CN108018234B - 一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用 - Google Patents

一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08及其应用，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M 2017409，保藏日期：2017年7月5日。该菌株产生的褐藻胶裂解酶为胞外酶，分离纯化简单，无需细胞破碎；在优选条件下，未经分离纯化的粗酶液酶活达到68.5U/mL；本发明所述菌株HQZ08发酵培养基成分简单，发酵时间较短，可用于大量制备褐藻胶寡糖。

Description

一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物菌株及其应用技术领域，具体涉及一株产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌及其制备褐藻胶裂解酶的发酵方法与褐藻胶寡糖的制备方法。
背景技术
褐藻胶是一种从海洋褐藻中提取的多糖，在食品、医药、日用化工等行业都有普遍的应用，但由于其粘度高，水溶性低，不易被人体吸收，在应用方面受到一定的限制。褐藻胶寡糖是褐藻胶经降解得到的聚合度2～10的低聚糖，由于水溶性好，容易被人体吸收，因此其在医药领域具有较高的应用价值。研究表明褐藻胶寡糖具有神经保护、抗哮喘、抑菌、增强免疫力、抗肿瘤、降血糖血脂、抗凝血及促生长等活性，并且能有效抵抗人体衰老，是一种极具开发潜力的低聚糖。
现有技术中褐藻胶寡糖的制备方法主要有酶降解法、物理和化学降解法。物理法操作简单，无污染，节约试剂，可以有效的切断大分子链，但是降解所得的极限分子质量较大，不易制备出分子量较小的寡糖。化学降解法包括酸降解法及氧化降解法，酸解法降解速度慢，需要高温高压，降解效率低，活性较高的寡糖含量不高，且会对环境造成污染。氧化降解法反应过程简单，成本较低，但降解条件剧烈且对寡糖的还原端有一定的破坏作用。而酶解法是一种条件温和可控性强和特异性高的生物降解方法，具有降解产物活性高、产物专一性好、反应条件温和、无污染等诸多优势，但由于缺乏产酶活力高的菌株，导致褐藻胶裂解酶产量低下，提高了酶解法的生产成本，限制了该法的推广应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一株产褐藻胶裂解酶的菌株。本发明产褐藻胶裂解酶的菌株名称为：海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M2017409，保藏日期：2017年7月5日。
本发明的另一个目的提供一种由上述产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetiamarina)HQZ08发酵制备褐藻胶裂解酶的方法，具体包括如下步骤：
(1)将海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；
(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；
(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；
(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；
步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH 7～7.5；
步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5；
步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH 7～7.5。
本发明还提供一种褐藻胶寡糖的制备方法，其步骤为：
(1)将海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；
(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；
(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；
(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；
(5)以步骤(4)所得褐藻胶裂解酶粗酶液对褐藻胶进行酶解，酶解体系如下：加酶量40～70U/g，底物浓度0.5～1％，酶解缓冲液为pH 7～8的PBS缓冲液，酶解温度35～45℃，酶解时间36～48h；
(6)将步骤(5)的酶解产物冷却后，离心过滤除去未降解的海藻酸钠，制得褐藻胶寡糖；
步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH 7～7.5；
步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5；
步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH 7～7.5。
本发明的有益效果是：
1、本发明的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08产生的褐藻胶裂解酶为胞外酶，分离纯化简单，无需细胞破碎；
2、本发明的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08营养要求简单，发酵时间短；
3、本发明的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08的产酶活性比较高，在优选条件下，未经过纯化的粗酶液酶活力达到68.5U/mL；
4、本发明的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08所产的褐藻胶裂解酶反应条件温和，对环境无污染；
5、本发明的褐藻胶寡糖的制备方法简单，成本低，可用于褐藻胶寡糖的大量制备。
附图说明
图1为本发明实施例1所筛选出的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08在平板培养基上的菌落形态图；
图2为本发明所述菌株与blast结果相近的菌株的16S rDNA序列构建的***发育树；
图3为培养基pH对海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；
图4为培养温度对海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；
图5为培养时间对海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；
图6为接种量对海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08产褐藻胶裂解酶的影响图；
图7为本发明实施例5所制得的褐藻胶寡糖的TLC色谱图。
具体实施方式
以下通过具体实施方式结合附图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
实施例1：产褐藻胶裂解酶菌株的筛选
(1)、50mL富集培养基分装于250mL锥形瓶中，取少量海泥以无菌水振荡30min，然后将该振荡液和采集到的海水分别接种到富集培养基中，接种量均为5mL，30℃培养48h。
(2)、初筛培养基倒平板，将富集培养的海水和海泥菌液分别进行10-1～10-7梯度稀释，对10-3～10-7稀释度的菌液进行涂布，30℃培养48h。观察菌落周围透明圈大小，选取生长状况良好且透明圈较大的菌株为出发菌株，进行平板划线分离纯化。
(3)、将50mL液体种子培养基装入250mL的锥形瓶中，将平板划线分离得到的菌种接种到分装好的培养基中，30℃恒温培养24h后，以2％的接种量接种到发酵产酶培养基中，30℃恒温培养24h后，离心收集上清液，DNS法测定粗酶活。将酶活最高的菌株加40％甘油和菌液1﹕1混合，保存于-80℃冰箱中备用。
液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5；
发酵产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH7～7.5。
如图1所示，该菌的菌落特征如下：涂布于平板培养基上30℃培养24h后菌落呈圆形，表面光滑，边缘整齐，颜色为乳白色，菌株在显微镜下为杆状、革兰氏染色阴性。该菌的生理生化特征见表1。表1：海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08的生理生化特征
Figure BDA0001507232060000061
所述的富集培养基组成为：海藻酸钠3～6g/L，硫酸铵3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH 7～7.5。
所述的初筛培养基组成为：海藻酸钠3～6g/L，硫酸铵3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，琼脂15～20g/L，pH 7～7.5。
实施例2：产褐藻胶裂解酶菌株的鉴定
将实施例1筛选出的菌株使用细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提细胞的全基因组，之后采用通用27F/1492R引物(正向引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，反向引物5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)进行16S rDNA的PCR扩增，PCR扩增条件为：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min。PCR扩增后委托北京六合华大基因科技有限公司广州分公司测序。
菌株的16S rDNA的脱氧核酸序列如序列表所示。将上述16S rDNA脱氧核酸序列与美国国立生物中心(National Center for Biotechnology Information USA,NCBI)的基因库中的16S rDNA序列进行比对，与Cobetia marina strain JCM 21022有99％的同源性，遂鉴定该菌为Cobetia marina。该菌与其近缘菌株的16S rDNA序列构建的***发育树如图2所示。
实施例3：海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08生产褐藻胶裂解酶的发酵条件优化
(1)培养基pH对海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08产酶的影响
设置六个实验组，考察了产酶培养基初始pH(6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5)对菌株产酶的影响，将菌株在配方为海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5的液体种子培养基中培养12～24h后，以2％的接种量接种于除pH不同外，均由海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L组成的液体产酶培养基中，在30℃培养24h。培养基初始pH能够直接影响菌体的细胞膜的通透性，稳定性以及代谢产物酶的活力。该菌在6.0～8.5范围内均能正常生长，当发酵培养基初始pH为7.0时菌株产酶达到最大值(如图3)。
(2)培养温度对海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08产酶的影响
温度对细菌的生长和产酶能力影响较显著，分别设置20℃、25℃、28℃、30℃、32℃、35℃进行菌株产酶能力的考察。将菌株在配方为海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH7～7.5的液体种子培养基中培养12～24h后，以2％的接种量接种于由海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L组成的pH 7.0的液体产酶培养基中，在不同温度下培养24h。结果显示当温度为25℃时该菌株产酶能力达到最大值(如图4)。
(3)发酵时间对海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08产酶的影响
产酶培养的过程中，随着培养时间的增加，菌群的生长达到稳定期，产酶量开始增加，而培养时间过长时可能会导致产生的酶逐渐失活。将菌株在配方为海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5的液体种子培养基中培养12～24h后，以2％的接种量接种于由海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L组成的pH7.0的液体产酶培养基中，在25℃分别培养18h、24h、30h、36h、42h，察培养时间对菌株产酶的影响。由图5可以看出，当培养时间达到24h时菌株产酶能力最大，超过24h产酶能力明显下降。
(4)接种量对海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08产酶的影响
将菌株在配方为海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5的液体种子培养基中培养12～24h后，接种于由海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L组成的pH 7.0的液体产酶培养基中，在25℃培养24h，考察了接种量分别为0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％时对菌株产酶的影响，接种后培养基总体积为50mL。由图6可知，2％的接种量是菌株HQZ08发酵产酶的最佳接种量。
实施例4：利用海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08生产褐藻胶裂解酶
(1)将海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08菌种接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，得到活化后的海科贝特氏菌菌种；所述的斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH 7～7.5。
(2)将步骤(1)活化培养后的海科贝特氏菌Cobetia marina HQZ08菌种接种至液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉0.5～1g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5。
(3)将步骤(2)种子液以0.5％～3％体积比的接种量移种到液体培养基中，于25～30℃、150～200r/min振荡下培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；所述液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH 7～7.5。
(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液在8000～12000r/min，10～15min、0.22μm条件下离心分离过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液，其活力达到68.5U/mL。
酶活力测定方法为：100μL粗酶液，加入900μL 0.3％的褐藻胶溶液(25mM pH为7.5的磷酸盐缓冲液溶解)中，在40℃恒温水浴锅中反应5min，加入2mL的DNS试剂停止反应，沸水煮沸5min。流水冷却，定容到10mL，540nm测吸光度。1mL粗酶液每分钟催化产生1μg还原糖所需的酶用量定义为一个酶活力单位。
实施例5：褐藻胶寡糖的制备
以实施例4制得的褐藻胶裂解酶粗酶液对褐藻胶进行酶解，酶解体系如下：加酶量40～70U/g，底物浓度0.5～1％，酶解缓冲液为pH 7～8的PBS缓冲液，酶解温度35～45℃，酶解时间36～48h。将酶解产物冷却后，离心过滤除去未降解的褐藻胶，制得所述褐藻胶寡糖。该制得的褐藻胶寡糖与褐藻胶寡糖标准品的TLC色谱图如图7所示，其中0：褐藻胶寡糖标准品(二糖、三糖、四糖、六糖)；1：自制褐藻胶寡糖产品。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，即依本发明专利范围及说明书内容所做的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
序列表
<110> 华侨大学
<120> 一株产褐藻胶裂解酶的菌株及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> (人工合成)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> (人工合成)
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<210> 3
<211> 1436
<212> DNA
<213> (海科贝特氏菌(Cobetia marina))
<400> 3
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ctgcttggct agagtgcagg agaggaaggt agaattcccg gtgtagcggt gaaatgcgta 660
gagatcggga ggaataccag tggcgaaggc ggccttctgg actgacactg acactgaggt 720
gcgaaagcgt gggtagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatgt 780
caactagccg ttgggtccct tgaggactta gtggcgcagc taacgcaata agttgaccgc 840
ctggggagta cggccgcaag gttaaaactc aaatgaattg acgggggccc gcacaagcgg 900
tggagcatgt ggtttaattc gatgcaacgc gaagaacctt acctaccctt gacatccaga 960
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cgtcagctcg tgttgtgaaa tgttgggtta agtcccgtaa cgagcgcaac ccctatcctt 1080
atttgccagc gagtaatgtc gggaactcta aggagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140
gtggggacga cgtcaagtca tcatggccct tacgggtagg gctacacacg tgctacaatg 1200
gcaagtacaa agggttgcaa tacggcgacg tggagccaat cccataaagc ttgcctcagt 1260
ccggattgga gtctgcaact cgactccatg aagtcggaat cgctagtaat cgtggatcag 1320
aatgccacgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgggagtg 1380
gactgcacca gaagtggtta gcctaacctt cgggagggcg atcaccacgg ttgtag 1436

Claims (3)

1.一株产褐藻胶裂解酶的菌株，所述菌株名称：海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，邮政编码：430072，保藏编号：CCTCC No：M 2017409，保藏日期：2017年7月5日。
2.一种根据权利要求1所述产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08发酵制备褐藻胶裂解酶的方法，具体包括如下步骤：
(1)将海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；
(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；
(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；
(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；
步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH 7～7.5；
步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5；
步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH 7～7.5。
3.一种根据权利要求1所述产褐藻胶裂解酶的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08发酵制备褐藻胶寡糖的制备方法，其步骤为：
(1)将海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于斜面培养基，于25～30℃下培养24～48h，进行活化；
(2)将步骤(1)活化后的海科贝特氏菌(Cobetia marina)HQZ08接种于液体种子培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养12～24h，得到种子液；
(3)将步骤(2)所得种子液接种于液体产酶培养基中，于25～30℃、150～200r/min下振荡培养24～48h，得到含褐藻胶裂解酶的发酵液；
(4)将步骤(3)含褐藻胶裂解酶的发酵液8000～12000r/min，10～15min离心分离、0.22μm过滤除去菌体，所得酶液即为褐藻胶裂解酶粗酶液；
(5)以步骤(4)所得褐藻胶裂解酶粗酶液对褐藻胶进行酶解，酶解体系如下：加酶量40～70U/g，底物浓度0.5～1％，酶解缓冲液为pH 7～8的PBS缓冲液，酶解温度35～45℃，酶解时间36～48h；
(6)将步骤(5)的酶解产物冷却后，离心过滤除去未降解的褐藻胶，制得褐藻胶寡糖；
步骤(1)所述斜面培养基的配方为：琼脂15～20g/L，海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g/L，七水合硫酸镁0.5～1g/L，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，pH 7～7.5；
步骤(2)所述的液体种子培养基的配方为：海藻酸钠3～6g/L，蛋白胨3～5g/L，酵母粉1～2g/L，氯化钠25～30g/L，pH 7～7.5；
步骤(3)所述的液体产酶培养基的配方为：海藻酸钠5～7g/L，蛋白胨3～5g/L，氯化钠25～30g，三水合磷酸氢二钾1～2g/L，pH 7～7.5。
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