CN101451113B - 一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种能生产琼胶酶的新型微生物需钠弧菌(Vibrionatriegens)CGMCC No.2428以及该菌生产琼胶酶的方法。该菌分离自东海沉积物，属于革兰氏阴性菌，好氧生长，最适生长NaCl浓度为5-10g/L，最适生长pH值为7.5，能利用酵母膏、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖等多种糖类作为能源与碳源生长，经鉴定该菌属于Vibrio natriegens。V.natriegens CGMCC No.2428生长周期短，7h就达对数生长期，该菌能诱导表达琼胶酶，通过简单的分离方法，可从培养液中收集琼胶酶。本发明提供的琼胶酶制备工艺简单，成本低廉，大量快速，可运用于工业生产或医药领域，以产生琼胶低聚糖。

Description

一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法
技术领域
本发明涉及保藏号为CGMCC No.2428的新微生物，保藏日期为2008年4月1日，分类命名为弧菌(Vibrio)，后鉴定为需钠弧菌(Vibrio natriegens)，本发明还涉及该菌株生产琼胶酶的方法。
背景技术
琼胶是某些海藻细胞壁中的一种水溶性多糖，由琼脂糖和琼脂胶组成。琼脂胶主要由含硫酸基、甲基等取代基团、结构复杂的多糖链构成。琼脂糖是由(1→3)-O-β-D-半乳糖和(1→4)-O-3，6-内醚-α-L-半乳糖交替组成的线形链状分子。
琼胶酶是一种降解琼脂糖的糖基水解酶，产酶菌多为海洋细菌。通过查阅资料、文献检索所知，Alterococcus、Alteromonas、Bacillus、Cytophaga、Microscilla、Microbulbifer、Pseudoalteromonas、Pseudomonas、Streptomyces、Zobellia等属中的某些菌株可产生琼胶酶，中国专利200410023656.1报道了一种从我国南海海域分离的生产琼胶酶的新菌种Alteromonas sp.nov.SY37-12(CCTCCM204009)。
琼胶酶水解海藻产生的寡糖往往具有抗肿瘤、抗病毒、增强免疫等性质，可作为手性药物拆分剂应用于生物医药领域，推动生物催化和生物转化的产业化工作。海洋中藻类含量极其丰富，将是未来人类食品有效来源之一，琼胶酶水解海藻产生的低聚糖用于生物质能源和食品，对于实现能源多样化，缓解能源危机，提高已有资源的利用价值，具有重大的作用，并将对传统能源和食品行业产生深远影响。此外，琼胶酶还可作为分子生物学的报告基因和多糖结构测定的工具酶、海产养殖的酶制剂等。可见，琼胶酶作为手性药物拆分剂、生物活性物质生产剂、风味改进剂，可广泛应用于生物医药、食品化工、海产养殖等领域。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种能生产具有高酶活性琼胶酶的菌株。
本发明的菌株是从自然环境中分离出来的新菌株，以往也没有需钠弧菌(Vibrio natriegens或简写为V.natriegens)生产琼胶酶的报道。制备琼胶酶的需钠弧菌(V.natriegens)分离自东海沉积物，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC No.2428。
经形态鉴定及生物学特性研究，保藏号为CGMCC No.2428的菌株具有以下特征：
(1)菌落形态：菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，凸起，乳白色。
(2)细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞显微镜下(Olympus，BX40)呈现运动性，形态为杆状居多(2-3μm×0.4-0.6μm)。
(3)生理生化特征：好氧生长，氧化酶、接触酶阳性，吲哚反应阴性，不水解淀粉、酪素、纤维素，能利用酵母膏、葡萄糖、***糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用木聚糖、乳糖、山梨醇，对庆大霉素、氯霉素敏感。
对保藏号为CGMCC No.2428的菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，发现16S rRNA基因部分片断长度为532bp，与已知需钠弧菌(V.natriegens)的16S rRNA基因序列相似性为99.4％。菌株V.natriegens CGMCC No.2428的16S rRNA序列具体可见序列表。
因此，参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》第二版第二卷的内容，根据菌株的限制因子特点、形态特征和生理生化指标，结合16S rRNA基因序列相似性，鉴定菌株CGMCC No.2428为需钠弧菌(V.natriegens)。
本发明的另一个目的是提供一种采用CGMCC No.2428生产琼胶酶的方法，包括以下步骤：
(1)将需钠弧菌(CGMCC No.2428)接种至发酵培养基中，20—37℃培养5-10小时；
(2)往发酵培养基中加入无菌琼脂糖诱导培养15-25小时；
(3)发酵培养基经高速离心，上清液经过微孔滤膜后，旋转蒸发至干，即得琼胶酶。
上述方法步骤(1)中，需钠弧菌可接种于pH值为6.5-8.5(优选7.5)的发酵培养基中，在20-37℃(优选30-35℃)温度下培养5-10小时(优选7小时)，使菌株V.natriegens CGMCC No.2428达到对数生长期。所述的发酵培养基组成如下：氯化钠5-10g/L，水合氯化镁2-6g/L，氯化钾0.5-2.5g/L，胰蛋白胨5-20g/L，其余为水，pH为6.5-8.5(优选7.5)。
上述方法步骤(2)中，需加入无菌琼脂糖诱导菌株表达琼脂酶。往培养基中加入加入无菌琼脂糖至终浓度0.05-5g/L(优选为1g/L)，150-250(优选180)rpm培养3-6h后，转速下调至50-100rpm(优选80rpm)再培养15-25h(优选18h)，得到需钠弧菌(V.natriegens)的富集培养液。
上述方法步骤(3)中，将步骤(2)中的富集培养液高速离心，例如5000-10000rpm离心5-10min，经离心获得的上清液中含有琼胶酶。上清液通过0.22μm孔径的微孔滤膜后，旋转蒸发至干，即为V.natriegens CGMCC No.2428琼胶酶，4℃低温保藏备用。
本发明发现的V.natriegens CGMCC No.2428生长周期短，7h就达对数生长期，该菌能诱导表达琼胶酶，诱导表达时间为17-22h。通过简单的分离方法，可从培养液中收集高活性的琼胶酶。本发明提供的琼胶酶制备工艺简单，成本低廉，大量快速，适合运用于工业生产或医药领域，以生产琼胶低聚糖广泛应用于生物医药、食品化工、海产养殖等领域。
附图说明
图1为V.natriegens CGMCC No.2428生长曲线图；
图2为不同琼脂糖诱导条件下V.natriegens CGMCC No.2428琼胶酶酶活力曲线图；
图3为不同培养时间条件下V.natriegens CGMCC No.2428琼胶酶酶活力曲线图
具体实施方式
实施例1：需钠弧菌(Vibrio natriegens)CGMCC No.2428的分离筛选
将采自我国东海沉积物样品2g放在50ml含玻璃珠的过滤除菌陈海水中，振荡打散，取上清液过滤除菌陈海水梯度稀释后涂布筛选培养基平板，37℃培养7天左右，观察结果。菌落周围形成凹陷的菌株挑选保藏，经卢戈氏碘液鉴定，菌落周围形成透明圈者为产酶菌株。将筛选获得的菌株接种液体筛选培养基，测定发酵液的琼胶酶活力，筛选出一株产琼胶酶菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.2428。菌株筛选培养基(g/L)：氯化钠19.45，氯化镁8.8，氯化钙1.8，氯化钾0.55，碳酸氢钠0.16，柠檬酸铁0.1，溴化钾0.08，氯化锶0.034，硼酸0.022，磷酸氢钠0.008，硅酸钠0.004，氟化钠0.0024，硝酸铵0.0016，酵母抽提物5.0，蛋白胨1.0，pH7.4，其余为水。
实施例2：需钠弧菌(V.natriegens)CGMCC No.2428的形态鉴定及生物学特性
V.natriegens CGMCC No.2428接种于发酵培养基(DSMZmedium308)，培养基组成如下(g/L)：氯化钠5.0，水合氯化镁4.0，氯化钾1.0，胰蛋白胨10.0，pH7.5，其余为水。制备固体培养基可再加入20g/L的琼脂。121℃灭菌30分钟。接种培养后，经鉴定，该菌具有以下特征：(1)菌落形态：菌落呈圆形，表面光滑，边缘平整，凸起，乳白色。(2)细胞形态：革兰氏阴性菌，细胞显微镜下(Olympus，BX40)呈现运动性，形态为杆状居多(2-3μm×0.4-0.6μm)。(3)生理生化特征：好氧生长，氧化酶、接触酶阳性，吲哚反应阴性，不水解淀粉、酪素、纤维素，能利用酵母膏、葡萄糖、***糖、蔗糖、麦芽糖，不能利用木聚糖、乳糖、山梨醇，对庆大霉素、氯霉素敏感。
实施例3：需钠弧菌(V.natriegens)CGMCC No.2428的16SrRNA基因的PCR扩增与序列测定
V.natriegens CGMCC No.2428接种于固体发酵培养基，从斜面中直接挑取一环菌体，加入400μL无菌水混匀，100℃水浴5分钟，12000rpm离心2分钟，上清直接用于PCR。扩增16S rRNA基因的一对通用引物如下：
正向引物：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；
反向引物：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；
上述引物分别对应大肠杆菌的16S rRNA基因的8—27和1510—1492位碱基。PCR反应体系(50μL)为：10×buffer 5μL，10mMdNTPs1μL，4mM引物各1μL，ddH2O 42μL，Taq酶0.5μL，模板DNA0.5μL。PCR反应条件为：94℃变性45s；55℃退火45s；72℃延伸90s，30个循环后72℃延伸10min。PCR产物纯化与序列测定由北京诺赛基因组研究中心有限公司完成。完成测定的16S rRNA基因部分片断长度为532bp，与菌株V.natriegens ATCC14048T的相关序列相似性为99.4％。菌株V.natriegens CGMCC No.2428的16S rRNA序列具体可见序列表。
因此，参照《Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology》第二版第二卷的内容，根据菌株的限制因子特点、形态特征和生理生化指标，结合16S rRNA基因序列相似性，鉴定菌株CGMCC No.2428为需钠弧菌(V.natriegens)。
实施例4：需钠弧菌(V.natriegens)CGMCC No.2428琼胶酶发酵生产条件
V.natriegens CGMCC No.2428接种于发酵培养基(DSMZmedium 308)，其生长范围与最佳生长条件如下：NaCl浓度范围为1-100g/L，最适为5-10g/L；生长pH值范围为6.5—8.5，最适为7.5；生长温度范围为20—37℃，最适为30—35℃。V.natriegensCGMCC No.2428接种于DSMZ medium 308培养基35℃培养7小时可至对数生长期(图1)。
琼脂糖是琼胶酶的诱导剂。将不同浓度的无菌琼脂糖(0、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0g/L)加入处于对数生长期的菌液中，180rpm培养4h后，转速下调至80rpm继续培养24h。还原糖浓度测定根据3，5-二硝基水杨酸(DNS)比色法，具体描述如下：培养液经5000rpm离心10min，直接取200μl上清液加入等体积的反应底物溶液(琼脂糖2.0g/L、氯化钠5.0g/L、Tris-HCl 50mM，pH7.5)，溶液充分混匀后55℃反应30min，再加入300μl DNS溶液沸水浴显色7min。溶液2000rpm离心5min后取上清500μl稀释至2.5ml，静至1min后测定光吸收值(OD540)。定义酶活力单位(U)为：每分钟释放1μmol还原糖所需要的酶量。V.natriegensCGMCC No.2428在不同琼脂糖诱导条件下的酶活力大小见图2，琼脂糖浓度为5g/L条件下，V.natriegens CGMCC No.2428琼胶酶产量优于其他试验条件；琼脂糖浓度为1g/L条件下，V.natriegensCGMCC No.2428琼胶酶产量可达10.3U/ml。
将无菌琼脂糖加入处于对数生长期的菌液中，至琼脂糖浓度为1g/L和5g/L，180rpm培养4h后，转速下调至80rpm继续培养。每隔4-8h取样，测定上清液中琼胶酶酶活大小(图3)。琼脂糖诱导表达17-22h，V.natriegens CGMCC No.2428琼胶酶产量即可达到最大值，为17-20U/ml。
实施例5：需钠弧菌(Vibrio natriegens)CGMCC No.2428琼胶酶制备
对数生长期的V.natriegens CGMCC No.2428菌液中加入无菌琼脂糖至终浓度1g/L，180rpm培养4h后，转速下调至80rpm培养18h。溶液5000rpm离心10min，上清液通过0.22μm孔径的微孔滤膜后，40-45℃旋转蒸发至干，即为V.natriegens CGMCCNo.2428琼胶酶，4℃低温保藏备用。使用过程中，采用Tris-HCl-NaCl溶液(氯化钠5.0g/L、Tris-HCl50mM，pH＝7.5)溶解，加至琼脂糖溶液混匀后55℃温浴12-24h，即可产生琼胶低聚糖。
序列表
<110>国家***第二海洋研究所
<120>一种需钠弧菌及采用该菌生产琼胶酶的方法
<160>1
<170>PatentIn version3.3
<210>Seq ID No.1
<211>532
<212>DNA
<213>Vibrio natriegens
<400>Seq ID No.1

Claims (10)

1.一种需钠弧菌(Vibrio natriegens)，菌种保藏号为CGMCCNo.2428。
2.根据权利要求1所述的需钠弧菌(Vibrio natriegens)，其特征在于：所述需钠弧菌(Vibrio natriegens)的16S rRNA序列如Seq ID NO.1所示。
3.一种利用权利要求1所述的需钠弧菌(Vibrio natriegens)制备琼胶酶的方法，包括如下步骤：
(1)将需钠弧菌CGMCC No.2428接种至发酵培养基中，20-37℃培养5-10小时；
(2)往发酵培养基中加入无菌琼脂糖诱导培养15-25小时；
(3)发酵培养基经高速离心，上清液经过微孔滤膜后，旋转蒸发至干，即得琼胶酶。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵培养基包括如下成分：氯化钠5-10g/L，水合氯化镁2-6g/L，氯化钾0.5-2.5g/L，胰蛋白胨5-20g/L，其余为水，pH为6.5-8.5。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的发酵培养基包括如下成分：氯化钠5g/L，水合氯化镁4g/L，氯化钾1g/L，胰蛋白胨10g/L，其余为水，pH为7.5。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的培养温度为30-35℃。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中往发酵培养基中加入无菌琼脂糖至终浓度0.05-5g/L。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)的过程为：培养基中加入无菌琼脂糖至终浓度0.05-5g/L，150-250rpm培养3-6h后，转速下调至50-100rpm，再培养15-18h，得到需钠弧菌(V.natriegens)的富集培养液。
9.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的离心速度为5000-10000rpm。
10.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中的微孔滤膜孔径为0.22μm。
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