氨酰胺(gln或Q)、甘氨酸(gly或G)、组氨酸(his或H)、异亮氨酸(ile或I)、亮氨酸(leu或L)、赖氨酸(lys或K)、甲硫氨酸(met或M)、苯丙氨酸(phe或F)、脯氨酸(pro或P)、丝氨酸(ser或S)、苏氨酸(thr或T)、色氨酸(trp或W)、酪氨酸(tyr或Y)和缬氨酸(val或V)。
术语“扩增”意思是增加多核苷酸的拷贝数。
如本文中所用的术语“抗体”指的是完整的免疫球蛋白分子以及能够结合抗原表位的免疫球蛋白分子片段,如Fab、Fab′、(Fab)2、Fv和SCA片段。
Fab片段由抗体分子的单价抗原结合片段组成,并可以通过木瓜蛋白酶消化整个抗体分子产生由完整的轻链与部分重链组成的片段而得到。
可通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子,然后还原产生由完整的轻链与部分重链组成的分子来获得抗体分子的Fab′片段。以这种方式处理每个抗体分子将获得两个Fab′片段。
可通过用胃蛋白酶处理整个抗体分子不需随后还原来获得抗体的(Fab′)2片段。(Fab′)2片段是两个Fab′片段通过两个二硫键连接在一起形成的二聚体。
Fv片段定义为作为两条链表达的含有轻链可变区和重链可变区的基因工程片段。
单链抗体(“SCA”)为由合适的、弹性多肽连接体连接的含有轻链可变区和重链可变区的基因工程单链分子。
术语“生物仿制药(biosimilar)”,又称作“后续生物制品(follow-onbiologic)”,是指专利或专营权届满后,得到官方批准的创新生物药剂制品(innovatorbiopharmaceutical products)的新产品。
术语“细胞生产宿主”或“制造宿主”指的是用于产生或制造蛋白的细胞系。真核细胞,如哺乳动物细胞,包括但不限于人、小鼠、仓鼠、大鼠、猴细胞系以及酵母、昆虫和植物细胞系。或者,可以使用原核细胞。在一个方面中,哺乳动物细胞生产宿主选自:3T3小鼠成纤维细胞;BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞;MDCK细胞;狗上皮细胞;Hela人上皮细胞;PtK1鼠袋鼠上皮细胞;SP2/0小鼠浆细胞及NS0小鼠浆细胞;HEK 293人胚肾细胞;COS猴肾细胞;CHO;CHO-S中国仓鼠卵巢细胞;R1小鼠胚细胞;E14.1小鼠胚细胞;H1人胚细胞;H9人胚细胞;PERC.6,人胚细胞。在另一个方面中,细胞生产宿主是GS-NSO或GS-CHOK1细胞系。在另一个方面中,细胞生产宿主选自酿酒酵母酵母细胞;和毕赤酵母细胞。在另一个方面中,细胞生产宿主是细菌细胞系。
具有“嵌合特性”的分子是指分子:1)与第一参考分子部分同源和部分异源;2)同时与第二参考分子部分同源和部分异源;没有3)排除同时与再一种或多种其它参考分子部分同源和部分异源的可能性。在非限制性的实施方案中,可通过组装重新排列的部分分子序列来制备嵌合分子。在非限制性的方面中,可使用多个分子模板通过合成嵌合多核苷酸来制备嵌合多核苷酸分子,使得所得到的嵌合多核苷酸具有多个模板的属性。
如本文中所用的术语“同源”指的是物种之间进化和功能相关的基因序列。例如,但不限于,在人基因组中,人CD4基因是小鼠3d4基因的同源基因,因为这两个基因的序列和结构表明,它们是高度同源的,并且这两个基因编码都编码通过MHC II类限制性抗原识别的在发出T细胞激活的信号中发挥功能的蛋白。
术语“商业规模”意思是以用于转售的适当规模生产蛋白或抗体。
如本文中所用的“比较窗口”指的是至少20个连续核苷酸位置的概念片段(conceptual segment),其中多核苷酸序列可以与至少20个连续核苷酸的参考序列进行比较,且其中比较窗口中多核苷酸序列部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可以包含20%或以下的添加或缺失(缺口),用于两条序列的最佳比对。用于比对比较窗口的序列最佳比对可以依照以下方法进行:Smithand Waterman(1981)Adv.Appl.Math.2:482的局部同源性算法,Needlemen and Wuncsch J.MoI.Biol.48:443(1970)的同源性比对算法,Pearson and Lipman Proc.Natl.Acad.Sci.(U.S.A.)85:2444(1988)的相似性搜索法,这些算法的计算机实施(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA,Genetics Computer Group,575Science Dr.,Madison,Wis.)或通过检查,并且选择通过各种方法产生的最佳比对(即,在比较窗口中形成同源性最高百分比)。
如本文中所用的术语“互补性决定区”和“CDR”指的是由Kabat和Chothia例证的本领域公认的术语。CDR的定义,一般也被称为超变区或高变环(Chothiaand Leks,1987;Clothiaet al.,1989;Kabatv et al.,1987;以及Tramontano et al.,1990)。尽管稍微更短或更长的可变结构域也适于形成单链抗体,但可变区结构域通常包含天然存在的免疫球蛋白链的氨基末端的大约105-115个氨基酸(例如,氨基酸1-110)。CDR是免疫球蛋白上决定所述分子特异性并与特定配体接触的部分。CDR是所述分子上最可变的部分并促成了这些分子的多样性。每个V结构域中存在三个CDR区,即CDR1、CDR2和CDR3。CDR-H表示可变重链的CDR区,而CDR-L涉及可变轻链的CDR区。H表示可变重链,而L表示可变轻链。Ig衍生区的CDR区可以如Kabat(1991)所述来确定。Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列),第5版,NIH公开号91-3242 U.S.美国卫生和公众服务部(Department of Health and Human Services),Chothia(1987)J.MoI.Biol.196,901-917和Chothia(1989)Nature,342,877-883。
如本文所用的术语“全面的”指的是演化技术,其中在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置上进行每一种可能的变化,并且通过测序或一些其他技术检测多核苷酸或多肽以证实已发生预期的变化。全面诱变指的是突变编码蛋白的基因区的DNA,所述突变改变所述蛋白密码子氨基酸序列,然后通过测序或其他技术确定所有突变已经发生,并且在最佳情况中排列,其中每个克隆在可鉴定的位置和/或被独特地标记。然后进行所有表达的突变体的筛选,以确保对于提高的表型,所有都得到了全面表达,以提供有保证的全面覆盖,即,用包含BioAtla CPE方法的全面筛选的CPE文库。同时也可以为了表达测量筛选***中的非表达克隆,以确保一旦能够用于表达可替换的***,如体外转录和翻译,没有不正确地标记为阴性或天然突变。或者,可以在筛选后对所有克隆进行测序,但应当包括所有阴性、天然和高表达突变型克隆(up mutant clone)。然后将没有鉴定的任何突变体加入第二轮筛选中,以产生真实的全面诱变和筛选表达/活性***,如CPE。通过之前不存在的最近在高通量筛选中的成功部分地使这种情况变得可行。
术语“全面位置演化”(CPETM)用于描述可以用于增强单个或多个抗体特性和结合特征的抗体演化技术平台。对于所有证实序列(或通过其他非统计学证实方法证实的)的蛋白内每个位置的63种可能的密码子变化,CPE平台可以将蛋白内每个单独密码子变化的体内作用全面性地作图。这种全面诱变技术通过测试沿着抗体可变结构域序列的每个位置的氨基酸变化快速地产生了抗体变体。
术语“组合蛋白合成”(CPSTM)用于描述可以用于通过将抗体的最佳特性组合至新的、高性能抗体中来优化所需抗体特征的组合蛋白合成技术。可以在CPETM后使用CPSTM,并且其可以虑及随后产生和体内选择改进的单独密码子的所有排列,用于鉴定蛋白或抗体内密码子变化的最优组合或组。这些技术的组合可以显著扩大用于筛选的抗体变体的集合,并且显著提高了发现具有单个或多个增强特征的抗体的可能性,所述特征如结合亲和性、特异性、热稳定性、表达水平、效应子功能、糖基化和溶解性。
对于全长抗体分子,免疫球蛋白基因可以获自杂交瘤细胞系的基因组DNA或mRNA。将抗体重链和轻链克隆在哺乳动物载体***中。用双链序列分析来证实组装。可以在其他人或哺乳动物宿主细胞系中表达抗体构建体。然后可以通过所表达目标抗体的瞬时转染试验和蛋白质印迹分析来验证构建体。可以使用快速试验方法分离和筛选具有最高生产力的稳定细胞系。
“保守氨基酸取代”指的是具有相似侧链的残基的可互换性。例如,一组具有脂肪族侧链的氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸;一组具有脂肪族羟基侧链的氨基酸是丝氨酸和苏氨酸;一组具有含酰胺侧链的氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺;一组具有芳香侧链的氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸;一组具有碱性侧链的氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸;以及一组具有含硫侧链的氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代组为:缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
本文中所用的术语“对应于”意思是多核苷酸序列与全部或部分参考多核苷酸序列同源(即,是相同的、非严格进化相关的),或多肽序列与参考多肽序列是相同的。相比之下,本文中所使用的术语“与……互补”意思是互补序列与全部或部分参考核苷酸序列同源。为了说明,核苷序列“TATAC”对应于参考序列“TATAC”,并且与参考序列“GTATA”互补。
术语“降解有效”量指的是与不接触酶的底物相比,加工至少50%底物所需的量。优选,至少80%底物被降解。
如本文中所用的,术语“限定的序列框架”指的是在非随机的基础上,通常基于实验数据或结构数据,而选择的一组限定的序列;例如,除其它变化外,限定的序列框架可以包含预测形成β片层结构的一组氨基酸序列,或可以包含亮氨酸拉链七肽重复基序、锌指结构域。“限定的序列核”是一组包括有限范围可变性的序列。而(1)20个常规氨基酸的完全随机的10-mer序列可以是(20)10个序列中的任一个序列,和(2)20个常规氨基酸的伪随机10-mer序列可以是(20)10个序列中的任一个序列,但将在特定位置和/或表现出某些残基偏好,(3)如果各残基位被允许是可允许的20个常规氨基酸(和/或可允许的非常规氨基/亚氨基酸)中的任一个,则限定的序列核是序列的子集。在单个选定的文库成员序列的片段或全长中,限定的序列核通常包括变异和未变异的残基位置和/或包括变异的残基的位置,其可以包含选自氨基酸残基的限定子集的残基等。限定的序列核可以指氨基酸序列或多核苷酸序列。举例,但不限于,序列(NNK)10和(NNM)10,其中,N代表A、T、G或C,K代表G或T,且M代表A或C,是限定的序列核心。
如本文所用的术语“去免疫”涉及产生模板结合分子的变体,与原始野生型分子相比,通过使其所述变体在人体内无免疫原性或免疫原性减少,修饰所述变体。根据本发明的去免疫分子涉及非人来源的抗体或其部分(如框架和/或CDR)。相应的实例是描述于US4,361,549中的抗体或其片段。术语“去免疫”还涉及显示出产生T细胞表位的倾向降低的分子。根据本发明,术语“产生T细胞表位的倾向降低”涉及T-细胞表位的去除,从而导致特定的T-细胞激活。
此外,产生T细胞表位的倾向降低意思是有助于T细胞表位形成的氨基酸的取代,即,对于T细胞表位形成是必须的氨基酸的取代。换言之,产生T细胞表位的倾向降低涉及免疫原性降低或诱导抗原非依赖性T细胞增殖的能力降低。此外,产生T细胞表位的倾向降低涉及去免疫化,这意思是诱导抗原非依赖性T细胞增殖的氨基酸序列的潜在T细胞表位的缺失或减少。
如本文中所用的术语“T细胞表位”涉及细胞内的肽、多肽或蛋白降解过程中释放出,并且随后由主要组织相容性复合体(MHC)的分子呈递以触发T细胞激活的短肽序列,特别参见WO 02/066514。对于由II类MHC呈递的肽,这种T细胞的激活随后可通过直接刺激B细胞产生所述抗体从而引发抗体应答。
DNA的“消化”指的是用仅在DNA特定序列发挥作用的限制性酶催化的DNA断裂。本文中所用的各种限制性酶是可购得的,且它们所用的反应条件、辅酶因子和其它需求是本领域普通技术人员已知的。为了分析目的,1μg质粒或DNA片段通常使用在约20μl缓冲液中的约2个单位的酶。为了分离用于构建质粒的DNA片段,一般用在更大体积中的20至250个单位的酶消化5至50μg DNA。具体限制性酶的合适缓冲液和底物量是由制造商指定的。通常使用37℃下约1小时的孵育时间,但可根据供应商的说明有所变化。消化后,将反应物直接进行凝胶电泳,以分离所需的片段。
如本文中所用的术语“DNA改组”表示在基本上同源但不相同的序列之间的重组,在一些实施方案中,DNA改组涉及通过非同源重组,如通过cer/lox和/或flp/frt***等的交换(crossover)。改组可以是随机或非随机的。
如本发明中所用的术语“表位”指的是抗原上的抗原决定簇,如IL-6多肽,抗体(如抗IL-6特异性抗体)的互补位可与其结合。抗原决定簇通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成,且可以具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征。如本文中所用的“表位”指的是抗原或其它大分子上能形成与抗体的可变区结合体相互作用的结合相互作用的那部分。通常,这种结合相互作用表现为与CDR的一个或多个氨基酸残基的分子间接触。
术语“演化”指的是与模板抗体相比,通过基因或合成修饰的抗体的至少一种特性、特征或活性的变化。
当涉及到参考多肽时,术语“片段”、“衍生物”和“类似物”包括保留了至少一种与参考多肽至少基本上相同的生物功能或活性的多肽。此外,术语“片段”、“衍生物”或“类似物”的典型实例是“前体形式(pro-form)”分子,如通过切割修饰而产生具有显著较高活性的成熟酶的低活性前体蛋白。
术语“片段”应用于核酸序列时,指的是编码抗体分子的一部分或子部分(sub-portion)的分子。例如,HC CDR1 DNA片段,可以编码完整的重链CDR1,或其截短的部分。
在一个方面中,本文中提供的某些方法提供了由模板多肽产生一组子代多肽,在所述子代多肽中,在每个氨基酸位置表现为“全范围单个氨基酸取代”的一组。如本文中所用的,“全范围单个氨基酸取代”指的是如本文所述的形成天然编码多肽的20个天然编码的α-氨基酸。
术语“基因”意思是参与产生多肽链的DNA片段;它包括编码区之前和之后的区域(前导区和拖尾区)以及单独的编码片段(外显子)之间的间隔序列(内含子)。
如本文中所用的“遗传不稳定性”指的是在减少事件(reductive events)过程中(其一般涉及通过重复序列的丢失使序列简化)高度重复序列被丢失的自然趋势。缺失往往涉及一个重复拷贝的丢失和重复之间一切的丢失。
术语“异源”意思是单链核酸序列无法与另一条单链核酸序列或其补体进行杂交。因此,异源区域意思是多核苷酸区域或多核苷酸在其序列内含有无法与另一个核酸或多核苷酸杂交的区域(area)或区(region)。这些区或区域例如是突变区域。
术语“同源(homoologous)”或“部分同源(homeologous)”是指一条单链核酸的核酸序列可以与互补的单链核酸序列进行杂交。杂交的程度可能取决于许多因素,包括序列之间同一性的量和杂交条件,如后面讨论的温度和盐浓度。优选相同区大于约5bp,更优选相同区大于10bp。
术语“人源化的”用来描述抗体,其中来自哺乳类动物(例如,小鼠)的互补性决定区(CDR)与人框架区相结合。通常将编码分离的CDR的多核苷酸移植(graft)到编码合适的可变区框架(和任选恒定区)的多核苷酸中,以形成编码完整抗体(例如,人源化的或完全人的)、抗体片段等的多核苷酸。在另一个方面中,除了小鼠抗体以外,还可以人源化其他物种,如,例如,其它啮齿动物、骆驼、兔、猫、狗、猪、马、牛、鱼、美洲驼和鲨鱼。广义而言,任何产生抗体的物种可以用于生产人源化抗体。此外,为了减少其潜在的抗原性,而不降低它们对靶标的亲和性,本发明的抗体可以为嵌合的、类人(human-like)的、人源化的或完全人抗体。嵌合的、类人的和人源化的抗体通常为如本领域所述的。通过在杂合抗体中整合尽可能少的外源序列来降低抗原性。可以通过本领域公知的方法来制备这些杂合抗体。
免疫球蛋白轻链或重链可变区由被三个高变区(也称为CDR)隔开的“框架”区的组成。框架区和CDR的范围已被精确的定义(参见,“Sequences of Proteins ofImmunological Interest(免疫学目标蛋白的序列)”,Kabat et al.,1987)。物种内不同的轻链或重链框架区的序列相对保守。如本文所用“人框架区”与天然存在的人免疫球蛋白的框架区基本上相同(约85或以上,通常90-95或以上)。抗体的框架区,即轻链和重链的组合框架区,用于定位和比对CDR。CDR主要负责结合抗原表位。按照本发明,框架区涉及免疫球蛋白的V结构域(VH或VL结构域)中的区,其为与抗原接触的高变互补性决定区(CDR)提供蛋白支架。在每个V结构域,存在四个框架区,称为FRL、FR2、FR3和FR4。框架1包括从V结构域的N-端直至CDR1的开始,框架2涉及CDR1和CDR2之间的区,框架3包括CDR2和CDR3之间的区,以及框架4意思是从CDR3的末端直至V结构域的C-端;特别参见,Janeway,Immunobiology(免疫生物学),Garland Publishing,2001,5th ed(第5版)。因此,框架区包括VH或VL结构域中CDR区外的所有区。在公开内容的一个方面中,将单个序列用于框架4,其通过抗体文库的每个成员保持恒定。在一个方面中,编码框架区4的单个序列是人框架集合中发现的最常见序列,仅限于来自功能表达抗体的种系序列。
本领域技术人员很容易由给定的序列推断出框架区和CDR;参见Kabat(1991)Sequences of Proteins of Immunological Interest(免疫学目标蛋白的序列),5th edit(第5版),NIH公开号91-3242U.S.美国卫生和公众服务部(Department of Health andHuman Services),Chothia(1987)J.MoI.Biol.196,901-917和Chothia(1989)Nature,342,877-883。
本发明的益处延及“工业应用”(或工业生产过程),该术语用于包括商业产业(或简单产业)中正确的应用以及非商业产业应用(例如,在非营利机构中进行生物医学研究)。相关应用包括在诊断、医药、农业、制造业和学术研究领域中的应用。
术语“相同的(identical)”或“同一性(identity)”意思是两条核酸序列具有相同的序列或互补序列。因此,“相同的区域”是指多核苷酸的区(region)或区域(area)相同,或整个多核苷酸与另一个多核苷酸的区域或多核苷酸相同或互补。
术语“分离的”是指该物质从原始环境(例如,如果它是天然存在的,则指的是自然环境)中移出。例如,在活动物体内存在的天然产生的多核苷酸或蛋白不是分离的,但是与自然体系中的某些或全部共存的物质中分开的同样的多核苷酸或蛋白则是分离的。这样的多核苷酸可以作为载体的一部分,和/或这样的多核苷酸或蛋白可作为组合物的一部分,且仍然可以分离的,因为这种载体或组合物不是自然环境的一部分。
“分离的核酸”意思是核酸,例如DNA或RNA分子,其不直接与5'和3'侧翼序列相邻,但当存在于其来源的生物体的天然存在的基因组中时通常与所述5'和3'侧翼序列直接相邻。因此,该术语描述,例如,并入载体(如质粒或病毒载体)中的核酸;并入异源细胞基因组(或同源细胞的基因组中,但与它天然存在的位置不同)中的核酸;及作为分开的分子存在的核酸,例如,通过PCR扩增或限制性酶消化产生的DNA片段,或通过体外转录产生的RNA分子。该术语还描述了形成编码其他多肽序列的杂合基因一部分的重组核酸,所述其他多肽序列用于例如产生融合蛋白。
如本文中所用的“配体”指的是被特定受体识别的分子,如随机肽或可变片段序列。本领域技术人员应当认识到,分子(或大分子复合物)可以同时是受体和配体。通常,分子量较小的结合伴侣称为配体,而分子量较大的结合伴侣称为受体。
“连接”指的是在两个双链核酸片段之间形成磷酸二酯键的过程(Maniatis etal.,1982,p.146)。除非另外规定,连接可使用已知的缓冲液和条件来完成,用10个单位的T4DNA连接酶(“连接酶”)/每0.5μg约等摩尔量的待连接DNA片段。
如本文中所用的,“连接体”或“间隔物”是指连接两个分子(如DNA结合蛋白和随机肽),并可以将两个分子置于优选的构型中的一个分子或一组分子,例如,使得随机肽能够以DNA结合蛋白最小的空间位阻与受体结合。
术语“哺乳动物细胞表面展示”指的是出于筛选的目的,使蛋白或抗体或抗体的一部分在哺乳动物宿主细胞表面上表达和展示的技术;例如,通过荧光激活细胞分选术来筛选特异性的抗原结合。在一个方面中,哺乳动物表达载体用于免疫球蛋白同时以如同DuBridge等的US2009/0136950中的分泌的和细胞表面结合的形式表达,在此通过引用将US2009/0136950引入本文中。在另一个方面中,Gao等的技术用于编码抗体文库的病毒载体,或抗体片段文库,当在如同如同Gaoet等的US2007/0111260中的细胞中表达时,将抗体片段展示于细胞膜上,Gao等的US2007/0111260,在此通过引用将其引入本文。整个IgG于哺乳动物细胞表面上的表面展示是已知的。例如,Akamatsuu等基于它们的抗原结合亲和性和生物活性,开发出适于直接分离IgG分子的哺乳动物细胞表面展示载体。使用EB病毒(Epstein-Barr virus)衍生的游离基因载体,在细胞表面上展示作为整个IgG分子的抗体文库,并通过磁珠和荧光激活细胞分选术的组合来筛选出特异性抗原结合。从分选的细胞中回收编码具有理想结合特征的抗体的质粒,并将其转化为用于产生可溶性抗体的形式。Akamatsuu et al.,J.Immunol.Methods 2007,327(1-2):40-52,在此通过引用将其并入。对于用于亲和性成熟的单链Fv抗体的细胞表面展示,Ho等使用了广泛用于瞬时蛋白表达的人胚胎肾293T细胞,。通过从大量表达具有略低亲和性的WT抗体的细胞中进行单次细胞分选(single-pass cell sorting),将表达具有较高亲和性的稀有突变抗体的细胞富集了240倍。此外,对使内在抗体热点随机的组合文库进行单次筛选后,获得了具有增强的CD22结合亲和性的高度富集的突变体。Ho et al.,Isolation of anti-CD22Fv with highaffinity by Fv display on human cells(通过在人细胞上展示Fv,分离出具有高亲和性的抗-CD22Fv),Proc Natl Acad Sci,USA,2006年6月20日;103(25):9637-9642;按引用将其并入本文中。
Beerli等,使用直接从人供体的外周血单核细胞(PBMC)中分离出的,靶抗原特异性B细胞。从该B细胞集合产生了重组的抗原特异性单链Fv(scFv)文库,并使用辛德毕斯病毒表达***通过哺乳动物细胞表面展示技术进行了筛选。这种方法可通过单轮FACS分离出抗原特异性抗体。从阳性克隆中分离出重链(HC)和轻链(LC)的可变区(VR),并产生出作为完整IgG或Fab片段的重组的完全人抗体。以这种方式,分离出几个结合Qβ病毒样颗粒(VLP)即模型病毒抗原的超突变高亲和力抗体、模型病毒抗原以及烟碱特异性抗体。在细胞培养物中,全部抗体显示出高表达水平。在小鼠模型中,临床前证实了烟碱特异性mAb的临床前验证。Beerli等,Isolation of human monoclonal antibodies by mammalian celldisplay(通过哺乳动物细胞展示分离出人类单克隆抗体),Proc Natl Acad Sci U S A,2008年September 23,月23;105(38):14336-14341;按引用将其并入本文中。
酵母细胞表面展示也是已知的,例如,参见Kondo and Ueda 2004,Yeast cell-surface display-applications of molecular display(分子展示的酵母细胞表面展示应用),Appl.Microbiol.Biotechnol.,64(1):28-40,其描述了例如,利用酿酒酵母的细胞表面工程***。几个用于在酿酒酵母中表达的代表性展示***描述于Lee et al.,2003,Microbial cell-surface display(微生物细胞表面展示)TRENDS in Bitechnol.21(1):45-52。还参见Boder and Wittrup 1997,Yeast surface display for screeningcombinatorial polypeptide libraries(用于筛选组合多肽文库的酵母表面展示),Nature Biotechnol.,15(6):553。
术语“制造”指的是以保证治疗性蛋白的至少I期临床试验的足够量或用于监管机构审批诊断蛋白的足够量来产生蛋白。
术语“错义突变”指的是其中单核苷酸发生改变的点突变,其产生编码不同氨基酸的密码子。使氨基酸变为终止密码子的突变,称为无义突变。
如本文中所用的“待演化的分子特性”包括由多核苷酸序列组成的分子、由多肽序列组成的分子,以及部分由多核苷酸序列且部分由多肽序列组成的分子。特别相关的-但绝不是限制-待演化的分子特性的实例包括在特定条件下的酶活性,如涉及温度;盐度;压力;pH以及甘油、DMSO、去污剂和/或在反应环境中所接触的任何其他分子的浓度。其他特别相关的-但绝不是限制-待演化的分子特性的实例包括稳定性--例如,在暴露于特定的环境中一段特定的时间后,残存的分子特性的量,该环境为诸如可能在存储过程中遇到的环境。
术语“多维表位作图”(MEM)指的是确定表位并解析对于抗体结合很重要的鉴定和氨基酸。关于由抗体识别的蛋白结合位点(表位)的信息,对将其用作生物学或诊断的工具以及理解其作用机制很重要。然而,抗原在其一级序列以及三维结构中是高度多样化的。表位通常分为三类:1)线性表位,即抗体结合多肽链线性部分的残基,2)构象表位,其中结合位点由结构元件形成(例如,α-螺旋、环),3)不连续表位,其中在抗原的三维结构中多肽链的两段或多段单独的序列结合延伸合在一起而形成结合表面。
术语“进行突变”指的是在核酸序列中产生突变;当突变发生于蛋白编码区的情况下,将导致密码子改变,其可能会或可能不会产生氨基酸变化。
术语“突变”是指野生型核酸序列的序列中的变化或肽或多肽序列中的变化。这种突变可以是点突变,如转换或颠换。所述突变可能是缺失、***或重复。
如本文中所用的,简并“N,N,G/T”核苷酸序列表示32种可能的三联体,其中“N”可以是A、C、G或T。
如本文中所用的,简并“N,N,N”核苷酸序列表示64种可能的三联体,其中“N”可以是A、C、G或T。
如本文所用的术语“天然存在”所适用对象指的是可以在自然界中发现的对象的事实。例如,生物体(包括病毒)中存在的、可从自然界来源分离出的、尚未在实验室中被人为修饰的多肽或多核苷酸的序列是天然存在的。一般来说,术语天然存在指的是在非病理(未患病)个体中存在的对象,例如对于该物种是普遍的。
如本文中所用的,“核酸分子”由至少一个碱基或一个碱基对组成,这分别取决于其是单链或双链。此外,核酸分子可完全地或嵌合地(chimerically)属于任何含有核苷酸的分子,例如但不限于以下核酸分子的组:RNA、DNA、基因组核酸、非基因组核酸、天然存在和非天然存在的核酸及合成的核酸。非限制的实例包括与任何细胞器相关的核酸,如线粒体、核糖体RNA,以及由一种或多种不是与天然存在的成分一起天然存在的成分嵌合组成的核酸分子。
此外,“核酸分子”可以部分含有一种或多种非核苷酸成分,例如但不限于氨基酸和糖类。因此通过举例而非限制,部分基于核苷酸和部分基于蛋白的核酶被认为是“核酸分子”。
此外,通过举例被,由可检测的部分,如放射性或可替换的非放射性标记来标记的核酸分子,同样被认为是“核酸分子”。
术语“编码特定蛋白的核酸序列”或“特定蛋白的DNA编码序列”或“编码特定蛋白的核苷酸序列”--以及其他同义词--指的是当置于适当调控序列的控制下时转录并翻译成蛋白的DNA序列。“启动子序列”是在细胞内能够结合RNA聚合酶并启动下游(3'方向)编码序列转录的DNA调控区。启动子是DNA序列的一部分。该序列区在其3'端具有起始密码子。启动子序列的确包含最少数量的碱基,其中是对于在高于背景的可检测水平下启动转录的必要元件。然而,在RNA聚合酶结合该序列并在起始密码子处(含启动子的3'端)开始转录后,转录沿3'方向向下游进行。在启动子内将发现转录起始位点(通过核酸酶S1的图谱来方便地确定)以及负责RNA聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。
术语“编码蛋白的核酸”或“编码蛋白的DNA”或“编码蛋白的多核苷酸”和其他同义词涵盖只包括编码蛋白的序列的多核苷酸以及包括其他编码和/或非-Cq3编码序列的多核苷酸。
在一个优选的实施方案中,“具体核酸分子种类(species)”是由它的化学结构来限定的,例如但不限于,一级序列,在另一个优选的实施方案中,具体“核酸分子种类”是通过该核酸种类的功能或通过由该核酸种类衍生的产物的功能来限定的。因此,通过非限制性的实例,“具体核酸分子种类”可由一种或多种属于它的活性或特性来限定,包括属于其表达产物的活性或特性。
即时定义“将核酸工作样品组装成核酸文库”包括将核酸样品并入基于载体的集合(collection)中的过程,如通过连接到载体并转化宿主。相关载体、宿主和其他试剂及其具体非限制性实例将在下文中描述。本发明的即时定义“将核酸工作样品组装成核酸库”还包括将核酸样品并入非基于载体的集合中的过程,如通过连接适配子。优选适配子可以与PCR引物退火,以便促进PCR扩增。
因此,在非限制性的实施方案中,“核酸文库”由的一种或多种核酸分子的集合组成。在另一个优选的实施方案中,“核酸文库”由非基于载体的核酸分子的集合组成。在又一个优选的实施方案中,“核酸文库”由部分基于载体和部分非基于载体的核酸分子的组合集合组成。优选,根据单独的核酸分子种类,包含分子集合的文库是可搜索的且可分离的。
本发明提供了“核酸构建体”或可替换的“核苷酸构建体”或可替换的“DNA构建体”。本文使用的术语“构建体”用来描述可以任选化学结合一个或多个其它分子部分(如载体或载体的一部分)的分子,如多核苷酸(例如,植酸酶多核苷酸)。在具体的--但不是限制的--方面中,核苷酸构建体的实例为适合于宿主细胞转化的表达DNA的DNA表达构建体。
“寡核苷酸”(或同义地“寡”)指的是可以化学合成的单链多脱氧核苷酸或两条互补的多脱氧核苷酸链。这种合成寡核苷酸可以含有或不含有5′磷酸。除非在激酶存在下向ATP中添加磷酸,否则那些不含有5′磷酸的合成寡核苷酸不会与另一个寡核苷酸连接。合成寡核苷酸会连接没有被去磷酸化的片段。为了实现基于聚合酶的扩增反应(如PCR),需提及“由至少第一同源序列即简并N,N,G/T序列和第二同源序列串联组成的32倍简并寡核苷酸”。如本文中所用的“同源的”是指进行基于聚合酶的扩增反应的寡核苷酸和亲本多核苷酸之间的同源性。
如本文中所用的术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件按功能关系进行连接。当核酸被置于与另一个核酸序列的功能关系中时,则它被“可操作地连接”。例如,如果启动子或增强子影响到编码序列的转录,则它被可操作地连接于所述编码序列。可操作地连接是指将要连接的DNA序列通常是连续的,且如果对于连接两个蛋白编码区是必须的,则其是连续的且位于阅读框中。
RNA聚合酶将两条编码序列转录为一条mRNA时,编码序列与另一个编码序列“可操作地连接”,然后其被翻译成含有源自两条编码序列的氨基酸的单个多肽。该编码序列不必彼此连邻,只要所表达的序列最终被加工以产生所需的蛋白即可。
如本文中所用的术语“生理条件”指的是与活的生物体相适的和/或通常存在于活的培养酵母细胞或哺乳动物细胞内的温度、pH值、离子强度、粘度等生化参数。例如,在典型实验室培养条件下生长的酵母细胞中的胞内条件为生理条件。体外转录混合物的合适的体外反应条件通常为生理条件。一般而言,体外生理条件包括50-200mM NaCl或KCl,pH 6.5-8.5,20-45℃和0.001-10mM二价阳离子(例如,Mg++,Ca++);优选约150mM NaCl或KCl,pH7.2-7.6,5mM二价阳离子,且通常包括0.01-1.0%非特异性蛋白(例如,BSA)。常常存在非离子型去污剂(吐温,NP-40,Triton X-100),通常约0.001-2%,通常0.05-0.2%(v/v)。具体含水条件可以由操作者按照常规方法加以选择。对于一般性的指导,可以使用以下缓冲含水条件:10-250mM NaCl,5-50mM Tris HCl,pH 5-8,任选添加二价阳离子和/或金属螯合剂和/或非离子去污剂和/或膜组分和/或消泡剂和/或闪烁材料(scintillants)。
如本文中所用的术语“群”意思是组分(如,多核苷酸、其部分或多核苷酸或蛋白)的集合。“混合群”意思是属于同一核酸或蛋白家族(即相关的)但其序列不同(即不相同)并且因此生物活性不同的组分的集合。
具有“原形式(pro-form)”的分子指的是如下的分子,在获得与对照的原形式分子相比具有不同属性的(例如,活性增加)更成熟的分子形式的过程中,所述分子经过一种或多种共价和非共价化学修饰(例如,糖基化、蛋白酶剪切、二聚化或寡聚化、温度诱导的或pH诱导的构象变化、与辅因子结合等)的任意组合。在成熟分子的产生过程中,当两种或多种化学修饰(例如,两种蛋白质水解,或蛋白质水解和去糖基化)可区别开来时,该参照前体分子可以称为“原前体形式(pre-pro-form)”的分子。
“特性”可以描述任何特征,包括待优化蛋白或抗体的任何物理、化学或活性特征特性。例如,在某些方面中,待优化的预定特性、特征或活性可以选自:蛋白-蛋白聚集减少、蛋白稳定性增强、蛋白溶解度增加、蛋白pH稳定性增强、蛋白温度稳定性增强、蛋白溶剂稳定性增强、选择性增强、选择性下降、糖基化位点的引入、结合位点的引入、免疫原性下降、蛋白表达的增强、抗原亲和性增加、抗原亲和性下降、结合亲和性变化、免疫原性变化、催化活性变化、pH优化或特异性增强。待优化的其他特性或特征包括体内(例如,血清半衰期)和/或体外(例如,半衰期)抗体稳定性;抗体的解链温度(Tm)(例如,如通过差异扫描量热法(DSC)或本领域已知的其他方法测定)、抗体的pI(例如,如等电聚焦(IEF)或本领域已知的其他方法测定);溶解性;结合特性(例如,抗体-抗原结合常数,如Ka、Kd、Kon、Koff)、平衡解离常数(KD);抗体溶解性(例如,在药物学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂中的溶解性)、效应子功能(例如,抗体依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC));表达水平和产生水平(例如,来自细胞的抗体产量)。
“优化的”特性指的是与模板抗体相比,突变蛋白或抗体中具体特性的所需变化。在一个方面中,优化特性指的是其中相对于模板抗体,改进为约1%至500%,或相对于模板抗体,约2倍至1000倍。
如本文中所用的,术语“伪随机”指的是具有有限变化的一组序列,其具有有限的变异性,例如,在另一个位置上残基的变化程度,但在任何伪随机位置上允许一定程度的残基变化,然而这些变化是有限的。
如本文中所用的“准重复单元”指的是待重配的重复单元,且根据定义是不相同的。事实上,该方法不仅是为由相同的起始序列产生的几乎相同的编码单元而提出的,也是为那些可以在某些区域显著不同的相似或相关序列的重配而提出的。然而,如果该序列中含有足够的可以通过这种方法重配的(be reasserted)同源序列,它们可以称为“准重复”单元。
如本文中所用的“随机肽文库”指的是编码一组随机肽的一组多核苷酸序列,并指由那些多核苷酸序列编码的一组随机肽,以及含有那些随机肽的融合蛋白。
如本文中所用的,“随机肽序列”指的是由两个或多个氨基酸单体组成并通过随机(stochastic)或随机(random)方法构建的氨基酸序列。随机肽可以包括含有不变序列的框架或支架基序。
如本文中所用的,“受体”指的是对给定的配体具有亲和性的分子。受体可以为天然存在的或合成的分子。受体可以以未改变的状态或作为与其他物质的聚合物来使用。受体可以共价或非共价地,直接地或通过特异性的结合物质连接结合成员。受体的实例包括,但不限于,抗体,包括单克隆抗体和带有与特异性抗原决定簇反应的抗血清(如病毒、细胞或其他物质)、细胞膜受体、复合碳水化合物和糖蛋白、酶和激素受体。
“重组”蛋白指的是通过重组DNA技术产生的酶,即由编码所需蛋白的外源DNA构建体转化的细胞产生的。“合成”蛋白是通过化学合成制备的那些蛋白。
术语“相关的多核苷酸”意思是多核苷酸的区(region)或区域(area)是相同的,以及多核苷酸的区或区域是异源的。
如本文中所用的“减少性重配(reductive reassortment)”指通过由重复序列介导的缺失(和/或***)事件而产生的分子多样性的增加。
以下术语用来描述两个或多个多核苷酸之间的序列关系:“参照序列”、“比较窗口”、“序列同一性”、“序列同一性百分比”和“基本相同”。
“参照序列”是用作序列比较基础的限定序列;参照序列可以是较大序列的子集,例如,作为序列表中给出的全长cDNA或基因序列的片段,或可以包含完整的cDNA或基因序列。一般来说,参照序列的长度为至少为20个核苷酸,长度经常为至少25个核苷酸,通常长度为至少50个核苷酸。由于两个多核苷酸可以各自(1)包含在两个多核苷酸之间相似的序列(即,完整核苷酸序列的一部分),以及(2)还可以包含两个多核苷酸之间不同的序列,因此两个(或多个)多核苷酸之间的序列比较通常通过在“比较窗口”中比较两个多核苷酸序列从而确定和比较局部区域的序列相似性来进行。
如本文中所用的“重复指数(RI)”是克隆载体中含有的准重复单元的平均拷贝数。
术语“饱和”指的是其中在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置上进行各种可能变化的演化技术;然而,每个位置上的变化不是通过检测来确定的,但仅为统计学推测,其中估计出模板每个位置上发生的大多数可能的变化或几乎每种可能的变化。饱和诱变指的是使编码蛋白的基因区的DNA发生突变,其改变所述蛋白的密码子氨基酸序列,然后基于接近全面覆盖的统计学过-采样(over-sampling),从基本上所有突变体的表达突变体中筛选出改进的表型,但不保证全面覆盖。
术语“序列同一性”意思是在比较窗口中两个多核苷酸序列是相同的(即,基于核苷酸-核苷酸比对)。术语“序列同一性百分比”是通过以下方式计算:在所述比较窗口中比较两个最佳比对序列,确定两个序列中出现相同核酸碱基(例如,A、T、C、G、U或I)位置的数量,产生匹配的位置数量,用匹配的位置数量除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小),所得结果乘以100得到序列同一性百分比。如本文中所用的这个“基本相同”表示多核苷酸序列的特征,其中多核苷酸序列与至少25-50个核苷酸的比较窗口的参照序列相比,包含具有至少80%序列同一性,优选至少85%序列同一性,通常90至95%序列同一性,最通常至少99%序列同一性的序列,其中通过将参照序列与可以包括比较窗口中参照序列的总共20%或以下的缺失或添加的多核苷酸序列相比,计算序列同一性百分比。
术语“沉默突变”指的是不会导致所表达多肽中的氨基酸改变且基于氨基酸***的密码子使用的冗余的密码子变化。
本领域已知的两个蛋白之间的“相似性”是通过氨基酸序列和一个蛋白的保守氨基酸取代与第二个蛋白序列的比较来确定的。可采用本领域众所周知的方法来确定相似性,例如,BLAST程序(美国国家生物信息中心网站(National Center for BiologicalInformation)上的基础局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool))。
如本文中所用的术语“单链抗体”指的是多肽连接中包含VH域和VL域的多肽,通常通过间隔肽(例如,[Gly-Gly-Gly-Gly-Ser]x)连接,并且其可以在氨基-和/或羧基-端包括其他氨基酸序列。例如,单链抗体可以包含用于连接编码多核苷酸的粘连部分(tethersegment)。例如,scFv为单链抗体。单链抗体一般是基本上由免疫球蛋白超家族的基因编码的至少10个连续氨基酸的一个或多个多肽片段组成的蛋白(例如,参见Williams andBarclay,1989k pp.361-368,按引用将其并入本文中),最常见由啮齿动物、非人灵长类动物、禽类、猪、牛、绵羊、山羊或人类重链或轻链基因序列编码。功能性的单链抗体通常含有免疫球蛋白超家族基因产物的足够部分,从而保留了结合具体靶分子的特性,所述靶分子通常为受体或抗原(表位)。
如果一对分子(例如,抗体-抗原对或核酸对)的成员彼此结合的亲和性比与其他非特异性分子结合的亲和性更大,则将它们称为彼此“特异性结合”。例如,针对抗原而产生的抗体与所述抗原的结合比它与非特异蛋白的结合更有效,则该抗体可描述为与该抗原特异性地结合。(同样,如果通过碱基配对相互作用核酸探针与靶标形成特异性的双链体,则可描述为该核酸探针特异性地结合目标核酸(见上文))。
“特异性杂交”在本文中限定为在第一多核苷酸和第二多核苷酸(例如,具有与第一个多核苷酸不同,但基本上相同序列的多核苷酸)之间形成杂合体,其中在混合物中基本上不相关的多核苷酸序列不形成杂合体。
术语“具体多核苷酸”意思是具有确定的端点和具有确定的核酸序列的多核苷酸。两个多核苷酸,其中一个多核苷酸与第二个多核苷酸的一部分序列相同,但末端不同,则包含两个不同的具体多核苷酸。
“严格的杂交条件”意思是仅在序列之间具有至少90%,优选至少95%,更优选至少97%同一性时,才会发生杂交。参见Sambrook et al.,1989年,通过引用将其并入本文。
本发明还包括与多肽序列(如本文中公开的任一个SEQ ID NO的序列)“基本相同”的多肽序列。“基本相同”的氨基酸序列是与参照序列只有保守氨基酸取代不同的序列,例如,用一个氨基酸取代同一类的另一个氨基酸(例如,用一种疏水性氨基酸,如异亮氨酸、缬氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一种疏水性氨基酸,或一种极性氨基酸取代另一种极性氨基酸,如用精氨酸取代赖氨酸,用谷氨酸取代天门冬氨酸,或用谷氨酰胺取代天门冬酰胺)。
此外,“基本相同”的氨基酸序列是与参照序列不同的序列,其与参照序列的不同之处在于一个或多个非保守取代、缺失或***,特别是当这种取代发生在分子的非活性位点上时,且前提是多肽实质上保留了其行为特性。例如,植酸酶多肽上可以缺失一个或多个氨基酸,从而形成了没有显著改变其生物活性的多肽结构修饰。例如,可以除去对于植酸酶生物活性非必需的氨基或羧基端的氨基酸。这种修饰可导致活性较低的植酸酶多肽的形成。
本发明提供“基本上纯的蛋白”。如本文中所用的术语“基本上纯的蛋白”用来描述分子,如多肽(例如,植酸酶多肽或其片段),其基本上不含自然情况下与其相结合的其他蛋白、脂类、碳水化合物、核酸和其他生物材料。例如,基本上纯的分子,如多肽,可以占目标分子至少60%的干重。可以使用标准方法,包括,例如,聚丙烯酰胺凝胶电泳(例如,SDS-PAGE)、柱层色谱(例如,高效液相色谱(HPLC))和氨基端氨基酸序列分析,来确定多肽纯度。
如本文中所用的“基本上纯的”意思是目标物质是所存在的主要物质(即在摩尔量上,它比组合物中任何其他单独的大分子更丰富),优选地,基本上纯的级分是指组合物中,目标物占存在的所有大分子的至少约50%(在摩尔量上)。通常,基本上纯的组合物包含在组合物中存在的所有大分子的约80-90%或更多。更优选地,将目标物纯化成基本均一(采用常规检测方法检测不到组合物中的污染物),其中组合物基本上由一种大分子组成。溶剂物质、小分子(<500道尔顿)和元素离子物质不被认为是大分子。
发明详述
本公开内容提供了一种用于在哺乳动物细胞中产生增强的全长抗体的方法。提供了具有验证的高度框架多样性的人源化变体的文库,其不需要回复突变来保持初始亲和性。不需要CDR移植或噬菌体展示。在一个实施方案中,针对与供体抗体相比的抗原结合,在ELISA中筛选人源化抗体文库。在另一个实施方案中,使用基于细胞的筛选来确定生物活性。在另一个实施方案中,该方法包括与供体抗体相比的同种型转换。
抗体是一类在接触抗原后诱发的血清蛋白。它们特异性结合诱发它们形成的抗原。Male,Immunology(免疫学),Gower Medical Publishing,London,1986,pp.19-34。免疫球蛋白(Ig)是抗体的同义词。结构上,抗体分子具有由通过链内和链间二硫键和非共价键稳定和交联的两个相同的重链(HC)和两个相同的轻链(LC)组成的常规四多肽链结构。重链还具有共价碳水化合物部分。不同的抗体类别由四链结构的聚合物组成。重链具有5种主要的类型(γ、μ、δ、α、ε),并且由440-600个氨基酸残基组成。轻链有两种主要的类型(κ、λ),并且具有约220-230个氨基酸残基。重链和轻链都折叠成结构域。蛋白水解酶,如木瓜蛋白酶和胃蛋白酶,可以用于将抗体分子***成不同特征的片段。木瓜蛋白酶产生两个分开且相同的Fab片段(各自具有一个抗原结合位点)和一个Fc片段。胃蛋白酶产生一个F(ab’)2片段。Alberts et al.,Molecular Biology of the Cell(细胞分子生物学),2nd ed.(第2版),1989,Garland Publishing,Inc.
轻链(LC)和重链(HC)在其氨基末端都具有可变序列,但在其羧基末端具有恒定序列。轻链具有约110个氨基酸长的恒定区和相同大小的可变区。重链也具有约110个氨基酸长的可变区,但H链恒定区的长度为约330个或440个氨基酸,这取决于H链的类别。Albertset al.,Molecular Biology of the Cell(细胞分子生物学),2nd ed.(第2版),1989,Garland Publishing,Inc.,pp 1019。仅有部分可变区直接参与抗原的结合。研究已经表明,L和H链的可变区中的可变性对于大部分而言,限于每个链中的三个小的超变区(也称为互补性决定区或CDR)。可变区的剩余部分,称为框架区(FR),是相对恒定的。Albertset al.,Molecular Biology of the Cell(细胞分子生物学),2nd ed.(第2版),1989,Garland Publishing,Inc.,pp 1019-1020。
在优选的实施方案中,本公开内容的方法提供了全长人源化抗体分子,不是Fab或部分长度的片段。可以使用本领域的公知方法(参见,例如,Harlow和Lane,上文),以及如下进一步描述的,来制得这些抗体片段,其保留一些产生它们的抗体的选择性结合抗原的能力(例如,多肽抗原)。通过免疫亲和性层析,抗体可以用于分离制备数量的抗原。这样的抗体的各种其他用途是诊断疾病和/或将疾病分期(例如,肿瘤)和用于治疗性应用来治疗疾病,如,例如:肿瘤、自体免疫疾病、AIDS、冠心病、感染等。对于给予人类患者,嵌合、类人(human-like)、人源化或完全人抗体特别有用。
与公开内容的人源化方法相比,通过CDR移植进行人源化
通过CDR移植,或重塑进行人源化,涉及将来自每个免疫球蛋白链的小鼠CDR***人可变区的FW区内。
CDR移植的一种方法可以用于形成所谓的框架-修补(patched)免疫球蛋白(framework-patched immunoglobin),并且公开于Leung等的美国专利第7,321,026号,通过引用将其并入本文。与之前所述的人源化方法不同,以前的方法将来自供体的CDR移植至单个受体免疫球蛋白的框架上,修补框架片段(FR1、FR2、FR3和FR4)或FR,以替代亲本免疫球蛋白相应的FR。将这些来自不同免疫球蛋白和来自不同物种的FR的自由搭配混合,并进行匹配形成最终的免疫球蛋白链。利用来自供体免疫球蛋白的一个或多个互补性决定区(CDR)和来自一个或多个人或灵长类动物免疫球蛋白的框架序列的一部分,制备了免疫球蛋白链。通过非人抗体和人抗体模板之间的最佳同源性选择单独的FR序列。然而,这种方法是劳动密集的,并且不容易鉴定最佳框架区。
另一种CDR移植方法描述于Williamset al.,Antibody Engineering(抗体工程化),Vol.1,Chapter 21(第21章),Konterman and Dubel(eds.)Springer-Verlag BerlinHeidelberg 2010,pp.319中。通过非人抗体和人抗体模板之间的最佳同源性选择了FR序列。认为人可变区的选择是非常重要的。在公众数据库中存在超过9,000个重链和超过2,500κ抗体。这些包括Kabat、GenBank和IMGT数据库。通过将这些数据库用Kabat编号***比对并在需要的情况下引入缺口,将每个人可变区与小鼠序列的同一性进行评分。在FW区、标准VH-VK界面残基测定残基同一性,并从潜在重要的同一性模型鉴定出残基。此外,鉴定了FW区中的糖基化模式,其可以导致对抗体结合的糖基化-依赖性作用。通过最大化与小鼠抗体的序列同一性和同源性,将所得到的人可变区序列进行提炼。
Williams等(Willianms et al.2010)描述的典型的CDR移植策略,从来自小鼠B细胞杂交瘤的可变区cDNA的克隆和测序开始。利用cDNA序列制备了嵌合重链和轻链构建体。平行设计了CDR移植的人可变区,并且制备了CDR移植的人源化重链和轻链构建体。使用嵌合和/或人源化表达构建体在瞬时转染中表达重组抗体。测试了重组人源化抗体的抗原结合效力。如果效力低,通过用选定的框架小鼠残基取代来制备进一步人源化的抗体形式。目的是获得具有最佳抗原结合效力但具有最小小鼠框架区抗体的人源化抗体。这种通过CDR移植进行人源化的方法多少也是劳动密集的,可能需要多次重复来制备呈现出最合需要的特征的人源化抗体。
还涉及重塑来降低免疫原性的另一种人源化抗体的方法涉及合成组合文库,所述组合物文库包含框内融合于框架区子库的框架区的供体抗体的CDR。Wu等的US2010/0216975(Wu et al.US2010/0216975)中公开了这种称为抗体框架改组(framework-shuffling)的技术,通过引用将其并入本文。例如,Wu等制备了利用通过重叠延伸的聚合酶链式反应(PCR)按序组装的组合子文库。
本公开内容提供了快速人源化免疫原性降低的抗体的的技术;同时与供体抗体相比时,保持或提高抗原结合特异性和亲和性,并且同时优化蛋白表达。在一个方面中,不需要另外的亲和性成熟。
本公开内容提供了由模板抗体生产人源化抗体的方法,其中可变区或CDR源自模板抗体,而抗体的框架和恒定区源自一个或多个人抗体。在一个方面中,框架来自功能表达的人抗体的人框架集合。在另一个方面中,使用单个序列用于轻链和重链中的任一个或两个中的框架区4。在进一步的方面中,将编码框架4的序列包含在表达载体中。源自模板抗体的可变区或CDR与模板抗体的可变区或CDR优选具有约90%至约100%的同一性,尽管考虑了任何和所有修饰,包括取代、***和缺失,只要人源化抗体保持结合靶抗原的能力即可。
源自人抗体的人源化抗体的区域,不需要与人抗体具有100%同一性。在优选的实施方案中,保留尽可能多的人氨基酸残基,使得免疫原性可以忽略,但按照需要以及按照根据本发明的下文中教导,替代人残基,特别是框架区的残基。如本文中公开的这样的修饰是支持由CDR形成的抗原结合位点同时最大化抗体的人源化所需的。在一具体方面中,源自人框架集合的人源化抗体的框架区与人抗体具有100%同一性。
每个重链和轻链可变区含有三个组合形成抗原结合位点的CDR。三个CDR由四个FR区围绕,FR区的主要功能是支持CDR。可以通过根据Kabat(1987)在Sequences of Proteinsof Immunological Interest(免疫目标蛋白的序列),第4版,美国卫生和公众服务部(United States Department of Health and Human Services),U.S.GovernmentPrinting Office(美国政府印刷局),Washington,D.C.的计算机辅助比对或通过例如利用Levitt(1983)J.Mol.Biol.165:595所述的ENCAD程序的可变区分子建模来鉴定重链和轻链可变区序列内的CDR序列。
在一个实施方案中,CDR源自一个或多个模板抗体。重链CDR和轻链CDR的确定完全在本领域技术人员的能力范围内。参见,例如,http://www.bioinf.org.uk/abs/。
可以通过本领域已知的任何技术来修饰或演化人源化抗体的CDR序列,并且其可以包括***、取代和缺失,达到人源化抗体保持结合和靶向抗原的能力的程度。本领域普通技术人员可以通过进行下文中所述的功能实验来确定这种活性的保持。
可以将源自模板抗原的一个或多个CDR的人源化HC可变结构域编码文库和源自模板抗原的一个或多个CDR的人源化LC可变结构域编码文库与人恒定区和框架区结合,形成人源化抗体。编码本发明的人源化抗体、片段和区域的恒定(C)区的人基因可以通过已知的方法源自人胎肝文库。人C区基因可以源自任何人细胞,包括表达和产生人免疫球蛋白的那些。人CH区可以源自任何已知的人H链的类别或同种型,包括γ、μ、α、δ、ε及其亚型,如G1、G2、G3和G4。因为H链同种型负责抗体的各种效应子功能,因此通过所需的效应子功能(如,补体固定)或抗体依赖性细胞细胞毒性(ADCC)中的活性来指导CH区的选择。优选,CH区源自γ1(IgG1)
人CL区可以源自人L链同种型,κ或λ,优选κ。
通过标准克隆技术从人细胞获得编码人免疫球蛋白C区的基因(Sambrook etal.,(Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册),2nd Edition(第2版),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)and Ausubel etal.,eds.Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学通用实验方案)(1987-1993))。可以容易地从含有表示两类L链、五类H链及其亚类的基因的已知克隆获得人C区基因。可以通过设计适当平截的嵌合H链基因来制备嵌合抗体片段,如F(ab’)2和Fab。例如,编码F(ab’)2片段的H链部分的嵌合基因将包括编码H链的CH1结构域和铰链区的DNA序列,接着是翻译终止密码子,以产生平截的分子。
通常,在一个实例中,通过克隆编码包含模板抗体的一个或多个CDR的H和L链抗原结合区的DNA片段,并且将这些DNA片段分别连接于包括CH和CL区的DNA片段,产生全长嵌合免疫球蛋白编码基因,从而制得本发明的人源化抗体、片段和区域。
可以通过***、取代和缺失来修饰抗体可变区的序列,只要嵌合抗体保持结合和抑制靶抗原的能力即可。本领域普通技术人员可以通过进行合适的功能测定来确定这种活性的保持。
可以使用用于工程化或人源化非人或人抗体的方法,并且所述方法是本领域公知的。通常,人源化或工程抗体具有一个或多个来自非人来源的残基,所述非人来源例如,但不限于,小鼠、大鼠、兔子、非人灵长类动物或其他哺乳动物。这些人氨基酸残基常常称为“输入”残基,其通常取自已知人序列的“输入”可变结构域、恒定结构域或其他结构域。公开了已知的人Ig序列,例如,
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这样的输入序列可以用于降低免疫原性或降低、增强或修饰结合、亲和性、结合速率(on-rate)、解离率(off-rate)、亲合力、特异性、半衰期或任何其他合适的特征,如本领域已知的。通常,保持部分或全部非人或人CDR序列,同时用人或其他氨基酸替代可变和恒定区的非人序列。还可以任选将抗体人源化,保留对抗原的高亲和性和其他有利的生物特性。为了实现这个目的,任选通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的,并且是本领域技术人员熟悉的。可以使用计算机程序,其说明和展示选定的候选免疫球蛋白序列可能的三维构象结构。这些展示的观察使得可以分析残基在候选免疫球蛋白序列功能中的可能作用,即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原能力的残基。这样,可以从共有序列和输入序列中选择和组合FR残基,以获得所需的抗体特征,如提高的对目标抗原的亲和性。通常,CDR残基直接并且大部分基本上涉及影响抗原结合。可以使用任何已知方法进行本发明抗体的人源化或工程化,如但不限于以下文献中所述的方法:Winter(Joneset al.,Nature321:522(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323(1988);Verhoeyen et al.,Science239:1534(1988)),Sims et al.,J.Immunol.151:2296(1993);Chothia and Lesk,J.Mol.Biol.196:901(1987),Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89:4285(1992);Presta et al.,J.Immunol.151:2623(1993),U.S.Pat.Nos.5,723,323,5,976,862,5,824,514,5,817,483,5,814,476,5,763,192,5,723,323,5,766,886,5,714,352,6,204,023,6,180,370,5,693,762,5,530,101,5,585,089,5,225,539;4,816,567,PCT/:US98/16280,US96/18978,US91/09630,US91/05939,US94/01234,GB89/01334,GB91/01134,GB92/01755;WO90/14443,WO90/14424,WO90/14430,EP 229246,通过引用将每篇文献全部并入本文中,包括其中引用的参考文献。
本发明人源化抗体的人恒定区可以是任何类别(IgG、IgA、IgM、IgE、IgD等)或同种型,并且可以包含κ或λ轻链。在一个实施方案中,人恒定区包含IgG重链或限定的片段,例如,同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4中的至少一个。在另一个实施方案中,人源化人抗体包含IgG1重链和IgG1K轻链。本发明的分离人源化抗体还包含由任何合适的多核苷酸编码的本文中公开的抗体氨基酸。优选,人源化抗体结合目标抗体,并由此部分或基本上中和蛋白的至少一种生物活性。
在一个方面中,人源化抗体将包含源自模板抗体的抗原结合区,其包含至少一个人互补性决定区(CDR1、CDR2和CDR3)或至少一个重链可变区的变体和至少一个人互补性决定区(CDR4、CDR5和CDR6)或至少一个轻链可变区的变体。
在具体实施方案中,抗体或抗原结合片段可以具有抗原结合区,其包含至少一个具有相应CDR1、2和/或3的氨基酸序列的重链CDR(即,CDR1、CDR2和/或CDR3)的至少一部分。在另一个具体实施方案中,抗体或抗原结合部分或变体可以具有抗原结合区,其包含至少一个具有相应CDR4、5和/或6的氨基酸序列的轻链CDR(即,CDR4、CDR5和/或CDR6)的至少一部分。在一个实施方案中,抗体或抗原结合片段的三个重链CDR和三个轻链CDR具有模板抗体的相应CDR的氨基酸序列。可以通过使用常规技术以化学方式将抗体的各个部分(例如,CDR、框架)连接在一起、通过使用常规重组DNA技术制备和表达编码抗体的(即,一个或多个)核酸分子或通过使用任何其他合适的方法和使用任意会导致本发明多肽表达的可能冗余密码子,来制备这样的抗体。
在另一个实施方案中,本公开内容提供了一种人源化抗体的方法,其包括在真核细胞生产宿主中表达全长抗体;该方法包括选择模板抗体;演化一个或多个来自模板抗体的CDR序列,以产生一个或多个CDR片段文库;将CDR片段文库与来自功能表达的抗体的人框架集合连接,其中利用来自池的每个框架区4的单个序列;针对至少一种预定的特性、特征或活性,筛选变体抗体;基于与模板抗体相比,免疫原性的降低和对抗原的亲和性,从一组突变抗体中选择变体人源化抗体。在一个方面中,针对与模板抗体相比的至少一种其他预定的特性、特征或活性,如表达水平,优化一个或多个变体人源化抗体;并且在与任何商业规模的演化步骤中相同的真核细胞生产宿主中表达抗体。在一个方面中,基于(1)与模板抗体相比免疫原性降低;(2)与模板抗体相比,至少一种预定的抗原结合特性、特征或活性的优化;和(3)与文库中的其他人源化抗体相比时高水平表达,从人源化抗体文库中选择人源化抗体。
在一个实施方案中,本公开内容的方法包括选择针对具体目标抗原的模板抗体。模板抗体可以是一个或多个特征期望得到改善或优化的现有小鼠单克隆抗体,或嵌合抗体,或甚至现有的人源化抗体。
在一个方面中,将模板抗体克隆并测序,以鉴定重链和轻链免疫球蛋白可变部分的FW1、CDR1、FW2、CDR2、FW3、CDR3和任选FW4的序列。
可以通过本领域已知的任何方式来制备编码通过从模板演化任何抗体的方法衍生的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个变体的dsDNA的片段文库。具体而言,双链DNA片段文库包含互补性决定区(CDR)片段编码文库,包括编码源自模板抗体的HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个或多个的全部或部分的片段。在一个方面中,用于HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3中的一个、两个、三个、四个或五个的文库可以含有包含模板抗体上相应区域序列的单个成员。
在另一个方面中,演化步骤包括演化技术。对编码模板抗体或其片段(如,CDR片段)的核酸序列进行任何演化方法,来制备抗体或片段文库。在一个方面中,通过全面蛋白工程化的方法进行演化,以最终产生一组突变抗体。全面蛋白工程化的方法可以选自,例如,全面位置演化(CPETM)、全面蛋白合成(CPSTM)、弯曲演化(Flex Evolution)、协同演化、全面位置***演化(CPITM)或全面位置缺失演化(CPDTM)中的一种和组合。这些技术详细公开于2010年7月16日提交的PCT/US2010/42302中,并且通过引用将其并入本文中。在另一个方面中,在用于产生人抗体文库的相同哺乳动物***中表达突变抗体。
在另一个实施方案中,针对具体靶抗原选择模板杂交瘤或重组抗体;进行模板抗体的一个或多个CDR的演化,以最终提供一组突变抗体,其例如通过使用哺乳动物细胞***中的抗体细胞表面展示来筛选;和在与筛选所用的相同哺乳动物细胞***中进行制造。
在另一个实施方案中,在制造宿主中将选定的模板杂交瘤/重组抗体人源化并筛选,接着在制造宿主中生产,其中优化(演化)步骤完全省略。
在本发明的其他方面中,通过演化抗体的Fc区、抗体中的沉默密码子和/或蛋白表达所用的载体和/或宿主基因,进行制造宿主中的下游表达优化。在一个方面中,通过任何演化技术来产生Fc文库。在表达优化的一个具体方面中,对抗体的Fc结构域进行全面演化,以形成可以用于选择用于任何Fv的最佳伴侣的Fc突变体文库。为了将所有Fc变体快速连接至每个新的Fv区,对优化进行设计。或者,这些Fc的子集可以用于连接于不同的Fv。为了最佳表达,作为哺乳动物细胞(例如,CHO,成本有效介质)中表达的全长抗体来筛选这些Fc变体/Fv组合中的每一个。此外,为了提高表达,可以在哺乳动物细胞中进行CPS,来筛选这些CPE苗头(hit)的多达12个或更多的所有理论排列。还可以选择具体的所需密码子变化来鉴定表达提高的克隆。鉴定沉默密码子,并且对这些位置进行CPE。筛选该CPE文库来鉴定最佳表达苗头。此外,高达12个或更多CPE苗头的所有理论排列都可以用于CPS方法中,来产生可以在哺乳动物细胞中筛选表达提高的新的文库。用顶端CPS沉默突变苗头来定制用于在具体细胞系和介质中的最佳表达的蛋白。这给生物仿制药精细结构控制提供了机会。
用于增强表达的其他方面包括:载体的优化,包括启动子、剪接位点、5’和3’末端、侧翼序列、基因缺失和重排的降低、宿主细胞基因活性的提高、宿主糖基化酶的优化以及全染色体宿主细胞诱变和选择。已经证明了5’氨基酸序列对于表达的增强是重要的。
前导候选物的演化
在另一个方面中,任何蛋白演化方法都可以用于同时演化抗体性能和表达优化。蛋白性能的优化可以包括各种特征的改善,如亲和性、药物动力学特征、组织靶向、蛋白-蛋白聚集、定址高试验可变性和修饰其他体内特征。
用于演化分子(包括本发明的模板抗体)的方法,包括随机和非随机方法。公开的方法包括随机和非随机诱变方法。这些方法中的任何一种可以用来将公开内容的人源化抗体进一步朝所需特征演化,如在不同的温度或pH环境中更好的稳定性,或在宿主细胞中更好的表达。在演化实验中,可以选择其他潜在的所需特性,如提高的催化活性、在各种条件下提高的稳定性、提高的选择性和/或溶解性和通过特征(如,降低的聚集)的提高而提高的表达结果。
可以在用于治疗性蛋白下游生产的真核宿主中直接进行演化,如哺乳动物细胞宿主或酵母细胞宿主。可以在用于筛选和/或演化以及制造的相同宿主中,为了最佳表达来演化候选物。可以通过以下方式实现表达优化:优化所用的载体(载体成分,如启动子、剪接位点、5’和3’末端和侧翼序列)、降低基因缺失和重排的宿主细胞基因修饰、通过演化相关基因的体内或体外方法演化宿主细胞基因活性、通过演化相关基因优化宿主糖基化酶和/或通过全染色体宿主细胞诱变和选择策略来选择具有表达能力增强的细胞。本文中将进一步描述宿主细胞。
针对待制造的候选物,可以利用细胞表面展示表达和筛选技术(例如,如上所限定的)筛选演化蛋白的文库。
广泛用于从起始分子形成可替换蛋白的现有方法是寡核苷酸定向诱变技术、易错聚合酶链式反应和盒式诱变,其中用合成的诱变寡核苷酸替代待优化的特定区域。在这些情况中,在原始序列的某些位点周围产生了多个突变位点。
在寡核苷酸定向诱变中,用合成的诱变寡核苷酸替代短的序列。易错PCR使用低保真度聚合条件,以在长序列中引入低水平的点突变。在未知序列片段的混合物中,易错PCR可以用来诱变混合物。在盒式诱变中,单个模板的序列模块通常被(部分)随机化序列替代。
已经通过使用由限制酶产生的相容粘末端连接2个多核苷酸片段制得了嵌合基因,其中每个片段源自分开的祖先(或亲本)分子。另一个实例是亲本多核苷酸中的单个密码子位置的诱变(即,实现密码子取代、添加或缺失),以产生编码单位点诱变多肽的单个子代多核苷酸。
此外,体内位点特异性重组***已经用于产生基因杂合体,以及体内重组的随机方法和质粒上同源但截短的基因之间的重组。还报道了可以通过重叠延伸和PCR来诱变。
非随机方法已经用于实现更大数量的点突变和/或嵌合,例如,全面或无遗漏的方法已经用于在具体突变组内产生所有分子物质,用于将功能性归因于模板分子中的特定结构基团(例如,特定的单个氨基酸位置或由两个或多个氨基酸位置组成的序列),和用于归类和比较特定的突变组。发明名称为“Whole cell engineering my mutagenizing asubstantial portion of a starting genome,combining mutations,and optionallyrepeating(完整细胞工程化my诱变起始基因组的实质性部分、组合突变和任选重复)”的美国专利号7033781描述了一种将生物体朝向所需特征演化的方法。发明名称为“Saturationmutagenesis in directed evolution(定向演化中的饱和诱变)”的美国专利号6764835和发明名称为“定向演化中合成连接组装(Synthetic ligation reassembly in directedevolution)”的美国专利号6562594描述了无遗漏地演化和筛选所需分子特征的方法。任何这样的方法可以用于本发明的方法中。
之前已知的“饱和诱变”方法和本文中优选的“全面”演化技术之间存在差别。饱和诱变指的是在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置形成每个可能变化的演化技术;然而每个位置的变化并没有通过测试来证实,而仅仅是通过统计学假定的。全面演化指的是在模板多核苷酸或模板多肽的每个位置形成每个可能变化的演化技术,并且对多核苷酸或多肽进行测试,以证实已经形成了预期的变化。
在另一个实施方案中,CPE/EvoMap可以用于鉴定和研发完全可突变的位点。在一个方面中,将多个完全可突变位点的开发称为弯曲演化,并且用于形成靶向变化,如引入用于糖基化的位点(例如,N-或O-连接的糖基化的氨基酸的密码子;共有序列Asn-Aa-Ser-Thr或Ser/Thr内的Asn)和用于化学缀合的位点。弯曲演化还可以用于设计蛋白酶切割位点、引入用于纯化和/或检测的标签、位点特异性标记等情况中。此外,沉默突变的密码子优化可以用于提高蛋白表达。在这个实施方案中,所述的弯曲演化,在蛋白表达后,针对至少一种与模板多肽相比的预定特性、特征或活性,重新筛选所产生的突变多肽文库。在一个方面中,预定的特性包括蛋白-蛋白聚集的减少、蛋白稳定性的增强,或蛋白溶解性提高。在一个方面中,同时针对两种或多种特性,筛选突变多肽文库。在另一个方面中,糖基化的任何真核表达***可以用于为例如哺乳动物、织物、酵母和昆虫细胞系引入糖基化位点。
在弯曲演化技术中,将相关蛋白或模板蛋白或多肽的生物信息学和蛋白x-射线晶体结构的评价用于模板优化。在一个方面中,选定的位点不在接触残基处。在另一个方面中,非表面蛋白突变的选择使得免疫原性风险降低。
弯曲演化的应用包括但不限于,减少蛋白-蛋白聚集、提高蛋白稳定性、通过糖基化文库优化药物动力学、优化蛋白二级和三级结构以及直接通过突变安置或间接通过糖基化遮掩使抗原位点去免疫化。
在弯曲演化的一个方面中,用EvoMapTM鉴定完全可突变位点,通过将糖基化残基***完全可突变位点中(或用于翻译作用的沉默突变)来进行CPS产生,并且通过分析型分析(例如,质谱分子、动态光散射)、免疫原性降低(通过生物信息学或试验)和/或药物动力学分析(例如,在Foxn1nu小鼠中)来进行组合糖基化文库的筛选。
在一个方面中,弯曲演化可以用于去免疫,以消除免疫原性,同时保持功能。可以通过用糖基化屏蔽免疫原性,鉴定可以消除免疫原性同时维持功能的人体细胞高度突变谱氨基酸取代,降低用于避免免疫原性潜能的剂量和最小化非表面氨基酸残基变化,来进行弯曲演化去免疫。此外,免疫原性数据库和算法可以用于鉴定和替代潜在的MHC结合表位。在一个方面中,将硅中计算机模拟(in silico)修饰预测结合CPE/CPS来产生变体。
可以通过本领域已知技术来测量降低的产生T-细胞表位和/或去免疫的倾向。优选,可以通过T细胞增殖试验在体外测试蛋白的去免疫。在该试验中,针对应答野生型或去免疫肽的增殖,筛选来自代表世界上>80%的HLA-DR等位基因的供体的PBMC。理想的是,只在用野生型肽装载抗原递呈细胞时检测细胞增殖。用于去免疫的其他试验包括人体外PBMC再刺激试验(例如,干扰素γ(TH1)或IL4(TH2)ELISA。或者,可以通过表达代表所有单元型的四聚体来测试去免疫。为了测试去免疫的肽是否在HLA-DR单元型上递呈,可以测量例如荧光标记的肽在PBMC上的结合。测量HLA I类和II类转基因小鼠对靶抗原(例如,干扰素γ或IL4)的应答。或者,用来自PBMC和/或转基因小鼠试验的驯化T细胞(MHCI 9mer;MHC II20mer)筛选表位文库。此外,可以通过测定抗去免疫分子的抗体在给药后是否在患者中产生来证明去免疫。
在一个方面中,本发明公开了利用蛋白工程化方法来产生在真核细胞中表达提高的沉默突变密码子优化的Fc变体。沉默突变是其中DNA序列的变异没有导致蛋白氨基酸序列变化的突变。在一个方面中,在恒定区中进行密码子诱变,用于优化真核细胞表达。表达特性改善同时保持介导效应子功能能力的密码子优化的Fc变体提高了治疗性抗体的产生。在这个方面中,例如,为了在不同表达宿主中筛选,例如利用CHO、HEK293和COS-7的哺乳动物细胞系表达筛选,可以对抗体分子的恒定区进行演化。
全面位置***演化
在一个实施方案中,本公开内容提供了鉴定由模板抗体形成或基于模板抗体形成的突变多肽和对其作图的方法。使用直链肽作为简单实例,在第一步中,通过本文中称为全面位置***(CPITM)演化的方法,产生从位置2至n(n对应于多肽链中的残基数)的每个密码子的一组天然存在的氨基酸变体(或其子集,或氨基酸衍生物)。
在CPITM中,在整个模板多肽的每个氨基酸后***氨基酸,一次一个,以产生一组延长的多肽。CPI可以用于一次***1、2、3、4或多达5个新位点。在每个新位置,添加20种氨基酸中的每一种,一次一个,从而在模板中添加的每个新位置形成一组20个不同的分子。在这种情况中,跳过位置1,其是甲硫氨酸或不变的。对于靶分子的每个多肽链重复该程序。最小组的氨基酸突变只含有用于20种天然氨基酸的每一种的一个密码子。
本发明涉及鉴定由模板多肽形成的或基于模板多肽形成的突变多肽和对其作图的方法。通常,多肽会包含n个氨基酸残基,其中该方法包括(a)产生n+[20x(n-1)]个分开的多肽,其中每个多肽与模板多肽的不同之处在于,其在模板中的每个位置后***了20种氨基酸中的每一种,一次一个;试验每个多肽的至少一种预定的特性、特征或活性;和(b)对于每个成员,鉴定所述特性、特征或活性相对于模板多肽的任何变化。
在一个实施方案中,选择一个或多个区域用于诱变,以如上所述,一次添加一个位置。在这样的情况中,n表示模板多肽的子集或区域。例如,在多肽是抗体的情况中,将整个抗体或抗体的一个或多个互补性决定区(CDR)进行诱变,以在模板多肽的每个位置后一次添加一个位置。
因此,本发明包括对一组由具有至少一个并且优选六个互补性决定区(CDR)的模板抗体形成的突变抗体进行作图的方法,CDR共同包含n个氨基酸残基,所述方法包括(a)产生n+[20x(n-1)]个分开的抗体,其中每个抗体与模板抗体的不同之处在于,其已经在模板序列中的每个位置后***了单个预定位置,一次一个;(b)试验每组的至少一种预定的特性、特征或活性,和(c)对于每个成员,鉴定特性、特征或活性相对于模板多肽的任何变化。对于抗体,预定的特性、特征或特性可以是例如结合亲和性和/或免疫原性。
此外,提供了生产一组由具有至少一个互补性决定区(CDR)的模板抗体形成的突变抗体的方法,CDR包含n个氨基酸残基,该方法包括:(a)产生n+[20x(n-1)]分开的抗体,其中每个抗体与模板抗体的不同之处在于,其在CDR的单个预定位置具有添加的额外氨基酸。在另一个实施方案中,抗体包含六个CDR,并且CDR共同包含n个氨基酸残基。
在另一个实施方案中,为了鉴定特性、特征或活性相对于缩短多肽的变化,在筛选后,将上述新的延长的多肽进一步突变和作图。通常,延长的多肽将包含n个氨基酸残基,其中该方法包括(a)产生n个(在初始残基是甲硫氨酸的情况中,n-1个)分开的多肽组,每个组都包含在多肽单个预定位置具有X个不同预定氨基酸残基的成员多肽;其中每组多肽的单个预定位置不同;试验每组的至少一种预定的特性、特征或活性;(b)对于每个成员,鉴定所述特性、特征或活性相对于模板多肽的任何变化;和任选(c)形成反映出这些变化的功能图。优选,所产生的不同成员多肽的数量等于n x X(或[n-1]x X,视情况而定)。
在可替换的方案中,该方法包括产生单个群,其包含来自延长多肽的几组突变多肽。在这个实施方案中,筛选整个新群,鉴定单独的成员,并产生功能图。
通常,在使用每种天然存在氨基酸的情况中,X将是19(表示20种天然存在氨基酸残基,并且排除模板多肽的给定位置中存在的特定残基)。然而,从头到尾可以使用任何氨基酸子集,并且每组多肽可以被用于整个群的总的X的全部或子集取代。
然而,应当认识到,每个表达***可能遇到密码子偏好,其中不足的tRNA集合导致翻译停止、早熟性翻译终止、翻译移码和氨基酸错误***。因此,为了表达优化,每组含有多达63个不同的密码子。
然后针对至少一种,并且优选两种或多种所需的特征,如改善的功能;中性突变、抑制突变和表达,筛选每个氨基酸组。
在一个方面中,可以对延长的多肽进行作图,以鉴定导致相对于“野生型”的缩短多肽的特性、特征或活性的变化。对于完整的多肽或“靶分子”,将每组的数据组合。然后可以按照本文中所述的,将来自延长多肽(靶分子)筛选的苗头用于进一步的全面诱变链和筛选。来自诱变的数据提供了所产生的靶分子的详细功能图(在本文中称为EvoMapTM)。该图含有每个突变怎样影响靶分子的性能/表达的详细信息。其可以允许鉴定在蛋白功能(或在抗体的情况中,抗原/受体结合)没有丢失的情况下未发生变化的所有位点。还显示出可以在哪发生变化而没有影响功能。
在另一个方面中,CPE可以用于在每个目标位置产生5、10、多达15,或多达全部19种氨基酸的文库。
全面位置缺失演化
全面位置缺失演化(CPDTM)涉及鉴定由模板多肽形成的或基于模板多肽形成的突变多肽或对其作图的方法。CPD演化缺失蛋白中的每个氨基酸,一次一个位置。通常,多肽会包含n个氨基酸残基,其中该方法包括(a)产生n-1个(在其中初始残基是甲硫氨酸的情况中,n-2个)分开的多肽,其中每个多肽与模板多肽的不同之处在于,其缺少单个预定位置;试验每个多肽的至少一种预定的特性、特征或活性;和(b)对于每个成员,鉴定所述特性、特征或活性相对于模板多肽的任何变化。
在CPD演化的一个实施方案中,选择一个或多个区域用于诱变,以一次除去一个位置。在这样的情况中,n表示模板多肽的子集或区域。例如,在多肽是抗体的情况中,将完整的抗体或抗体的一个或多个互补性决定区(CDR)进行诱变,以在模板多肽中一次除去一个位置。
在一个实施方案中,因此CPD包括对一组由具有至少一个并且优选六个互补性决定区(CDR)的模板抗体形成的突变抗体作图的方法,CDR共同包含n个氨基酸残基,该方法包括(a)产生(n-1)个分开的抗体,其中每个抗体与模板抗体的不同之处在于缺少单个约定的位置;(b)试验每组的至少一种预定的特性、特征或活性;和(c)对于每个成员,鉴定相对于模板抗体的特性、特征或活性的任何变化。对于抗体,预定的特性、特征或特性可以是例如结合亲和性和/或免疫原性。
CPD演化的一个方面包括产生一组由具有至少一个互补性决定区(CDR)的模板抗体形成的突变抗体的方法,CDR包含n个氨基酸残基,该方法包括:(a)产生n-1个分开的抗体,其中每个抗体与模板抗体的不同之处在于缺少CDR的单个预定位置。在另一个实施方案中,抗体包含六个CDR,并且CDR共同包含n个氨基酸残基。
在CPD演化的另一个实施方案中,在鉴定特性、特征或活性相对于缩短多肽的变化的筛选后,将上述的新缩短多肽进一步突变和作图。通常,缩短的多肽将包含n个氨基酸残基,其中该方法包括(a)产生n(在其中初始残基是甲硫氨酸的情况中,n-1个)组分开的多肽,每个组包含在多肽单个预定位置具有X个不同预定氨基酸残基的成员多肽;其中每组多肽的单个预定位置不同;试验每组至少一种预定的特性、特征或活性;(b)对于每个成员,鉴定所述特性、特征或活性相对于模板多肽的任何变化;和(c)形成反映这些变化的功能图。优选,所产生的不同成员多肽的数量等于n x X(或[n-1]x X,视情况而定)。
在可替换的方案中,CPD方法包括产生单个群,其包含来自缩短多肽的几组突变多肽。在这个实施方案中,筛选完整的新群,鉴定单独的成员,并产生功能图。通常,在使用每种天然存在氨基酸的情况中,X将是19(表示20种天然存在氨基酸残基,并且排除模板多肽的给定位置中存在的特定残基)。然而,从头到尾可以使用任何氨基酸子集,并且每组多肽可以被用于整个群的总的X的全部或子集取代。
任何突变或合成方法都可以用于在CPD演化中产生突变体组。在一个实施方案中,多肽的产生包括(i)将编码模板多肽的含密码子多核苷酸进行基于聚合酶的扩增,使用待诱变的每个密码子的64-倍简并寡核苷酸,其中每个64-倍简并寡核苷酸由第一个同源序列和简并N,N,N三联体序列组成,使得产生一组子代多核苷酸;和(ii)将该组子代多核苷酸进行克隆扩增,使得由子代多核苷酸编码的多肽得到表达。
在CPD演化的一个实施方案中,将整个缩短的多肽进行饱和诱变。在另一实施方案中,选择饱和诱变的一个或区域。在这类情况下,n表示模板多肽的组或区域。例如,如果多肽是抗体,则将整个抗体或上述抗体的一个或多个互补性决定去(CDR)进行饱和诱变。
因此,CPD演化公开内容包括对一组由具有至少一个并优选六个互补性决定区(CDR)的缩短模板抗体形成的突变抗体作图的方法,CDR共同包含n个氨基酸残基,该方法包括(a)产生n组分开的抗体,每组包含成员抗体,所述成员抗体在CDR的单个预定位置具有X个不同预定氨基酸残基;其中每组抗体的单个预定位置不同;并且所产生的不同成员抗体的数量等于n x X;(b)试验每组至少一种预定的特性、特征或活性;(c)对于每个成员,鉴定特性、特征或活性相对于模板抗体的任何变化;和(d)形成这些变化的结构位置图。对于抗体,预定的特性、特征或特性可以是结合亲和性和/或免疫原性。如上所示,在可替换的方案中,可以产生包含所有突变抗体组的单个群。
此外,提供了产生一组由具有至少一个互补性决定区(CDR)的缩短模板抗体形成的突变抗体的方法,CDR包含n个氨基酸残基,该方法包括:(a)产生n组分开的抗体,每组包含成员抗体,所述成员抗体在CDR的单个预定位置具有X个不同的预定氨基酸残基;其中每组抗体的单个预定位置不同;并且所产生的不同成员抗体的数量等于n x X。在另一个实施方案中,抗体包含六个CDR,并且CDR共同包含n个氨基酸残基。
组合蛋白合成
组合蛋白合成(CPSTM)涉及组合来自任何演化技术的单个苗头,以组合两个或多个突变。
核酸分子
使用本文中提供的信息,如编码来自模板抗体或其特定片段、变体或共有序列的相邻CDR氨基酸序列的至少一个的至少70-100%的核苷酸序列,或包含这些序列中的至少一个的保藏载体,使用本文中所述的或本领域已知的方法,可以获得本发明的编码至少一种抗-抗原抗体的核酸分子。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式,如mRNA、hnRNA、tRNA或任何其他形式,或DNA形式,包括但不限于,通过克隆获得或合成产生的cDNA和基因组DNA,或其任意组合。DNA可以是三链的、双链的或单链的,或其任意组合。在一个实施方案中,DNA是双链的。DNA或RNA的至少一条链的任何部分可以是编码链,也称为有义链,或可以是非编码链,也称为反义链。
本发明的分离核酸分子可以包括包含开放阅读框(ORF)的核酸分子,任选具有一个或多个内含子,例如,但不限于,至少一个CDR的至少一个特定部分,如至少一个重链或轻链的CDR1、CDR2和/或CDR3;包含模板抗体或可变区的编码序列的核酸分子和包含编码模板抗体变体的核苷酸序列的核酸分子。当然,遗传密码是本领域公知的。因此,产生这样的编码特定抗-抗原(例如,本发明的人源化抗体)的简并核酸变体是本领域技术人员的常规技术。参见,例如,Ausubel,et al,上文,并且这样的核酸变体包括在本发明中。本发明的分离核酸分子的非限制性实例包括各自编码HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2、LCCDR3、HC可变区和LC可变区的全部或部分的核酸片段。
如本文中所示,通过本公开内容的方法制备的包含编码模板抗体变体的核酸的核酸分子可以包括,但不限于,独立编码抗体片段的氨基酸序列的那些,完整抗体或其部分的编码序列,抗体、片段或部分编码序列,以及其他序列,如至少一个信号前导肽或融合肽的编码序列,具有或不具有上述其他编码序列,如至少一个内含子,与其他的非编码序列一起,其他的非编码序列包括但不限于,非编码5’和3’序列,如在转录、mRNA加工中起作用的转录的、非转录的序列,包括剪接和聚腺苷酸化信号(例如,mRNA的核糖体结合和稳定性);编码其他氨基酸序列的其他编码序列,如提供其他功能的那些。因此,编码抗体的序列可以与标记物序列融合,如编码促进包含抗体片段或部分的融合抗体的纯化的肽的序列。
与本文中所述的多核苷酸选择性杂交的多核苷酸
本发明提供在选择性杂交条件下与本文公开的多核苷酸杂交的分离核酸。因此,该实施方案的多核苷酸可以用于分离、检测和/或定量包含这些多核苷酸的核酸。例如,本发明的多核苷酸可以用于鉴定、分离或扩增保藏文库中的部分或全长克隆。在一些实施方案中,多核苷酸是从人或哺乳动物核酸文库分离的或与其cDNA互补的基因组或cDNA序列。
优选,cDNA文库包含至少80%全长序列,优选至少85%或90%全长序列,并且更优选至少95%全长序列。可以将cDNA文库标准化来提高稀有序列的表现度。对于相对于互补序列具序列同一性降低的序列,通常但不是排他地使用低或中等严格杂交条件。对于同一性更高的序列,任选使用中等和高严格条件。低严格条件允许具有约70%序列同一性的序列选择性杂交,并且可以用于鉴定直系同源(orthologous)或旁系同源(paralogous)序列。
设计的蛋白文库的现有方法包括基因组装诱变技术。可以由相对短的、合成的、重叠的寡脱氧核糖核苷酸(oligos)通过DNA聚合酶延伸来组装完整的基因和质粒。基因组装诱变获得了一群由短的编码两条基因链的并且在靶向位置含有简并碱基的单链寡核苷酸组装的基因变体。组装PCR后,使用外部引物扩增全长基因变体。组装诱变方法具有以相对于常规PCR升高的比例引入非靶向突变的技术限制。尽管额外的多样性可能是有利的,但可能需要提高文库大小来确保完全代表所有可能的预期序列。参见,例如,Bassette et al.,2003,Construction of Designed Protein Libraries Using Gene AssemblyMutagenesis.Directed Evolution Library Creation,Methods and protocols(使用基因组装诱变的设计蛋白文库的构建。定向演化文库形成,方法和实验方案).FrancesH.Arnold和George Georgiou编辑,Methods in Molecular Biology,231,29-37。
任选地,本发明的多核苷酸将编码由本文中所述多核苷酸编码的抗体的至少一部分。本发明的多核苷酸包含可以用于与编码本发明的抗体的多核苷酸选择性杂交的核酸序列。参见,例如,Ausubel,上文;Colligan,上文,通过引用将每一篇全部并入本文中。
核酸的构建
如本领域公知的,可以使用(a)重组方法,(b)合成技术,(c)纯化技术,或其组合,来制得本发明的分离核酸。
核酸可以便利地包含除了本发明多核苷酸以外的序列。例如,可以将包含一个或多个内切核酸酶限制位点的多克隆位点***核酸中,以帮助多核苷酸的分离。此外,可以将可翻译序列***,以帮助本发明的翻译的多核苷酸的分离。例如,六-组氨酸标记物序列提供了纯化本发明蛋白的方便的方式。本发明的核酸--除了编码序列--任选是用于克隆和/或表达本发明的多核苷酸的载体、适配子,或连接体。
可以将其他序列添加至这些克隆和/或表达序列中,以优化它们在克隆和/或表达中的功能,来帮助多核苷酸的分离,或提高多核苷酸引入细胞中。克隆载体、表达载体、适配子和连接体的使用是本领域公知的。(参见,例如,Ausubel,上文;或Sambrook,上文)。
用于构建核酸的重组方法
可以使用许多本领域技术人员已知的克隆方法,从生物来源获得本发明的分离核酸组合物,如RNA、cDNA、基因组DNA,或其任何组合。在一些实施方案中,将在严格条件下与本发明多核苷酸选择性杂交的寡核苷酸探针用于鉴定cDNA或基因组DNA文库中的所需序列。RNA的分离,以及cDNA和基因组文库的构建,是本领域普通技术人员公知的。(参见,例如,Ausubel,上文;或Sambrook,上文)。
核酸筛选和分离方法
可以使用基于本发明多核苷酸序列(如本文中公开的那些)的探针来筛选cDNA或基因组文库。探针可以用来与基因组DNA或cDNA序列杂交,以分离相同或不同生物体中的同源基因。本领域技术人员应当认识到在试验中可以使用各种程度的杂交严格性;并且杂交或洗涤介质可以是严格的。随着杂交条件变得越严格,用于发生双链形成的探针和目标之间的互补性程度必须越高。可以通过温度、离子强度、pH和存在部分变性溶剂(如,甲酰胺)中的一个或多个因素来控制严格程度。例如,通过例如操纵0%至50%范围内的甲酰胺浓度来改变反应物溶液的极性,从而方便地改变杂交严格性。可检测结合需要的互补程度(序列同一性)会根据杂交介质和/或洗涤介质的严格性而改变。互补程度最佳地为100%,或70-100%,或其中任意范围或数值。然而,应当理解,通过降低杂交和/或洗涤介质的严格性,可以抵偿探针和引物中的次要序列变化。
RNA或DNA的扩增方法是本领域公知的,并且基于本文中呈现的教导和指导,可以根据本发明来使用而不需要大量实验。
已知的DNA或RNA扩增方法包括,但不限于,聚合酶链式反应(PCR)和相关扩增方法(参见,例如,Mullis等的美国专利第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、第4,965,188号;Tabor等的第4,795,699号和第4,921,794号;Innis等的第5,142,033;Wilson等的第5,122,464;Innis等的第5,091,310号;Gyllensten等的第5,066,584号;Gelfand等的第4,889,818号;Silver等的第4,994,370号;Biswas等的第4,766,067号;Ringold等的第4,656,134号),以及使用靶序列的反义RNA作为用于双链DNA合成的模板的RNA介导的扩增(Malek等的美国专利第5,130,238号,具有商品名NASBA),将这些参考文献的全部内容通过引用引入本文中(参见,例如,Ausubel,上文;或Sambrook,上文)。
例如,聚合酶链式反应(PCR)技术可以用于扩增本发明的多核苷酸序列和直接来自基因组DNA或cDNA文库的相关基因。PCR和其他体外扩增方法还可以用于,例如,克隆编码待表达蛋白的核酸序列、制备用作检测样品中所需mRNA存在的探针的核酸、用于核酸测序或用于其他目的。通过体外扩增方法足以指导本领域技术人员的技术的实例可以在Berger,上文,Sambrook,上文和Ausubel,上文,以及Mullis等美国专利第4,683,202(1987)号;和Innis et al.,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications(PCR实验方案,方法和应用指导)编辑,Academic Press Inc.,San Diego,Calif.(1990)中找到。可购得的用于基因组PCR扩增的试剂盒是本领域已知的。参见,例如,Advantage-GC GenomicPCR Kit(Clontech)。此外,例如,T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可以用于提高长PCR产物的产量。
用于构建核酸的合成方法
还可以通过利用已知方法的直接化学合成来制备本发明的分离核酸(参见,例如,Ausubel,et al.,上文)。化学合成通常产生单链寡核苷酸,可以通过与互补序列杂交,或使用单链作为模板用DNA聚合酶聚合,将其转变成双链DNA。本领域技术人员应当认识到,尽管DNA的化学合成限于约100个或更多个碱基的序列,但通过较短序列的连接可以获得较长序列。
重组表达盒
本发明还提供了包含本发明的核酸的重组表达盒。本发明的核酸序列,例如,本发明的编码抗体的cDNA或基因组序列,可以用于构建可引入至少一个所需宿主细胞中的重组表达盒。重组表达盒通常将包含可操作连接于转录启动调控序列的本发明的多核苷酸,所述转录启动调控序列将指导所述多核苷酸在既定宿主细胞中的转录。可以使用异源和非异源(即,内源)启动子来指导本发明核酸的表达。
在一些实施方案中,可以将作为启动子、增强子或其他元件的分离核酸引入本发明非异源形式的多核苷酸中的合适位置中(上游、下游或内含子中),以上调或下调本发明多核苷酸的表达。例如,可以通过突变、缺失和/或取代在体内或体外改变内源启动子。
编码dsDNA文库的框架片段(其编码HC FW1、HC FW2、HC FW3、LC FW1、LC FW2和LCFW3的全部或部分)选自人框架集合,其只选自功能表达的来自人种系序列的抗体。为了最大序列多样性,选择人框架集合。
本公开内容的方法还包括以下步骤:通过以FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的顺序逐步液相连接重链FW编码片段和CDR编码片段,由HC片段文库组装,以产生人源化HC可变结构域编码文库。
本公开内容的方法还包括以下步骤:通过以FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的顺序逐步液相连接重链FW编码片段和CDR编码片段,由LC片段文库组装,以产生人源化LC可变结构域编码文库。
可以使用轻链和重链的组合可变结构域人源化文库的液相合成。人源化轻链(LC)可变结构域文库的组装,例如,含有人轻链框架(FW)和非人互补性决定区(CDR)。例如,通过使用FW和CDR DNA片段的逐步液相连接,来组装文库。通过本领域技术人员已知的技术,以FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的顺序,使用FW和CDR DNA的逐步液相连接来组装文库。例如,通过以下参考文献中的一种或多种技术,通过引用将每一篇并入本文中。Lo,B.K.,2003,Antibody humanization by CDR grafting.Antibody Engineering,Methods andprotocols(通过CDR移植的抗体人源化。抗体工程化,方法和实验方案).Benny K.C.Lo编辑,Methods in Molecular Biology,248,135-159;Kashmiri et al.,2003,Developing aminimally immunogenic humanized antibody by SDR grafting.AntibodyEngineering,Methods and protocols(通过SDR移植产生最小致免疫的人源化抗体。抗体工程化,方法和实验方案),Benny K.C.Lo编辑,Methods in Molecular Biology,248,361-376;Bassette,P.H.,et al.,2003,Construction of Designed Protein LibrariesUsing Gene Assembly Mutagenesis.Directed Evolution Library Creation,Methodsand protocols(使用基因组装诱变的设计蛋白文库的构建。定向演化文库形成,方法和实验方案),编辑Arnold和Georgiou,Methods in Molecular Biology,231,29-37;Chames,P.,et al.,2001,Selections on Biotinylated antigens.Antibody Engineering(对生物素化抗原的选择),R.Kontermann和S.Dubel编辑,Springer Lab Manual,149-166;O’Brien S.,和Jones,T.,2001,Humanising antibodies by CDR grafting.AntibodyEngineering(通过CDR移植人源化抗体),R.Kontermann和S.Dubel编辑,Springer LabManual,567-590。本文中将进一步详细地描述片段的组装。
如所述,本发明还涉及生产全长人源化抗体的方法,所述抗体包含一个或多个源自模板抗体的CDR和来自人框架集合的框架区,所述框架池只含有来自功能表达抗体的框架。选择人框架集合来提供最大的框架序列多样性。如本文中具体描述的,这样的人源化抗体可以包括由于天然突变或人为操纵的一个或多个氨基酸取代、缺失或添加。优选,这样的抗体可以以高亲和性(例如,低于或等于约10-9M的KD)结合抗原。与本文中所述的序列基本上相同的氨基酸序列包括包含保守氨基酸取代以及氨基酸缺失和/或***的序列。保守氨基酸取代指的是第一个氨基酸由具有与第一个氨基酸相似的化学和/或物理特性(例如,电荷、结构、极性、疏水性/亲水性)的第二个氨基酸替代。保守性取代包括一个氨基酸由以下组内的另一个氨基酸替代:赖氨酸(K)、精氨酸(R)和组氨酸(H);天冬氨酸(D)和谷氨酸(E);天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、酪氨酸(Y)、K、R、H、D和E;丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、色氨酸(W)、甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C)和甘氨酸(G);F、W和Y;C、S和T。
当然,本领域技术人员可能进行的氨基酸取代的数量,取决于许多因素,包括上述的那些。通常,如本文中具体说明的,对于任何给定的人源化抗体、片段或变体,氨基酸取代、***或缺失的数量将不超过40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1个,如1-30个,或其中的任何范围或数值。
可以通过本领域已知的方法,如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变(例如,Ausubel,上文,第8章,15;Cunningham and Wells,Science 244:1081-1085(1989)),来鉴定本发明的抗-抗原抗体中对于功能是必需的氨基酸。后一种程序在分子中的每个残基处引入单个丙氨酸突变。然后测试所得到的突变体分子的生物活性,如,但不限于,至少一种抗原中和活性。还可以通过结构分析,如结晶、核磁共振或光亲和标记(Smith,et al.,J.Mol.Biol.224:899-904(1992)和de Vos,et al.,Science 255:306-312(1992)),来鉴定对于抗体结合关键的位点。
本公开内容的方法还包括将组装的人源化重链可变结构域文库和组装的轻链可变结构域文库克隆至表达载体中以形成人源化文库的步骤。在一个方面中,表达载体包含编码框架区4的核苷酸序列。将人源化文库转染至细胞中。
载体和宿主细胞
本发明还涉及包括本发明的分离的核酸分子的载体、用重组载体进行基因改造的宿主细胞和按照本领域公知的通过重组技术生产至少一种人源化抗体。参见,例如,Sambrook等,上文;Ausubel等,上文,通过引用将每一篇全部并入本文中。
可以将多核苷酸任选连接于含有选择标记的载体,用于在宿主中增殖。通常,将质粒载体引入沉淀物中,如磷酸钙沉淀,或引入与带电脂质的复合物中。如果载体是病毒,可以使用合适的包装细胞系将其进行体外包装,然后转导至宿主细胞中。
应当将DNA***片段可操作地连接于合适的启动子。表达构建体将进一步含有用于转录启动、终止的位点,并且在转录的区域内,含有用于翻译的核糖体结合位点。通过构建体表达的成熟转录本的编码部分将优选在待翻译mRNA的开始处包括翻译起始密码子和合适地置于待翻译mRNA末端处的终止密码子(例如,UAA,UGA或UAG),对于哺乳动物或真核细胞表达,优选UAA和UAG。
表达载体将优选但任选包括至少一种可选择标记物。这样的标记物包括,例如,但不限于,用于真核细胞培养的氨甲蝶呤(MTX)、二氢叶酸还原酶(DHFR,美国专利第4,399,216号;第4,634,665号;第4,656,134号;第4,956,288号;第5,149,636号;第5,179,017号)、氨苄青霉素、新霉素(G418)、霉酚酸或谷氨酰胺合成酶(GS,U.S.Pat.Nos.5,122,464;5,770,359;5,827,739)抗性,以及用于在大肠杆菌和其他细菌或原核生物中培养的四环素或氨苄青霉素抗性基因(据此通过引用,将上述专利完全并入)。以下描述的适用于表面展示和全长抗体展示的表达载体,是特别优选的。用于以上所述的宿主细胞的合适培养基和条件是本领域已知的。合适的载体对本领域技术人员而言是显而易见的。可以通过磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、阳离子脂质介导的转染、电穿孔、转导、感染或其他已知方法来实现将载体构建体引入宿主细胞中。现有技术中描述了这样的方法,如,Sambrook,上文,第1-4和16-18章;Ausubel,上文,第1、9、13、15、16章。
人源化抗体在哺乳动物细胞中的克隆和表达
典型的哺乳动物表达载体含有至少一个启动子元件(其介导mRNA转录的起始),抗体编码序列以及转录终止和转录本的聚腺苷酸化需要的信号。其他元件包括增强子、Kozak序列和两侧为用于RNA剪接的供体和受***点的间插序列。可以用来自SV40的早期和晚期启动子、来自逆转录病毒的长末端重复序列(LTRS)(例如,RSV、HTLVI、HIVI)和细胞巨化病毒(CMV)的早期启动子,来实现高效转录。然而,也可以使用细胞元件(例如,人肌动蛋白启动子)。用于实施本发明的合适表达载体包括,例如,载体,如pIRES1neo、pRetro-Off、pRetro-On、PLXSN或pLNCX(Clonetech Labs,Palo Alto,Calif.)、pcDNA3.1(+/-)、pcDNA/Zeo(+/-)或pcDNA3.1/Hygro(+/-)(Invitrogen)、PSVL和PMSG(Pharmacia,Uppsala,Sweden)、pRSVcat(ATCC 37152)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC 67109)。可以使用的哺乳动物宿主细胞包括人Hela 293、H9和Jurkat细胞、小鼠NIH3T3和C127细胞、Cos1、Cos7和CV1、鹌鹑QC1-3细胞、小鼠L细胞和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
或者,可以在含有整合至染色体中的基因的稳定细胞系中表达基因。用可选择标记(如,dhfr、gpt、新霉素或潮霉素)共同转染可以鉴定和分离转染的细胞。
还可以扩增转染的基因,以表达大量的已编码的抗体。DHFR(二氢叶酸还原酶)标记物可以用于产生携带数百乃至数千个目标基因拷贝的细胞系。另一种有用的选择标记物是酶谷氨酰胺合酶(GS)(Murphy,et al.,Biochem.J.227:277-279(1991);Bebbington,etal.,Bio/Technology 10:169-175(1992))。使用这些标记物,使哺乳动物细胞在选择培养基中生长,并且选择具有最高抗性的细胞。这些细胞系含有整合至染色体中的扩增的基因。中国仓鼠卵巢(CHO)细胞和NSO细胞常常用于抗体的生产。
在CHO细胞中克隆和表达
在一个方面中,用T4DNA连接酶连接分离的可变和恒定区编码DNA与去磷酸化载体。然后转化大肠杆菌HB101或XL-1蓝细胞,并且使用例如限制酶分析来鉴定含有***质粒pC4中的片段的细菌。
例如,在一个方面中,将缺少活性DHFR基因的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞用于转染。使用脂质体(lipofectin),用0.5μg质粒pSV-2-neo共转染5μg表达质粒pC4。质粒pSV2neo含有显性可选择标记物,即来自Tn5的neo基因,其编码赋予一组抗生素(包括G418)抗性的酶。将细胞接种于补充了1μg/ml G418的α-MEM中。2天后,将细胞胰蛋白酶化,并接种于杂交瘤克隆平板(Greiner,德国)中的补充了10、25或50ng/ml氨甲喋呤加1μg/ml G418的α-MEM中。约10-14天后,将单个克隆胰蛋白酶化,然后接种于6-孔皮氏培养皿中或10ml烧瓶中,使用不同浓度的氨甲喋呤(50nM、100nM、200nM、400nM、800nM)。然后将在最高浓度的氨甲喋呤下生长的克隆转移至含有更高氨甲喋呤浓度(1mM、2mM、5mM、10mM、20mM)的新6-孔平板中。重复相同的程序,直至在100-200mM浓度下生长的克隆。例如,通过SDS-PAGE和蛋白质印迹、ELISA或通过反相HPLC分析,分析所需基因产物的表达。
用于生产抗体、其指定部分或变体的说明性细胞培养物是哺乳动物细胞。哺乳动物细胞***常常将是单层细胞的形式,尽管也可以使用哺乳动物细胞悬浮液或生物反应器。本领域中已经研发了许多能够表达完整的糖基化蛋白的合适宿主细胞系。在一个方面中,从真核细胞生产宿主细胞系选择细胞,所述真核细胞生产宿主细胞系选自由下述细胞组成的组中的成员:3T3小鼠成纤维细胞;BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞;MDCK,狗上皮细胞;Hela人上皮细胞;PtK1鼠袋鼠上皮细胞;SP2/0小鼠浆细胞;和NS0小鼠浆细胞;HEK293人胚肾细胞;COS猴肾细胞,包括COA-1(例如,ATCC CRL 1650)、COS-7(例如,ATCC CRL-1651);CHO、CHO-S中国仓鼠卵巢细胞;R1小鼠胚细胞;E14.1小鼠胚细胞;H1人胚细胞;H9人胚细胞;PER C.6人胚细胞;酿酒酵母酵母细胞;和毕赤酵母细胞。在一个具体方面中,真核细胞生产宿主细胞系是CHO-S。在另一个具体方面中,真核细胞生产宿主细胞系是HEK293。在进一步的具体方面中,真核细胞生产宿主细胞系是CHOK1SV。在另一个具体方面中,真核细胞生产宿主细胞系是NS0。
用于这些细胞的表达载体包括一个或多个以下的表达控制序列,如,但不限于,复制起点;启动子(例如,晚期或早期SV40启动子、CMV启动子(美国专利第5,168,062号;第5,385,839号)、HSV tk启动子、pgk(磷酸甘油酸激酶)启动子、EF-1α启动子(美国专利第5,266,491号))、至少一个人免疫球蛋白启动子;增强子,和/或加工信息位点,如核糖体结合位点、RNA剪接位点、聚腺苷酸化位点(例如,SV40大T Ag多A添加位点)和转录终止子序列。参见,例如,Ausubel等,上文;Sambrook等,上文。用于生产本发明的核酸或蛋白的其他细胞是已知的和/或可获得的,例如,可从美国细胞系和杂交瘤的典型培养保藏目录(AmericanType Culture Collection Catalogue of Cell Lines and Hybridomas(www.atcc.org))或其他已知或商业来源获得。
使用真核宿主细胞时,通常将聚腺苷酸化或转录终止子序列并入载体中。终止子序列的一个实例是来自牛生长激素基因的聚腺苷酸化序列。还可以包括用于转录本精确剪接的序列。剪接序列的一个实例是来自SV40的VP1内含子(Sprague,et al.,J.Virol.45:773-781(1983))。此外,如本领域已知的,可以将控制宿主细胞中的复制的基因序列并入载体中。
可以通过在含有编码本发明抗体的内源DNA的宿主细胞中打开(turning on)(通过操纵),在宿主细胞中表达本发明的核酸。这样的方法是本领域公知的,例如,如在美国专利第5,580,734号、第5,641,670号、第5,733,746号和第5,733,761号中所述的,通过引用将上述专利全部并入本文中。
本公开内容的方法还包括在细胞中表达全长人源化抗体以形成人源化抗体文库的步骤。在一个方面中,细胞是具有抗体细胞表面展示的真核细胞生产宿主。在另一个方面中,在真核细胞生产宿主中进行一个或两个筛选步骤。
抗体的生产
任选通过本领域熟知的细胞系、混合的细胞系、永生细胞或永生细胞的克隆群来产生至少一个本发明的人源化抗体。参见,例如,Ausebel等编辑,Current Protocols inMolecular Biology,John Wiley&Sons,Inc.,NY,N.Y.(1987-2001);Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(分子克隆:实验室手册),第2版增补,ColdSpring Harbor,N.Y.(1989);Harlow和Lane,antibodies,a Laboratory Manual(抗体,实验室手册),Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)。Colligan等编辑,Current Protocols inImmunology(免疫学中的通用实验方案),John Wiley&Sons,Inc.,NY(1994-2001);Colligan等,Current Protocols in Protein Science(蛋白科学中的通用实验方案),John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),通过引用将每篇全部并入本文中。
在一种方法中,通过将合适的永生细胞系(例如,骨髓瘤细胞系,如,但不限于,Sp2/0、Sp2/0-AG14、NSO、NS1、NS2、AE-1、L.5、>243、P3X63Ag8.653、Sp2 SA3、Sp2 MAI、Sp2SS1、Sp2 SA5、U937、MLA 144、ACT IV、MOLT4、DA-1、JURKAT、WEHI、K-562、COS、RAJI、NIH3T3、HL-60、MLA 144、NAMAIWA、NEURO 2A)等,或异源骨髓瘤(heteromyloma)、其融合产物,或源自其的任何细胞或融合细胞,或本领域已知的任何其他合适细胞系,与产抗体细胞融合来产生杂交瘤,参见,例如,www.atcc.org,www.lifetech.com.等,所述产抗体细胞,如,但不限于,分离或克隆的脾脏、外周血、淋巴、扁桃体或含其他免疫或B细胞的细胞,或表达重链或轻链恒定或可变或框架或CDR序列的任何其他细胞,作为内源或异源核酸,作为重组或内源的,病毒、细菌、藻类、原核生物、两栖动物、昆虫、爬行动物、鱼类、哺乳动物、啮齿动物、马、绵羊、山羊、羊、灵长类动物、真核生物、基因组DNA、cDNA、rDNA、线粒体DNA或RNA、叶绿体DNA或RNA、hnRNA、mRNA、tRNA、单、双或三链的、杂交的等,或其任何组合。参见,例如,Ausubel,上文,和Colligan,Immunology,上文,第2章,通过引用全部并入本文中。
还可以用任何其他合适的宿主细胞也表达编码本发明的抗体、其指定的片段或变体的异源或内源核酸。可以使用选择培养条件或其他合适的已知方法来分离融合的细胞(杂交瘤)或重组细胞,并且通过有限稀释或细胞分选术,或其他已知方法来克隆。可以通过合适的试验(例如,ELISA)来选择产生具有所需特异性的抗体的细胞。
还可以使用至少一种人源化抗体编码核酸来提供转基因动物或在其乳中产生这些抗体的哺乳动物,如,山羊、牛、马、羊等,从而来制备本发明的抗体。利用已知的方法,可以提供这类动物。参见,例如,但不限于美国专利第5,827,690号;第5,849,992号;第4,873,316号;第5,849,992号;第5,994,616号、第5,565,362号;第5,304,489号等,通过引用将每一篇全部并入本文中。
另外,可以使用至少一种人源化抗体编码核酸来提供转基因植物和培养的植物细胞(如,但不限于烟草和玉米),所述转基因植物和培养的植物细胞在从其培养的植物部分或细胞中产生这些抗体、其指定部分或变体,从而制备本发明的抗体。作为非限制性实例,表达重组蛋白的转基因烟草叶已经成功用于提供大量重组蛋白,例如,使用诱导型启动子。参见,例如,Cramer et al.,Curr.Top.Microbol.Immunol.240:95-118(1999)和其中引用的参考文献。此外,转基因玉米已经用于在商业生产水平表达哺乳动物蛋白,其生物活性等于其他重组***中产生的或从天然来源纯化的那些。参见,例如,Hood et al.,Adv.Exp.Med.Biol.464:127-147(1999)和其中引用的参考文献。还可以从转基因植物种子(包括烟草种子和马铃薯块茎)大量产生抗体,包括抗体片段,如单链抗体(scFv)。参见,例如,Conrad et al.,Plant Mol.Biol.38:101-109(1998)和其中引用的参考文献。因此,还可以根据已知方法,使用转基因植物来生产本发明的抗体。参见,例如,Fischer et al.,Biotechnol.Appl.Biochem.30:99-108(October,1999),Ma et al.,TrendsBiotechnol.13:522-7(1995);Ma et al.,Plant Physiol.109:341-6(1995);Whitelam etal.,Biochem Soc.Trans.22:940-944(1994);和其中引用的参考文献。通过引用将以上的每一篇参考文献全部并入本文中。
抗体的纯化
可以通过公知的方法,从重组细胞培养物收集和纯化人源化抗体,包括但不限于,蛋白A纯化、蛋白G纯化、硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水性相互作用层析、亲和性层析、羟磷灰石层析和凝集素层析。高性能液相色谱(“HPLC”)也可以用于纯化。参见,例如,Colligan,Current Protocols in Immunology(免疫学中的通用实验方案)或Current Protocols in Protein Science(蛋白科学中的通用实验方案),John Wiley&Sons,NY,N.Y.,(1997-2001),例如,第1、4、6、8、9和10章,通过引用将每一篇全部并入本文中。
本发明的抗体包括天然纯化的产物、化学合成程序的产物和通过重组技术从真核宿主产生的产物,真核宿主包括,例如,酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞。根据重组生产程序中所用的宿主,本发明的抗体可以是糖基化的或可以是非糖基化的,优选糖基化的。这样的方法描述于许多标准实验室手册中,如Sambrook,上文,17.37-17.42部分;Ausubel,上文,第10、12、13、16、18和20章,Colligan,Protein Science,上文,第12-14章,按引用全部并入文本中。
可以通过,例如,ELISA、ELISPOT、流式细胞术、免疫细胞学、分析、Sapidyne KinExATM动力学排斥试验、SDS-PAGE和蛋白质印迹,或通过HPLC分析以及通过本文中公开的多种其他功能试验,来表征纯化的抗体。
本公开内容的方法还包括筛选人源化抗体文库来确定人源化抗体表达水平的步骤。本公开内容的方法还包括筛选人源化抗体文库来确定与模板抗体对抗原的亲和性相比的人源化抗体对抗原的亲和性的步骤。在一个方面中,筛选纯化的抗体。在另一个方面中,真核细胞生产宿主能够进行抗体细胞表面展示,并且在真核细胞生产宿主中进行筛选步骤。
在具体方面中,筛选步骤选自定量ELISA;亲和性ELISA;ELISPOT;流式细胞术、免疫细胞学、表面等离子体共振分析、Sapidyne KinExATM动力学排斥试验;SDS-PAGE;蛋白质印迹和HPLC分子,以及通过本文中公开的多种其他功能试验。
在本发明的其他方面中,通过演化抗体的Fc区、抗体中的沉默密码子和/或蛋白表达中所用的载体和/或宿主基因,在制造宿主中进行下游表达优化。在一个方面中,通过任何演化技术来产生Fc文库。在表达优化的一个具体方面中,对抗体的Fc结构域进行CPE,以形成可以用于选择用于任何Fv的最佳伴侣的Fc突变体文库。为了将所有Fc变体快速连接至每个新的Fv区,对优化进行设计。或者,这些Fc的子集可以用于连接不同的Fv。为了最佳表达,作为在哺乳动物细胞(例如,CHO,成本有效介质)中表达的全长抗体来筛选这些Fc CPE变体/Fv组合中的每一个。此外,为了提高表达,可以在哺乳动物细胞中进行CPS,来筛选这些CPE苗头中多达12个或更多苗头的所有理论排列。还可以选择特定的所需密码子变化来鉴定具有提高表达的克隆。鉴定沉默密码子,并且对这些位置进行CPE。筛选该CPE文库来鉴定最佳表达苗头。此外,高达12个或更多CPE苗头的所有理论排列可以用于CPS方法中,来产生针对提高表达可以在哺乳动物细胞中筛选的新的文库。将顶端CPS沉默突变苗头用来定制用于在具体细胞系和介质中最优表达的蛋白。这给生物仿制药精细结构控制提供了机会。
用于增强表达的其他方面包括:载体的优化,包括启动子、剪接位点、5’和3’末端、侧翼序列、基因缺失和重排的降低、宿主细胞基因活性的提高、宿主糖基化酶的优化以及全染色体宿主细胞诱变和选择。已经证明了5’氨基酸序列对于表达的增强是重要的。
实施例
缩写:
BSA--牛血清白蛋白
EIA--酶免疫测定
FBS--胎牛血清
H2O2--过氧化氢
HRP--辣根过氧化物酶
Ig--免疫球蛋白
IL-6--白细胞介素-6
IP--腹膜内
IV--静脉内
Mab--单克隆抗体
OD--光密度
OPD--o-苯二胺二盐酸盐
PEG--聚乙二醇
PSA--青霉素、链霉素、两性霉素
RT--室温
SQ--皮下
v/v--体积/体积
w/v--重量/体积
实施例1
实施例1.重链和轻链双链DNA片段的制备
这个实验方案描述了双链(ds)DNA片段的制备,所述双链(ds)DNA片段用于重链和轻链可变结构域的组装[[SOP 2A)]]。首先通过将合成的寡核苷酸(oligo)退火来制备dsDNA片段。Oligo是5’-磷酸化的,从而允许片段彼此连接并且连接到克隆载体中。
该程序需要的试剂、消耗品和设备显示于表1中。
表1.试剂、消耗品和设备。
描述 | 认可的供应商 | 目录No. | |
SeaKem LE琼脂糖 | Cambrex | 50004 | |
溴化乙锭 | Sigma-Aldrich | E1510 | |
TAE缓冲液(10x)-1000ml | Ambion | 9869 | |
1M Tris/HCl,pH 8.0-100ml | Ambion | 9855G | |
2M KCl-100ml | Ambion | 9640G | |
DTT(粉末形式) | Fisher | BP1725 | |
1M MgCl2-100ml | Ambion | 9530G | |
不含核酸酶的水-5x100ml | Ambion | 9939 | |
琼脂糖凝胶装置 | Bio-Rad | 1707764 | |
琼脂糖凝胶粉末供应 | Bio-Rad | 1645050 | |
4%琼脂糖凝胶 | 参见附录1 | N/A | |
琼脂糖凝胶装载缓冲液 | Invitrogen | 10816-015 | |
25碱基对(bp)DNA序列梯 | Invitrogen | 10597-011 | |
微离心机 | Eppendorf | 5417C | |
高速离心机 | Beckman | Avanti J-30I | |
高速离心转子 | Beckman | ||
热-混合器 | Eppendorf | 5350-0000-013 | |
热-循环仪 | MJ或Eppendorf | ||
PCR管 | VWR | 53509-304 | |
96孔PCR平板 | VWR |
以下显示了所需的缓冲液配方。
50X TAE缓冲液
●242g Tris碱
●57.1ml冰醋酸
●37.2g Na2EDTA-2H2O
●加入蒸馏H2O至最终1升的体积
1X TAE缓冲液
●20ml 50X TAE缓冲液
●800ml蒸馏H2O
0.1M DTT
●1.54g DTT
●10ml蒸馏H2O
●存储在-20℃
80%甘油
●20ml甘油
●80ml蒸馏H2O
●通过高压灭菌来灭菌
含有溴化乙锭的4%琼脂糖凝胶
●4g LE琼脂糖
●100ml 1X TAE缓冲液
●将琼脂糖在微波炉中熔化并且涡旋以确保均匀混合
●将琼脂糖冷却至55℃
●将2.5μl 20mg/ml溴化乙锭加入琼脂糖中
●倒至凝胶平台上。
程序
从IDT订购了寡核苷酸(1μmol规格,PAGE纯化的,冻干的,并且是5’磷酸化的)。将冻干的oligo在微离心机中在12,000xg下离心30秒,然后打开试管。根据从IDT获得的数据,将重悬浮的Oligo以100pMole/μl重悬浮于不含核酸酶的H2O中。将重悬浮的oligo在微离心机中在12,000xg下离心30秒,并且在薄壁PCR管(或96孔PCR平板)中与75μl匹配的正向和反向引物混合。将寡核苷酸在热循环仪中退火,使用以下温度特征:
95℃ 5’→90℃ 5’→85℃ 5’→75℃ 5’→70℃ 5’→65℃ 5’→60℃ 5’→55℃5’→50℃ 5’→45℃ 5’→40℃ 5’→35℃ 5’→35℃ 5’
退火的DNA片段的终浓度为50pMole/μl。将退火的DNA片段储存在-20℃。
通过在1.5ml微离心管中设立以下反应来进行dsDNA片段(或片段集合)的质量控制分析:
将10μl每种样品加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上;将25-bpDNA序列梯用作标准品。将凝胶在100V下在1X TAE缓冲液中运行20-30分钟。
用于该程序的标准参考文献包括Current Protocols in Molecular biology(分子生物学中的通用实验方案),Ausubel,F.,Brent,R.,Kingston,R.E.,Moore,D.D.,Seidman,J.G.,Smith,J.A.,Struhl,K.编辑,John Wiley&Sons Inc.;Whitehouse,A.,Deeble,J.,Parmar,R.,Taylor,G.R.,Markham,A.F.,和Meredith,D.M.,Analysis of themismatch and insertion/deletion binding properties of Thermus thermophilus,HB8,MutS(Thermus thermophilus,HB8,MutS的错配和***/缺失结合特性的分析),Bioichemical and Biophysical Research Communications 233,834-837;Wang,J.andL.J.Directly fishing out subtle mutations in genomic DNA with histidine-tagged Thermus thermophilus MutS(用组氨酸标记的Thermus thermophilus MutS直接搜索出细小的突变),Mutation Research 547(2004)41-47。
实施例2.组合可变结构域文库-重链的液相分析
该实验方案描述了人源化重链(HC)可变结构域文库的组装。文库含有顺序为FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的人重链框架(FW)和非人互补性决定区(CDR)。总共存在7个FW1、5个FW2和8个FW3片段。通过使用FW和CDR DNA片段的逐步液相连接来组装文库。完成该实验方案的典型时间是四天,每人形成约四个重链文库。
表2:试剂、消耗品和设备
以下显示了所需的缓冲液配方。
50X TAE缓冲液
●242g Tris碱
●57.1ml冰醋酸
●37.2g Na2EDTA-2H2O
●加入蒸馏H2O至终体积为1升
1X TAE缓冲液
●20ml 50X TAE缓冲液
●800ml蒸馏H2O
含有溴化乙锭的3%琼脂糖凝胶
●3g LE琼脂糖
●100ml 1X TAE缓冲液
●将琼脂糖在微波炉中熔化并且涡旋以确保均匀混合
●将琼脂糖冷却至55℃
●将2.5μl 20mg/ml溴化乙锭加入琼脂糖中
●倒至凝胶平台上
含有溴化乙锭的4%琼脂糖凝胶
●4g LE琼脂糖
●100ml 1X TAE缓冲液
●将琼脂糖在微波炉中熔化并且涡旋以确保均匀混合
●将琼脂糖冷却至55℃
●将2.5μl 20mg/ml溴化乙锭加入琼脂糖中
●倒至凝胶平台上
液相合成程序按照以下逐步形式中所示的进行。在第1天,HC可变结构域的组装涉及同时进行连接1和连接2,并且同时进行连接3和连接4。
连接1:FW1b→FW1a
在冰上的微离心管中准备以下连接反应。存在7个连接反应(FW1-1至FW1-7)。在不同的微离心管中准备每个连接反应,总共7个管。
1.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.(秒))。
2.在室温下孵育1小时。
3.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
FW1连接 20μL
10x样品加样缓冲液 3μL
总体积 23μL
4.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
5.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
6.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
7.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
8.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
9.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
10.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
11.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
12.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
13.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
14.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
15.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
16.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并且将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制纯化的连接产物。
连接2:FW3b→FW3a
17.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应。存在8个连接反应(FW3-1至FW3-8)。在不同的微离心管中准备每个连接反应,总共7个管。
18.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
19.在室温下孵育1小时。
20.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
FW3连接 20μL
10x样品加样缓冲液 3μL
总体积 23μL
21.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
22.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
23.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
24.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
25.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
26.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
27.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
28.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
29.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
30.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
31.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
32.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
33.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并且将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接3:CDR1→FW1
1.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
2.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
3.在室温下孵育1小时。
4.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
CDR1-FW1连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
5.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
6.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
7.将凝胶片段混合在两个微离心管中。
8.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
9.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
10.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
11.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
12.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
13.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
14.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
15.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
16.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
17.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并且将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接4:CDR2→FW3
18.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
19.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
20.在室温下孵育1小时。
21.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
CDR2-FW3连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
22.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
23.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
24.将凝胶片段混合在两个微离心管中。
25.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
26.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
27.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
28.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
29.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
30.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
31.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
32.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
33.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
34.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并且将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
在第2天,通过同时进行连接5和连接6继续HC可变结构域的组装。
连接5:FW2→CDR1-FW1
1.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
FW2片段集合含有5个FW2片段,每个为90pMole。
2.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
3.在室温下孵育1小时。
4.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
FW2-CDR1-FW1连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
5.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
6.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
7.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
8.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
9.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
10.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
11.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
12.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
13.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
14.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
15.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
16.将30μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
17.将洗脱的DNA合并(总体积60μl)并且将3μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接6:CDR3→FW3-CDR2
18.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
[[FW2片段集合含有5个FW2片段,各自为90pMole]]
19.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
20.在室温下孵育1小时。
21.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
CDR3-FW3-CDR2连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
22.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
23.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
24.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
25.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
26.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
27.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
28.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
29.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
30.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
31.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
32.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
33.将30μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
34.将洗脱的DNA合并(总体积60μl)并且将3μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接7:全长HC可变结构域
1.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
35.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
36.在室温下孵育1小时。
37.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
全长HC可变结构域连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
38.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的3%琼脂糖TAE凝胶上。使用100bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
39.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
40.将凝胶片段混合在一个微离心管中。
41.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
42.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
43.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
44.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
45.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
46.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
47.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
48.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
49.将30μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
50.将3μl加载于3%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
确定重链CDR。以下一组规则允许鉴定大部分抗体重链可变结构域序列中的CDR。
CDR-H1
开始:约位置26,总在半胱氨酸后4个
之前的残基:C-X-X-X
长度:10-12个氨基酸
之后的残基:总是W,通常是W-V,但也有W-I、W-A
CDR-H2
开始:总在CDR-H1结束后15个残基
之前的残基:通常是L-E-W-I-G,但有多种变化
长度:16-19个氨基酸
之后的残基:K/R-L/I/V/F/T/A-T/S/I//A
CDR-H3
开始:总在CDR-H2结束后33个残基(总在半胱氨酸后2个)
之前的残基:总是C-X-X,通常是C-A-R
长度:3-25个残基
之后的残基:W-G-X-G(通常是W-G-Q-G)
对于该实验方案的参考文献包括L.B.K.C.Antibody humanization by CDRgrafting.Antibody Engineering.Methods and protocols(通过CDR移植的抗体人源化。抗体工程化。方法和实验方案).Benny K.C.Lo编辑,Methods in Molecular Biology,2004;248,135-159;Developing a minimally immunogenic humanized antibody by SDRgrafting.Antibody Engineering,Methods and protocols(通过SDR移植产生最小致免疫的人源化抗体).Benny K.C.Lo编辑,Methods in Molecular Biology,2004,248,361-376;Bassette,P.H.,Mena,M.A.,Nguyen,A.W.和Daugherty,P.S.Construction of DesignedProtein Libraries Using Gene Assembly Mutagenesis.Directed Evolution LibraryCreation,Methods and protocols(使用基因组装诱变构建设计的蛋白文库。定向演化文库形成,方法和实验方案).Frances H.Arnold和George Georgiou编辑,Methods inMolecular Biology,2003,231,29-37;Chames,P.,Hoogenboom,H.R.,and Henderikx,P.Selection on Biotinylated antigens.Antibody Engineering(生物素抗原上的选择。抗体工程化),R.Kontermann and和S.Dubel编辑,Springer Lab Manual,149-166;ObrienS.,和Jones,T.Humanising antibodies by CDR grafting.Antibody Engineering(通过CDR移植人源化抗体。抗体工程化),R.Kontermann和S.Dubel编辑,Springer Lab Manual,567-590。
实施例3.组合可变结构域文库的液相合成-轻链。
该实验方案描述了人源化轻链(LC)可变结构域文库的组装。文库含有顺序为FW1-CDR1-FW2-CDR2-FW3-CDR3的人轻链框架(FW)和非人互补性决定区(CDR)。总共存在7个FW1、4个FW2和8个FW3片段。通过使用FW和CDR DNA片段的逐步液相连接来组装文库。完成该实验方案的典型时间为四天,每个人形成约四个重链文库。试剂、消耗品和设备描述于以上的实施例2,表2中。以上的实施例2中显示了所需的缓冲液配方。
按照以下逐步形式所示的进行了液相合成程序。在第1天,HC可变结构域的组装涉及同时进行连接1和连接2,以及同时进行连接3和连接4。
连接1:FW1b→FW1a
34.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应。存在7个连接反应(FW1-1至FW1-7)。在不同的微离心管中准备每个连接反应,总共7管。
35.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
36.在室温下孵育1小时。
37.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
FW1连接 20μL
10x样品加样缓冲液 3μL
总体积 23μL
38.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
39.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
40.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
41.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
42.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
43.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
44.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
45.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
46.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
47.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
48.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
49.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
50.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制纯化的连接产物。
连接2:FW3b→FW3a
51.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应。存在8个连接反应(FW3-1至FW3-8)。在不同的微离心管中准备每个连接反应,总共7管。
52.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
53.在室温下孵育1小时。
54.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
FW3连接 20μL
10x样品加样缓冲液 3μL
总体积 23μL
55.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
56.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
57.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
58.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
59.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
60.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
61.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
62.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
63.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
64.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
65.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
66.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
67.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接3:CDR1→FW1
35.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
36.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
37.在室温下孵育1小时。
38.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
CDR1-FW1连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
39.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
40.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
41.将凝胶片段混合在两个微离心管中。
42.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
43.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
44.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
45.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
46.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
47.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
48.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
49.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
50.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
51.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接4:CDR2→FW3
52.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
53.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
54.在室温下孵育1小时。
55.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
CDR2-FW3连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
56.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
57.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
58.将凝胶片段混合在两个微离心管中。
59.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
60.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
61.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
62.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
63.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
64.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
65.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
66.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
67.将52μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
68.将洗脱的DNA合并(总体积104μl)并将6μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
第2天,通过同时进行连接5和连接6继续HC可变结构域的组装。
连接5:FW2→CDR1-FW1
51.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
52.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
53.在室温下孵育1小时。
54.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
FW2-CDR-1-FW1连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
55.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
56.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
57.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
58.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
59.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
60.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
61.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
62.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
63.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
64.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
65.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
66.将30μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
67.将洗脱的DNA合并(总体积60μl)并将3μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接6:CDR3→FW3-CDR2
68.在冰上的微离心管中准备以下的连接反应:
[[FW2片段集合含有4个FW2片段,各自为90pMole]]
69.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
70.在室温下孵育1小时。
71.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
CDR3-FW3-CDR2连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
72.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的4%琼脂糖TAE凝胶上。使用25bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
73.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
74.将来自7个连接反应的凝胶片段混合在两个微离心管中。
75.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
76.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
77.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
78.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
79.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
80.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
81.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
82.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
83.将30μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
84.将洗脱的DNA合并(总体积60μl)并将3μl加载于4%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
连接7:全长LC可变结构域
2.在冰上的微离心管中准备连接反应:
85.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
86.在室温下孵育1小时。
87.在1.5ml微离心管中设立以下反应:
全长LC可变结构域连接 140μL
10x样品加样缓冲液 15μL
总体积 155μL
88.加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的3%琼脂糖TAE凝胶上。使用100bp DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
89.切割出对应于正确大小的条带,并且使用QIAquick凝胶提取试剂盒纯化。
90.将凝胶片段混合在一个微离心管中。
91.将3体积的缓冲液QG加入1体积的凝胶中。
92.在50℃下孵育10分钟直至凝胶薄片已经完全溶解。将1凝胶体积的异丙醇加入样品中并混合。
93.将QIAquick离心柱放入预备好的2ml收集管中。
94.将样品施加于QIAquick柱上,并且离心1分钟。
95.丢弃流过物,并且将QIAquick柱放回相同的收集管中。
96.将0.75ml缓冲液PE加入QIAquick柱中并且离心1分钟。
97.丢弃流过物,并将QIAquick柱在17,900xg(13,000rpm)下再离心1分钟。
98.将QIAquick柱放入干净的1.5ml微离心管中。
99.将30μl缓冲液EB加入QIAquick膜的中央,并且将柱离心1分钟。让柱静置1分钟,然后离心1分钟。
100.将3μl加载于3%琼脂糖凝胶上,以质量控制。
确定轻链CDR。以下一组规则允许鉴定大部分抗体轻链可变结构域序列中的CDR。
CDR-L1
开始:约位置24,总在半胱氨酸后1个
之前的残基:C
长度:10-17个氨基酸
之后的残基:总是W,通常是W-Y-Q,但也有W-L-Q、W-F-Q、W-Y-L
CDR-L2
开始:总在CDR-L1结束后16个残基
之前的残基:通常是I-Y,但也有V-Y、I-K、I-F
长度:通常是7个氨基酸
CDR-L3
开始:总在CDR-L2结束后33个残基(总在半胱氨酸后2个)
之前的残基:总是C
长度:7-11个残基
之后的残基:F-G-X-G(通常是F-G-Q-G)
实施例4.组装的可变结构域的克隆。HC和LC可变结构域与Fc的连接。
该实验方案描述了将组装的人源化重链和轻链可变结构域克隆至BioAtla表达载体pBA-K和pBA-L中。估算的完成时间为7天,,每人4个克隆程序。表3显示了所需的试剂、消耗品和设备。
表3:试剂、消耗品和设备
对于这个实验方案需要以下缓冲剂。
50X TAE缓冲液
242g Tris碱
57.1ml冰醋酸
37.2g Na2EDTA-2H2O
加入蒸馏H2O至终体积为1升
1X TAE缓冲液
20ml 50X TAE缓冲液
800ml蒸馏H2O
含有溴化乙锭的1%琼脂糖凝胶
4g LE琼脂糖
100ml 1X TAE缓冲液
将琼脂糖在微波炉中熔化并且涡旋以确保均匀混合
将琼脂糖冷却至55℃
将2.5μl 20mg/ml溴化乙锭加入琼脂糖中
倒至凝胶平台上
LB
10g NaCl
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
加入蒸馏H2O至终体积为1升
用5N NaOH调节pH至7.0
高压灭菌
LB-羧苄青霉素琼脂
10g NaCl
10g胰蛋白胨
5g酵母提取物
加入蒸馏H2O至终体积为1升
用5N NaOH调节pH至7.0
高压灭菌
冷却至55℃
加入10ml 10mg/ml滤器灭菌的羧苄青霉素
倒入皮氏培养皿中(25ml/100-mm平板)
SOC培养基
0.5g NaCl
20g胰蛋白胨
0.5g酵母提取物
2ml滤器灭菌的20%葡萄糖
加入蒸馏H2O至终体积为1升
高压灭菌
在使用前加入10ml滤器灭菌的1M MgCl2和10ml滤器灭菌的1M MgSOs。
在第1天,用BsaI消化pBA载体。在冰上的微离心管中准备以下消化反应:
1.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)。
2.将反应在50℃下孵育过夜。
第2天
3.将2μL Apex磷酸酶加入微离心管中
4.在37℃下孵育10分钟
5.在70℃下加热5分钟,以灭活Apex磷酸酶
用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化BsaI消化的pBA载体
6.将500μL缓冲剂PBI加入微离心管中
7.通过涡旋混合并快速离心
8.一次加载750μL至柱上
9.在12,000x g下离心1分钟,并从收集管中轻轻倒出液体
10.重复直至处理了所有样品
11.用750μL PE缓冲液(加入了乙醇!)洗涤
12.在12,000x g下离心1分钟,并从收集管中轻轻倒出液体
13.将柱子放回收集管中并再次离心
14.将柱子放入新的微离心管上,并用50μL EB缓冲液洗脱
质量控制分析
1.为了质量控制BsaI消化的pBA载体,在1.5ml微离心管中设立了以下反应:
2.将10μL加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖TAE凝胶上。使用1kb加DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
3.用分光光度计(OD260/280)测定BsaI消化的pBA载体的浓度。
4.设立以下连接反应来确定BsaI消化的pBA载体的背景和连接效率:
a.载体背景连接
b.测试***片段连接
5.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)
6.在室温下孵育2小时或16℃下孵育过夜
7.将每个连接反应混合物转化至XLI Blue超感受态细胞中
8.将14ml BD Falcon聚丙烯圆底试管在冰上预冷。将SOC培养基温热至42℃。
9.将XLI Blue超感受态细胞在冰上解冻。解冻时,温和混合并将100ul细胞等分到每个预冷的试管中。
10.将1.7μLβ-巯基乙醇加入每个等份细胞中。将细胞在冰上孵育10分钟,每2分钟温和涡旋。
11.将2μL连接反应混合物加入一个等份细胞中。温和地轻弹试管。
12.将试管在冰上孵育30分钟。
13.将试管在42℃水浴中热脉冲45秒。
14.将试管在冰上孵育2分钟。
15.加入900ul预热的SOC培养基,并将试管在37℃下在225-250rpm下振荡孵育1小时。
16.将20μL和200μL转化混合物涂布于含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。
17.将平板在37℃下孵育过夜。
第3天
18.将菌落计数并且计算载体的效率和背景以及用于连接的***片段的最佳量。
将重链(HC)可变结构域连接至BsaI消化的pBA载体中
在冰上的微离心管中准备以下连接反应:
1.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)
2.将反应室温下孵育2小时或16℃下孵育过夜
3.将每个连接反应混合物转化至XLI Blue超感受态细胞中
4.将14ml BD Falcon聚丙烯圆底试管在冰上预冷。准备SOC培养基至42℃
5.将XLI Blue超感受态细胞在冰上解冻。解冻时,温和混合并将100ul细胞等分到每个预冷的试管中。
6.将1.7μLβ-巯基乙醇加入每个等份细胞中。将细胞在冰上孵育10分钟,每2分钟温和涡旋。
7.将2μL连接反应混合物加入一个等份细胞中。温和地轻弹试管。
8.将试管在冰上孵育30分钟。
9.将试管在42℃水浴中热脉冲45秒。
10.将试管在冰上孵育2分钟。
11.加入900ul预热的SOC培养基,并将试管在37℃下在225-250rpm下振荡孵育1小时。
12.将20μL和200μL转化混合物涂布于含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。
13.将平板在37℃下孵育过夜。
第4天
14.将平板上的菌落计数,并且挑选24个菌落用于迷你制备和测序。
15.重复转化以获得至少2000个菌落。
16.将6ml LB培养基加入含有菌落的每个平板中,并且用涂布器温和刮擦细菌,以形成密集的悬浮液。
17.用另外2ml LB培养基洗涤每个平板,以收集残余的细菌。
18.将细菌汇合在带有盖子的单个无菌烧瓶中。
19.取出一半汇合的细菌并进行质粒制备
20.向剩余的汇合细菌中,加入0.2体积的80%丙三醇并彻底混合。
21.将1-ml等份试样分配至无菌的1.5ml微离心管中并在-80℃下冷冻。
用QIAprep Spin Miniprep试剂盒纯化pBA-重链可变结构域(pBA-HC)
1.将沉淀的细菌细胞重悬浮于500μL P1缓冲液(含有RNase A)中,并且转移至两个微离心管中。
2.加入250μL P2缓冲液并且通过将试管颠倒4-6次来彻底混合。
3.加入350μL N3缓冲液,并且立即通过涡旋彻底混合。
4.在微离心管中在13,000rpm下离心10min(分钟)。
5.通过滗析将上清液施加于QIAprep离心柱上。
6.在微离心管中在13,000rpm下离心1min。丢弃流过物。
7.通过加入0.75ml PE缓冲液洗涤QIAprep离心柱。
8.在微离心管中在13,000rpm下离心10min。
9.丢弃流过物,并且再离心1min,以除去残余的洗涤培养基。
10.将QIAprep柱放入干净的1.5ml微离心管中。为了洗脱DNA,将50μL EB缓冲液加入每个QIAprep离心柱的中央,在室温下静置1min。
11.在微离心管中在13,000rpm下离心2min。
12.用分光光度计(OD260/280)测定DNA浓度。
pBA-HC文库的BsmBI消化
在冰上的微离心管中准备以下消化反应:
1.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)
2.将反应在55℃下孵育过夜。
第5天
3.将2μL Apex磷酸酶加入微离心管中
4.在37℃下孵育10分钟
5.在70℃下加热5分钟,以灭活Apex磷酸酶
用QIAquick PCR纯化试剂盒纯化BsmBI消化的pBA-HC文库
1.将500μL缓冲剂PBI加入微离心管中。
2.通过涡旋混合并快速离心。
3.一次加载750μL至柱上。
4.在12,000x g下离心1分钟,并从收集管中轻轻倒出液体。
5.重复直至处理了所有样品。
6.用750μL PE缓冲液(加入了乙醇!)洗涤。
7.在12,000x g下离心1分钟,并从收集管中轻轻倒出液体。
8.将柱子放回收集管中并再次离心。
9.将柱子放入新的微离心管上,并用50μL EB缓冲液洗脱。
质量控制分析
1.为了质量控制BsmBI消化的pBA-HC文库,在1.5ml微离心管中设立了以下反应:
2.将10μL加载至含有0.5μg/ml溴化乙锭的1%琼脂糖TAE凝胶上。使用1kb加DNA序列梯作为标准。将凝胶在1X TAE缓冲液中在100V下运行20-30分钟。
3.用分光光度计(OD260/280)测定BsmBI消化的pBA-HC文库的浓度。
4.设立以下对照连接反应来确定BsmBI消化的pBA载体的背景和连接效率:
a.载体背景连接
b.测试***片段连接
5.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)
6.在室温下孵育2小时或16℃下孵育过夜
7.将每个连接反应混合物转化至XLI Blue超感受态细胞中
8.将14ml BD Falcon聚丙烯圆底试管在冰上预冷。将SOC培养基温热至42℃。
9.将XLI Blue超感受态细胞在冰上解冻。解冻时,温和混合并将100ul细胞等分到每个预冷的试管中。
10.将1.7μLβ-巯基乙醇加入每个等份细胞中。将细胞在冰上孵育10分钟,每2分钟温和涡旋。
11.将2μL连接反应混合物加入一个等份细胞中。温和地轻弹试管。
12.将试管在冰上孵育30分钟。
13.将试管在42℃水浴中热脉冲45秒。
14.将试管在冰上孵育2分钟。
15.加入900ul预热的SOC培养基,并将试管在37℃下在225-250rpm下振荡孵育1小时。
16.将20μL和200μL转化混合物涂布于含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。
17.将平板在37℃下孵育过夜。
第6天
18.将菌落计数并且计算载体的效率和背景以及用于连接的***片段的最佳量。
将轻链(LC)可变结构域连接至BsmBI消化的pBA-HC文库中
在冰上的微离心管中准备以下连接反应:
1.温和混合并在微离心机中简短离心(5sec.)
2.将反应室温下孵育2小时或16℃下孵育过夜
3.将每个连接反应混合物转化至XLI Blue超感受态细胞中
4.将14ml BD Falcon聚丙烯圆底试管在冰上预冷。将SOC培养基准备至42℃
5.将XLI Blue超感受态细胞在冰上解冻。解冻时,温和混合并将100ul细胞等分到每个预冷的试管中。
6.将1.7uLβ-巯基乙醇加入每个等份细胞中。将细胞在冰上孵育10分钟,每2分钟温和涡旋。
7.将2uL连接反应混合物加入一个等份细胞中。温和地轻弹试管。
8.将试管在冰上孵育30分钟。
9.将试管在42℃水浴中热脉冲45秒。
10.将试管在冰上孵育2分钟。
11.加入900ul预热的SOC培养基,并将试管在37℃下在225-250rpm下振荡孵育1小时。
12.将20μL和200μL转化混合物涂布于含有羧苄青霉素的LB琼脂平板上。
13.将平板在37℃下孵育过夜。
第7天
14.将平板上的菌落计数,并且挑选48个菌落用于迷你制备和测序。
15.重复转化以获得至少20,000个菌落。
16.将6ml LB培养基加入含有菌落的每个平板中,并且用涂布器温和刮擦细菌,以形成密集的悬浮液。
17.用另外2ml LB培养基洗涤每个平板,以收集残余的细菌。
18.将细菌汇合在带有盖子的单个无菌烧瓶中。
19.向剩余的汇合细菌中,加入0.2体积的80%丙三醇并彻底混合。
20.将1-ml等份试样分配至无菌的1.5ml微离心管中并在-80℃下冷冻。
实施例5.将人源化文库转染至CHO-S细胞中。
该实验方案描述了将DNA转染至CHO-S细胞中的方法。估算的完成时间为3天,每人384个样品。表4显示了所需的试剂、消耗品和设备。
表4:试剂、消耗品和设备
该实验方案需要以下缓冲剂。
热灭活的胎牛血清
原始销售瓶中的500ml热灭活胎牛血清
在56℃下加热30分钟,每5分钟混合
制备50ml等份试样并存储在-20℃
补充血清的达尔伯克改良伊格尔培养基
500ml达尔伯克改良伊格尔培养基
50ml热灭活的胎牛血清
5ml 10mM MEM非必需氨基酸
第1天
1.在转染一周前,将CHO-S细胞转移至补充血清的达尔伯克改良伊格尔培养基(D-MEM)中的单层培养物中。
2.在转染前一天,将0.4x 105个细胞涂布于96孔形式中的每个转染样品100μl补充血清的D-MEM中。
第2天
3.在工作日结束时进行转染。
4.对于每个转染样品,制备DNA-Lipofectamine复合物。
5.将0.2μg DNA于25μL Opti-MEM低血清培养基中稀释。温和混合。
6.将0.5μL Lipofecctamine于25μL Opti-MEM低血清培养基中稀释。温和混合并在室温下孵育5min。
7.将稀释的DNA和稀释的Lipofectamine混合。温和混合,并在室温下孵育20min。
8.将50μL DNA-Lipofectamine复合物加入含有细胞和培养基的每个孔中。通过将平板前后摇摆来温和混合。
9.将细胞在37℃下在5%CO2培养箱中孵育过夜。
第3天
10.吸出每个孔中的培养基。将100μL补充血清的D-MEM加入每个孔中。收集用于ELISA试验的上清液和用于β-半乳糖苷酶试验的细胞裂解物。
实施例6.通过定量ELISA测定人源化克隆的表达水平
该实验方案描述了测定细胞培养物上清液中抗体表达水平的方法。估算的完成时间为2天,每人96个样品。表5显示了所需的试剂、消耗品和设备。
表5:试剂、消耗品和设备
该实验方案需要以下缓冲液。
洗涤溶液
PBS中的0.05%吐温-20
封闭溶液
PBS中的2%Carnation脱脂奶
第1天
11.用100μL涂覆溶液中10μg/ml亲和性纯化的Fc-特异性山羊抗人IgG涂覆Nunc-Immuno Maxisorp 96孔平板。
12.用密封物盖住平板并在4℃下孵育过夜。
第2天
13.滗析平板并且敲出残余液体。
14.加入200ul洗涤溶液。在室温下在200rpm下振荡5min。
15.滗析平板并且敲出残余液体。
16.加入200ul封闭溶液。在室温下在200rpm下振荡1小时。
17.滗析平板并且敲出残余液体。
18.将双份的封闭溶液中100ul/孔的标准化浓度的纯化人血清IgG加入平板中。
19.将双份的100ul来自转染程序的上清液加入平板中。
20.在室温下在200rpm下振荡一小时。
21.滗析平板并且敲出残余液体。
22.加入200ul洗涤溶液。在室温下在200rpm下振荡5min。
23.重复步骤11-123次。
24.将100ul封闭溶液中1:5000稀释的亲和性纯化的山羊抗人抗体与HRP的缀合物加入每个孔中。
25.在室温下在200rpm下振荡一小时。
26.滗析平板并且敲出残余液体。
27.加入200ul洗涤溶液。在室温下在200rpm下振荡5min。
28.重复步骤17-183次。
29.将100ul Sigma TMB底物加入每个孔中。在室温下孵育并且每2-5分钟检查。
30.加入100ul 1N HCl以停止反应。
31.在450nm处阅读。
实施例7.通过亲和性ELISA测定人源化克隆的亲和性
该实验方案描述了比较细胞培养物上清液中的抗体的亲和性的方法。估算的完成时间为2天,每人96个样品。表6显示了所需的试剂、消耗品和设备。
表6:试剂、消耗品和设备
该实验方案所需的缓冲液与实施例6中所述的相同。
第1天
32.用100μL涂覆溶液中2μg/ml抗原涂覆Nunc-Immuno Maxisorp 96孔平板。
33.用密封物盖住平板并在4℃下孵育过夜。
第2天
34.滗析平板并且敲出残余液体。
35.加入200ul洗涤溶液。在室温下在200rpm下振荡5min。
36.滗析平板并且敲出残余液体。
37.加入200ul封闭溶液。在室温下在200rpm下振荡1小时。
38.滗析平板并且敲出残余液体。
39.将双份的封闭溶液中100ul/孔的对照抗体(2μg/ml)加入平板中。
40.将双份的100ul来自转染(SOP 5A)的上清液加入平板中。
41.在室温下在200rpm下振荡一小时。
42.滗析平板并且敲出残余液体。
43.加入200ul洗涤溶液。在室温下在200rpm下振荡5min。
44.重复步骤11-123次。
45.将100ul封闭溶液中1:5000稀释的亲和性纯化的山羊抗人抗体与HRP的缀合物加入每个孔中。
46.在室温下在200rpm下振荡一小时。
47.滗析平板并且敲出残余液体。
48.加入200ul洗涤溶液。在室温下在200rpm下振荡5min。
49.重复步骤17-183次。
50.将100ul Sigma TMB底物加入每个孔中。在室温下孵育并且每2-5分钟检查。
51.加入100ul 1N HCl以停止反应。
52.在450nm处阅读。
实施例8.BA001和人源化衍生物的Biacore(表面等离子体共振)亲和性测量
用BIAcore 3000,GE Healthcare测定结合曲线和动力学参数。将抗人Fc(1.8mg/ml)在NaOAc缓冲液(10mM,pH 4.8)中稀释至50ug/ml的浓度,并且使用BIAcore***手册中所述的制造商的胺偶联化学与CM-5传感器芯片的羧甲基化的葡聚糖基质偶联。使用针对10000RU的表面制备范例,首先用NHS/EDC激活传感器表面上的羧基,接着添加抗人Fc。通过注入1M乙醇胺来封闭剩余的激活基团。每个流动细胞单独偶联。使用这些条件,制备了含有7554-9571RU的抗人Fc的四个流动细胞表面。在初步实验中,确定了三次注入(15ul,以30ul/min)100mM H3PO4/0.05%CHAPS将有效除去结合的免疫球蛋白并且保持固定化抗人Fc的结合能力。
在BIAcore上,在25℃和30ul/min的流速下,进行了实验。将抗体候选物以5ug/ml溶解于HBS(10mM HEPED,含有0.15M NaCl、3.4mM EDTA和0.05%表面活性剂P20,pH7.4)中。将分析物IL-6以0.25、0.125、0.062和0.015ug/ml溶解于HBS中。将3*30ul的5ug/ml的抗体BA001流过各自的流动细胞,接着以30ul/min注入240ul的每个IL-6浓度(缔合阶段)和连续的1200秒缓冲液流动(解离阶段)。通过三次连续注入15ul来再生芯片的表面,每次使用100mM H3PO4/0.05%CHAPS。HBS的注入作为参照(空白sensogram),用于减去本体折射率,用于分析。在BIAevaluation 4.1中使用1:1模型,对于解离(kd,[s-1]和缔合(ka,[M-1s-1])两者都进行了局部拟合和整体拟合,并计算(kd/ka)解离常数(KD,[M])。
使用BIAeveluation 3.0版本进行了分析。通过将实验曲线与源自相互作用机制模型的速率方程拟合,从sensogram数据产生动力学常数。使用1:1结合模型,使用局部RUmax拟合、ka、kd和KD,测定了整体分析。
利用了以下等式:
图4中列出了亲和性成熟之前人源化抗-IL6Mabs的Biacore数据。
实施例9.由模板抗-IL6抗体制备人源化抗体
用于模板抗体和前导苗头(leader hit)和片段核酸和蛋白序列的序列公开于Frey等美国公开第2010/0138945号,Humanized Anti-IL-6 Antibodies(US PublicationNo.2010/0138945,Humanized Anti-IL-6 Antibodies,Frey et al.)中,通过引用将其全部并入文本中。在这个实施例中,模板抗体是BA001;抗人IL-6抗体。模板抗体BA001与CNTO328相比,是相同序列,但是在不同表达***中制造的,CNTO328是来自US2006/0257407的嵌合、人-小鼠抗体,按引用将其并入本文中。
图1显示了与用于人源化模板抗体BA001类似的方法的示意图。实施例1-8中描述了详细步骤。将模板抗体克隆,并且鉴定每个互补性决定区(CDR)的序列。合成初始CDR;并且制备了基于每个CDR的合成ds DNA片段文库。只由获自人种系序列的人功能表达抗体制备了人框架集合。将CDR和人框架组装,在这种情况中,通过逐步液相连接,来形成人源化轻链(LC)可变结构域编码文库;和人源化重链(HC)可变结构域编码文库。将LC和HC结构域***载体中。在一个方面中,载体含有编码LC和HC框架4的序列。转染含有***片段的载体并在哺乳动物细胞系中表达,以制备全长人抗体变体文库;在这种情况中,制备人IgG变体文库。筛选文库,以选择至少一个特征与供体抗体相当或更优的人源化抗体,所述特征例如抗原亲和性或在哺乳动物生产细胞系中的表达水平。图2显示了来自模板抗体BA001的人源化变体的初级筛选的数据。初级筛选包含与供体抗体相比的变体的高通量ELISA,供体抗体用星号显示。ELISA用于测定抗原结合和定量。实施例中详细呈现了ELISA实验方案。
图3显示了就表达和功能而言,与模板抗体BA001相比,头8个证实的人源化抗体变体苗头。苗头的选择基于抗原结合、在哺乳动物细胞系中的表达水平和序列多样性。所示的BA001和人源化变体的DNA和蛋白序列描述于美国公开第US2010/0138945号中,通过引用将其并入本文中。
图4显示了与模板抗体相比,人源化抗IL-6抗体的结合亲和性BiaCore表面等离子体共振数据。模板CNTO328即嵌合的、人-小鼠抗体的数据来自美国2006/0257407(US2006/0257407),通过引用将其并入本文中。BA001也是具有与模板CNTO328相同序列的模板抗体,但是在不同表达***中制造的。获得了人源化变体抗体h1-h8,没有另外的亲和性成熟。
图5显示了ELISA的结果,其中人源化抗体变体阻断了模板抗体BA001的抗原结合。
显然,本发明可以以不同于之前的描述和实施例中特别描述的方式来实施。根据以上的教导,本发明的各种改变和变化是可能的,并且因此落入所附权利要求的范围内。
Claims (20)
1.一种生产人源化抗体或人源化抗体片段的方法,所述方法包括:
(a)合成包含重链互补性决定区片段编码文库和重链框架片段编码文库的免疫球蛋白重链双链DNA片段文库,
其中所述重链互补性决定区片段编码文库包括其中文库的每个双链DNA片段编码重链互补性决定区并且每个双链DNA片段源自模板抗体的重链互补性决定区1的重链互补性决定区1编码文库;其中文库的每个双链DNA片段编码重链互补性决定区并且每个双链DNA片段源自模板抗体的重链互补性决定区2的重链互补性决定区2编码文库;以及其中文库的每个双链DNA片段编码重链互补性决定区并且每个双链DNA片段源自模板抗体的重链互补性决定区3的重链互补性决定区3编码文库,
所述重链框架片段编码文库包括其中文库的每个双链DNA片段编码至少部分重链框架并且每个双链DNA片段源自从功能表达的人抗体获得的人重链框架1集合的重链框架1编码文库;其中文库的每个双链DNA片段编码至少部分重链框架并且每个双链DNA片段源自从功能表达的人抗体获得的人重链框架2集合的重链框架2编码文库,以及其中文库的每个双链DNA片段编码至少部分重链框架并且每个双链DNA片段源自从功能表达的人抗体获得的人重链框架3集合的重链框架3编码文库;
(b)合成包含轻链互补性决定区片段编码文库和轻链框架片段编码文库的免疫球蛋白轻链双链DNA片段文库,
其中所述轻链互补性决定区片段编码文库包括其中文库的每个双链DNA片段编码轻链互补性决定区并且每个双链DNA片段源自模板抗体的轻链互补性决定区1的轻链互补性决定区1编码文库;其中文库的每个双链DNA片段编码轻链互补性决定区并且每个双链DNA片段源自模板抗体的轻链互补性决定区2的轻链互补性决定区2编码文库;以及其中文库的每个双链DNA片段编码轻链互补性决定区并且每个双链DNA片段源自模板抗体的轻链互补性决定区3的轻链互补性决定区3编码文库,
所述轻链框架片段编码文库包括其中文库的每个双链DNA片段编码至少部分轻链框架并且每个双链DNA片段源自从功能表达的人抗体获得的人轻链框架1集合的轻链框架1编码文库;其中文库的每个双链DNA片段编码至少部分轻链框架,并且每个双链DNA片段源自从功能表达的人抗体获得的人轻链框架2集合的轻链框架2编码文库;以及其中文库的每个双链DNA片段编码至少部分轻链框架并且每个双链DNA片段源自从功能表达的人抗体获得的人轻链框架3集合的轻链框架3编码文库;
(c)通过以框架1-互补性决定区1-框架2-互补性决定区2-框架3-互补性决定区3的顺序逐步液相连接来自所述重链框架片段编码文库的重链框架编码片段和来自所述重链互补性决定区片段编码文库的重链互补性决定区编码片段,由所述重链片段文库组装,以产生人源化重链可变结构域编码文库;
(d)通过以框架1-互补性决定区1-框架2-互补性决定区2-框架3-互补性决定区3的顺序逐步液相连接来自所述轻链框架片段编码文库的轻链框架编码片段和来自所述轻链互补性决定区片段编码文库的轻链互补性决定区编码片段,由所述轻链片段文库组装,以产生人源化轻链可变结构域编码文库;
(e)将组装的人源化重链可变结构域编码文库和组装的轻链可变结构域编码文库克隆至表达载体中,以形成人源化文库,所述表达载体包含编码重链框架区4的核苷酸序列和编码轻链框架区4的核苷酸序列,所述编码重链框架区4的核苷酸序列源自功能表达的人抗体的人重链可变结构域,所述编码轻链框架区4的核苷酸序列源自功能表达的人抗体的人轻链可变结构域;
(f)将所述人源化文库转染至细胞中;
(g)在所述细胞中表达人源化抗体或人源化抗体片段,以形成人源化抗体文库;
(h)筛选所述人源化抗体文库,以测定所述人源化抗体或人源化抗体片段的表达水平;和
(i)筛选所述人源化抗体文库,以选择与所述模板抗体对抗原的亲和性相比对相同抗原的亲和性更高的人源化抗体或人源化抗体片段。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述人源化抗体文库具有10000000个成员或更少。
3.如权利要求2所述的方法,其中所述人源化抗体文库具有1000000个成员或更少。
4.如权利要求3所述的方法,其中所述人源化抗体文库具有100000个成员或更少。
5.如权利要求1所述的方法,其中所述克隆步骤包括将所述组装的人源化重链可变结构域编码文库克隆至所述表达载体中,以形成载体-重链可变结构域DNA文库,并且将所述组装的轻链可变结构域编码文库连接至所述载体-重链可变结构域DNA文库中,以形成所述人源化文库。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述表达步骤包括由单个启动子表达所述人源化重链可变结构域和所述人源化轻链可变结构域。
7.如权利要求1所述的方法,还包括筛选与所述模板抗体相比具有一种或多种其他改善的特征的人源化抗体或人源化抗体片段的步骤;所述一种或多种特征选自:平衡离解常数KD;稳定性;解链温度Tm;pI;溶解度;表达水平;相对于所述模板抗体降低的免疫原性和改善的效应子功能。
8.如权利要求1所述的方法,其中所述细胞选自真核细胞生产宿主细胞系,所述细胞系选自:3T3小鼠成纤维细胞;BHK21叙利亚仓鼠成纤维细胞;MDCK,狗上皮细胞;Hela人上皮细胞;PtK1鼠袋鼠上皮细胞;SP2/0小鼠浆细胞;NS0小鼠浆细胞;COS猴肾细胞;CHO-S中国仓鼠卵巢细胞;R1小鼠胚细胞;E14.1小鼠胚细胞;酿酒酵母(S.cerevisiae)酵母细胞;和毕赤酵母细胞。
9.如权利要求8所述的方法,其中所述真核细胞生产宿主细胞系是CHO-S。
10.如权利要求8所述的方法,其中所述真核细胞生产宿主细胞系是CHOK1SV或NS0。
11.如权利要求1所述的方法,其中所述细胞是具有抗体细胞表面展示的真核细胞生产宿主的细胞。
12.如权利要求11所述的方法,其中在所述真核细胞生产宿主中进行一个或两个所述筛选步骤。
14.如权利要求1所述的方法,其中所述编码重链互补性决定区的双链DNA片段通过演化所述模板抗体的互补性决定区而衍生自所述模板抗体。
15.如权利要求1所述的方法,其中所述编码轻链互补性决定区的双链DNA片段通过演化所述模板抗体的互补性决定区而衍生自所述模板抗体。
16.如权利要求14或15所述的方法,其中所述演化互补性决定区通过氨基酸取代、氨基酸***和氨基酸缺失中的一种或多种来完成。
17.如权利要求14或15所述的方法,其中所述演化互补性决定区通过全面位置演化、全面蛋白合成、弯曲演化、协同演化、全面位置***演化或全面位置缺失演化来完成。
18.如权利要求1所述的方法,其中所述表达载体包含编码人抗体的恒定区的核苷酸序列以确保所述人源化抗体文库中的人源化抗体是全长人源化抗体。
19.如权利要求1所述的方法,其中所述细胞选自真核细胞生产宿主细胞系,所述真核细胞生产宿主细胞系选自CHO细胞。
20.如权利要求1所述的方法,其中所述筛选步骤(i)为亲和性ELISA。
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