CN113234633B - 一株产几丁质酶的菌株及其在几丁寡糖制备中的应用 - Google Patents

一株产几丁质酶的菌株及其在几丁寡糖制备中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株产几丁质酶的菌株及其在几丁寡糖制备中的应用。产几丁质酶的菌株，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021418，保藏日期2021年4月20。本发明还提供了利用所述产几丁质酶的菌株生产几丁质酶，将几丁质酶用在降解几丁质制备几丁寡糖中的应用方法。与现有技术相比，本发明所述产几丁质酶的菌株生物来源新型，其发酵方法简单，产酶成本较低，应用价值大。另外该菌来源的几丁质酶可通过克隆表达到工程菌中，有望实现几丁质酶大量制备并用于大规模生产几丁寡糖。

Description

一株产几丁质酶的菌株及其在几丁寡糖制备中的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一株产几丁质酶的菌株及其在几丁寡糖制备中的应用。
背景技术
几丁质(chitin)，又称甲壳素、壳多糖，是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖(GlcNAC)通过β-1，4糖苷键连接而成的线性多糖。其储量十分丰富，在自然界中的含量仅次于纤维素，是自然界中除纤维素外第二大生物质可再生资源，每年几丁质的生物合成量远远超过100亿吨，是人类巨大的再生资源宝库。几丁质不溶于水、有机溶剂和碱液，因此较难被直接利用。但几丁质被降解或脱乙酰后得到的几丁寡糖和壳聚糖有极高的应用价值。几丁寡糖的分子量小，更易于吸收利用，因此具有更好的生理活性，如抗肿瘤、增强免疫效应、降血糖、调节肠道菌群、抗炎等。
目前工业生产几丁寡糖、壳寡糖的方法主要是以虾蟹壳为原料，经过浓盐酸和氢氧化钠的处理除去钙盐和蛋白，得到几丁质。几丁质和壳聚糖再经过物理化学降解法处理，可得到聚合度较低的几丁寡糖和壳寡糖。但这种方法成本高，对环境污染大，且聚合度不可控制。而酶法稳定，对环境无污染，成本较低，且能得到固定聚合度的几丁寡糖，有着巨大的应用和发展前景。
目前研究最多的是微生物几丁质酶，主要是通过自然筛选或者克隆表达来获得优良菌株，产生特定的几丁质酶，降解几丁质得到特定的几丁寡糖产物。从而让几丁质及其衍生物的应用更加广泛，为其将来的工业化生产和应用奠定基础。
不同的菌株产的几丁质酶不尽相同，其产酶发酵条件也各有差异，因此筛选出高效产几丁质酶的菌株并研究其产酶发酵条件在几丁质的研究方面也至关重要。随着对几丁质酶研究的不断深入，几丁质及其衍生物的工业化生产也会越来越成熟，逐渐规模化，工业化。
虽然经过长时间的研究，几丁寡糖已广泛应用于医药、化工、纺织、印染、造纸、功能食品以及环境保护等领域，但其生产工艺仍不成熟，工业化生产条件仍不完善。因此需要进一步研究以及发掘出新的几丁质酶，为几丁寡糖生产奠定基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一株产几丁质酶的菌株及其在几丁寡糖制备中的应用。
本发明从虾蟹养殖场池底土壤中筛选得到了一株产几丁质酶的菌株，本发明还以该产几丁质酶的菌株为出发菌株，通过理化性质研究和发酵条件优化，探索出特定的发酵方法用以生产几丁质酶，从而得到特定的几丁寡糖产物。所制备的酶能水解几丁质生成几丁寡糖，酶解产生的几丁寡糖可广泛应用于医药、化工、印染、造纸、纺织、功能性食品以及环保等领域。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
本发明首先提供一株产几丁质酶的菌株，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021418，保藏日期2021年4月20。
所述产几丁质酶的菌株能产生几丁质酶系并用于降解几丁质，主要产物为几丁单糖、二糖和三糖。
所述产几丁质酶的菌株，经过菌落形态观察，分子鉴定，确定该菌株为变形杆菌纲，奈瑟氏菌科，chitinilyticum属的一个新株，将其命名为Chitinilyticum sp.ZQ-8。
对所述产几丁质酶的菌株形态及理化性质研究，其特征为菌落湿润，较光滑，较透明，易挑取，其质地均匀，边缘与中央颜色一致，在固体筛选培养基上可观察到菌落周围明显变透明。
在本发明的一个实施方式中，所述产几丁质酶的菌株的16S rRNA基因如SEQ IDNo.1所示。
本发明还提供一种所述产几丁质酶的菌株的发酵方法，具体为：将所述产几丁质酶的菌株接入发酵培养基作为种子液培养，再将摇好的种子液接种于发酵培养基中，进行培养。
在本发明的一个实施方式中，在将所述产几丁质酶的菌株接入发酵培养基作为种子液培养时，所述产几丁质酶的菌株存在形式为甘油菌或平板菌。
在本发明的一个实施方式中，在将所述产几丁质酶的菌株接入发酵培养基作为种子液培养时，培养的条件为：37℃培养1天。
在本发明的一个实施方式中，将摇好的种子液接种于发酵培养基中，进行培养的条件为：接种量为1％，于37℃，200prm条件下培养3天。
在本发明的一个实施方式中，所述发酵培养基的组成为：
发酵培养基(g/L)：碳源10～30，蛋白胨5～15，NaCl 2.5～5.0，KH2PO4 0.3～1.2，K2HPO4 0.1～0.5，MgSO4 0.5～1.0，pH7.0～8.0；
所述发酵培养基中还添加1‰～3‰的胶体几丁质作为诱导剂；
所述碳源选自几丁质粉末、胶体几丁质、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖、纤维素粉或木糖等中的一种或几种，优选为几丁质粉末。
在本发明的一个实施方式中，优选的，所述发酵培养基的组成为：
发酵培养基(g/L)：碳源30，蛋白胨10，NaCl 2.5，KH2PO4 0.7，K2HPO4 0.3，MgSO40.5，pH7.0；所述发酵培养基中还添加1‰的胶体几丁质作为诱导剂。
优选地，所述碳源为几丁质粉末。
在本发明的一个实施方式中，所述产几丁质酶的菌株的发酵培养过程中是在氧气存在环境下进行的。
通过实验研究表明本发明得知，所述产几丁质酶的菌株是兼性厌氧菌，在氧气充足条件下会产生更多的几丁质酶。
本发明还提供一种所述产几丁质酶的菌株的应用，利用所述产几丁质酶的菌株生产几丁质酶，将几丁质酶用在降解几丁质制备几丁寡糖中。
在本发明的一个实施方式中，所述产几丁质酶的菌株发酵后，通过简单前处理获得粗酶液，加入胶体几丁质反应一段时间后检测产物，研究发现，在短时间内可产生几丁三糖、四糖，甚至更高聚合度的寡糖，最终主要剩下几丁二糖、三糖以及部分单糖。
在本发明的一个实施方式中，通过改变发酵条件或酶解条件用以得到不同浓度的几丁寡糖。
所述产几丁质酶的菌株通过发酵产生一种或多种几丁质酶。通过改变发酵条件，可控制不同几丁质酶的产量及比例。同时通过改变酶解条件也可得到不同浓度的几丁寡糖。在无氧或少氧情况下，菌体生长缓慢，发酵产生的粗酶酶解产物主要为几丁二糖。在氧气充足情况下，菌体生长较快，发酵产生的粗酶酶解产物主要为几丁二糖和几丁三糖。
基于以上研究发现，本发明用平底摇瓶发酵产生的粗酶酶解产物主要为几丁二糖，用挡板摇瓶发酵产生的粗酶酶解产物主要为几丁二糖和几丁三糖。
在本发明的一个实施方式中，所述产几丁质酶的菌株来源的几丁质酶可通过克隆表达到工程菌中，有望实现几丁质酶大量制备并用于大规模生产几丁寡糖。
与现有技术相比，本发明的有益效果体现在以下方面：
本发明所述产几丁质酶的菌株生物来源新型，其发酵方法简单，产酶成本较低，应用价值大。另外该菌来源的几丁质酶可通过克隆表达到工程菌中，有望实现几丁质酶大量制备并用于大规模生产几丁寡糖。
附图说明
附图1为Chitinilyticum sp.ZQ-8菌株菌落形态照片。
附图2为基于16SrRNA基因序列构建的***发育树。
附图3为不同种类碳源对酶活的影响结果。
附图4为TLC法对酶解产物进行分析的结果。1，2号是酶解产物，M是N-乙酰氨基葡萄糖。
附图5为1，2号酶不同酶解温度下的产物TLC图。
附图6为1号酶50℃酶解产物液相图。
附图7为2号酶50℃酶解产物液相图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。
实施例1
产几丁质酶的菌株Chitinilyticum sp.ZQ-8的分离与鉴定
从虾蟹养殖场池底土壤中筛选得到了一株产几丁质酶的菌株，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021418。
所述产几丁质酶的菌株，经过菌落形态观察，分子鉴定，确定该菌株为变形杆菌纲，奈瑟氏菌科，chitinilyticum属的一个新株，将其命名为Chitinilyticum sp.ZQ-8。
1)形态学鉴定
将Chitinilyticum sp.ZQ-8菌株通过划线法接种到固体筛选培养基中培养，2天后观察菌落形态。结果显示，菌落湿润，较光滑，较透明，易挑取，其质地均匀，边缘与中央颜色一致，初步判断该菌为细菌。通过革兰氏染色确定该菌为革兰氏阴性菌。其菌落形态如附图1所示。
2)分子鉴定
采用常规的16SrRNA测序法，因该菌为革兰氏阴性菌，故可直接PCR克隆出保守序列，引物为27F:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，将克隆出的序列送到生物公司测序。所述产几丁质酶的菌株的16S rRNA基因如SEQ ID No.1所示。将测序结果与已有序列进行比对，发现其与Chitinilyticum litopenaei C1最接近，通过建立***发育树(如图2所示)，根据亲缘关系分析，推测该菌属于Chitinilyticum属的一个新株。
实施例2
几丁质酶产生菌Chitinilyticum sp.ZQ-8粗酶酶活测定
胶体几丁质配置：
(1)将预冷的300ml浓盐酸缓慢加入装有10g几丁质粉末的烧杯中充分搅拌。
(2)加入100ml蒸馏水并搅拌成糊状，放入4℃冰箱过夜。
(3)待完全溶胀后加入蒸馏水搅拌至溶液变乳白色。
(4)6000r/min离心10min，弃去上清并水洗沉淀。如此反复直到洗至中性。
(5)最后定容到1000ml，即得到1％胶体几丁质。
DNS配置：
取3，5-二硝基水杨酸3.15g，加入500ml水中，水浴至45℃，搅拌5s，然后缓慢加入20g NaOH，不断搅拌直至透明。再加入91g酒石酸钾钠，2.5g苯酚，2.5g无水亚硝酸钠，继续加热，补水至300ml，搅拌直至溶解，冷却后定容至1000ml并过滤后避光保藏。一周后可使用，有效期6个月。
酶活测定：
1)发酵液预处理：取发酵液于8000r/min离心10min，取上清。
2)取100μl粗酶液与400μl 1％胶体几丁质混合，50℃水浴10min。
3)再加入500μl DNS，1000μl的水定容到2ml，沸水浴10min后540nm处测OD值。
酶活定义：在最适条件下，1mL酶液1min降解几丁质产生的还原糖的μmol数定义为一个酶活单位U。
实施例3
几丁质酶产生菌Chitinilyticum sp.ZQ-8发酵条件优化
基础发酵培养基(g/L)：胶体几丁质10，蛋白胨10，Nacl 5，KH2PO4 0.7，K2HPO40.3，MgSO4 0.5，pH7.0。此培养基用平底锥形瓶在37℃发酵3天后的酶活为0.20U/ml。
溶氧对发酵产酶情况的影响
根据溶氧不同可将实验分成5个组，第一组用250ml平底锥形瓶装50ml发酵液密封无氧发酵，第二组用250ml平底锥形瓶装50ml发酵液有氧发酵，第三组用250ml平底锥形瓶装30ml发酵液有氧发酵，第四组用250ml挡板锥形瓶装50ml发酵液有氧发酵，第五组用250ml挡板锥形瓶装30ml发酵液有氧发酵。第一组到第五组溶氧是逐渐提高的。五组摇瓶在37℃发酵三天后测其酶活。
结果显示，第一组酶活为0.12U/ml，第二组酶活为0.20U/ml，第三组酶活为0.42U/ml，第四组酶活为1.26U/ml，第五组酶活为1.64U/ml，其中第五组酶活最高，相比于基础发酵培养基，酶活提高了约8倍。说明该菌在氧气充足条件下更利于产几丁质酶。
碳源及碳源添加量的影响
在基础发酵培养基上选用粉末几丁质、葡萄糖、果糖、蔗糖、淀粉、乳糖、纤维素粉、木糖等作为碳源替代胶体几丁质，碳源添加量均为1％，即10g/L，并添加1‰胶体几丁质作为诱导剂，用挡板锥形瓶在37℃发酵3天。
结果如图3所示。由图3可知粉末几丁质作为碳源效果最佳，其发酵粗酶液酶活为1.82U/ml。几丁质粉末制备成本较低，来源广泛，是较为合适的碳源。
在其他条件不变的情况下，改变碳源(几丁质粉末)的添加量，相同条件下发酵。结果显示加入3％的几丁质粉末时酶活最高，此时酶活可达2.24U/ml。因此，适当在发酵培养中增加碳源有利于提高酶活。
实施例4：几丁寡糖的制备及检测
粗酶液的制备：首先将甘油菌或平板菌接入发酵培养基活化1天，再将种子液接种1％到发酵培养基，于37℃，200rpm培养三天，发酵培养基(g/L)的组成为：几丁质粉末30，蛋白胨10，NaCl 2.5，KH2PO4 0.7，K2HPO4 0.3，MgSO4 0.5，pH7.0，并添加1‰胶体几丁质作为诱导剂。将得到的发酵液经8000rpm离心10min处理后收集上清。取10U粗酶液，加入100mL1％胶体几丁质，在50℃恒温水浴锅中反应24h，边反应边搅拌。待反应完毕后用10000rpm离心10分钟，除去残留的一些杂质及未反应完全的底物，收集上清并作鉴定。
TLC鉴定：首先在薄层色谱板离顶端1cm处划一条直线，每隔1cm点一个样，一个样点3μl酶解产物。点好样后放入展开缸中展开。展开剂配方(v/v)为异丙醇：水：氨水＝15：1：7.5。显色剂配方(v/v)为大茴香醛：乙醇：浓硫酸：乙酸＝5：90：5：1。
鉴定结果如附图4所示。结果显示最终产物为几丁单糖、二糖和三糖。
实施例5：不同条件下酶解产物分析
本实施例通过平底摇瓶及挡板摇瓶发酵得到两组酶，其发酵培养基及发酵方法和实施例4一致。平底摇瓶发酵产生的粗酶编号1，挡板摇瓶发酵产生的粗酶编号2，两组酶除摇瓶不同外其余发酵条件均一致。分别测1号酶和2号酶在25℃，30℃，35℃，40℃，45℃，50℃，55℃，60℃下反应的酶活及产物。
酶活结果如表1所示，由此可知1号酶和2号酶最适反应温度均为50℃。
表1不同酶解温度下的酶活
再用1号酶及2号酶酶解底物，测定其在不同温度下的产物及产量。具体方法如下：
取2ml 1％胶体几丁质，即20mg底物，加入200ul 1号或2号粗酶液，在30℃，40℃，50℃，60℃下分别酶解24h，再用TLC检测其产物组成，HPLC检测各组分的含量。
TLC结果显示：1号酶在不同温度条件下都是主产几丁二糖。2号酶在50℃条件下可主产一二三糖。再用HPLC法定量测定1号酶及2号酶在50℃酶解后各糖含量，结果如表2及表3所示。
表2 1号酶50℃酶解24h各糖含量
表3 2号酶50℃酶解24h各糖含量
降解率＝降解后各糖质量/底物总质量
各糖占比＝各糖含量/总糖含量×100％
各糖浓度＝(标品浓度×样品峰面积)/标品峰面积；
其中，标品指的是纯的几丁寡糖标准品，样品指的是通过实验获得的酶解样品。
由此可知不同条件下产物及产量是不同的，故可通过控制酶解温度及发酵条件来控制几丁寡糖的产量和比例。
附图5为1，2号酶不同酶解温度下的产物TLC图。
附图6为1号酶50℃酶解产物液相图。
附图7为2号酶50℃酶解产物液相图。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一株产几丁质酶的菌株，其特征在于，该菌株为变形杆菌纲，奈瑟氏菌科，chitinilyticum属的一个新株，命名为Chitinilyticum sp.ZQ-8，已保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2021418，保藏日期2021年4月20日。
2.一种权利要求1所述产几丁质酶的菌株的应用，其特征在于，利用权利要求1所述产几丁质酶的菌株生产几丁质酶，将几丁质酶用在降解几丁质制备几丁寡糖中。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，用平底摇瓶发酵产生的粗酶酶解产物主要为几丁二糖，用挡板摇瓶发酵产生的粗酶酶解产物主要为几丁二糖和几丁三糖。
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