CN112458022B - 高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及微生物领域，更具体地，本发明涉及高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和应用。所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.20490。本发明的优点在于所提供的地衣芽孢杆菌Bl22培养方法简单，能够利用普通碳源和氮源进行快速培养并发酵高产几丁质脱乙酰酶。所产几丁质脱乙酰酶最适催化温度相对较低，为40℃左右，在较宽的pH范围内(pH值6‑10)均表现出很高的催化活性，工业应用中可以节约能源和辅料等成本，具有广阔的应用前景。

Description

高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和 应用

技术领域

本发明涉及微生物领域。更具体地，本发明涉及高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌Bl22及其相关产品和应用。

背景技术

几丁质(chitin)，又名甲壳质、甲壳素，是由N-乙酰氨基-D-葡萄糖单体通过β-1,4-糖苷键连接而成的多糖。它是自然界中含量仅次于纤维素的第二大类天然高分子有机化合物，广泛存在于无脊椎动物(如虾、蟹和昆虫等)的外骨骼以及真菌和藻类的细胞壁中。几丁质由于溶解性差，不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂等，大大限制了其利用价值。如几丁质脱去乙酰基(脱乙酰度大于55％)便可得到溶解性极大提高的壳聚糖(chitosan)。而且壳聚糖具有生物降解性、生物相容性、无毒性、抑菌、抗癌、降脂、增强免疫等多种生理功能，可广泛应用于医药、食品、纺织、农业、环保和化妆品等领域，有很高的应用价值和开发前景。

目前，壳聚糖的工业生产方法主要为化学法。通常使用40％-60％的浓氢氧化钠高温处理几丁质制备壳聚糖。此法存在生产成本高、环境污染大以及产品稳定性和均一性差等缺点。几丁质脱乙酰酶(chitin deacetylase，E.C.3.5.1.41)可以脱去几丁质上的乙酰基生成脱乙酰度稳定、分子质量分布范围窄的壳聚糖产品。此外，酶法生产壳聚糖，反应条件温和，能耗值低且环境友好，为解决化学法制备壳聚糖存在的问题提供了一条新的途径，是壳聚糖生产行业未来的发展方向。

自1974年文献首次报道鲁氏毛霉(Mucor rouxii)几丁质脱乙酰酶后，研究人员已从真菌、细菌和昆虫中分离获得了多种几丁质脱乙酰酶。然而，目前报道的几丁质脱乙酰酶普遍存在发酵时间长，产酶活力低，催化温度高，脱乙酰效果差等问题，且多数为真菌来源的酶，细菌来源的少。细菌在发酵产酶方面较真菌更有优势，菌株更容易实现规模化发酵培养，产酶更容易分离纯化。因此，通过对产几丁质脱乙酰酶微生物资源的开发，尤其是筛选获得高产酶的细菌，有望满足酶法制备壳聚糖的工业化生产需要。

发明内容

本发明的目的是提供一株高产几丁质脱乙酰酶的地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)及其相关产品和应用。

为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一株地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.20490。

第二方面，本发明提供了一种发酵剂，该发酵剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌的菌体物质。

第三方面，本发明提供了如上所述的地衣芽孢杆菌，或者如上所述的发酵剂在生产几丁质脱乙酰酶和/或脱除几丁质上的乙酰基中的应用。

第四方面，本发明提供了一种几丁质脱乙酰酶，该几丁质脱乙酰酶来自如上所述的地衣芽孢杆菌，或者如上所述的发酵剂。

第五方面，本发明提供了一种几丁质脱乙酰酶的制备方法，该方法包括：将如上所述的地衣芽孢杆菌种子或如上所述的发酵剂接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，将所述发酵液进行固液分离得到菌体细胞沉淀，然后对所述菌体细胞进行破碎，得到含有几丁质脱乙酰酶的物料。

第六方面，本发明提供了一种产品，该产品含有如上所述的几丁质脱乙酰酶，或者由如上所述的方法制备。

第七方面，本发明提供了如上所述的几丁质脱乙酰酶或如上所述的产品在脱除几丁质上的乙酰基中的应用。

第八方面，本发明提供了一种脱除几丁质上的乙酰基的方法，该方法包括：将如上所述的地衣芽孢杆菌，或者如上所述的发酵剂，或者如上所述的几丁质脱乙酰酶，或者如上所述的产品与几丁质接触，以对其中的乙酰基进行脱除。

本发明的优点在于：所提供的地衣芽孢杆菌Bl22培养方法简单，能够利用普通碳源和氮源进行快速培养并发酵高产几丁质脱乙酰酶。所产几丁质脱乙酰酶最适催化温度相对较低，为40℃左右，在较宽的pH范围内(pH值6-10)均表现出很高的催化活性，工业应用中可以节约能源和辅料等成本，具有广阔的应用前景。

本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

生物保藏

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，于2020年08月06日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.20490，简称Bl22。

附图说明

附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。

图1为不同温度条件下Bl22几丁质脱乙酰酶酶活曲线。

图2为不同pH条件下Bl22几丁质脱乙酰酶酶活曲线。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

第一方面，本发明提供了一种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)，其中，该地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No.20490，简称Bl22。

本发明的地衣芽孢杆菌分离自湖南省吉首市。

本发明提供的地衣芽孢杆菌的16SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1：

将该序列与GenBank数据库中的序列进行同源比对，发现与菌株Bacilluslicheniformis YEBFR6(Accession:MT332717.1)的16SrDNA相似性为99％。

本发明涉及的菌株地衣芽孢杆菌Bl22 16SrDNA序列的扩增和分析如下：

使用天根生化(北京)有限公司生产的细菌基因组提取试剂盒提取得到地衣芽孢杆菌Bl22基因组，选用扩增原核微生物16SrDNA序列的通用引物于PCR mix体系中反应。

所述通用引物(委托上海生工公司合成)：

27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.2)；

1492R:5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.3)。

所述反应体系(50μl)为：Premix(25μl)，ddH₂O(22μl)，上下游引物(各1μl)，DNA模板(1μl)。反应程序：94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环；72℃终延伸5min。

取4μlPCR扩增产物，1％琼脂糖凝胶电泳检测。PCR扩增产物委托上海生工公司测序。

本发明涉及的菌株地衣芽孢杆菌Bl22的形态特征如下：

该菌株为革兰氏阳性菌、菌体直杆状(长度为2.0-6.0μm、宽度为0.3-1.0μm)、具有芽孢且芽孢不膨大；在LB培养基上生长的单菌落呈黄白色，不透明，表面褶皱，中间稍突起，边缘不规则，大小为3-5mm，易挑取。

本发明提供的地衣芽孢杆菌经过培养能够产生大量地衣芽孢杆菌的活菌体，所述培养的方法没有特别的要求，只要是能使所述地衣芽孢杆菌增殖即可，例如可以将10⁷数量级的活菌体接种于地衣芽孢杆菌培养基中，在35-37℃的温度下培养12-72小时后，得到菌体培养液。所述地衣芽孢杆菌培养基可以为公知的各种适合地衣芽孢杆菌培养的培养基，例如可以为LB液体培养基添加或不添加无机盐。

根据本发明一种优选的实施方式，可以将所述地衣芽孢杆菌Bl22的种子接种到发酵培养基中进行发酵培养，从而得到含有地衣芽孢杆菌Bl22的活菌体的发酵液。

其中，所述发酵培养基可以为通常的液体LB培养基，但根据本发明一种优选的实施方式，所述发酵培养基含有葡萄糖、酵母粉、胰蛋白胨和K₂HPO₄，pH值6.5-7.2；其中，葡萄糖可以为35-45g/l、酵母粉可以为20-30g/l、胰蛋白胨可以为10-20g/l、K₂HPO₄可以为2-4g/L，余量为水。

其中，所述发酵培养的条件可以为：温度为30-37℃，时间为20-24h。进一步优选在搅拌(100-200rpm)下进行培养。经培养后，经检测，发酵液中几丁质脱乙酰酶含量达到1800-2100U/ml。

由此可见，本发明提供的地衣芽孢杆菌Bl22能够利用普通碳源(例如，葡萄糖)和氮源(例如，酵母粉)进行快速培养并发酵高产几丁质脱乙酰酶。

发酵液中几丁质脱乙酰酶含量可以通过常规方法进行检测，例如，对硝基苯胺显色法。

本发明可以进一步分离上述培养液中的地衣芽孢杆菌的活菌体，所述分离的方法没有特别的限制，只要是能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为公知的条件，本发明在此不再赘述。

根据本发明，在将所述地衣芽孢杆菌Bl22接种至发酵培养基中之前，还优选对其进行活化，例如，进行1-3级活化，所述活化可以在常规的地衣芽孢杆菌培养基中进行。

优选的，先将超低温保藏的菌株于LB固体培养基上进行划线，置于恒温培养箱培养活化，温度为30-37℃，时间为18-24h。其中，所述LB固体培养基可以含有酵母提取物4-6g/L、胰蛋白胨8-12g/L、NaCl 8-12g/L、琼脂粉15-25g/L，余量为水，pH值6.5-7.2。

平板活化之后，进一步优选的，从活化平板挑取单菌落，并置于种子培养基恒温振荡培养活化，搅拌速度为100-200rpm，温度为30-37℃，时间为6-12h。其中，所述种子培养基可以含有：酵母提取物4-6g/L、胰蛋白胨8-12g/L、NaCl 8-12g/L，余量为水，pH值6.5-7.2。

第二方面，本发明提供了一种发酵剂，该发酵剂含有如上所述的地衣芽孢杆菌的菌体物质。

所述发酵剂含有地衣芽孢杆菌CGMCC No.20490的活菌体，相对于每克所述发酵剂，所述活菌体的含量优选为10⁵-10¹⁰CFU，更优选为10⁷-10⁹CFU。

其中，CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表示活菌的数量。可以将培养后的培养液稀释至合适的水平并涂布平板培养后获得。

根据本发明，所述发酵剂可以按照常规的方法进行制备，例如，可以按照如上第一方面中的方法进行发酵培养，获得地衣芽孢杆菌CGMCC No.20490的菌体细胞，然后按照常规的方法制备成发酵剂。

其中，所述发酵剂可以为液体状态，也可以为固体状态，通常情况下为固体状态。具体的，当发酵培养结束后，如果在较短的时间内即可使用，例如，1个月之内，则可以直接以得到的发酵液或者适当的浓缩后作为发酵剂，此情况下，发酵剂可以为液体状态的；但如果需要保存较长时间后再使用，则可以制备成固体发酵剂，例如，将发酵液固液分离，获得菌体细胞沉淀，然后再与冻干保护剂混合并冻干后获得固体发酵剂。

其中，所述冻干保护剂可以为脱脂乳粉、麦芽糊精、海藻糖、葡聚糖及甘油等中的至少一种。

此外，所述发酵剂还可以为以甘油管保存的形式，例如，将对数生长期的菌体接种至甘油管中获得，其中，所述甘油管中通常含有25-35体积％，例如30体积％的丙三醇。

如上所述的，本发明提供的地衣芽孢杆菌Bl22能够利用普通碳源和氮源进行快速培养并发酵高产几丁质脱乙酰酶。基于此，本发明还提供了如下的应用。

第三方面，本发明提供了如上所述的地衣芽孢杆菌，或者如上所述的发酵剂在生产几丁质脱乙酰酶和/或脱除几丁质上的乙酰基中的应用。

第四方面，本发明提供了一种几丁质脱乙酰酶，该几丁质脱乙酰酶来自如上所述的地衣芽孢杆菌，或者如上所述的发酵剂。

第五方面，本发明提供了一种几丁质脱乙酰酶的制备方法，该方法包括：将如上所述的地衣芽孢杆菌种子，或者如上所述的发酵剂接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，将所述发酵液进行固液分离得到菌体细胞沉淀，然后对所述菌体细胞进行破碎，得到含有几丁质脱乙酰酶的物料。

根据本发明，所述发酵液的制备方法已经在如上第一方面进行了详细的介绍，为了避免不必要的重复，此处不再赘述。

根据本发明，将所述发酵液进行固液分离的方法可以为常规的方法，例如，离心，过滤等。根据本发明一种优选的实施方式，将发酵液在8000-15000rpm下离心2-10min。

根据本发明，对所述菌体进行破碎的方法没有特别的限制，可以按照本领域常规的操作，例如，可以采用超声破碎，酶解破碎，表面活性剂破碎，高温破碎等等。根据本发明一种优选的实施方式，采用超声破碎的方法对菌体细胞沉淀进行破碎。例如，设置超声破碎仪振幅杆为2、功率为20％，超声频率为2s/2s(即破碎2s，暂停2s)，破碎总时间为5min。

根据本发明，菌体破碎后所得料液再经固液分离后的上清即为地衣芽孢杆菌的几丁质脱乙酰酶粗酶液。

其中，将菌体破碎后所得料液进行固液分离的方法可以为常规的方法，例如，离心，过滤等。根据本发明一种优选的实施方式，将菌体破碎后所得料液在8000-15000rpm下离心2-10min即可。

根据本发明，还可以根据实际情况对得到的地衣芽孢杆菌的脱乙酰酶粗酶液进一步纯化获得纯度较高的几丁质脱乙酰酶，所述纯化的方法为本领域技术人员所公知，此处不再重复赘述。

第六方面，本发明提供了一种产品，该产品含有如上所述的几丁质脱乙酰酶，或者由如上所述的方法制备。

根据本发明，所述产品，例如，可以为如上所述的几丁质脱乙酰酶粗酶液，还可以为经纯化后的几丁质脱乙酰酶纯酶液，也可以为将几丁质脱乙酰酶人工添加到预定的介质中制备得到的酶产品。在所述产品中，几丁质脱乙酰酶的浓度可以为0.01-99.99重量％。

第七方面，本发明提供了如上所述的几丁质脱乙酰酶或如上所述的产品在脱除几丁质上的乙酰基中的应用。

第八方面，本发明提供了一种脱除几丁质上的乙酰基的方法，该方法包括：将如上所述的地衣芽孢杆菌，或者如上所述的发酵剂，或者如上所述的几丁质脱乙酰酶，或者如上所述的产品与几丁质接触，以对其中的乙酰基进行脱除。

优选的，所述脱除几丁质上的乙酰基的方法包括：将如上所述的几丁质脱乙酰酶，或者如上所述的产品与几丁质接触，以对其中的乙酰基进行脱除。

所述接触的条件可以在较宽的范围内选择，优选的pH值4-13(例如，可以为4、5、6、7、8、9、10、11、12和13)，优选为7-10；温度为25-55℃(例如，可以为25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃)，优选为30-45℃。

根据本发明，不同温度条件下酶活曲线图如图1所示，可见在40℃时地衣芽孢杆菌Bl22几丁质脱乙酰酶活性最高。

根据本发明，不同pH条件下酶活曲线图如图2所示，可见在pH值为6-10时地衣芽孢杆菌Bl22几丁质脱乙酰酶均具有较高活性。

需要说明的是，如上所述的酶活是指使用地衣芽孢杆菌脱乙酰酶粗酶液进行测定的酶活。

其中，所述粗酶液可以通过如下方法进行制备：收集发酵液，固液分离后，倒掉培养基上清，取超声破碎缓冲液(45-55mM Tris-cl、15-25mM NaOH、pH 7.5-8.5)充分重悬菌体；将重悬菌置于冰水混合浴中，进行超声破碎，破碎液经固液分离，上清即为地衣芽孢杆菌脱乙酰酶粗酶液。

本发明所提供的地衣芽孢杆菌Bl22所产几丁质脱乙酰酶最适催化温度相对较低，为40℃左右，在较宽的pH范围内(pH值6-10)均表现出很高的催化活性，工业应用中可以节约能源和辅料等成本，具有广阔的应用前景。

实施例

以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。

实施例1

本实施例用于说明利用地衣芽孢杆菌Bl22产几丁质脱乙酰酶的方法

(1)菌种活化

培养方法：取适量超低温保藏菌株于LB活化平板划线，置于恒温培养箱培养，温度为35±2℃，时间为20h。

活化培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、琼脂粉20g/L，余量为水，pH值6.5-7.2。

(2)种子培养

培养方法：从活化平板挑取单菌落置于种子培养基恒温振荡培养，搅拌速度为150rpm，温度为35±2℃，时间为9h。

种子培养基：酵母提取物5g/L、胰蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，余量为水，pH值6.5-7.2。

(3)发酵培养

培养方法：将种子液按照1体积％的接种量转接至发酵培养基恒温振荡培养，搅拌速度为150rpm，温度为35±2℃，时间为20-24h；

发酵培养基：葡萄糖40g/l、酵母粉25g/l、胰蛋白胨15g/l、K2HPO4 3g/L，余量为水，pH值6.5-7.2。

发酵20-24h，发酵液中几丁质脱乙酰酶含量达到1800-2100U/ml(23小时达到发酵最高点，2100U/ml粗酶液)，其中，测试方法如实施例3所述(按照实施例2所述方法制备粗酶液)。测试条件温度为40℃，pH值为8.0。

实施例2

本实施例用于说明地衣芽孢杆菌Bl22几丁质脱乙酰酶粗酶液的制备

收集10ml发酵23小时的发酵液，12000rpm离心5min，倒掉培养基上清，取10mL超声破碎缓冲液(50mM Tris-cl、20mM NaOH、pH 8.0)上下吸打，充分重悬菌体；将10ml重悬菌液平均分成10份，每份1ml，转移至10个2mL离心管中，将每个离心管置于固定的冰水混合浴中，单独进行超声破碎，设置超声破碎仪振幅杆为2、功率为20％，超声频率为2s/2s(即破碎2s，暂停2s)，破碎总时间为5min；所有破碎液经12000rpm离心5min，收集上清至一新的15ml离心管中，即为地衣芽孢杆菌脱乙酰酶粗酶液。

实施例3

本实施例用于说明不同条件下几丁质脱乙酰酶的酶活

酶活检测方法如下：

取一支15ml离心管，加入1ml 200mg/l的对硝基乙酰苯胺水溶液、1ml稀释适当倍数的粗酶液以及3ml预保温的浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液，使反应液终体积为5ml，于50℃水浴反应0.5h，沸水浴5min，终止酶促反应，加水定容至10ml，混匀，12000rpm离心5min，测定上清液在400nm处的吸光值A400。空白对照体系中添加1ml同样浓度的灭活酶液，其余同上，测定上清液的吸光值A0，每个样品对应一个空白。

酶活单位的定义：在上述反应条件下每小时产生1μg对硝基苯胺所需要的酶量定义为一个酶活力单位。酶活力计算公式为：

酶活力(U/ml)＝((A400-A0)*10*n)/KT

A400—样品在400nm处的吸光值；A0—空白的吸光值；10—溶液体积10ml；n—酶液稀释倍数；K—线性系数(0.0648)；T—反应时间，h

1)酶的最适催化温度

准备若干1.5ml离心管，分别加入200μl 200mg/l的对硝基乙酰苯胺水溶液、200μl上述粗酶液(稀释适当倍数)以及600μl浓度为0.05M的磷酸盐缓冲液(pH8.0)，反应液总体积为1ml，分别置于25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃和55℃水浴中，每个温度条件下放置3支平行离心管，反应0.5h，沸水浴5min，终止酶促反应，12000rpm离心5min，测定上清液在400nm处的吸光值A400。空白对照体系中添加200μl灭活酶液，其余同上，测定上清液的吸光值A0，每个温度条件下均设置空白。

不同温度条件下酶活曲线图如图1所示，在40℃时地衣芽孢杆菌Bl22几丁质脱乙酰酶活性最高，定义此温度下几丁质脱乙酰酶的酶活为100％(2100U/ml粗酶液)，其余各温度条件下测得的酶活数据与40℃时酶活的比值为相应的相对酶活。

2)酶的最适催化pH值

取一96孔深孔板，每孔中分别加入200μl 200mg/l的对硝基乙酰苯胺水溶液、200μl上述粗酶液(稀释适当倍数)以及600μl不同pH(2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0和13.0)的磷酸盐缓冲液，反应液总体积为1ml，置于40℃摇床中振荡反应0.5h，沸水浴5min，终止酶促反应，12000rpm离心5min，测定上清液在400nm处的吸光值A400。空白对照体系中添加200μl灭活酶液，其余同上，测定上清液的吸光值A0，每个pH条件均设置空白。

不同pH条件下酶活曲线图如图2所示，在pH值为8时地衣芽孢杆菌Bl22几丁质脱乙酰酶活性最高(2100U/ml粗酶液)，定义此条件下几丁质脱乙酰酶的酶活为100％，其余各pH值条件下测得的酶活数据与pH值为8时酶活的比值为相应的相对酶活。在pH值为6-10时地衣芽孢杆菌Bl22几丁质脱乙酰酶均具有较高活性，相对酶活为91.6-100％。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。

Claims (9)

1.一株地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis），其特征在于，所述地衣芽孢杆菌的保藏编号为CGMCC No. 20490。

2.一种发酵剂，其特征在于，该发酵剂含有权利要求1所述的地衣芽孢杆菌的活菌体。

3.根据权利要求2所述的发酵剂，相对于每克所述发酵剂，所述活菌体的含量为10⁵-10¹⁰CFU。

4.根据权利要求2所述的发酵剂，相对于每克所述发酵剂，所述活菌体的含量为10⁷-10⁹CFU。

5.权利要求1所述的地衣芽孢杆菌，或者权利要求2-4任意一项所述的发酵剂在生产几丁质脱乙酰酶和/或脱除几丁质上的乙酰基中的应用。

6.一种几丁质脱乙酰酶的制备方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌，或者权利要求2-4任意一项所述的发酵剂接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液，将所述发酵液进行固液分离得到菌体细胞沉淀，然后对所述菌体细胞进行破碎，得到含有几丁质脱乙酰酶的物料。

7.一种脱除几丁质上的乙酰基的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求1所述的地衣芽孢杆菌，或者权利要求2-4任意一项所述的发酵剂与几丁质接触，以对其中的乙酰基进行脱除。

8.根据权利要求7所述的方法，其中，所述接触的条件包括：pH值4-13；温度为25-55℃。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其中，所接触的条件包括：pH值7-10；温度为30-45℃。

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