CN117229979B - 一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物领域，公开了一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌及其应用；所述产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌HZ11分类命名为延长微泡菌Microbulbifer elongatus，于2023年08月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28090；该菌可产褐藻胶裂解酶，也可降解褐藻；所述褐藻胶裂解酶活性可达87.108U·mL^‑1；本发明还提供了上述延长微泡菌在生产褐藻胶裂解物中应用。相比现有技术，本发明提供的菌株可用于制备褐藻胶寡糖，对于提高褐藻胶利用效率，促进功能褐藻胶寡糖的开发与制备具有重要意义。

Description

一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体涉及一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌及其应用。

背景技术

褐藻胶是褐藻细胞壁的重要结构组分，约占藻体干重的18%-40%，由（1-4）糖苷键连接的β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）及α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronicacid，G）构成。褐藻胶具有凝胶性、稳定性和粘性，在食品、药品、化妆品、化肥、纺织品生产中作为稳定剂、保湿剂、增稠剂和乳化剂，发挥着重要作用。此外，褐藻胶还具有降血脂、抗肿瘤、抗菌等生物活性。

市售褐藻胶分子量多为33000-400000Da，溶解速度慢，溶液黏度大，难以穿透生物膜被机体吸收利用。而降解后聚合度为2-25的褐藻胶寡糖（Alginate oligosaccharide，AOS）往往表现出更好的物化特性及更高的生物活性。AOS的生物活性受聚合度及M/G构成比例的影响。因此，如何高效、定向制备AOS成为AOS研究利用的重点问题，生物降解法是解决该问题的潜在手段之一。

生物降解法通常指通过添加褐藻胶裂解酶，或通过微生物发酵产生褐藻胶裂解酶对褐藻胶进行降解，获得AOS，具有反应条件温和、生物酶作用位点专一、产率高等优点，可以有效规避物理、化学降解过程中出现的能耗高、反应时间长、重复性差、污染环境等问题。已鉴定的褐藻胶裂解菌主要来自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、弧菌属（Vibrio sp.）以及鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）。但由于大部分褐藻胶裂解菌菌株产酶能力较低，所以尚未实现微生物发酵制备AOS的工业规模化生产。基于此，发掘筛选高效、安全的褐藻胶裂解菌具有重要意义与实际生产价值。

专利申请CN116606769A公开了一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌突变株及其应用，提供了一株生产褐藻胶裂解酶的弗氏弧菌C3-2(Vibrio furnissii C3-2)，该菌株所产生的褐藻胶裂解酶的酶活力较野生菌株提升了40％以上，且褐藻胶裂解酶对碱性环境的耐受性更强，同时遗传特性稳定，具有良好的工业发展前景。然而，采用该菌株生产褐藻胶裂解酶的效率依旧难以满足工业生产要求。

提供一种高效的产褐藻胶裂解酶菌株是本领域待解决的重要问题之一。

发明内容

本发明提供了一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌及其应用，该菌株可在温和的外界条件下（温度约25-32℃，pH 7.0左右）利用自身合成的胞外酶将褐藻胶降解为褐藻胶寡糖。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌HZ11，分类命名为延长微泡菌Microbulbifer elongatus，于2023年08月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28090，保藏地址为中国北京。

所述延长微泡菌HZ11分离自浙江舟山群岛附近的海水，利用以褐藻胶为唯一碳源的平板定向筛选得到。

所述延长微泡菌HZ11的生理生化特征如下：

在25℃的培养温度下，菌株可生长pH值为6.5-8.5，可生长氯化钠浓度为20-90g/L。

按2%的接种量，将HZ11种子液分别接种至1L 2216E和产酶培养基中，25℃，120转/min培养，每隔2小时取样，检测培养基OD600吸光值变化情况，绘制HZ11生长曲线。检测发现，在2216E培养基中，HZ11大约在接种8小时后进入对数生长期，26小时后进入平缓期，培养至36h开始衰亡。而在产酶培养基中，HZ11在接种10小时后进入对数生长期，24小时后进入平缓期，培养至38h开始衰亡。

本发明所采用的培养基组分组成如下：

2216E固体培养基：蛋白胨 5g，酵母提取物 1g，磷酸铁 0.01g，琼脂20g，海水1L，121℃高温高压灭菌20min。

2216E液体培养基：蛋白胨 5g，酵母提取物 1g，磷酸铁 0.01g，海水1L，121℃高温高压灭菌20min。

产酶培养基：褐藻胶 5g，硫酸铵 5g，磷酸氢二钾 2g，氯化钠 30g，七水合硫酸镁1g，七水合硫酸亚铁 0.01g，去离子水 1L，pH自然，121℃高温高压灭菌20min。

本发明还提供了一种采用上述延长微泡菌HZ11（Microbulbifer elongatus）制备褐藻胶裂解酶的方法，包括以下步骤：

（1）将保藏编号为CGMCC No.28090的延长微泡菌HZ11（Microbulbifer elongatus）活化，得到活化菌落；

（2）将步骤（1）得到的活化菌落接种，培养，得到菌株种子液；

（3）将步骤（2）得到的菌株种子液接种，培养，离心除去沉淀，提取，即得。

优选地，步骤（1）中所述活化为：将所述延长微泡菌置于2216E固体培养基上活化菌株。

进一步优选地，所述活化菌株的过程为：将冷冻菌液在2216E固体培养基划线，倒置培养。

更进一步优选地，所述倒置培养的温度为28-32℃，时间为22-26h。

优选地，步骤（2）中所述接种为：接种于2216E液体培养基。

优选地，步骤（2）中所述培养为：培养至OD 600=0.6-0.8。

进一步优选地，所述培养的条件为：温度25-28℃，转速100-140rpm，时间22-26h。

优选地，步骤（3）中所述接种为：接种于产酶培养基。

进一步优选地，所述接种的接种量为2%（v/v）。

优选地，步骤（3）中所述培养的条件为：温度25-28℃，转速100-140rpm，时间22-26h。

本发明还提供了采用上述方法制备的褐藻胶裂解酶。

本发明还提供了上述延长微泡菌HZ11在制备褐藻胶降解物中的应用。

本发明还提供了上述褐藻胶裂解酶在制备褐藻胶降解物中的应用。

本发明还提供了采用上述褐藻胶裂解酶制备褐藻胶降解物的方法，包括以下步骤：

S1.将保藏编号为CGMCC No.28090的延长微泡菌HZ11（Microbulbifer elongatus）活化，得到活化菌落；

S2.将步骤S1得到的活化菌落接种，培养，得到菌株种子液；

S3.将步骤S2得到的菌株种子液按2%接种量，接种至含褐藻胶的产酶培养基中，25-28℃，120转/min培养40小时；

或

S1.将保藏编号为CGMCC No.28090的延长微泡菌HZ11（Microbulbifer elongatus）活化，得到活化菌落；

S2.将步骤S1得到的活化菌落接种，培养，得到菌株种子液；

S3.将步骤S2得到的菌株种子液接种，培养，离心除去沉淀，取上清液，按8%添加量加入含褐藻胶的缓冲溶液中，降解褐藻胶。

优选地，所述缓冲溶液包括以下组分：

褐藻胶、磷酸一氢钠、磷酸二氢钠和氯化钠。

更进一步优选地，所述缓冲溶液的pH=7.5。

最优选地，所述缓冲溶液包括以下浓度的组分：

褐藻胶0.05kg/L、磷酸一氢钠和磷酸二氢钠共50mM及氯化钠300mM。

本发明的有益效果为：

本发明提供的保藏号为CGMCC No.28090的延长微泡菌Microbulbifer elongatusHZ11菌株对于褐藻胶具有高效的降解作用。该菌株可在温和的外界条件下（温度约25-32℃，pH 7.0左右）利用自身合成的胞外酶将褐藻胶降解为褐藻胶寡糖。

本发明提供的菌株可用于制备褐藻胶寡糖，对于提高褐藻胶利用效率，促进功能褐藻胶寡糖的开发与制备具有重要意义。

保藏说明

保藏菌株：延长微泡菌HZ11；

分类命名：延长微泡菌Microbulbifer elongatus；

保藏编号：CGMCC No.28090；

保藏日期：2023年08月03日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏地址：中国北京。

附图说明

图1为菌株HZ11平板菌落形态图；

图2为菌株HZ11显微镜形态观察图（1000×）；

图3为HZ11 PCR产物琼脂糖凝胶电泳图；

图4为HZ11 16S rDNA***进化树；

图5为HZ11生长曲线图；

图6为葡萄糖标准曲线图；

图7为酶解产物薄层层析分析图；

图8为HZ11在琼脂平板上的生长情况图；

图9为HZ11在淀粉平板上的生长情况图；

图10为HZ11在羧甲基纤维素钠平板上的生长情况图；

图11为未接种HZ11及接种HZ11降解海带3天后的形态图（a为对照组；b、c为两组实验组）；

图12为未接种HZ11及接种HZ11降解铜藻5天后的形态图（a为对照组，b、c、d为三组实验组）；

图13为图12降解后铜藻上清液图（a为对照组，b、c、d为三组实验组）。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做详细说明。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的含义相同。

本发明的实施或测试中可以使用与本发明所述相似或等价的任何方法和材料，此处列举优选的方法和材料。

本发明中使用的原料均为普通市售产品，对其来源不做具体限定。

以下原料来源，为示例性说明：

本发明采用的设备及仪器如下：

本发明所采用的培养基组分组成如下：

2216E固体培养基：蛋白胨 5g，酵母提取物 1g，磷酸铁 0.01g，琼脂20g，海水1L，121℃高温高压灭菌20min。

2216E液体培养基：蛋白胨 5g，酵母提取物 1g，磷酸铁 0.01g，海水1L，121℃高温高压灭菌20min。

产酶培养基：褐藻胶 5g，硫酸铵 5g，磷酸氢二钾 2g，氯化钠 30g，七水合硫酸镁1g，七水合硫酸亚铁 0.01g，去离子水 1L，pH自然，121℃高温高压灭菌20min。

实施例1 HZ11菌体形态观察及16S rDNA鉴定

该菌株在2216E固体培养基上，30℃倒置培养24h，生长出边缘光滑整齐的乳白色圆形菌落（图1）；经革兰氏染色，该菌株为革兰氏阴性菌，镜检观察为细长杆状（图2）。

利用2216E液体培养基将菌株培养至OD600=0.6-0.8，提取细菌总DNA，以此为模板扩增16S rDNA序列，所用引物为27F（SEQ ID No.1）与 1492R（SEQ ID No.2）。所得到的PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，为明亮单一条带，长度约为1500 bp（图3）。将该PCR产物送至北京睿博兴科生物技术有限公司测序（测序结果如SEQ ID No.3所示）。测序结果在NCBI（National Center for Biotechnology Information）数据库进行BLAST比对，该序列与Microbulbifer属微生物16S rDNA序列具有较高的相似度，***发育树如图4所示。HZ11与Microbulbifer elongatus的16S rDNA序列相似度最高，为99.93%，结合上述菌体形态观察结果，鉴定该菌株为延长微泡菌（Microbulbifer elongatus）。

实施例2 HZ11生理生化特征

在25℃的培养温度下，HZ11菌株可生长pH值为6.5-8.5，可生长氯化钠浓度为20-90g/L。

配制HZ11种子液：

取200mL 2216E液体培养基，接种100μL HZ11冻存甘油菌液，25℃，120rpm摇床培养至OD=0.6，作为HZ11种子液备用。

按2%的接种量，将HZ11种子液分别接种至1L 2216E液体培养基和1L产酶培养基中，25℃，120rpm培养，每隔2h取样，检测培养基OD600吸光值变化情况，绘制HZ11生长曲线。检测发现，在2216E液体培养基中，HZ11大约在接种8小时后进入对数生长期，26h后进入平缓期，培养至36h开始衰亡。而在产酶培养基中，HZ11在接种10h后进入对数生长期，24h后进入平缓期，培养至38h开始衰亡（图5）。

实施例3 HZ11产胞外褐藻胶裂解酶酶活检测

（1）制备褐藻胶裂解酶粗酶液。

将HZ11种子液按2%接种量接种至产酶培养基中，产酶培养基装液量为50mL/300mL（培养基体积/锥形瓶容器体积），28℃，120rpm培养40h。培养结束后，离心除去菌体沉淀，所得上清液即为褐藻胶裂解酶粗酶液。

（2）绘制葡萄糖标准曲线。

准确配制1mg/mL D-无水葡萄糖标准溶液，分别吸取0、20、40、60、80、100、120、140、160、180、200μL标准溶液于洁净离心管中，补充无菌水至终体积为200μL。每管加入150μL DNS试剂混合均匀，煮沸反应10min，冷却后加入1mL无菌水混合均匀，检测OD540吸光值，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，OD540为纵坐标绘制标准曲线（图6）。

（3）HZ11褐藻胶裂解酶酶活检测

将80μL粗酶液与920μL褐藻胶底物溶液（褐藻胶0.5%（m/v），NaH₂PO₄-Na₂HPO₄50mM，氯化钠 300mM，pH=7.5）混合均匀，30℃水浴30min；在其他条件不变的情况下，另设粗酶液煮沸10min灭活作为对照组。反应结束后，取200μL粗酶液与褐藻胶底物溶液反应得到的反应液与150μL DNS溶液混合均匀，煮沸反应10min，冷却后加入1mL无菌水混合均匀，检测OD540吸光值变化情况；设置3组平行实验。

酶活力单位的定义：在以上反应条件下，1min内生产1μg的还原糖所需的褐藻胶裂解酶的含量为一个酶活力单位（U·mL^-1）。具体计算公式如下：

酶活力（U·mL^-1）=（m×N×1000）/（T×V）

m——粗酶液酶促反应产生的还原糖含量（mg），根据葡萄糖标准曲线和OD540计算；

N——发酵上清液稀释倍数（未稀释为1）；

T——酶促反应时间；

V——酶液（发酵上清液）体积；

据此公式，计算得到在该培养条件下，HZ11所产胞外褐藻胶裂解酶酶活为87.108U·mL^-1。

（4）酶解产物薄层层析分析

将80μL HZ11褐藻胶裂解酶粗酶液与920μL 1%褐藻胶底物（褐藻胶1%（m/v），NaH₂PO₄-Na₂HPO₄50mM，氯化钠 300mM，pH 7.5）混合均匀，30℃酶解24h。

对酶解产物进行薄层层析鉴定。以正丁醇：乙酸：水（3：2：3，v/v/v）为展开剂，酶解产物在硅胶板上点样，置于层析缸中展开。层析结束后，将硅胶板取出晾干，喷洒显色剂（硫酸：乙醇=1：9，v/v），用电炉烘烤显色。实验结果表明，HZ11酶解褐藻胶产物主要为褐藻胶二糖（图7）。

图7中：A：D-甘露糖醛酸单糖标准品，B：D-甘露糖醛酸二糖标准品，C：酶解产物，D：未酶解褐藻胶底物。

实施例4 HZ11产其他胞外多糖降解酶鉴定

配制分别以淀粉、羧甲基纤维素钠和琼脂为碳源的固体平板培养基。培养基内容物包括：硫酸铵5g/L，七水合硫酸镁1g/L，磷酸氢二钾2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠30g/L，琼脂1.2%-1.5%（m/v）。在以淀粉或羧甲基纤维素钠为碳源的培养基中，在上述内容物的基础上添加1%（m/v）的淀粉或羧甲基纤维素钠。

将40μL HZ11种子液分4次等量滴加到相应固体平板培养基上，30℃培养箱倒置培养48h。

培养结束后，以琼脂（图8）和淀粉（图9）为碳源的平板菌落周围明显出现水解圈。用15mL刚果红染液（1mg/mL）覆盖羧甲基纤维素钠平板表面，染色15min；弃染液，加入15mL氯化钠溶液（1M），脱色10min，弃氯化钠溶液。经染色后，羧甲基纤维素钠平板生长菌落周围出现透明水解圈（图10）。上述实验结果表明，HZ11还可以分泌胞外淀粉酶、琼脂酶、纤维素酶，以淀粉、琼脂或羧甲基纤维素钠为碳源生长。

实施例5 HZ11降解海带及铜藻情况

（1）HZ11降解海带：

海带用无菌水多次冲洗藻体表面，切成细小碎块备用。

设置一组对照组：向一个锥形瓶中加入6g海带碎块与20mL产酶培养基；

设置两组实验组：向两个锥形瓶分别加入6g海带碎块与19mL产酶培养基，再加入1mL HZ11种子液。将锥形瓶置于23℃ 180rpm摇床中振荡培养，定期观察海带碎块形态变化。

三组实验的海带碎块3天后都有不同程度的水解。对照组（未接种HZ11菌液）的海带碎块水解程度略差，且瓶壁粘附有较多的海带碎块（图11中a）；两组实验组（接种HZ11菌液）的海带碎块3天后几乎彻底水解，瓶壁附着的海带碎块残留较少（图11中b、c）。结果表明HZ11对于海带有较好的水解效果，且在单独作用时也能将海带水解得较为彻底。

（2）HZ11降解铜藻：

将铜藻用水彻底清洗去掉表面杂质后用滤纸吸干水分，在超净工作台内先用无菌水彻底清洗后再用无菌海水清洗干净备用。

设置一组对照组：将12g铜藻加入50mL无菌海水中；

设置三组实验组：分别将12g铜藻加入49mL无菌海水中，再分别加入1mL HZ11种子液；将锥形瓶置于25℃、120rpm摇床中振荡培养，定期观察铜藻形态变化。

7天后铜藻有不同程度的水解，将水解后的铜藻液离心收集上清液。对照组（未接种HZ11菌液）的铜藻水解程度较差（图12中a），水解上清液较为清澈（图13中a）；三组实验组（接种HZ11菌液）的铜藻水解程度略有不同，实验组一（图12中b）水解程度较好，水解液最为浑浊（图13中b）；实验组二、三水解程度相对较低（图12中c、d），水解上清液较为浑浊（图13中c、d）。结果表明HZ11对于铜藻有较好的水解效果。

对比例

由于对比例与本实验采用的酶活检测方法不同，且对比例未提供原始实验数据，因此无法对比二者酶活力。但本发明证明了除褐藻胶裂解酶外，HZ11还可产生淀粉酶、琼脂酶和纤维素酶（图8-图10），可以说明本发明相较于对比例的有益效果。

以上是结合具体实施例对本发明进一步的描述，但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (8)

1.一株产褐藻胶裂解酶的延长微泡菌HZ11，分类命名为延长微泡菌（Microbulbifer elongatus），于2023年08月03日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.28090，保藏地址为中国北京。

2.采用权利要求1所述的延长微泡菌制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于：包括以下步骤：

（1）将所述延长微泡菌HZ11活化，得到活化菌落；

（2）将步骤（1）得到的活化菌落接种，培养，得到菌株种子液；

（3）将步骤（2）得到的菌株种子液接种，培养，离心除去沉淀，提取，即得；

步骤（3）中所述接种为：接种于产酶培养基；

所述产酶培养基，包括以下组分：

褐藻胶、硫酸铵、磷酸氢二钾、氯化钠、七水合硫酸镁、七水合硫酸亚铁和去离子水。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（1）中所述活化为：将所述延长微泡菌置于2216E固体培养基上活化菌株；所述2216E固体培养基，包括以下组分：

蛋白胨，酵母提取物，磷酸铁，琼脂和海水。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述活化菌株的过程为：将冷冻菌液在2216E固体培养基划线，倒置培养；所述倒置培养的温度为28-32℃，时间为22-26h。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述接种为：接种于2216E液体培养基；步骤（2）中所述培养为：培养至OD600=0.6-0.8;

温度为25-28℃，转速为100-140rpm，时间为22-26h；

所述2216E液体培养基，包括以下组分：

蛋白胨，酵母提取物，磷酸铁和海水。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤（3）中所述接种的接种量为2%。

7.权利要求1所述的延长微泡菌在制备褐藻胶降解物中的应用。

8.一种制备褐藻胶降解物的方法，其特征在于：包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述的延长微泡菌HZ11活化，得到活化菌落；

S2.将步骤S1得到的活化菌落接种，培养，得到菌株种子液；

S3.将步骤S2得到的菌株种子液按2%接种量，接种至含褐藻胶的产酶培养基中，25-28℃，120rpm培养40小时；

或

S1.将权利要求1所述的延长微泡菌HZ11活化，得到活化菌落；

S2.将步骤S1得到的活化菌落接种，培养，得到菌株种子液；

S3.将步骤S2得到的菌株种子液接种，培养，离心除去沉淀，取上清液，按8%添加量加入含褐藻胶的缓冲溶液中，降解褐藻胶。