CN118006510B - 一株产褐藻胶裂解酶的微泡菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物领域，公开了一株产褐藻胶裂解酶的微泡菌及其应用；所述产褐藻胶裂解酶的微泡菌的分类命名为东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis），于2024年02月02日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：64370；该菌可产褐藻胶裂解酶；所述褐藻胶裂解酶活性可达25.2U·mL‑1；本发明还提供了上述微泡菌和来源于所述微泡菌的褐藻胶裂解酶在生产褐藻胶裂解物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一株产褐藻胶裂解酶的微泡菌及其应用。
背景技术
海藻酸钠，又名褐藻酸钠，最初自褐藻类生物生成的褐藻胶中提取，在工业中通常由β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和α-L-古罗糖醛酸（α-L-guluronic acid，G）通过1,4-糖苷键聚合而成，在食品工业中具有增稠、凝胶、稳定体系等多种用途。褐藻寡糖（Alginate Oligosaccharides，AOS）是一种聚合度为2-25的分子，由褐藻胶分解而成，具有调节人体免疫、抗氧化、抗肿瘤、保护神经***、促进植物生长、抑菌等多种功能。AOS因具有特殊的化学特性和生物特性，在农业、食品、药品、保健品、化妆品、冶金、化工等领域具有潜在、广泛的应用价值。此外，褐藻胶还具有降血脂、抗肿瘤、抗菌等生物活性。
市售褐藻胶的分子量多为33000-400000 Da，其溶解速度慢，溶液黏度大，难以穿透生物膜而被机体吸收利用。而降解后聚合度为2-25的褐藻寡糖往往表现出更好的物化特性及更高的生物活性。AOS的生物活性受聚合度及M/G构成比例的影响。因此，如何高效、定向制备AOS成为AOS研究利用的重点问题，其中，生物降解法是解决该问题的潜在手段之一。
生物降解法通常指通过添加褐藻胶裂解酶或通过微生物发酵产生褐藻胶裂解酶来对褐藻胶进行降解，从而获得AOS，该方法具有反应条件温和、生物酶作用位点专一、产率高等优点，可以有效规避物理、化学降解过程中出现的能耗高、反应时间长、重复性差、污染环境等问题。已鉴定的褐藻胶裂解菌主要来自假单胞菌属（Pseudomonas sp.）、芽孢杆菌属（Bacillus sp.）、弧菌属（Vibrio sp.）以及鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas sp.）。但是，由于大部分褐藻胶裂解菌菌株产酶能力较低，所以尚未实现微生物发酵制备AOS的工业规模化生产。基于此，发掘筛选出高效、安全的褐藻胶裂解菌具有重要意义与实际生产价值。
提供一种高效的产褐藻胶裂解酶菌株是本领域亟待解决的重要问题之一。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提出了以下技术方案。
在第一方面，本发明提供了一株产褐藻胶裂解酶的东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis），该微泡菌菌株于2024年02月02日保藏于位于广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：64370。
在第二方面，本发明提供了一种由本发明第一方面的东海微泡菌菌株制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将所述东海微泡菌菌株的种子液接种于液体培养基中，并在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。
在第三方面，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶是通过本发明第一方面的东海微泡菌菌株的发酵得到的。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的东海微泡菌菌株和本发明第三方面的褐藻胶裂解酶在制备褐藻寡糖中的应用。
在第五方面，本发明提供了一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，所述方法包括：使本发明第三方面的褐藻胶裂解酶与含褐藻胶的样品接触以进行酶解。
本发明的有益效果为：
本发明提供了一株可用于制备褐藻胶寡糖的新东海微泡菌菌株，丰富了生产褐藻胶裂解酶的菌种来源。本发明提供的保藏号为GDMCC No：64370的微泡菌SKLFSR 131具有高效的褐藻胶降解作用，该菌株可在温和的外界条件下（温度约35℃，pH 8.0左右）利用自身合成的褐藻胶裂解酶将褐藻胶降解为褐藻寡糖。本发明提供的东海微泡菌和来源于所述东海微泡菌的褐藻胶裂解酶可用于制备褐藻寡糖，对于提高褐藻胶利用效率、促进功能褐藻寡糖的开发与制备具有重要意义。
附图说明
图1为菌株SKLFSR 131的透明圈筛选；
图2为菌株SKLFSR 131的显微镜形态观察（5000×）；
图3为菌株SKLFSR 131的发酵产酶及菌体生长曲线；
图4为酶解产物薄层层析分析。
具体实施方式
本发明公开了产褐藻胶裂解酶菌株及其应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现本发明。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
除非另外定义，否则本文所使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。在对本发明进行详细描述之前，提供以下定义以更好地理解本发明。
在提供数值范围的情况中，例如浓度范围、百分比范围或比率范围，应当理解，除非上下文另有明确规定，否则在该范围的上限与下限之间的、到下限单位的十分之一的各中间值以及在所述范围内的任何其他所述值或中间值包含在所述主题内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括在较小范围中，并且此类实施方案也包括在所述主题内，受限于所述范围中的任何特定排除的极限值。在所述范围包括一个或两个极限值的情况中，排除那些所包括的极限值中的任一个或两个的范围也包括在所述主题中。
在本发明的上下文中，很多实施方案使用表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”。表述“包含”、“包括”或“基本/主要由……组成”通常情况下可以理解为开放式表述，表示不仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤等外，还包括其他的元素、组分、组件、方法步骤。另外，在本文中，表述“包含”、“包括”或者“基本/主要由……组成”在某些情况下也可以理解为封闭式表述，表示仅包括该表述后面具体列出的各元素、组分、组件、方法步骤，而不包括任何其他的元素、组分、组件、方法步骤。此时，该表述等同于表述“由……组成”。
如上所述，本发明提供了一株产褐藻胶裂解酶的微泡菌及其应用。
在第一方面，本发明提供了一株产褐藻胶裂解酶的东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis）菌株，该东海微泡菌菌株于2024年02月02日保藏于位于广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：64370。该东海微泡菌菌株是发明人从山东威海荣成市采集的海带样品中筛选到的一株野生菌株，在本发明中也被命名为SKLFSR 131。
在一个实施方案中，所述东海微泡菌菌株具有如SEQ ID NO:1所示的16S rDNA序列。
本发明的东海微泡菌SKLFSR 131具有以下特性：
（1）可以在以海藻酸钠为唯一碳源的筛选培养基中水解海藻酸钠并在氯化钙的处理下显现透明圈；
（2）在海洋琼脂培养基（2216）中生长良好；
（3）可以产褐藻胶裂解酶；
（4）可以将褐藻胶水解为褐藻寡糖。
虽然目前已有研究表明微泡菌（Microbulbifer）属的其他种菌株可以产褐藻胶裂解酶，但本发明筛选得到的东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis）种属的菌是否可产褐藻胶裂解酶以及酶活如何尚未有报道，而同属不同种的菌之间存在着较大差异，一个种的微泡菌可以产褐藻胶裂解酶并不意味着另一个种的微泡菌同样也可以产褐藻胶裂解酶。因此，相比于现有研究，本发明提供了一株可用于制备褐藻胶寡糖的新菌株，丰富了生产褐藻胶裂解酶的菌种来源，对于提高褐藻胶的利用效率、促进功能褐藻胶寡糖的开发与制备具有重要意义。
在第二方面，本发明提供了一种由本发明第一方面的东海微泡菌菌株制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将所述东海微泡菌菌株的种子液接种于液体培养基中，并在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。
在一个优选的实施方案中，在步骤（1）中，将所述东海微泡菌菌株在30℃、200 rpm条件下振荡培养一段时间，例如至少20小时，例如至少20小时、至少30小时或者至少40小时。
在一个实施方案中，所述方法还包括：在步骤（1）之前，将所述东海微泡菌菌株的单菌落接种于液体培养基中，并于在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，以制备所述东海微泡菌菌株的种子液。
在一个优选的实施方案中，将所述东海微泡菌菌株的单菌落在30℃、200 rpm条件下振荡培养一段时间，例如24-48小时。
在一个实施方案中，所述液体培养基为2216液体培养基。
2216液体培养基是一种常用于海生细菌的增菌培养的培养基，主要包括：酵母浸粉、蛋白胨、柠檬酸铁、氯化钠、氯化镁、氯化钾、硫酸钠、氯化钙、碳酸钠、溴化钾、SrCl2、H3BO3、NaSiO3、NaF、NH4NO3、Na2HPO4、蒸馏水，且PH为7.6。其中培养基中蛋白胨和酵母浸粉可以提供氮源、维生素、生长因子，满足细菌生长的需求；各种无机盐提供与海水相似的环境，适合海生细菌的生长，还可以加入琼脂为凝固剂，从而配制为相应的固体培养基。
在一个优选实施方案中，所述2216液体培养基的配方为：酵母浸粉1.0 g，蛋白胨5.0 g，柠檬酸铁0.1 g，NaCl 19.45 g，氯化镁5.9 g，氯化钾0.55 g，硫酸钠3.24 g，氯化钙1.8 g，碳酸钠0.16 g，溴化钾0.08 g，SrCl2 34.0 mg，H3BO3 22.0 mg，NaSiO3 4.0 mg，NaF2.4 mg，NH4NO3 1.6 mg，Na2HPO4 8.0 mg，蒸馏水1000.0 mL，PH 7.6。所述2216液体培养基在121℃高温高压灭菌20 min后即可使用。
在一个实施方案中，所述方法还包括：在步骤（1）之后，将所述含褐藻胶裂解酶的发酵液在6000-8000 r/min下离心10-30 min，收集上清液，即得到粗酶液。该粗酶液可以直接使用，也可以在进一步提纯之后使用。
在第三方面，本发明提供了一种褐藻胶裂解酶，其特征在于，所述褐藻胶裂解酶是通过本发明第一方面的东海微泡菌菌株的发酵得到的。
在一个实施方案中，所述褐藻胶裂解酶是通过本发明第二方面的方法制备得到的。
在第四方面，本发明提供了本发明第一方面的东海微泡菌菌株和本发明第三方面的褐藻胶裂解酶在制备褐藻寡糖中的应用。
在第五方面，本发明提供了一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，所述方法包括：使本发明第三方面的褐藻胶裂解酶与含褐藻胶的样品接触以进行酶解。
在一个实施方案中，所述褐藻寡糖为褐藻胶二糖、褐藻胶三糖和/或褐藻胶四糖。
本发明提供的东海微泡菌菌株可在温和的外界条件下（温度约35℃，pH 8.0左右）利用自身合成的褐藻胶裂解酶将褐藻胶降解为褐藻寡糖。本发明提供的东海微泡菌和来源于所述微泡菌的褐藻胶裂解酶可用于制备褐藻寡糖，对于提高褐藻胶利用效率、促进功能褐藻寡糖的开发与制备具有重要意义。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。本领域技术人员将会理解，以下实施例仅是说明性的，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1、微泡菌SKLFSR 131的分离与筛选
从山东威海荣成市采集得到海带样品，将取得的样品于加入磁珠的生理盐水中震荡2小时，过夜静置，然后接种到以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基中，在30℃、200 r/min的条件下培养至块状海带降解后再转接，连续传代5次。将连续驯化5代的培养液用生理盐水分别稀释10-7、10-8、10-9倍，然后涂布于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上，在30℃的条件下培养3-5天，待平板上长出单菌落后，随机挑取菌落形态各异的单菌落于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上划线。将划线后得到的单菌落接入装有以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基的24孔板中，在30℃、200 r/min的条件下培养24-30小时，待菌液浑浊后对菌液进行保藏和复筛。将初筛得到的单菌落点种于以海藻酸钠为唯一碳源的固体培养基上，培养3天后通过CaCl2显色法观察透明圈大小（图1）。
上述以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基的配方如下：海藻酸钠5 g/L，硫酸铵5g/L，K2HPO4 2 g/L，NaCl 5 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，FeSO4·7H2O 0.01 g/L。
上述以海藻酸钠为唯一碳源固体培养基的配方，是在以海藻酸钠为唯一碳源的液体培养基配方的基础上增加了琼脂。
实施例2、微泡菌SKLFSR 131的鉴定
（1）电镜下的菌体特征
在扫描电镜下观察实施例1中筛选出的微泡菌菌株SKLFSR 131的形态结构。图2为微泡菌SKLFSR 131在扫描电镜下放大5000倍的菌体特征，从图中可以看出，菌体呈杆状，多个排列成泡状，大小为0.3-0.5μm×1.1-7.5μm。
（2）序列比对
将实施例1筛选出的菌株使用细菌基因组DNA抽提试剂盒（天根生化科技有限公司）抽提细胞的全基因组，之后采用通用27F/1492R引物(正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rDNA的PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 60 s，35个循环；72℃ 10min。委托生工生物工程（上海）股份有限公司对经PCR扩增的产物进行测序。菌株的16SrDNA的脱氧核酸序列如SEQ ID NO：1所示：
CCCGAAGGTTAGACTAGCCACTTCTGGAGCAACCCACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGGCCGGGAACGTATTCACCGTGACATTCTGATTCACGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGGAGTCGAGTTGCAGACTCCGATCCGGACTACGATTGGTTTTCTCGGATTAGCTCCACCTCGCGGATTCGCAACCGTCTGTACCAACCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGACGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCGTCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTTGAGTTCCCACCATTACGTGTTGGCAACAAAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAGCCATGCAGCACCTGTCACTCAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTCTGAGGATGTCAAGCCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAGGCGGTCTACTTATTGCGTTAGCTGCGTCACAAAGTCCTCAAGGAACCCTACGACTAGTAGACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGCACCTCAGCGTCAGTATCGAGCCAGGCAGTCGCCTTCGCCACTGATGTTCCTTCCTATATCTACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACTACCCTCTCTCGTACTCTAGCCATCCAGTTCTGAATGCAGTTCCCAGGTTAAGCCCGGGGCTTTCACATCCAGCTTAAATAACCGCCTACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCCGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGGAGTTAGCCGGTGCTTCTTCTGCAGGTAACGTCAATCTTGCAGAGTATTAATCTACAAGCCTTCCTCCCTGCTGAAAGTGCTTTACAACCCGAAGGCCTTCTTCACACACGCGGCATGGCTGGATCAGGGTTGCCCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCTGATCATCCTCTCAGACCAGCTACGGATCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCTCACCAACTAGCTAATCCGACGCGGGCATATCCAATAGCACGAGGTCCGAAGATCCCCCGCTTTCCCCCGTAGGGCGTATGCGGTATTAGCATCCGTTTCCGAATGTTGTCCCCCACTACTGGGCAATTTCCCACGCGTTACTCACCCGTCCGCCGCTCTACTCATTCCCGAAGGAACTTTCGCGCTCGACTTGCA
将上述16S rDNA脱氧核酸序列与美国国立生物中心(National Center forBiotechnology Information USA，NCBI)的基因库中的16S rDNA序列进行比对，发现该菌株的16S rDNA序列与东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis）菌株CN85的16S rDNA序列有99%的同源性，遂鉴定该菌株为东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis），并将其命名为SKLFSR 131。该菌株于2024年02月02日保藏于位于广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：64370。
实施例3、发酵产酶曲线及菌体生长曲线测定
使用发酵培养基培养菌株SKLFSR 131，每5小时取样测定发酵液OD600和发酵液酶活力，测定菌株SKLFSR 131的生长曲线和发酵产酶曲线步骤如下：
（1）将东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis）SKLFSR 131接种于2216固体培养基，于30℃下培养24至48小时，直至其长出单菌落；
（2）挑取步骤（1）中的单菌落至4 mL的2216液体培养基中，于30℃、200 rpm过夜培养12至14小时，进行菌株的活化；
（3）将步骤（2）中的种子菌液以2%的接种量接种到200 mL/500 mL（培养基体积/锥形瓶体积）的2216液体培养基中，于30℃、200 rpm发酵培养40小时，每间隔5小时取一次样；
（4）培养结束后，将步骤（3）的发酵液在6000-8000 r/min下离心10-30 min，收集上清液，即得到粗酶液；
（5）测定发酵液OD600，用二硝基水杨酸（DNS）法测定发酵液酶活力，绘制菌株SKLFSR 131的生长曲线和发酵产酶曲线（图3）。
2216固体培养基的配方为：酵母浸粉1.0 g，蛋白胨5.0 g，柠檬酸铁0.1 g，NaCl19.45 g，氯化镁5.9 g，氯化钾0.55 g，硫酸钠3.24 g，氯化钙1.8 g，碳酸钠0.16 g，溴化钾0.08 g，SrCl2 34.0 mg，H3BO3 22.0 mg，NaSiO3 4.0 mg，NaF 2.4 mg，NH4NO3 1.6 mg，Na2HPO4 8.0 mg，琼脂 20 g蒸馏水1000.0 mL，PH 7.6，在121℃高温高压灭菌20 min。
发酵培养基为2216液体培养基，其配方如下：酵母浸粉1.0 g，蛋白胨5.0 g，柠檬酸铁0.1 g，NaCl 19.45 g，氯化镁5.9 g，氯化钾0.55 g，硫酸钠3.24 g，氯化钙1.8 g，碳酸钠0.16 g，溴化钾0.08 g，SrCl2 34.0 mg，H3BO3 22.0 mg，NaSiO3 4.0 mg，NaF 2.4 mg，NH4NO3 1.6 mg，Na2HPO4 8.0 mg，蒸馏水 1000.0 mL，PH 7.6，121℃高温高压灭菌20 min。
发酵产酶曲线绘制方法如下：
（1）绘制葡萄糖标准曲线
准确配制1 mg/mL D-无水葡萄糖标准溶液，分别吸取40、80、120、160 μL标准溶液于洁净离心管中，补充无菌水至终体积为200 μL。每管加入150 μL 二硝基水杨酸（DNS）试剂混合均匀，煮沸反应10 min，冷却后加入1 mL无菌水混合均匀，检测OD540吸光值，以葡萄糖含量（mg）为横坐标，OD540为纵坐标绘制标准曲线。
（2）二硝基水杨酸（DNS）法检测SKLFSR 131褐藻胶裂解酶的酶活
将80 μL粗酶液与920 μL褐藻胶底物溶液（褐藻胶0.5%（m/v），NaH2PO4，Na2HPO4 50mM，氯化钠300 mM，pH=7.5）混合均匀，30℃水浴30 min；在其他条件不变的情况下，另设粗酶液煮沸10 min灭活作为对照组。反应结束后，取200 μL粗酶液与褐藻胶底物溶液反应得到的反应液与150 μL DNS溶液混合均匀，煮沸反应10 min，冷却后加入1 mL无菌水混合均匀，检测OD540吸光值变化情况。
（3）酶活力单位的定义：在以上反应条件下，1 min内生产1 μg的还原糖所需的褐藻胶裂解酶的含量为一个酶活力单位（U·mL-1）。具体计算公式如下：
酶活力（U·mL-1）=（m×N×1000）/（T×V）
m——粗酶液酶促反应产生的还原糖含量（mg），根据葡萄糖标准曲线和OD540计算；
N——发酵液稀释倍数（未稀释为1）；
T——酶促反应时间（min）；
V——酶液（发酵液）体积（mL）。
据此公式，计算得到在该培养条件下培养不同时间的菌株SKLFSR 131所产褐藻胶裂解酶的酶活，即可绘制发酵产酶曲线。
检测发现，在2216液体培养基中，SKLFSR 131大约在接种5小时后进入对数生长期，20小时后进入平缓期，培养至35小时开始衰亡。菌体生长量在25小时达到最大，在30小时酶活力达到最高，DNS法测得的酶活力为25.2±0.34 U/mL（图3）。
实施例4、褐藻胶寡糖的制备
（1）酶解产物薄层层析分析
以实施例3制得的褐藻胶裂解酶粗酶液对褐藻胶进行酶解，向500 µL的含有50mmol/L磷酸盐和300 mmol/L NaCl的0.25% (质量体积比)海藻酸钠溶液(pH 8.0)中加入0.5 U褐藻胶裂解酶，35°C条件下反应72小时，煮沸10 min终止反应，得到终产物。
（2）对酶解产物进行薄层层析鉴定
取1 µL上述终产物在TLC硅胶平板上点样，置于层析缸中展开，展开剂接近硅胶板上方1 cm处时取出晾干，加入显色剂，15秒后取出晾干在150°C条件下显示。展开剂为正丁醇:乙酸:H2O(3:2:3，体积比)，显色剂为硫酸:乙醇(1:9，体积比)。
实验结果表明，SKLFSR 131酶解褐藻胶产物为褐藻胶二糖、褐藻胶三糖和褐藻胶四糖（图4）。
Claims (10)
1.一株产褐藻胶裂解酶的东海微泡菌（Microbulbifer donghaiensis）菌株，该东海微泡菌菌株于2024年02月02日保藏于位于广东省广州市越秀区先烈中路100号59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：64370。
2.一种由权利要求1所述的东海微泡菌菌株制备褐藻胶裂解酶的方法，其特征在于，所述方法包括：（1）将所述东海微泡菌菌株的种子液接种于液体培养基中，并在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤（1）之前，将所述东海微泡菌菌株的单菌落接种于液体培养基中，并在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，以制备所述东海微泡菌菌株的种子液。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述液体培养基为2216液体培养基。
5.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在步骤（1）之后，将所述含褐藻胶裂解酶的发酵液在6000-8000 r/min下离心10-30 min，收集上清液，即得到粗酶液。
6.权利要求1所述的东海微泡菌菌株在制备褐藻寡糖中的应用。
7.一种制备褐藻寡糖的方法，其特征在于，所述方法包括：
（a）通过发酵权利要求1所述的东海微泡菌菌株得到褐藻胶裂解酶；
（b）使所述褐藻胶裂解酶与含褐藻胶的样品接触以进行酶解。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）包括：（1）将所述东海微泡菌菌株的种子液接种于液体培养基中，并在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤（a）包括：（2）在步骤（1）之前，将所述东海微泡菌菌株的单菌落接种于液体培养基中，并在25-35℃、180-240 rpm条件下振荡培养，以制备所述东海微泡菌菌株的种子液。
10.根据权利要求7-9中任一项所述的方法，其特征在于，所述褐藻寡糖为褐藻胶二糖、褐藻胶三糖和/或褐藻胶四糖。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant |