CN112760265A - 一种适合动态培养的细菌纤维素菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种适合动态培养产细菌纤维素的菌株，该菌株是从柿子中分离筛选获得，经鉴定是Gluconacetobacterxylinus，命名为木葡糖酸醋杆菌171027‑PER1(Gluconacetobacter xylinus)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心，保藏编号为CGMCC No.15234，保藏日期为2018年1月17日。本发明还公开了一种上述木葡糖酸醋杆171027‑PER1动态发酵生产细菌纤维素的方法，其动态发酵纤维素产量可达6g/L，纤维直径低，有更强的持水能力。

Description

一种适合动态培养的细菌纤维素菌株及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种适合动态培养的产细菌纤维素菌株的分离、鉴定及培养，以及利用该菌株生产细菌纤维素的方法。
背景技术
细菌纤维素(Bacterial Cellulose，简称BC)是由驹形杆菌属(Komagataeibacter)、根瘤菌属(Rhizobium)和八叠球菌属(Sarcina)等细菌合成并分泌到胞外的纤维素。BC是由D-吡喃葡萄糖分子以β-1,4糖苷键聚合而成的线性长链。通常由宽度为约20nm-80nm的微细纤维(纳米纤维)构成，具有许多的优良特性，如高纯度，高结晶度，高抗张强度和弹性模量。
目前国内外采用静态和动态两种培养方法培养细菌纤维素产生菌，静态培养方式下，所产的细菌纤维素较为致密，成膜状。静态培养产的细菌纤维素已经应用到食品、声音震动膜、高强度纸、新型伤口包扎材料等产品，已经开发完全，市场前景巨大；但是动态发酵产细菌纤维素的方法国内市场空白，有待开发，动态发酵往往会产生片状、絮状、球状等各种形态，产量受到限制，无法大规模生产进行产业化。如孙东平动态发酵优化木醋杆菌1.1812培养基(木醋杆菌1.1812发酵产细菌纤维素的研究，孙东平，南京理工大学学报 (自然科学板).2005，(05))，BC最高产量为2.0g/L；许云华等进行中试研究，细菌纤维素机械搅拌发酵产量从2.2g/L提高到2.8g/L(气升式发酵产细菌纤维素的中试实验研究，徐云华，食品研究与开发.2016，37(19))。
发明内容
为了解决现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种适合动态培养的细菌纤维素菌株及其在细菌纤维素生产中的应用。
本发明提供了一种细菌纤维素生产菌株，为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus 171027-PER1)(目前也称木糖驹形氏杆菌(Komagataeibacterxylinus 171027-PER1))，该菌株于2018年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称 CGMCC，保藏编号为CGMCC No.15234。保藏地址为中国北京。
所述菌株为木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)，在光学显微镜下通过革兰氏染色可见菌体呈现蓝色短杆状，无鞭毛和芽孢等结构，为革兰氏阴性细菌；在固体培养基培养3d后，菌落呈白色圆状，边缘光滑无凸起，周围无水解圈；
所述菌株的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明还提供了一种产细菌纤维素菌株的筛选方法，包含以下步骤：
(1)一次富集培养：将腐烂水果接入pH为4.0～6.0(优选为4.0)，含有制霉菌素和无水乙醇的种子培养基中，摇晃试管，28～34℃(优选为30℃)恒温培养箱培养；
(2)二次富集培养：将一次富集生长出的菌膜水洗后放入种子培养基，加入制霉菌素， 28～34℃(优选为30℃)恒温培养箱培养；
(3)稀释涂板：将二次富集生长出的菌膜剪碎，稀释后涂于含有荧光增白剂28的固体种子培养基平板中，28～34(优选为30℃)℃恒温培养箱培养；
(4)斜面保存：将长有单菌落的平板放在紫外灯下观察，挑取荧光的菌落接种于种子培养基斜面扩大培养，28～34℃(优选为30℃)恒温培养箱中培养，镜检为菌株培养物后，斜面保藏于2～4℃(优选为4℃)冰箱。
在一个具体实施方式中，所述产细菌纤维素菌株的筛选方法，包含以下步骤：
(1)一次富集培养：
挑取各种腐烂水果分别接入用乙酸调节pH至4.0的种子培养基中，其中含有150ul的制霉菌素和300ul的无水乙醇，将水果稍微剪碎，摇晃小试管，置于30℃恒温培养箱培养；
(2)二次富集培养：
将一次富集长出来的菌膜用生理盐水洗三遍，放入种子培养基中，剪碎，加入150ul的制霉菌素，摇晃小试管，置于30℃恒温培养箱再次培养；
(3)稀释涂板：
将二次富集长出来的菌膜剪碎，稀释三个梯度为10-1，10-2，10-3，分别涂在含有荧光增白剂28的固体种子培养基平板中，将涂好的种子培养基平板放入30℃恒温培养箱中培养；
(4)斜面保存：
将长有单菌落的平板放在254nm的紫外灯下观察，挑取荧光的菌落接种于种子培养基斜面扩大培养，将接好的斜面放入30℃恒温培养箱中培养，镜检为菌株培养物后，斜面保藏于4℃冰箱。
在一些实施例中，步骤(1)所述的腐败水果选自樱桃、油桃、苹果、芒果、橘子、柿子等中的至少一种。
在一些实施例中，步骤(1)和/或步骤(2)所述的种子培养基成分为：葡萄糖1～3％(优选为2％)、酵母粉0.5～1％(优选为0.5％)、蛋白胨0.5～1％(优选为0.5％)、磷酸氢二钠0.1～0.5％(优选为0.27％)、柠檬酸0.1～0.2％(优选为0.115％)，pH值为5.0～7.0(优选为6.0)；优选地，葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，pH值为6.0。
在一些实施例中，步骤(3)所述的固体种子培养基成分为在种子培养基中加入1.5％-2.0％ (优选为2.0％)的琼脂。
本发明还提供了一种通过分子生物学鉴定菌种的方法，包括以下步骤：
将冷冻保藏的菌种接入30mL种子培养基中，30℃，160r/min培养20h后划线至HS培养基平板上，30℃培养至其长出菌落。将单菌落进行活化后，接种至添加纤维素酶(6.7％,≥45units/mg)的种子培养基中，培养24h后提取DNA进行其纯度浓度检测，并采用细菌16S rDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)进行扩增。PCR反应程序为94℃预变性10min，94℃变性40s， 54℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸5min，产物于4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后委托上海美吉生物医药科技有限公司测序，并使用软件CExpress 将所得16SrDNA序列校正、正反向拼接。拼接后序列经National center for Biotechnolog yInformation(NCBI)数据库BLAST对比分析，下载同源性最高的前10株模式菌株序列作为参照菌株，使用软件MEGA7.0分析序列特征并构建Neighbor-Joining进化树，获得菌种鉴定结果。
本发明还提供了一种利用木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1动态发酵生产细菌纤维素的方法，以包含蔗糖的培养基作为发酵原料，将木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1进行动态发酵，获得所述细菌纤维素，包括以下步骤：
步骤一：将木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1接入种子培养基中，于28～ 34℃(优选为30℃)的恒温培养箱中静置培养24-30h(优选为24h)，得到171027-PER1培养液；
步骤二：使用脱脂棉过滤步骤一获得的171027-PER1培养液即得到不含细菌纤维素膜的 171027-PER1种子液；
步骤三：将171027-PER1种子液按照8-10％(优选为8％)的接种量转接入装有30～70mL (优选为50mL)发酵培养基的三角瓶中，于28～34℃(优选为30℃)，100～200rpm(优选为120rpm)的恒温摇床培养4～7d(优选为4d)，即可获得细菌纤维素发酵液；
步骤四：将步骤三获得的细菌纤维素发酵液离心、水洗、碱煮、中和、干燥后获得细菌纤维素粉末。
所述的种子培养基主要成分为：葡萄糖1～3％(优选为2％)、酵母粉0.5～1％(优选为 0.5％)、蛋白胨0.5～1％(优选为0.5％)、磷酸氢二钠0.1～0.5％(优选为0.27％)、柠檬酸 0.1～0.2％(优选为0.115％)，pH值为5.0～7.0(优选为6.0)；优选地，葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，pH值为6.0。
所述的发酵培养基主要成分为：蔗糖4～5％，(优选为5％)，酵母粉0.5～1.2％，(优选为0.9％)，蛋白胨0.3～0.7％，(优选为0.5％)，磷酸氢二钾0.1％～0.5％，(优选为0.3％)，乙酸0.2～1.0％，(优选为0.6％)，硫酸镁1～2％，(优选为2％)，pH值为4.0～6.0，(优选为5.0)；优选地，蔗糖5％，酵母粉0.9％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.3％，乙酸0.6％，硫酸镁2％，pH值为5.0。
步骤二中，所述脱脂棉过滤是将脱脂棉放置于针筒内，然后将171027-PER1培养液倒入针筒中，自然过滤得到均一不含细菌纤维素膜的171027-PER1种子液。
步骤四中，所述离心是将细菌纤维素发酵液装入离心瓶中，9000rpm离心5min；所述水洗是将离心后的细菌纤维素发酵液加入超纯水后再倒入离心瓶中，9000rpm离心5min，去除上清液；所述碱煮是将水洗后的细菌纤维素发酵液加入1％氢氧化钠溶液，然后在80-100℃沸水浴1h；所述中和是将碱煮后的细菌纤维素加入100mL 1％乙酸中和pH；所述干燥是将中和后的细菌纤维素发酵液在80℃烘箱中烘12h。
本发明还提供了由上述方法制备得到的细菌纤维素。
三角瓶和发酵罐对发酵获得厚度仅有27nm，均一性高的细菌纤维素至关重要。
在三角瓶体系中，所述木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1产生的细菌纤维素均一分散，不同于一般的细菌纤维素生产菌株产生片状或团状的细菌纤维素。
在发酵罐体系中，所述木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1产生的细菌纤维素均一分散，不同于一般的细菌纤维素生产菌株产生片状或团状的细菌纤维素。
所述木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1产生的细菌纤维素的平均直径仅有27nm。
本发明以上步骤中，三角瓶和发酵罐都是重要的：细菌纤维素是细菌生长过程一边消耗碳源一边从胞外分泌细菌纤维素，产生的细菌纤维素会将细菌包裹起来，由于一直不断的产生细菌纤维素，所以大部分菌体发酵过程都会聚集团状或者块状。另外，产细菌纤维素的菌体大都是严格好氧菌，当纤维素过多包裹菌体后，会影响菌体的氧气和能量供给，使得菌体状态越来越差，从而产量降低。
本发明在三角瓶动态发酵中，虽然摇床不断振荡，但是在整个过程中，发酵液相对菌体来说是静止的，所以容易形成团状或块状纤维素。
本发明在发酵罐中，纤维素很容易粘连并包裹在搅拌桨上，形成大块细菌纤维素缠绕在搅拌桨上，从而发酵罐中较少的细菌纤维素。
本发明还提供了所述木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌)171027-PER1在发酵生产细菌纤维素中的应用。
本发明的有益效果包括：本发明得到的细菌纤维素菌株171027-PER1与目前报道菌株相比，适合动态发酵，具有高产、纤维素更细的特性，结合形态学、生理生化和***发育分析，171027-PER1鉴定为木葡糖酸醋杆菌(木糖驹形氏杆菌Komagataeibacterxylinus)。本发明的菌株动态发酵产生更为分散的细丝状细菌纤维素，更加适合动态发酵；产量较高，发酵4d达到了6g/L，且纤维直径更低，仅为27nm。目前文献中报道的纤维直径主要是 50-100nm，更细的纤维直径有着更强的持水能力，可吸收自身干重的60-700倍水分。
附图说明
图1是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1的***发育分析图。
图2是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1产细菌纤维素的红外光谱分析图。
图3是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1产细菌纤维素的热重分析图。
图4是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1产细菌纤维素的扫描电镜图。
图5是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1产细菌纤维素的直径分布图。
图6是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1与标准菌株的动态发酵产量比较图。
图7是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1与标准菌株ATCC 53263的三角瓶产的细菌纤维素形态比较图。(图A是木糖驹形氏杆菌171027-PER1三角瓶产的细菌纤维素，图B是标准菌株ATCC 53263三角瓶产的细菌纤维素)
图8是本发明木糖驹形氏杆菌171027-PER1与标准菌株ATCC 53263的发酵罐产的细菌纤维素形态比较图。(图A是木糖驹形氏杆菌171027-PER1发酵罐产的细菌纤维素，图B是标准菌株ATCC 53263发酵罐产的细菌纤维素)
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。
实施例1：产细菌纤维素菌株的分离：
(1)一次富集培养：
挑取各种腐烂水果分别接入用乙酸调节pH至4.0的种子培养基中，其中含有150ul的制霉菌素和300ul的无水乙醇，将水果稍微剪碎，摇晃小试管，置于30度恒温培养箱培养；
(2)二次富集培养：
将一次富集长出来的菌膜用生理盐水洗三遍，放入种子培养基中，剪碎，加入150ul的制霉菌素，摇晃小试管，置于30℃恒温培养箱再次培养；
(3)稀释涂布：
将二次富集长出来的菌膜剪碎，稀释三个梯度为10-1，10-2，10-3，分别涂在含有荧光增白剂28的固体种子培养基平板中，将涂好的种子培养基平板放入30℃恒温培养箱中培养；
(4)斜面保存：
将长有单菌落的平板放在254nm的紫外灯下观察，挑取荧光的菌落接种于种子培养基斜面扩大培养，将接好的斜面放入30℃恒温培养箱中培养，镜检为菌株培养物后，斜面保藏于 4℃冰箱；
所述的腐败水果选自樱桃、油桃、苹果、芒果、橘子、柿子等中的至少一种。
所述种子培养基主要成分为：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，pH值为6.0。
实施例2：细菌的鉴定
(1)扩增171027-PER1菌株的16S rDNA基因，其主要步骤有：
将冷冻保藏的菌种接入30mL种子培养基中，30℃，160r/min培养20h后划线至HS培养基平板上，30℃培养至其长出菌落。将单菌落进行活化后，接种至添加纤维素酶(6.7％,≥45units/mg)的种子培养基中，培养24h后提取DNA进行其纯度浓度检测，并采用细菌1 6SrDNA通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’)进行扩增。PCR反应程序为94℃预变性10min，94℃变性40s，54℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环，最后72℃延伸5min，产物于4℃保存。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证后委托上海美吉生物医药科技有限公司测序，并使用软件CExpress将所得16S rDNA序列校正、正反向拼接。
经过序列比对，利用MEGA软件制作进化树，结果表明171027-PER1菌株与KomagataeibacterxylinusATCC 53524(原名称为Gluconacetobacterxylinus)同源性最高。
(2)对木糖驹形氏杆菌171027-PER1菌株按照生理生化试剂盒操作说明进行生理生化试验，并根据《伯杰氏细菌鉴定手册》鉴定，鉴定结果如下表1和2所示：
表1菌株171027-PER1的生理生化特征
Figure BDA0002934111210000061
Figure BDA0002934111210000071
表2菌株171027-PER1的碳源利用试验
试剂 结果 试剂 结果
葡萄糖 + 木糖 -
蔗糖 + ***糖 -
鼠李糖 _ 半乳糖 +
麦芽糖 + 山梨醇 -
甘露醇 _ 肌醇 -
果糖 +
注：“+”表示利用，“-”表示不利用
综合分析，本发明所分离出的菌株为一种木糖氏驹形杆菌Komagataeibacterxylinus(原名称为木葡糖酸醋杆菌Gluconacetobacterxylinus)。
实施例3：三角瓶细菌纤维素的生产
将保藏于4℃的木糖氏驹形杆菌171027-PER1接入种子培养基中，于30℃的恒温培养箱静置培养28h得到171027-PER1培养液，使用脱脂棉过滤即得到不含细菌纤维素膜的种子液，再将171027-PER1种子液按照9％的接种量转接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于30℃，120rpm恒温摇床培养4d，发酵结束后，9000rmp离心5min，去除培养基，将沉淀下来的细菌纤维素继续水洗离心两次。用1％的氢氧化钠溶液在沸水浴1h去除菌体及其他杂质。用1％的乙酸进行离心中和，水洗至中性，然后将纯化的细菌纤维素放入80℃烘箱烘干 12h，计算产量。
所述的种子培养基主要成分为：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，pH值为6.0。
所述的发酵培养基主要成分为：蔗糖5％，酵母粉0.9％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.3％，乙酸0.6％，硫酸镁2％，pH值为5.0。
实施例4：10L发酵罐细菌纤维素的生产
将保藏于4℃的木糖驹形氏杆菌171027-PER1接入种子培养基中，于30℃的恒温培养箱静置培养28h得到171027-PER1培养液，使用脱脂棉过滤即得到不含细菌纤维素膜的一级种子液，再将171027-PER1种子液按照9％的接种量转接入装有50mL种子培养基的250mL普通三角瓶中，于30℃，120rpm恒温摇床培养24h得到二级种子液，再按照9％的接种量接入装有5.5L发酵培养基的10L发酵罐中，30℃，200rpm发酵4d。待发酵结束后，取样，9000rmp离心5min，去除培养基，将沉淀下来的细菌纤维素继续水洗离心两次。用1％的氢氧化钠溶液在沸水浴1h去除菌体及其他杂质。用1％的乙酸进行离心中和，水洗至中性，然后将纯化的细菌纤维素放入80℃烘箱烘干12h，计算产量。
所述的种子培养基主要成分为：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，pH值为6.0。
所述的发酵培养基主要成分为：蔗糖5％，酵母粉0.9％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.3％，乙酸0.6％硫酸镁2％，pH值为5.0。
实施例5：细菌纤维素样品制备
按照本发明实施例4生产细菌纤维素。待发酵结束后，取样，9000rmp离心5min，去除培养基，将沉淀下来的细菌纤维素继续水洗离心两次。用1％的氢氧化钠溶液在沸水浴1h去除菌体及其他杂质。用1％的乙酸进行离心中和，水洗至中性。将呈中性的细菌纤维素置于冷冻干燥机中进行干燥，干燥结束后粉碎机粉碎得到细菌纤维素粉末。
图2是本发明实施例5中得到细菌纤维素样品的红外光谱图，由图2可观察到纤维素的典型吸收峰。3343cm-1处为分子内氢键和羟基的伸缩振动峰，2917cm-1为C-H伸缩振动吸收峰，1110cm-1和1055cm-1是由C-O-C伸缩振动产生，与文献报道一致，说明本发明的细菌纤维素属于Ⅰ型α纤维素。
图3是本发明实施例5中得到细菌纤维素样品的热重分析，由图3可知，细菌纤维素的重量的损失主要有三个阶段，第一阶段质量损失发生在100℃附近，损失量为4.46％，主要失去的是细菌纤维素表面的一些结合水；第二阶段质量损失发生在250℃附近，损失量为34.38％，主要是由于细菌纤维素中含有大量的羟基，羟基脱水导致，与文献中报道第二阶段主要在 238℃～329℃有最大的失重一致；第三阶段质量损失发生在430℃附近，损失量为15.16％，细菌纤维素继续被分解。热重分析表明该菌株所产的细菌纤维素最大的失重温度在250℃，具有耐高温的性质。
图4是本发明实施例5中得到细菌纤维素样品的SEM图，由图4可知，动态发酵方法所产的纤维丝紧密交错且纤维丝粗细存在明显不均匀情况，有大量孔隙结构存在，从而具备很大的比表面积，使其能吸收自身干重上百倍的水分。
图5是本发明实施例5中得到的细菌纤维素样品的纤维直径分布图，由图5可知，纤维直径只要分布在20-40nm之间，平均直径仅有27nm，远小于文献中普遍的50-100nm
实施例6：木糖驹形氏杆菌171027-PER1和模式菌株动态培养产细菌纤维素对比
将保藏于4℃的木糖驹形氏杆菌171027-PER1和产细菌纤维素的模式菌株ATCC53263、DSM 2004、DSM 46603、DSM 11804分别接入种子培养基中，于30℃的恒温培养箱静置培养28h得到菌株培养液，使用脱脂棉过滤即得到不含细菌纤维素膜的种子液，再将种子液按照9％的接种量转接入装有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中，于30℃，120rpm恒温摇床培养4d，发酵结束后，9000rmp离心5min，去除培养基，将沉淀下来的细菌纤维素继续水洗离心两次。用1％的氢氧化钠溶液在沸水浴1h去除菌体及其他杂质。用1％的乙酸进行离心中和，水洗至中性，然后将纯化的细菌纤维素放入80℃烘箱烘干12h，计算产量。
图6是本发明实施例6中木糖驹形氏杆菌171027-PER1和模式菌株动态培养产细菌纤维素产量对比图，由图6可知，本发明的木糖驹形氏杆菌171027-PER1动态培养细菌纤维素的产量为6g/L，其他模式菌株如ATCC 53263动态培养细菌纤维素的产量为1.03g/L，DSM2004 动态培养细菌纤维素的产量为0.99g/L，DSM 46603动态培养细菌纤维素的产量为0.71g/L， DSM11804动态培养细菌纤维素的产量为1.8g/L。由此可知，本发明的木糖驹形氏杆菌171027-PER1动态培养显著高于其他模式菌株，具有产量高的优点。
图7和图8是本发明中木糖驹形氏杆菌171027-PER1和模式菌株ATCC 53263在三角瓶和发酵罐中动态培养生产的细菌纤维素的形态图。由图7可知，图7A是木糖驹形氏杆菌171027-PER1三角瓶动态培养生产的细菌纤维素，是均匀分散的，图7B是模式菌株ATCC53263三角瓶动态培养生产的细菌纤维素，是成块状，分布不均一。由图8可知，图8A是木糖驹形氏杆菌171027-PER1发酵罐动态培养生产的细菌纤维素，是均匀分散的，图8B是模式菌株ATCC 53263发酵罐动态培养生产的细菌纤维素，是成块状，分布不均一。
所述的种子培养基主要成分为：葡萄糖2％、酵母粉0.5％、蛋白胨0.5％、磷酸氢二钠0.27％、柠檬酸0.115％，pH值为6.0。
所述的发酵培养基主要成分为：蔗糖5％，酵母粉0.9％，蛋白胨0.5％，磷酸氢二钾0.3％，乙酸0.6％，硫酸镁2％，pH值为5.0。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离本发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学
<120> 一种适合动态培养的细菌纤维素菌株及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1380
<212> DNA
<213> Komagataeibacter xylinus Per-1
<400> 1
gggcatgggg cagcttacca tgcaagtcgc acgaaccttt cggggttagt ggcggacggg 60
tgagtaacgc gtagggatct gtccatgggt gggggataac tttgggaaac tgaagctaat 120
accgcatgac acctgagggt caaaggcgca agtcgcctgt ggaggaacct gcgttcgatt 180
agctagttgg tggggtaaag gcctaccaag gcgatgatcg atagctggtc tgagaggatg 240
atcagccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300
attggacaat gggcgcaagc ctgatccagc aatgccgcgt gtgtgaagaa ggttttcgga 360
ttgtaaagca ctttcagcgg ggacgatgat gacggtaccc gcagaagaag ccccggctaa 420
cttcgtgcca gcagccgcgg taatacgaag ggggcaagcg ttgctcggaa tgactgggcg 480
taaagggcgc gtaggcggtt gacacagtca gatgtgaaat tcctgggctt aacctggggg 540
ctgcatttga tacgtggcga ctagagtgtg agagagggtt gtggaattcc cagtgtagag 600
gtgaaattcg tagatattgg gaagaacacc ggtggcgaag gcggcaacct ggctcatgac 660
tgacgctgag gcgcgaaagc gtggggagca aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 720
tgtaaacgat gtgtgctgga tgttgggtga ctttgtcatt cagtgtcgta gttaacgcga 780
taagcacacc gcctggggag tacggccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacgggggc 840
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgcagaacc ttaccagggc 900
ttgacatgcg gaggccgtgt ccagagatgg gcatttctcg caagagacct ccagcacagg 960
tgctgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg gttaagtccc gcaacgagcg 1020
caaccctcgc ctttagttgc cagcacgtct gggtgggcac tctaaaggaa ctgccggtga 1080
caagccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatgtc ctgggctaca 1140
cacgtgctac aatggcggtg acagtgggaa gccaggtggt gacaccgagc cgatctcaaa 1200
aagccgtctc agttcggatt gcactctgca actcgagtgc atgaaggtgg aatcgctagt 1260
aatcgcggat cagcatgccg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1320
caccatggga gttggtttga ccttaagccg gtgagcgaac cgcaaggacg cagccgacca 1380
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22

Claims (11)

1.一种细菌纤维素菌株，其特征在于，该细菌纤维素菌株命名为木葡糖酸醋杆菌(Gluconacetobacterxylinus 171027-PER1)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.15234，保藏日期为2018年1月17日。
2.如权利要求1所述的细菌纤维素菌株，其特征在于，所述菌株为木葡糖酸醋杆菌，在光学显微镜下通过革兰氏染色可见菌株呈现蓝色短杆状，无鞭毛和芽孢等结构，为革兰氏阴性细菌；在固体培养基培养3d后，菌落呈白色圆状，边缘光滑无凸起，周围无水解圈；和/或，所述菌株的基因序列如SEQ ID NO:1所示。
3.一种木葡糖酸醋杆菌171027-PER1动态发酵生产细菌纤维素的方法，其特征在于，所述方法以包含蔗糖的培养基作为发酵原料，将木葡糖酸醋杆菌171027-PER1进行动态发酵，获得所述细菌纤维素，具体包括如下步骤：
步骤一：将如权利要求1或2所述的菌株171027-PER1接入种子培养基中，于28～34℃的恒温培养箱中静置培养24-30h，得到171027-PER1培养液；
步骤二：使用脱脂棉过滤步骤一获得的171027-PER1培养液即得到不含细菌纤维素膜的171027-PER1种子液；
步骤三：将171027-PER1种子液按照8-10％的接种量转接入装有30～70mL发酵培养基的三角瓶中，于28～34℃，100～200rpm的恒温摇床培养4～7d，即可获得细菌纤维素发酵液；
步骤四：将步骤三获得的细菌纤维素发酵液离心、水洗、碱煮、中和、干燥后获得细菌纤维素粉末。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述发酵培养基包括如下组分:蔗糖4～5％，酵母粉0.5～1.2％，蛋白胨0.3～0.7％，磷酸氢二钾0.1％～0.5％，乙酸0.2～1.0％，硫酸镁1～2％，pH值为4.0～6.0；
所述种子培养基包括如下组分：葡萄糖1～3％，酵母粉0.5～1％，蛋白胨0.5～1％，磷酸氢二钠0.1～0.5％，柠檬酸0.1～0.2％，pH值为5.0～7.0。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤二中，所述脱脂棉过滤是将脱脂棉放置于针筒内，然后将171027-PER1培养液倒入针筒中，自然过滤得到均一不含细菌纤维素膜的171027-PER1种子液。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤四中，所述离心是将细菌纤维素发酵液装入离心瓶中，9000rpm离心5min；所述水洗是将离心后的细菌纤维素发酵液加入超纯水后再倒入离心瓶中，9000rpm离心5min，去除上清液；所述碱煮是将水洗后的细菌纤维素发酵液加入1％氢氧化钠溶液，然后在80-100℃沸水浴1h；所述中和是将碱煮后的细菌纤维素加入100mL 1％乙酸中和pH；所述干燥是将中和后的细菌纤维素发酵液在80℃烘箱中烘12h。
7.如权利要求3-6之任一项所述方法制备得到的细菌纤维素。
8.如权利要求7所述的细菌纤维素，其特征在于，所述木葡糖酸醋杆菌171027-PER1产生的细菌纤维素均一分散；和/或，所述木葡糖酸醋杆菌171027-PER1产生的细菌纤维素的平均直径仅有27nm。
9.如权利要求1或2所述的木葡糖酸醋杆菌171027-PER1在发酵生产细菌纤维素中的应用。
10.一种木葡糖酸醋杆菌的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括如下步骤：
(1)一次富集培养：将腐烂水果接入pH为4.0～6.0，含有制霉菌素和无水乙醇的种子培养基中，摇晃试管，28～34℃恒温培养箱培养；
(2)二次富集培养：将一次富集生长出的菌膜水洗后放入种子培养基，加入制霉菌素，28～34℃恒温培养箱培养；
(3)稀释涂板：将二次富集生长出的菌膜剪碎，稀释后涂于含有荧光增白剂28的固体种子培养基平板中，28～34℃恒温培养箱培养；
(4)斜面保存：将长有单菌落的平板放在紫外灯下观察，挑取荧光的菌落接种于种子培养基斜面扩大培养，28～34℃恒温培养箱中培养，镜检为菌株培养物后，斜面保藏于2～4℃冰箱。
11.如权利要求10所述的筛选方法，其特征在于，步骤(1)中，所述的腐败水果选自樱桃、油桃、苹果、芒果、橘子、柿子中的至少一种；步骤(1)或步骤(2)中，所述的种子培养基成分为：葡萄糖1～3％、酵母粉0.5～1％、蛋白胨0.5～1％、磷酸氢二钠0.1～0.5％、柠檬酸0.1～0.2％，pH值为5.0～7.0。
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