CN102971426A - 具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW - Google Patents

Abstract

本发明涉及具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。本发明通过分析存在于自然的微生物区系中的未知的宏基因组，来提供新颖的微生物及蛋白质。本发明涉及具有序列目录第二序列中所记载的氨基酸序列的海藻酸裂解酶(alginate lyase)及AlyDW。根据本发明，提供通过分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的微生物来稳定地分解海藻类的酶。并且，本发明提供应用从生物工程方面大量生产功能性多糖类的技术来减少在加工工序中派生的废弃物的量，并提高资源的应用度的技术。

Description

具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW

【技术领域】

本发明涉及具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶AlyDW(Metagenome Libraries with Alginate Lyase Activity andNovel Enzyme AlyDW)。

【背景技术】

海藻类作为在韩国沿近海大量栖息的生物，是一种潜在资源。大部分的海藻类经过简单加工之后可供食用，但是，将来有望成为用作生物能源或者功能性食品及医药原料的资源。

海藻类的组成成分大部分是多糖类，但是盐分含量较高，表层被粘液性的多糖体所包裹。因此，为了利用海藻类作为资源，首先应当伴随多糖体的分解。纤维素和琼脂等多糖体作为β-1，4-配糖(glycoside)，能够被多种微生物分解。但是，利用陆地植物体的多糖体作为基质的微生物和利用海藻类的多糖体作为基质的微生物在栖息环境或基质的氯度方面互不相同。例如，在对黄褐盒管藻的细胞壁分解能力优秀的细菌进行几次继代培养的情况下，能够确认细胞壁分解能力显著下降。为了解决这种问题，需要确立分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的多种微生物，并能够使这种微生物稳定地分解海藻类的条件。

为了降低海藻酸等海藻多糖体的聚合度，通过基于盐酸、有机酸的酸水解法来降低聚合度，从而制备低分子化海藻酸。基于酸的低分子化海藻酸制备法由于在工序上进行过度的酸处理，因而需要将耐酸性装置和废弃的强酸中和后排出，由此需要大量的碱，导致工序成本变贵。但是，通过确立利用来源于鲍鱼的微生物酶，而能够在无需强酸和强碱的温和的反应条件下生成低分子化海藻酸的反应条件，从而需要确立应用从生物工程方面大量生产多糖类的技术来减少海藻类加工工序中派生的废弃物的量，并提高资源的应用度的技术。

在自然环境中栖息的微生物的培养方法十分繁杂且非常苛刻。能够从实际环境生态***分离培养的微生物小于1％，故无法通过传统的培养方法进行培养。为了克服这种困难，正在应用在不进行微生物的分离及培养的情况下，掌握细菌群集的多样性、结构及功能的分子生物学方法。其中，利用最广泛的部分是通过作为利用核酸的分子生物学方法的16S rRNA基因的碱基序列决定来进行***分类学分析，从而正在活跃进行鉴定及应用此的研究。16SrRNA基因具有按照种类水准划分细菌的信息，该基因的碱基序列的变化对掌握微生物之间的亲缘进化关系十分有用。但是，即使通过分子生物学方法来确认存在于生态***的微生物信息，分离出微生物并掌握所分离的微生物的特性的过程也对在基因资源的确保方面上起到十分重要的作用。

由于需要新颖的功能性食品及发酵性生物资源，因而对于新颖微生物的酶的需求逐渐增加。从海洋生物的肠道(intestinal tracts)分离的裂解酶-生产微生物生产出混合有琼脂糖酶(agarase)、昆布糖酶(laminarase)、纤维素酶(cellulase)以及海藻酸裂解酶(alginatelyase)的海藻类-分解酶。¹⁸并且，据报道，海藻酸裂解酶按照β-消去机理(elimination mechanism)，将微生物的褐藻类分解为α-L-古罗糖醛酸(guluronic acid)(G)、β-D-甘露糖醛酸(mannuronic acid)(M)、交替的(alternating)MG(GM)以及杂聚的(heteropolymeric)MG(GM)。¹¹从包含鲍鱼(abalone)及Psuedoalteromonas sp.IAM14594(AF082561)、Sphingomonas sp.A1(AB120939)、Klebsiellapneumonia subsp.aerogenes(L19657)、Vibrio sp.QY101(AY221030)以及Psuedomonas sp.OS-ALG-9(AB003330)的多种海洋细菌的内脏分离出这种酶。^{2，4，13，15}迄今，在基因组(Genebank)数据库中所报告的海藻酸裂解酶为23ORF程度。²⁴根据以往的研究，许多其他微生物的海藻酸裂解酶按照两种基质特异性划分为G块-特异聚古罗糖醛酸(polyguluronate)裂解酶(EC 4.2.2.11)及M块-特异聚甘露糖醛酸(polymannuronate)裂解酶(EC 4.2.2.3)。¹⁹最近，发现了通过具有高等植物的根部生长促进、Bifidobacterium sp.生长速度的加速、人体单核(mononuclear)细胞的细胞毒性细胞因子生产的诱导、IgE的抑制、抗高血压效果等确切的生物学活性的酶来进行分解的海藻酸。5因此，海藻酸裂解酶及海藻酸低聚糖备受食品及医药品产业的研究员的瞩目。

利用16s rRNA基因的克隆文库的独立性培养研究提供了Alpha-、Gamma-、Epsilonproteobacteria及mollicutes相对于作为主要微生物区系的鲍鱼Haliotis discus hannai的内脏里的所有细菌的多样性。²¹然而，未提供能够通过上述16s rRNA基因的信息获知微生物的生物学功能的有效信息。^17，23与此相对地，利用福斯质粒(fosmid)克隆***的宏基因组文库能够确认难以培养的生物体的新颖基因。¹利用直接从福斯质粒载体及处于多种环境的样本分离出的约为40kb的***(insert)大小的上述筛选***用于确认几丁质酶(chitinase)、脱氢酶(dehydrogenase)、氧化还原酶(oxidoreductase)、淀粉酶(amylase)、酯酶(esterase)、内切葡聚糖酶(endoglucanase)以及环状糊精酶(cyclodextrinase)等广泛的基因。^1，20发明者利用宏基因组文库，在鲍鱼的肠内微生物区系中查明了高活性的海藻酸裂解酶基因。

在本说明书的全文中，参照引用了多篇论文及专利文献，并标注了引用部分。所引用的论文及专利文献的揭示内容，作为参照结合在本说明书，用以更加清楚地说明本发明所属技术领域的水准及本发明的内容。

【发明内容】

本发明致力于开发出具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及AlyDW。其结果，分离出来源于鲍鱼肠内的微生物来查明了具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库及新颖酶，并查明了这种新颖酶所具有的最佳活性条件，从而完成了本发明。

本发明的目的在于，提供具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。

本发明的再一个目的在于，提供新颖的海藻酸裂解酶(alginatelyase)。

本发明的另一个目的在于，提供对新颖的海藻酸裂解酶(alginatelyase)进行编码的核酸分子。

本发明的还一个目的在于，提供包含上述核酸分子的重组载体。

本发明的又一个目的在于，提供通过上述重组载体进行转化的细胞。

本发明的其他一个目的在于，提供海藻酸的分解方法。

本发明的目的及优点通过下面的具体实施方式、权利要求书及附图变得更加清楚。

根据本发明的实施方式，本发明提供包含22个ORF的具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库。上述22个ORF包含：序列目录第一序列的第1280-3652次核苷酸序列、第5025-6128次核苷酸序列、第6365-7492次核苷酸序列、第8687-9202次核苷酸序列、第9206-9823次核苷酸序列、第9823-11250次核苷酸序列、第11377-12189次核苷酸序列、第12290-13306次核苷酸序列、第13611-14642次核苷酸序列、第14646-15212次核苷酸序列、第15417-16388次核苷酸序列、第17370-19223次核苷酸序列、第19452-21017次核苷酸序列、第21253-22143次核苷酸序列、第22309-23121次核苷酸序列、第23333-24208次核苷酸序列、第24294-24989次核苷酸序列、第25446-26477次核苷酸序列、第26549-28063次核苷酸序列、第28362-29579次核苷酸序列、第30103-30930次核苷酸序列以及第31010-31696次核苷酸序列。

在本说明书中，术语“核苷酸”是指以单链或双链形态存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，只要未进行特殊说明，就包含天然核苷酸的类似物(Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，Chemical Reviews，90：543-584(1990))。

优选地，上述宏基因组文库具有序列目录为第一序列的核苷酸序列，更加优选地，上述宏基因组文库是通过利用从鲍鱼的内脏的微生物区系(microflora)获得的基因组DNA来构建的。

在本说明书中，术语“宏基因组(metagenome)”是指存在于自然界的微生物总集合，所谓的宏基因组是从土壤、海水、泥滩、河川、大气以及动物的大肠等多种自然环境中采取的微生物的DNA相互混合的形态，不是该DNA按照其种类分离的形态。并且，术语“宏基因组(metagenome)”还指以基因形态分析微生物的功能或多样性的技术。宏基因组是一种用于将作为存在于自然界的多种环境中的总微生物的染色体组的宏基因组克隆后在宿主细胞等中维持、表达，来构建宏基因组文库，从而对难培养微生物的***进行分类，并探索有用的酶和次级代谢产物的研究。

本发明的宏基因组文库能够通过本发明所属的技术领域中公知的各种方法来实施。优选地，利用黏粒(Bruce A.Voyles(2002)Thebiology of viruses 2nd ed.ISBN 0-07-237031-9)及福斯质粒(Barry G.Hall(July 2004).″Predicting the evolution of antibiotic resistancegenes.″.Nature Reviews Microbiology 2(5).doi：10.1038/nrmicro888.PMID 15100696)来构建宏基因组文库。

本发明的宏基因组文库的有用性在于，作为用于探索有用的酶(例如，海藻酸裂解酶)和次级代谢产物的研究手段。

根据本发明的再一实施方式，本发明提供具有在序列目录为第二序列中所记载的氨基酸序列的海藻酸裂解酶(alginate lyase)。

与以往的利用微生物的海藻酸分解方法不同，本发明者需要通过基于酸的低分子化海藻酸制备法来将强酸中和之后排出，而为了解除由此造成的工序成本，致力于确立能够通过分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的微生物来稳定地分解海藻类的条件。其结果可知，采掘了新颖的海藻酸裂解酶，据此，确认了能够对海藻酸进行更加有效而更加稳定的低分子化。

在本说明书中，术语“海藻酸裂解酶”是指分解由G块-特异聚古罗糖醛酸(polyguluronate)及M块-特异聚甘露糖醛酸(polymannuronate)组成的海藻酸来进行低分子化的酶。

根据本发明的优选实施例，上述海藻酸裂解酶是来源于微生物的酶。最优选地，上述海藻酸裂解酶是来源于鲍鱼的肠内微生物的酶。

根据本发明的另一实施方式，本发明提供对上述海藻酸裂解酶进行编码的核酸分子。

最优选地，本发明的核酸分子包含由序列目录为第一序列的第15417-16388次核苷酸序列来表示的核苷酸序列。

在本说明书中，术语“核酸分子”是指综合包含DNA(gDNA及cDNA)和RNA分子，在核酸分子中作为基本结构单位的核苷酸不仅包含天然的核苷酸，还包含糖或碱基部位变形的类似物(analogue)(Scheit，Nucleotide Analogs，John Wiley，New York(1980)；Uhlman及Peyman，Chemical Reviews，90：543-584(1990))。

核苷酸中的变异也包括在蛋白质中不引起变化的情况。这种核酸包含核酸分子，该核酸分子包含功能性均等的密码子或对相同的氨基酸进行编码的密码子(例如，根据密码子的简并性，相对于精氨酸或丝氨酸的密码子是六个)或者对生物学上均等的氨基酸进行编码的密码子。

并且，核苷酸中的变异还会给海藻酸裂解酶本身带来变化。即使在给海藻酸裂解酶的氨基酸带来变异的情况下，也能够获得表现出与本发明的海藻酸裂解酶几乎相同的活性的变异。

对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，应当清楚理解，本发明的海藻酸裂解酶中能够包含的生物学功能等同替代局限于发挥与本发明的海藻酸裂解酶均等的生物学活性的氨基酸序列的变异。

这种氨基酸变异基于氨基酸支链取代物的相对类似性，例如疏水性、亲水性、电荷、大小等发生。根据对于氨基酸支链取代物的大小、形态以及种类的分析可知，精氨酸、赖氨酸及组氨酸均为带阳电荷的残基；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸具有类似的大小；苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸具有类似的形态。因此，基于这种考虑事项，精氨酸、赖氨酸及组氨酸；丙氨酸、甘氨酸及丝氨酸；以及苯丙氨酸、色氨酸及酪氨酸可谓是生物学上的功能等同替代。

在导入变异时，能够考虑到氨基酸的疏水性指数(hydropathicidex)。各个氨基酸根据疏水性和电荷赋予疏水性指数。上述疏水性指数：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸盐(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸盐(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；以及精氨酸(-4.5)。

对于赋予蛋白质的交互性生物学功能(interactive biologicalfunction)来说，疏水性氨基酸指数起到十分重要的作用。众所周知，只有用具有类似的疏水性指数的氨基酸进行取代，才能保留类似的生物学活性。在参照疏水性指数来导入变异的情况下，在表现出优选为±2以内，更优选为±1以内，进而优选为±0.5以内的疏水性指数差异的氨基酸之间进行取代。

另一方面，众所周知，具有类似的亲水性值(hydrophilicity value)的氨基酸之间的取代造成具有均等的生物学活性的蛋白质。如美国专利第4554101号中所示，已赋予了各个氨基酸残基以下的亲水性值：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸盐(+3.0±1)；谷氨酸盐(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。

在参照亲水性值来导入变异的情况下，在表现出优选为±2以内，更优选为±1以内，进而优选为±0.5以内的亲水性值差异的氨基酸之间进行取代。

在未整体改变分子活性的蛋白质中的氨基酸替换为本发明所属技术领域所公知(H.Neurath，R.L.Hill，The Proteins，Academic Press，New York，1979)。最通常发生的替换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Thr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly之间的替换。

鉴于具有均等的生物学活性的上述变异，本发明的海藻酸裂解酶或编码该海藻酸裂解酶的核酸分子还包含序列目录中所记载的序列和表现出实质同一性(substantial identity)的序列。上述的实质同一性是指对本发明的上述序列和任意的其他序列进行排列使其最大限度地对应，并在利用本发明所属技术领域中通常利用的算法来分析所排列的序列的情况下，例如表现出最少99％的相同性的序列。用于比较序列的排列方法，已在本发明所属技术领域中公知。关于排列的多种方法及算法已在Smith and Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)；Needleman and Wunsch，J.Mol.Bio.48：443(1970)；Pearson andLipman，Methods in Mol.Biol.24：307-31(1988)；Higgins and Sharp，Gene 73：237-44(1988)；Higgins and Sharp，CABIOS 5：151-3(1989)；Corpet et al.，Nuc.Acids Res.16：10881-90(1988)；Huang et al.，Comp.Appl.BioSci.8：155-65(1992)and Pearson et al.，Meth.Mol.Biol.24：307-31(1994)中公开。NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al.，J.Mol.Biol.215：403-10(1990))能通过NCBI(National Center for Biological Information)等进行了解，在网络上与blastp、blastm、blastx、tblastn及tblastx等序列分析程序联动地进行利用。BLSAT的链接是http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/。利用该程序的序列相同性比较方法能在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html中进行确认。

根据本发明的还一实施方式，本发明提供包含对海藻酸裂解酶进行编码的本发明的上述核酸分子的重组载体。

本发明的载体***能够通过本发明所属技术领域中公知的多种方法来构建，与此相关的具体方法已在Sambrook et al.，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(2001)中公开，该文献将作为参照结合在本说明书。

本发明的载体能够构建为典型地用于克隆的载体或用于表达的载体。并且，本发明的载体能够将原核细胞作为宿主来进行构建。本发明的载体能够构建为典型地用于克隆的载体或用于表达的载体。

例如，本发明的载体为表达载体，在将原核细胞作为宿主的情况下，一般包含能够进行转录的强有力的启动子(例如，tac启动子、lac启动子、lacUV5启动子、lpp启动子、p_L ^λ启动子、p_R ^λ启动子、rac5启动子、amp启动子、recA启动子、SP6启动子、trp启动子及T7启动子等)，用于开始解码的核糖体结合位点及转录/解码结束序列。在利用E.coli作为宿主细胞的情况下，能够利用E.coli色氨酸生物合成途径的启动子及操纵基因部位(Yanofsky，C.，J.Bacteriol.，158：1018-1024(1984))以及噬菌体λ的左向启动子(p_L ^λ启动子，Herskowitz，I.and Hagen，D.，Ann.Rev.Genet.，14：399-445(1980))作为调节部位。

另一方面，在本发明中能够利用的载体通过操纵本发明所属技术领域中常用的质粒(例：pSC101、ColE1、pBR322、pUC8/9、pHC79、pUC19以及pET等)、噬菌体(例：λgt4、λB、λ-Charon、λΔz1以及M13等)或者病毒(例：SV40等)来制备。

另一方面，本发明的载体，作为选择标记包含本发明所属技术领域中通常利用的抗生素耐性基因，可举例对于氨比西林、庆大霉素、羧苄青霉素、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素以及四环素的耐性基因。

根据本发明的又一实施方式，本发明提供包含本发明的上述载体的转化体。

作为能够对本发明的载体稳定而连续地进行克隆及表达的宿主细胞，能利用本发明所属技术领域中公知的任何一种宿主细胞，例如有E.coli JM109、E.coli BL21(DE3)、E.coli RR1，E.coli LE392、E.coliB、E.coli X 1776、E.coli W3110、枯草杆菌、苏云金芽孢杆菌等杆菌属菌株以及鼠伤寒沙门氏菌、粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌属等肠杆菌科菌株等。

将本发明的载体运输到宿主细胞内的方法能够通过CaCl₂方法(Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9：2110-2114(1973))、高效感受态细菌制备试剂盒(Hanahan方法)(Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9：2110-2114(1973)；以及Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166：557-580(1983))以及电穿孔方法(Dower，W.J.et al.，Nucleic.Acids Res.，16：6127-6145(1988))等来实施。

注入到宿主细胞内的载体在宿主细胞内表达，在这种情况下，将会获得大量海藻酸裂解酶。例如，在上述表达载体包含lac启动子的情况下，用IPTG处理宿主细胞来诱导基因表达。

根据本发明的还一实施方式，本发明提供海藻酸的分解方法，所述海藻酸的分解方法包括使上述第一项的海藻酸裂解酶(alginatelyase)或上述第五项的进行转化后的细胞与海藻酸接触的步骤。

本发明者试图发现具有海藻酸分解能力的酶及生产这种酶的微生物菌株，并且致力于通过利用上述酶或菌株来开发出低分子化海藻酸。其结果，发掘了能够按照与以往公知的合成方法不同的方法来分解海藻酸的海藻酸裂解酶，并据此确认了低分子化海藻酸的生成。

归纳本发明的特征及优点为如下。

(a)本发明通过分析存在于自然的微生物区系中的未知的宏基因组来提供新颖的微生物及蛋白质。

(b)本发明提供能够通过分离出海藻类的多糖体分解能力优秀的微生物来稳定地分解海藻类的酶。

(c)本发明提供应用从生物工程方面大量生产功能性多糖类的技术来减少在加工工序中派生的废弃物的量，并提高资源的应用度的技术。

【附图说明】

图1是应用西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)法的海藻酸水解能力评价结果。图1表示已确认活性的平板筛选。并表示(A)来源于Flavobacterium sp.的阳性对照组；(B)来源于E.coli的阴性对照组以及(C)溶藻弧菌宏基因组片段(AlyDW)。

图2是溶藻弧菌宏基因组片段(AlyDW)的示意图。图中所示的明暗差异表示推定基因的功能性分类。对角线条纹为与细胞的进程相关的ORF，闪亮箭头为与代谢相关的ORF，亮灰色为与信息存储相关的ORF。深灰色表示没有相同性的不明基因。

图3表示确认针对宏基因组片段(AlyDW)的海藻酸裂解酶活性的pH(A)及温度(B)的影响的还原糖分析结果。

图4表示基于应用薄层色谱法的宏基因组片段(AlyDW)的海藻酸的解聚结果。左屏(a)表示在40℃下经3小时培养后的聚(β-D-mannuronate，lane 1)及聚(α-L-guluronate，lane 2)的水解简况。右屏(b)表示培养海藻酸及溶藻弧菌宏基因组片段(AlyDW)之后获得的HPLC馏分的已分解的海藻酸产物。来源于Flavobacterium sp.的阳性对照组(lane 4)、阴性对照组(海藻酸唯一，lane 5)、阴性对照组(酶唯一，lane 6).M是G1(葡萄糖)、G2(纤维二糖)、G3(纤维三糖)、G4(纤维四糖)、G5(纤维五糖)、G6(纤维六糖)、G7(纤维七糖)以及G8(纤维八糖)的标准混合物。

图5至图6表示来源于宏基因组片段的推定海藻酸裂解酶及宏基因组片段(ORF-11)蛋白质的排列结果。氨基酸序列利用ClustalX程序来进行排列。比较的生物为Klebsiella pneumoniae subsp.Aerogenes、Saccharophagus degradans 2-40、Microbulbifer sp.6532A、Vibrio harveyi aDA3、Cellulophaga lytica DSM 7489、Vibriosp.A9m、Vibrio alginolyticus 40B、Pseudoalteromonas sp.CY2、Vibriosplendidus 12B01、Polaribacter sp.MED152以及Agarivorans sp.JAM-A1m，上述生物的基因银行登录号分别为Q59478、ABD81738、BAJ62034、ZP_0617515、YP_004263738、BAH79133、ZP_06182095、ACM89454、ZP_00990010、ZP_01052859及BAG70358。

图7是应用西吡氯铵(cetylpyridinium chloride)法的海藻酸水解能力评价结果。图7表示已确认活性的平板筛选。并表示(A)来源于Flavobacterium sp.的阳性对照组；(B)来源于E.coli的阴性对照组；(C)溶藻弧菌宏基因组片段(AlyDW)以及(D)重组海藻酸分解酶(AlyDW11)。

图8表示重组海藻酸分解酶(AlyDW11)的SDS-PAGE分析及酶谱(zymogram)活性染色的结果。(a)SDS-PAGE之后，利用考马斯亮蓝R-250来进行染色。M为分子量标记，1列为利用IPTG来表达的pMAL-c2X-AlyDW1的细胞提取物，2列为利用直链淀粉亲和柱的清洗过程，3列为最终洗脱出的重组海藻酸分解酶(AlyDW11)。(b)为酶谱活性染色结果，1列为重组海藻酸分解酶，2列为来源于Flavobacterium sp.的阳性对照组。

图9表示确认针对重组海藻酸分解酶的海藻酸裂解酶活性的pH(A)及温度(B)的影响的还原糖分析结果。

图10是通过薄层色谱法表示重组海藻酸分解酶的海藻酸分解能力的结果。(a)表示在45℃下，将重组海藻酸分解酶与聚(β-D-甘露糖醛酸酯，1列)或聚(α-L-葡糖醛酸酯，2列)反应3小时的情况下出现的水解结果。3列及4列是将Flavobacterium sp.作为阳性对照组，与聚β-D-甘露糖醛酸酯(或聚α-L-葡糖醛酸酯，lane 4)反应的结果，5列及6列是将阴性对照组与聚β-D-甘露糖醛酸酯或聚α-L-葡糖醛酸酯反应的结果。(b)表示在45℃下，使重组海藻酸分解酶与海藻酸反应3小时之后得出的海藻酸分解程度结果(1列)。2列是阳性对照组、Flavobacterium sp.，作为阴性对照组分别使用了海藻酸(3列)及酶(4列)。M将G1(葡萄糖)、G2(纤维二糖)、G3(纤维三糖)、G4(纤维四糖)、G5(纤维五糖)、G6(纤维六糖)、G7(纤维七糖)、G8(纤维八糖)的混合物作为基准。

【具体实施方式】

下面，将通过实施例对本发明进行更详细的说明。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，应该理解，这些实施例仅用以更加具体说明本发明，根据本发明的主旨，本发明的范围不局限于这些实施例。

【实施例】

【实验材料及方法】

【宏基因组文库构建(Metagenomic library construction)】

2009年2月，从韩国丽水近海获取了鲍鱼(abalone)样本。直接提取及纯化DNA来准备了DNA。⁷通过使用以往所说明的适当的协议，从样本中构建出了宏基因组文库。²⁸用适量的Sau3AI限制酶来部分切断纯化的DNA，在1％琼脂糖凝胶中进行电泳来仅洗脱出40-50kb部分的DNA，并用牛小肠碱性磷酸酶(Calf intestinal alkalinephosphatase，CIAP)来对DNA进行去磷酸化。在16℃下，用BamHI限制酶将宏基因组DNA将福斯质粒载体(pCC1FOS ready vector，Epicentre，美国)切断之后使其与用Sau3AI部分切断的DNA进行16小时连接反应。用MAX拉姆达包装提取试剂盒(Epicentre，USA)来执行体外包装，并且只利用了涂抹到加入了卡那霉素(50μg/ml)的LB固体培养基而重组的群体。接着，进行大肠杆菌(Escherichiacoli)转染来构建宏基因组文库。

【文库筛选及鸟枪法(shotgun)序列分析】

为了评价活性海藻酸裂解酶(alginate lyase)的分解能力，执行了西吡氯铵(cetylpyridinium chloride，CPC)分析。将宏基因组DNA连接到福斯质粒载体(pCC1FOS ready vector，Epicentre，美国)之后包装在拉姆达(lambda)噬菌体，并使其感染Escherichia coli。其结果得到感染细胞。在包含0.1％海藻酸的LB(Luria-Bertani)琼脂(agar)培养基中培养一天上述感染细胞。向上述细胞添加10％CPC溶液，在37℃下等待1小时，观察所形成的亮区(图1)。为了确认阳性克隆的整体序列，将纯化的福斯质粒DNA及由PHRED/PHRAP/CONSED包装准备的鸟枪法DNA文库，组合成鸟枪法测序片段来使用。DNA序列根据制造商的公知，使用ABI 9700热循环仪(Applied Biosystems)及ABI PRISM^TM BigDye^TM TerminatorCycle Sequencing kit(Applied Biosystems，version 3.1)来决定。为了数据库检索及序列比较，使用国家生物技术信息中心(National Centerfor Biotechnology Information，NCBI)的BLAST(Basic LocalAlignment Search Tool)程序。使用Artemis程序，进行完整的福斯质粒***序列嵌入(insert)，并用BLASTP及PSIBLAST程序来确认蛋白质编码部分的功能。预测蛋白质根据直系同源集簇(orthologous groups，COR)的群聚范畴进行分类。^12，22-23将使用CLUSTAL_X程序来获得的福斯质粒克隆开放阅读框(open readingframes：ORF)的完整的核苷酸序列与从NCBI核苷酸数据库获得的同种基因进行排列。⁶

【酶活性的决定】

通过还原粮含量的测定Nelson-Somogyi分析来决定酶的内切葡聚糖酶(endoclucanase)活性，上述还原粮含量的测定(Nelson-Somogyi)分析方法是，处理大量的还原糖来测定因碳酸盐的糖苷键的酶水解而增加的颜色强度。³标准曲线使用分光光度计(美卡希斯，韩国)，以525nm吸光度测定为基准，准备了31.5μg/ml-100μg/ml浓度范围的葡萄糖。使用0.1mM柠檬酸磷酸盐(citrate-phosphate)缓冲液(pH 4.0-7.0)、10mM磷酸盐缓冲液(pH8.0)以及50mM甘氨酸-氢氧化钠(glycine-NaOH)缓冲液(pH9.0-10.0)，在温度(15℃-50℃)及pH(4.0-10.0)下，测定2小时左右最佳酶活性。当存在最佳条件(pH 8.0及40℃)的金属离子及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD⁺)时，决定酶活性的抑制及增大。

【海藻酸裂解酶(alginate lyase)活性测定】

为了生产海藻酸裂解酶，在40℃下，在LB(Luria-Bertani)培养基中培养16小时克隆。培养基使用蛋白质浓缩试剂盒(Rapid-Con^TM蛋白质浓缩试剂盒，elpis，首尔，韩国)来进行浓缩。按照根据Laemmli说明的方法，用没有2-巯基乙醇(mercaptoethanol)的样本缓冲液，对AlyDW进行处理，并用10％丙烯酰胺(acrylamide)凝胶进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE：sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)后进行分析。³SDS-PAGE之后，在添加了25％甲醇的再生缓冲液(50mM Tris-HCl缓冲液，pH7.0，10mg/ml酪蛋白(casein)，2mM EDTA，0.01％NaN₃)中，使凝胶内的蛋白质进行在30分钟期间再生三次。用100mM磷酸盐缓冲液1(pH 8)清洗聚丙烯酰胺凝胶之后，覆盖在由1mg/ml海藻酸钠(sodium alginate)、10mg/ml NaCl以及100mM磷酸盐缓冲液1(pH8)组成的1.5％琼脂糖凝胶上。在37℃下，培养20小时上述凝胶之后，在10％CPC溶液浸渍1小时，然后泡在蒸馏水中清洗。

【利用薄层色谱法的反应产物的分析】

纤维寡糖(cellooligosaccharides)标准混合物(纤维二糖(cellobiose)、纤维三糖(cellotriose)、纤维四糖(cellotetraose)、纤维五糖(cellopentaose)、纤维六糖(cellohexaose)、纤维七糖(celloheptaose)以及纤维八糖(cellooctaose))是从西格玛奥德里奇购买的。为了决定测试克隆具有的海藻酸裂解酶活性，将0.1％海藻酸与37℃的100mM磷酸盐缓冲液1(pH 8)中的AlyDW(2.19mg/ml)50μl进行反应。对基于凝胶过滤层析法(gel filtrationchromatography：GFC)的海藻酸低聚物的馏分执行利用反相色谱柱(Asahipak)GS-310色谱柱(21.5mm ID×500mm，Showa DenkoKogyo Co.Ltd.东京，日本)的高效液相色谱(HPLC)(SHIMADZU集团，LC-6AD泵，RID-10A检测器，SPD-M20A检测器：SHIMADZU，东京，日本)。使水以5ml/min速度流下，来分离样本。通过注入已分解的海藻酸溶液的一部分(aliquot)(2ml)来获得馏分。将反应产物在1-丙醇(propanol)、硝基甲烷(nitromethane)以及水混合物(5∶3∶2，v/v/v)中反应2小时之后，通过利用硅胶板(silica gel plate，Merck KGaA，64271 Darmstadt，德国)的薄层色谱法来分离水解产物。分离之后，向糖(sugar)喷射1ml硫磺酸(sulfuric acid)及10ml储存(stock)溶液(1g二苯胺(diphenylamine)、1ml苯胺(aniline)、100ml丙酮(acetone))的混合物来进行显谱。²⁶

【结果及讨论事项】

【宏基因组片段的筛选及ORF分析】

从由鲍鱼(abalone)的肠内微生物植物群(flora)组成的总9万克隆中筛选的3840克隆中，筛选出表达海藻酸裂解酶活性的一种细菌宏基因组片段(AlyDW)(图1)。鸟枪法(shot-gun)测序数据的分析表示阳性宏基因组片段具有平均G+C含量43.3％及22个预测ORF的长度31.7kb的基因。a基于TMHMM调查而制作，b表示不属于COG群(图2及表1)。

【表1】

在上述ORF中，17ORF表示与NCBI核苷酸数据库中公开的功能的基因的重要的类似性，5ORF相应于NCBI细菌的基因组数据库的假定蛋白质。6个ORF与细胞的进程及信息存储相关，10ORF与代谢作用相关。3ORF(11、12及13)表示与Klebsiella pneumonia亚种.aerogenes、Vibrio splendidus以及Vibrio种Gammaproteobacteria门的海藻酸裂解酶基因的蛋白质序列的类似性。

【AlyDW的特征】

在还原糖分析中，溶藻弧菌(alginolytic)活性在30-45℃条件下表现出80％以上的活性，在40℃下表现出最高值。在低温(15-25℃)下，也维持在40℃下表现出的活性的60±5％的活性，由此表现出低温活性酶的特征(图3)。在pH 8下，表现出最大溶藻弧菌活性，在pH 4至pH 9下，表现出约90％的剩余活性。但是，在pH 9以上的情况下，活性急剧下降(图3)。

在表2中概括了金属离子及NAD⁺等辅助因子对海藻酸裂解酶的活性的影响。将阴性对照组的值作为“1”来显示相对值，通过三次的单独实验，导出了标准偏差值。

【表2】

上述结果表明，就海藻酸裂解酶活性而言，NAD⁺、Mg²⁺及Ag⁺的组合，相比没有金属阳离子及NAD⁺的对照组，表现出至少1.6-2.0倍的刺激效应(stimulatory effect)。NAD⁺促进海藻酸裂解酶活性的增加，而EDTA抑制海藻酸裂解酶活性约20％。这是因为酶活性所需的阳离子的螯合。绝对酶活性是最佳条件下的0.15μmoles/min/mg蛋白质的活性。从包含Haliotis spp.、Littorin spp.以及Turbo cornutus的海洋软体动物(mollusk)获得的海藻酸裂解酶是在25-50℃及pH4.0-9.6下具有最佳值的endo-poly(M)及exo-poly(G)裂解酶。当存在Ca²⁺或Mg²⁺等二价阳离子时，酶活性得到增加。^{9，16，26-27}据报道，在GH4等配糖水解酶群中，为了α-1，4或β-1，4-配糖键的水解，需求NAD⁺及金属离子。²⁵

海藻酸低聚物的其他简况能够通过海藻酸裂解酶(AlyDW)的海藻酸分解得到确认。经过3小时之后，用薄层色谱法(thin-layerchromatography)对AlyDW的海藻酸水解最终产物进行分析(图4)。如图4所示，AlyDW具有内分解(endolytic)活性，首先分解聚(β-D-甘露糖醛酸)，其次分解聚(α-L-古罗糖醛酸)。从海洋软体动物中分离出的海藻酸裂解酶最喜好endo-poly(M)裂解酶。²⁷

通过执行高效液相色谱法(high performance liquidchromatography：HPLC)可知，20个馏分中3个馏分与来源于Flavobacterium sp.的商业性酶不同，由以180kDa-342kDa分解的海藻酸产物及1,153-1,315Da的六聚物(hexamer)构成，相比商业性酶，构成更小的分子量的产物，由此可知AlyDW是有用的酶。

【溶藻弧菌ORF-11的特征】

从理论上来讲，AlyDW的3ORF(ORF11、12及13)具有35、67及57kDa的分子量。用Amicon浓缩器来浓缩宏基因组细菌细胞悬浮液之后，在用10％SDS-PAGE分析不相关的蛋白质时表现出了多频带。SDS-PAGE之后，在再生条件下，通过SDS-PAGE对凝胶内的蛋白质进行分析并进行活性染色。

ORF 11(AlyDW)的推定氨基酸序列和Sde_2478(Saccharophagus degradans 2-40)及alyA(Klebsiella pneumoniaesubsp.aerogenes)基因之间的同源关系分别为63％及65％。相反，上述ORF 11(AlyDW)的推定氨基酸序列和algMsp(Microbulbifersp.6532A)、VME_15370(Vibrio harveyi 1DA3)、Celly_3050(Cellulophaga lytica DSM 7489)、alg(Vibrio sp.A9m)、VMC 35250(Vibrio alginolyticus 40B)、alyPI(Pseudoalteromonas sp.CY2)、V12B01_24259(Vibrio splendidus 12B01)、MED152_06195(Polaribactor sp.MED152)以及AlgL(Agarivorans sp.JAM-A1)基因之间的同源关系为54％-60％(图5-6)。多糖裂解酶(polysaccharide lyase：PL)同族7海藻酸裂解酶具有被认为起到作为基质粘合及催化部位的作用的(R/E)(S/T/N)EL、Q(I/V)H以及YFKAG(V/I)YNQ的三种高保存性氨基酸序列。²⁴AlyDW宏基因组片段的ORF11具有在K.pneumonia的G及M特异裂解酶(AlyA)、海洋细菌ATCC 433367的M-特异裂解酶(AlxM)以及Corynebacterium sp.的G-特异裂解酶(ALY-1)中也得到确认的RSEL、QIH以及YFKAGVYNQ。上述氨基酸序列判断为维持海藻酸裂解酶的稳定的三维结构及功能的必需部分。^13-14

【AlyDW11的制备及分析】

提取存在于鲍鱼消化器官的微生物的DNA之后，将提取的整体基因组DNA制成约为32kb的DNA片段之后，进行***DNA的末端修复，并进行大小筛选，然后连接到CopyControl Cloning-Ready载体、pCC1FOS(福斯质粒文库构建试剂盒，Epicentre)，并转化到大肠杆菌之后，涂抹到含有抗生素的平板培养基进行培养，筛选表现出抗生素耐性的转化株来构建福斯质粒文库。从文库筛选具有海藻酸分解活性的克隆之后，获取了具有将海藻酸水解为低分子的内分解(endolytic)海藻酸裂解酶活性的克隆(图7)。利用具有BamHⅠ及HindⅢ切断部位的引物来使海藻酸裂解酶基因ORF-11增幅。连接到pMAL-c2X载体(NEW ENGLAND BioLabs，英国)之后投入到E.coli BL21(DE3)，然后利用直链淀粉亲和柱，从利用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG：isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)表达的pMAL-c2X-AlyDW11洗脱出重组蛋白质。利用10％SDS-PAGE确认了在约76kDa下过度表达的AlyDW11(图8)。通过还原糖分析法，对AlyDW11进行海藻酸分解酶的适当pH及温度的探索的结果，在45℃下表现出最高的活性。最佳pH出现在pH 7，在大于pH 8的pH值上活性减少(图9)。就海藻酸裂解酶活性而言，金属离子等辅助因子的NAD⁺、Mg²⁺或A^g+的组合，分别与没有金属阳离子和NAD+的条件相比，高达1.6倍至2.1倍(表3)。

【表3】

经过3小时之后，通过薄层色谱法(Thin-layer Chromatography：TLC)观察具有海藻酸裂解酶(AlyDW11)的海藻酸水解的最终产物。AlyDW11具有内分解活性，聚(β-D-甘露糖醛酸酯)的活性相比聚(α-L-葡糖醛酸酯)更佳，这也表明从大部分的海洋软体生物中观察到endo-poly(M)裂解酶。在与海藻酸反应而得的产物中，获得了180至342Da、540至720Da、1080至1260Da的海藻酸低分子低聚物，这些表明，上述酶是能够生产出分子量比商业性酶更小的酶(图10)。AlyDW11DNA序列以登录号JN392921注册在基因银行(GeneBank)中。

以上，对本发明的特定部分进行了详细说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，应当理解，上述具体说明仅作为优选的实施例，本发明的范围不局限于此。因此，本发明的实质性范围由所附的权利要求书及其等同替代进行定义。

【参考文献】

1.Ammiraju J，Yu Y，Luo M，Kudrna D，Kim H，Goicoechea JL，Katayose Y(2005)Random sheared fosmid library as a newgenomic tool to accelerate complete finishing of rice(Oryza sativaspp.Nipponbare)genome sequence：sequencing of gap-specificfosmid clones uncovers new euchromatic portions of the genome.Theor Appl Genet 111：1596-1607

2.Baron AJ，Wong TY，Hicks SJ，Gacesa P，Willcock D，McPherson MJ(1994)Alginate lyase from Klebsiella pneumoniaesubsp.aerogenes：gene cloning，sequence analysis and high-levelproduction in Escherichia coli.Gene 143：61-66

3.Green F，Clausen CA，Highley TL(1989)Adaptation of theNelson-Somogyi reducing sugar assay to a microassay using microtiterplates.Anal Biochem 182：197-199

4.Han F，Gong QH，Song K，Li JB，Yu WG(2004)Cloning，sequence analysis and expression of gene alyVI encoding alginatelyase from marine bacterium Vibrio sp.QY101.DNA Seq 15：344-350

5.Iwamoto M，Kurachi M，Nakashima T，Kim D，Yamaguchi K，Oda T，Iwamoto Y，Muramatsu T(2005)Structure-activityrelationship of alginate oligosaccharides in the induction of cytokineproduction from RAW264.7 cells.FEBS Lett 579：4423-4429

6.Jeanmougin F，Thompson JD，Gouy M，Higgins DG，Gibson TJ(1998)Multiple sequence alignment with CLUSTAL_X.TrendsBiochem Sci 23：403-405

7.Kim SJ，Lee CM，Kim MY，Yeo YS，Yoon SH，Kang HC，KooBS(2007)Screening and characterization of an enzyme withbeta-glucosidase activity from environmental DNA.J MicrobiolBiotechnol 17：905-912

8.Laemmli U(1970)Cleavage of structural proteins during theassembly of the head of bacteriophage T4.Nature 227：680-685

9.Larsen B，Hooen K，Ostgaard K(1993)Kinetics 254 andspecificity of alginate lyases.Hydrobiologia 260：557-561

10.Leemhuis H，Euverink GW，Dijkhuizen L(2003)High-throughput screening for gene libraries expressing carbohydratehydrolase activity.Biotechnol Lett 25：1643-1645

11.Li JW，Dong S，Song JS，Li CB，Chen XL，Xie BB，Zhang YZ(2011)Purification and characterization of a bifunctional alginatelyase from Pseudoalteromonas sp.SM0524.Mar Drugs 9：109-123

12.Lopez-Garcia P，Brochier C，Moreira D，Rodriguez-Valera F(2004)Comparative analysis of a genome fragment of anuncultivated mesopelagic crenarchaeote reveals multiple horizontalgene transfers.Environ Microbiol 6：19-34.

13.Maki H，Mori A，Fujiyama K，Kinoshita S，Yoshida T(1993)Cloning，sequence analysis and expression in Escherichia coli of agene encoding an alginate lyase from Pseudomonas sp.OS-ALG-9.JGen Microbiol 139：987-993

14.Malissard M，Duez C，Guinand M，Vacheron MJ，Michel G(1993)Sequence of a gene encoding a(poly ManA)alginate lyaseactive on Pseudomonas aeruginosa alginate.FEMS Microbial Lett110：101-106

15.Miyake O，Ochiai A，Hashimoto W，Murata K(2004)Originand diversity of alginate lyases of families PL-5 and-7 inSphingomonas sp.strain A1.J Bacteriol 186：2891-2896

16.Nakada HI，Sweeny PC(1967)Alginic acid degradation byeliminases from abalone hepatopancreas.J Biol Chem 242：845-851

17.Quaiser A，Ochsenreiter T，Klenk HP，Kletzin A，Treusch AH，Meurer G，Eck J，Sensen CW，Schleper C(2002)First insight intothe genome of an uncultivated crenarchaeote from soil.EnvironMicrobiol 4：603-611

18.Seiderer LJ，Newell RC，Cook PA(1982)Quantitativesignificance of style enzymes from two marine mussels(Choromytilusmeridionalis 278 Krauss and Perna perna Linnaeus)in relation todiet.Mar Biol Lett 3：257-271

19.Shimokawa T，Yoshida S，Takeuchi T，Murata K，KobayashiH(1997)Some properties and action mode of(1→4)-α-L-guluronan lyase lyase from Enterobacter cloacae M-1.CarbohydrRes 304：125-132

20.Suenaga H，Ohnuki T，Miyazaki K(2007)Functionalscreening of a metagenomic library for genes involved in microbialdegradation of aromatic compounds.Environ Microbiol 9：2289-2297

21.Tanaka R，Ootsubo M，Sawabe T，Ezura Y，Tajima K(2004)Biodiversity and in situ abundance of gut microflora of abalone(Haliotis discus hannai)determined by culture independenttechniques.Aquaculture 241：453-463

22.Tatusov RL，Galperin MY，Natale DA，Koonin EV(2000)The COG database：a tool for genome-scale analysis of proteinfunctions and evolution.Nucleic Acids Res 28：33-36

23.Treusch AH，Kletzin A，Raddatz G，Ochsenreiter T，QuaiserA，Meurer G，Schuster SC，Schleper C(2004)Characterization oflarge-insert DNA libraries from soil for environmental genomicstudies of Archea.Environ Microbiol 6：970-980

24.Uchimura K，Miyazaki M，Nogi Y，Kobayashi T，Horikoshi K(2010)Cloning and sequencing of alginate lyase genes fromdeep-sea strains of Vibrio and Agarivorans and characterization of anew Vibrio enzyme.Mar Biotechnol 12：526-533

25.Varrot A，Yip VLY，Li Y，Rajan SS，Yang X，Anderson WF，Thompson J，Withers SG，Davies GJ(2005)NAD+and metal ionsdependent hydrolysis by family 4 glycosidase：Structural insight intospecificity for phospho-α-D-glucosides.J Mol Biol 346：423-435

26.Voget S，Steele HL，Streit WR(2006)Characterization of ametagenome-derived halotolerant cellulase.J Biotechnol 126：26-36

27.Wong TY，Preston LA，Schiller NL(302 2000)Alginatelyase：Review of major sources and enzyme characteristics，structure-function analysis，biological roles and applications.AnnuRev Microbiol 54：289-340

28.Yun S，Lee J，Kim S(2005)Screening and isolation of agene encoding 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase from ametagenomics library of soil DNA.J Korean Soc Appl Bio Chem48：345-351

Claims (9)

1.一种具有海藻酸裂解酶活性的宏基因组文库，其特征在于，包含22个开放阅读框，

上述22个开放阅读框包含：序列目录第一序列的第1280-3652次核苷酸序列、第5025-6128次核苷酸序列、第6365-7492次核苷酸序列、第8687-9202次核苷酸序列、第9206-9823次核苷酸序列、第9823-11250次核苷酸序列、第11377-12189次核苷酸序列、第12290-13306次核苷酸序列、第13611-14642次核苷酸序列、第14646-15212次核苷酸序列、第15417-16388次核苷酸序列、第17370-19223次核苷酸序列、第19452-21017次核苷酸序列、第21253-22143次核苷酸序列、第22309-23121次核苷酸序列、第23333-24208次核苷酸序列、第24294-24989次核苷酸序列、第25446-26477次核苷酸序列、第26549-28063次核苷酸序列、第28362-29579次核苷酸序列、第30103-30930次核苷酸序列以及第31010-31696次核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的宏基因组文库，其特征在于，上述宏基因组文库具有序列目录第一序列的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的宏基因组文库，其特征在于，上述宏基因组文库是通过利用从鲍鱼的内脏的微生物区系中获得的基因组DNA来构建的。

4.一种海藻酸裂解酶，其特征在于，包含序列目录第二序列中所记载的氨基酸序列。

5.一种核酸分子，其特征在于，对包含序列目录第二序列中所记载的氨基酸序列的海藻酸裂解酶进行编码。

6.根据权利要求5所述的核酸分子，其特征在于，上述核酸分子包含序列目录第一序列的第15417-16388次核苷酸序列。

7.一种重组载体，其特征在于，包含上述权利要求4至6所述的核酸分子。

8.一种细胞，其特征在于，通过上述权利要求7所述的重组载体进行转化。

9.一种海藻酸的分解方法，其特征在于，包括使上述权利要求4所述的海藻酸裂解酶或上述权利要求8所述的进行转化后的细胞与海藻酸接触的步骤。

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