CN116218971A - 一种高效染色质dna结合图谱测序方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种高效染色质DNA结合图谱测序方法，本发明方法采用BAMEA‑Tn5转座酶，BAMEA‑Tn5转座酶为将特异性识别所述转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到；本发明实施例方法是通过BAMEA‑Tn5转座酶作用，基于核酸适配体的识别能力将Tn5酶靶向至细胞内的转录因子位点，并通过Tn5酶的剪切活性在染色质DNA与转录因子结合的位点添加BAMEA接头序列与标签。本发明测序方法采用核酸适配体靶向识别转录因子，极大程度地降低了测序成本，且核酸适配体性能稳定，重现性强。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种染色质DNA结合图谱测序方法，更具体地，本发明涉及一种不依赖任何抗体的快速高效染色质DNA结合图谱测序方法。
背景技术
细胞核染色质的调控性区域富集了多样化的转录因子、组蛋白修饰等基因调控元件，形成了细胞特异性的染色质DNA结合图谱(Chromatin DNA Binding Landscape)。这些调控元件在许多疾病过程和胚胎发育、细胞分化等重要生物过程中起着关键作用。高通量地检测这些调控元件在染色质DNA中的富集位点，对于揭示基因表达调控的分子机制具有重要意义。经典的染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)，以及近年来不断发展的CUT&Tag、CUT&RUN、itChIP-seq、CoBATCH、ChIL-seq等方法，大大促进了这一领域的发展。
但相关技术公开的染色质DNA结合图谱测序技术，依赖于高纯度、高特异性的抗体，抗体价格昂贵、稳定性差，且操作复杂，耗时较长。
发明内容
本发明实施例旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一，为此，本发明实施例提出了一种染色质DNA结合图谱测序方法，包括如下步骤：
(1)收集细胞，加入甲醛溶液，使转录因子与DNA交联；(2)将活化后的磁珠加入细胞中孵育，再分离收集磁珠；(3)加入通透封闭液进行孵育，再分离收集磁珠；(4)加入含BAMEA-Tn5转座酶且不含转座酶激活剂的溶液孵育，再分离收集磁珠；(5)洗涤细胞后，再加入含有转座酶激活剂的缓冲液孵育；(6)向步骤(5)的溶液中再加入MEB-Tn5转座酶，继续孵育细胞；(7)用链霉亲和素磁珠回收酶切后的片段；(8)PCR建库，二代测序；
其中，所述BAMEA-Tn5转座酶为将特异性识别所述转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到的；所述MEB-Tn5转座酶为5’端含有常规接头序列的Tn5转座酶。
本发明实施例中，BAMEA-Tn5转座酶的作用是基于核酸适配体的识别能力将Tn5酶靶向至细胞内的转录因子位点，并通过Tn5酶的剪切活性在染色质DNA与转录因子结合的位点添加BAMEA接头序列与标签(例如生物素标签)。在该步骤完成后，再用MEB-Tn5转座酶与细胞作用，对细胞染色质DNA的开放性位点进行随机剪切，得到DNA小片段。随后，通过链霉亲和素磁珠的富集，只有在BAMEA-Tn5转座酶作用的步骤中，被特异性添加标签的那些小片段才能被富集，从而对转录因子所结合的DNA位点进行特异性的捕获。在这个过程中，BAMEA-Tn5转座酶和MEB-Tn5转座酶的分别处理，也为目标DNA片段添加了可供PCR扩增的引物结合位点。因此，只需对链霉亲和素磁珠富集产物进行PCR，即可实现染色质DNA结合图谱测序文库的构建。本发明实施例测序方法不需要使用抗体，或用于实现特异性结合的其他蛋白/多肽；避免了因使用抗体带来的成本高、稳定性差等问题。且本发明实施例测序方法采用核酸适配体，极大程度地降低了测序成本，且核酸适配体性能稳定，重现性强。
在一些实施例中，所述核酸适配体序列为DNA序列，其能够在细胞原位状态下与细胞内所述转录因子进行特异性结合，结合力Kd值小于100nM。
在一些实施例中，所述BAMEA-Tn5转座酶的5’端的修饰基团为生物素(Biotin)、Halo Tag配体分子氯化烷烃或SNAP Tag配体分子苯甲基鸟嘌呤。优选为生物素。
在一些实施例中，所述BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述BAMEA-Tn5接头序列由等摩尔的BAMEA序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述BAMEA序列的结构为5’-B-A-L-MEA-3’，其中，B为生物素，A为核酸适配体序列，L为连接臂，所述MEA的序列如SEQ ID No.1所示。
5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG-3’(SEQ ID No.1)；
5’-P-CTG TCT CTT ATA CAC ATC TGA CGC TGC CGA CGA-3’(5’磷酸化)(SEQ IDNo.2)。
进一步地，所述BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后室温下孵育1h获得。
在一些实施例中，所述BAMEA序列中的连接臂为T10核酸(TTTTTTTTTT)、C6接头、C12接头、S9接头、S18接头中的一种。C6接头、C12接头、S9接头、S18接头的结构如图4所示。
在一些实施例中，所述MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述MEB-Tn5接头序列由等摩尔的MEB序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述MEB序列如SEQ ID No.3所示。
5’-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-3’(SEQ ID No.3)。
在一些实施例中，所述MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后室温孵育1h获得。
在一些实施例中，所述磁珠为刀豆蛋白A磁珠。
在一些实施例中，所述通透封闭液为含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白、随机单链核酸的溶液。
在一些实施例中，所述转座酶激活剂为二价金属离子，例如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+中的一种或多种。优选地，所述转座酶激活剂为Mg2+。
在一些实施例中，步骤(1)为：收集细胞，用0.1-0.5％甲醛交联5min，0.125M甘氨酸中和5min，使转录因子与DNA交联，然后用PBS缓冲液洗涤3次，去除甲醛与甘氨酸的残留。
在一些实施例中，步骤(3)中的细胞孵育的温度为4-25℃(优选为10-20℃)，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(4)中的细胞孵育的温度为4-25℃(优选为10-20℃)，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(5)中的细胞孵育的温度为37℃，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(6)中的细胞孵育的温度为37℃，时间为30min。
在一些实施例中，所述Tn5转座酶由Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn8转座酶、Tn9转座酶或Tn10转座酶替代。
本发明实施例还提供了一种试剂盒，包括：BAMEA-Tn5转座酶；所述BAMEA-Tn5转座酶为将特异性识别所述转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到的。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括：MEB-Tn5转座酶；所述MEB-Tn5转座酶为5’端含有常规接头序列的Tn5转座酶。
在一些实施例中，所述核酸适配体序列为DNA序列，其能够在细胞原位状态下与细胞内所述转录因子进行特异性结合，结合力Kd值小于100nM。
在一些实施例中，所述BAMEA-Tn5转座酶的5’端的修饰基团为生物素(Biotin)、Halo Tag配体分子氯化烷烃或SNAP Tag配体分子苯甲基鸟嘌呤。优选为生物素。
在一些实施例中，所述BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述BAMEA-Tn5接头序列由等摩尔的BAMEA序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述BAMEA序列的结构为5’-B-A-L-MEA-3’，其中，B为生物素，A为核酸适配体序列，L为连接臂，所述MEA的序列如SEQ ID No.1所示。
5’-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG-3’(SEQ ID No.1)；
5’-P-CTG TCT CTT ATA CAC ATC TGA CGC TGC CGA CGA-3’(5’磷酸化)(SEQ IDNo.2)。
在一些实施例中，所述BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后室温下孵育1h获得。
在一些实施例中，所述BAMEA序列中的连接臂为T10核酸(TTTTTTTTTT)、C6接头、C12接头、S9接头、S18接头中的一种。C6接头、C12接头、S9接头、S18接头的结构如图4所示。
在一些实施例中，所述MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述MEB-Tn5接头序列由等摩尔的MEB序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述MEB序列如SEQ ID No.3所示。
5’-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-3’(SEQ ID No.3)。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括封闭序列，所述封闭序列如SEQ ID No.4所示。
ATAGGCTGCGAAGGCGATAG(SEQ ID No.4)
在一些实施例中，所述试剂盒还包括以下组中的一种或多种：洗涤缓冲液、结合缓冲液、反应缓冲液、封闭缓冲液、退火缓冲液。
在一些实施例中，10X洗涤缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.5,1.5M NaCl、5mM亚精胺。
在一些实施例中，10X结合缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.9,100mM KCl、10mM CaCl2、10mM MnCl2。
在一些实施例中，10X反应缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.5,3M NaCl、5mM亚精胺。
在一些实施例中，25X封闭缓冲液包括：50mM EDTA pH＝8.0，2.5％ BSA。
在一些实施例中，所述退火缓冲液包括：10mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA,100mM NaCl。
在一些实施例中，所述试剂盒还包括测序引物。
在一些实施例中，所述Tn5转座酶由Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn8转座酶、Tn9转座酶或Tn10转座酶替代。
本发明实施例还提供了上述试剂盒在染色质DNA结合图谱测序中的应用。
在一些实施例中，所述试剂盒用于临床病理穿刺或手术切除的组织样本。用于研究与疾病相关细胞的表观调控机制，对于临床研究具有重要意义。
本发明实施例具有的优点和有益效果为：
(1)本发明操作简单，仅需4.5-5小时即可完成文库构建的过程，显著缩短了相关技术中的建库时间。
(2)本发明不需要使用抗体，或用于实现特异性结合的其他蛋白/多肽；避免了因使用抗体带来的成本高、稳定性差等问题。
(3)本发明采用核酸适配体，极大程度的降低了测序成本，且核酸适配体性能稳定，重现性强。
(4)本发明测序方法信噪比高，优于经典的染色质免疫共沉淀测序。
附图说明
本发明上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解。
图1为是经典的ChIP-seq方法的流程示意图。
图2为BAMEA-Tn5转座酶的构建示意图；
图3为MEB-Tn5的结构示意图。
图4为C6接头、C12接头、S9接头、S18接头的结构图；
图5为本发明实施例染色质DNA结合图谱测序方法的流程示意图；
图6为FOXM1转录因子染色质富集位点可视化图谱；
图7为不同方法获得的FOXM1染色质富集位点数目统计；
图8为不同方法获得的FOXM1染色质富集位点韦恩图；
图9为FOXM1染色质富集位点与染色质开放性位点韦恩图；
图10为FOXM1 AptaChC-seq方法的重现性；
图11为AptaChC-seq获取的FOXM1转录因子在染色质不同区域的分布；
图12为基于核酸适配体的AptaChC-seq性能的稳定性。
具体实施方式
细胞核染色质的调控性区域富集了多样化的转录因子、组蛋白修饰等基因调控元件，形成了细胞特异性的染色质DNA结合图谱(Chromatin DNA Binding Landscape)。这些调控元件在许多疾病过程和胚胎发育、细胞分化等重要生物过程中起着关键作用。高通量地检测这些调控元件在染色质DNA中的富集位点，对于揭示基因表达调控的分子机制具有重要意义。经典的染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)，以及近年来不断发展的CUT&Tag(Cleavage Under Targets and Tagmentation)、CUT&RUN(Cleavage Under Targets andRelease Using Nuclease)、itChIP-seq(indexing and tagmentation-based ChIP-seq)、CoBATCH(combinatorial barcoding and targeted chromatin release)、ChIL-seq(Chromatin Integration Labeling sequencing)等方法，大大促进了这一领域的发展。
图1示出了经典ChIP-seq方法的流程，首先，用1％甲醛对活细胞进行交联，使各种染色质调控元件与其结合的DNA片段共价连接。其次，用超声波打断染色质，使调控性蛋白与小片段DNA的复合体游离至溶液中。然后，在溶液中加入表面修饰了目标蛋白特异性抗体的磁珠进行孵育，捕获目标蛋白及其所结合的DNA片段。下一步，纯化捕获下来的DNA片段。最后，制备DNA文库并进行二代测序。整个流程约需3天时间。
其他方法，诸如CUT&Tag、CUT&RUN、itChIP-seq、CoBATCH、ChIL-seq等，在具体操作步骤上与ChIP-seq有所区别，但是核心环节都是通过抗体捕获目标蛋白及其所结合的DNA片段，且操作复杂，操作所需要的时间较长，比如CUT&Tag约需12小时，CUT&RUN约需9-12小时，itChIP-seq约需12小时，ChIL-seq约需3天等。
核酸适配体(Aptamer)是由DNA或RNA构成的功能核酸分子，通过形成特定的核酸二级结构来识别靶标，包括小分子、蛋白、多肽、金属离子等。核酸适配体可以通过商业化的核酸固相合成原理合成，成本低，稳定性好，重现性强，容易修饰和功能化。从不同公司、不同批次合成得到的适配体，均有一致的结合能力。因此，适配体是一种性能优异的分子识别工具，已经在酶联免疫吸附法、免疫层析等生物分析方法中替代抗体来识别目标分子。如果能将核酸适配体用于染色质DNA结合图谱测序中替代抗体，实现不依赖抗体的染色质DNA结合图谱绘制，具有很大的应用前景。
然而，在相关技术的染色质DNA结合图谱测序方法中简单地用核酸适配体替代抗体是不行的。例如，在经典的染色质免疫共沉淀测序技术中，可以直接将抗体修饰的磁珠替换为适配体修饰的磁珠，但无法解决ChIP-seq固有的缺点(步骤复杂、信噪比低、需要细胞量大)。在CUT&Tag和CUT&RUN等基于免疫剪切的方法中，一抗、二抗、Protein A/G依次结合目标位点产生的级联放大，实现了多个核酸酶分子在靶点附近的富集，从而得到小片段剪切产物。在只使用核酸适配体，不适用任何抗体或Protein A/G等功能多肽的前提下，难以实现核酸酶分子在染色质靶标位点的富集，只能产生DNA双链断裂，难以得到片段化的剪切产物。因此，必须对染色质DNA图谱测序方法进行改进和创新，才能实现不依赖任何抗体的染色质DNA结合图谱测序。
需要说明的是，公开上述信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
以下为术语或词语说明，且除非另外定义，否则本文中使用的全部技术和科学术语具有本发明所属领域的熟练技术人员通常理解的含义。
在本文中，词语“包含”和“包括”及其各种变体意指可能包含允许但没有具体描述的其它要素或整体。
术语“转录因子”是指能够与基因的转录调节区域的一部分进行序列特异性相互作用的多肽。该相互作用可以是直接的序列特异性结合，其中转录因子直接接触核酸；或者是通过其他辅助蛋白介导或促进的间接的序列特异性结合，其中转录因子通过直接核酸结合蛋白而被束缚在核酸上。另外，一些转录因子表现出诱导的或协同的结合。转录因子影响基因转录的水平。
术语“核酸适配体”是指已经通过反复循环的体外选择或SELEX(通过指数富集的配体的***进化)工程化以结合至靶分子的核酸分子。核酸适配体可以是DNA或RNA分子。适配体可以包含修饰，例如，经修饰的核苷酸，例如2′-氟取代的嘧啶，和/或可包含一个或多于一个具有L-核糖单元(或L-脱氧核糖)而不是标准D-核糖单元(或D-脱氧核糖单元)的核苷酸。
术语“特异性结合”是指与结合至另一靶标相比，核酸适配体更强地结合至其特定的靶标如表位。如果核酸适配体以比相对于第二靶标的解离常数更低的解离常数(Kd)结合第一靶标，则相比第二靶标，该核酸适配体与第一靶标的结合更强。优选化合物与其特异性结合的靶标的解离常数(Kd)比与其未特异性结合的靶标的解离常数(Kd)低超过10倍，优选超过20倍，更优选超过50倍，甚至更优选超过100倍、200倍、500倍或1000倍。
在本文中，术语“Kd”通常以“mol/L”度量，有时缩写为“M”旨在表示核酸适配体与转录因子之间的特定相互作用的解离平衡常数。
术语“二代测序”，也称高通量测序，是指Illumina、LifeTechnologies、Roche等目前采用的所谓的“合成平行测序”或“连接测序”平台。二代测序方法还可以包括纳米孔测序方法(例如由Oxford Nanopore Technologies商业化的)、电子检测方法(例如由LifeTechnologies商业化的Ion Torrent技术的)以及基于单分子荧光的方法(例如由PacificBiosciences商业化的)。
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明首次提出了一种不依赖任何抗体的快速高效染色质DNA结合图谱测序方法Aptamer-guided chromatin cleavage with sequencing(AptaChC-seq)，在不使用任何基于蛋白的相互作用因子的前提下，实现了简便、高效、低成本、重现性强的染色质DNA结合图谱测序。
本发明实施例的染色质DNA结合图谱测序方法，包括如下步骤：
(1)收集细胞，加入甲醛溶液，使转录因子与DNA交联；(2)将活化后的磁珠加入细胞中孵育，再分离收集磁珠；(3)加入通透封闭液进行孵育，再分离收集磁珠；(4)加入含BAMEA-Tn5转座酶且不含转座酶激活剂的溶液孵育，再分离收集磁珠；(5)洗涤细胞后，再加入含有转座酶激活剂的缓冲液孵育；(6)向步骤(5)的溶液中再加入MEB-Tn5转座酶，继续孵育细胞；(7)用链霉亲和素磁珠回收酶切后的片段；(8)PCR建库，二代测序；
其中，BAMEA-Tn5转座酶为将特异性识别转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到的；MEB-Tn5转座酶为5’端含有常规接头序列的Tn5转座酶。
本发明实施例中，BAMEA-Tn5转座酶的作用是基于核酸适配体的识别能力将Tn5酶靶向至细胞内的转录因子位点，并通过Tn5酶的剪切活性在染色质DNA与转录因子结合的位点添加BAMEA接头序列与标签(例如生物素标签)。在该步骤完成后，再用MEB-Tn5转座酶与细胞作用，对细胞染色质DNA的开放性位点进行随机剪切，得到DNA小片段。随后，通过链霉亲和素磁珠的富集，只有在BAMEA-Tn5转座酶作用的步骤中，被特异性添加标签的那些小片段才能被富集，从而对转录因子所结合的DNA位点进行特异性的捕获。在这个过程中，BAMEA-Tn5转座酶和MEB-Tn5转座酶的分别处理，也为目标DNA片段添加了可供PCR扩增的引物结合位点。因此，只需对链霉亲和素磁珠富集产物进行PCR，即可实现染色质DNA结合图谱测序文库的构建。本发明实施例测序方法不需要使用抗体，或用于实现特异性结合的其他蛋白/多肽；避免了因使用抗体带来的成本高、稳定性差等问题。且本发明实施例测序方法采用核酸适配体，极大程度的降低了测序成本，且核酸适配体性能稳定，重现性强。
在一些实施例中，核酸适配体序列为DNA序列，其能够在细胞原位状态下与细胞内转录因子进行特异性结合，结合力Kd值小于100nM。可以理解的是，在本发明核酸适配体序列可以根据待测的转录因子种类而灵活改变，均可实现该方法的效果。例如，Tan等人报道的人类转录因子FOXM1适配体TCA CTT CAC ACC GCA TCT CTA CGT CCG GTT GCG CTT TCCTTT(SEQ ID No.5)，可以在本方法中实现人类细胞染色质FOXM1转录因子图谱测序。
BAMEA序列5’端修饰的基团是用于亲和纯化的小分子功能基团，需要能够通过核酸固相合成的步骤直接与核酸链连接。在一些实施例中，BAMEA-Tn5转座酶的5’端的修饰基团为生物素(Biotin)、Halo Tag配体分子氯化烷烃或SNAP Tag配体分子苯甲基鸟嘌呤。优选为生物素。
在一些实施例中，BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中BAMEA-Tn5接头序列由等摩尔的BAMEA序列和ME序列退火杂交形成，ME序列如SEQ ID No.2所示；BAMEA序列的结构为5’-B-A-L-MEA-3’，其中，B为生物素，A为核酸适配体序列，L为连接臂，MEA的序列如SEQ ID No.1所示。5’-TCG TCG GCA GCG TCA GATGTG TAT AAG AGA CAG-3’(SEQ ID No.1)；
5’-P-CTG TCT CTT ATA CAC ATC TGA CGC TGC CGA CGA-3’(5’磷酸化)(SEQ IDNo.2)。
进一步地，BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后室温下孵育1h获得。
在一些实施例中，BAMEA序列中的连接臂为T10核酸(TTTTTTTTTT)、C6接头、C12接头、S9接头、S18接头中的一种。C6接头、C12接头、S9接头、S18接头的结构如图4所示。可以理解的是，连接臂用于确保核酸适配体与Tn5转座酶之间的合适距离。
在一些实施例中，MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中MEB-Tn5接头序列由等摩尔的MEB序列和ME序列退火杂交形成，ME序列为5’端修饰有磷酸基团的SEQ ID No.2；MEB序列如SEQ ID No.3所示。
5’-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-3’(SEQ ID No.3)。
在一些实施例中，MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后室温孵育1h获得。
在一些实施例中，磁珠为刀豆蛋白A磁珠。
在一些实施例中，通透封闭液为含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白、随机单链核酸的溶液。
在一些实施例中，转座酶激活剂为二价金属离子，例如Mg2+、Zn2+、Mn2+、Ca2+、Fe2+中的一种或多种。优选地，转座酶激活剂为Mg2+。
在一些实施例中，步骤(1)为：收集细胞，用0.1-0.5％甲醛交联5min，0.125M甘氨酸中和5min，使转录因子与DNA交联，然后用PBS缓冲液洗涤3次，去除甲醛与甘氨酸的残留。
在一些实施例中，步骤(3)中的细胞孵育的温度为4-25℃(优选为10-20℃)，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(4)中的细胞孵育的温度为4-25℃(优选为10-20℃)，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(5)中的细胞孵育的温度为37℃，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(6)中的细胞孵育的温度为37℃，时间为30min。
在一些实施例中，步骤(4)中BAMEA-Tn5转座酶在反应体系的浓度为50-100nM。
在一些实施例中，步骤(6)中的MEB-Tn5转座酶在反应体系的浓度为50-100nM。
在一些实施例中，染色质DNA结合图谱测序方法，包括如下步骤：
S1：收集细胞，用0.1-0.5％甲醛交联5min，0.125M甘氨酸中和5min，使转录因子与DNA交联，然后用PBS缓冲液洗涤3次，去除甲醛与甘氨酸的残留；
S2：用活化的刀豆蛋白A磁珠捕获细胞，使得细胞附着在磁珠上；该步骤便于后续步骤中用磁力架分离细胞与溶液；
S3：加入含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白、随机单链核酸的溶液，室温孵育细胞半小时；该步骤是为了通透细胞、封闭非特异性的DNA结合位点；
S4：加入含有BAMEA-Tn5转座酶，且不含镁离子的溶液，室温孵育细胞半小时；
该步骤是为了使BAMEA-Tn5转座酶特异性地结合在待测转录因子上；
S5：洗涤细胞2次；去掉非特异性结合的BAMEA-Tn5转座酶；加入含有镁离子的缓冲液，激活Tn5转座酶的活性，37℃孵育细胞半小时，使转录因子位点被BAMEA-Tn5转座酶切割，同时让生物素修饰的接头序列连接在基因组DNA的特定位点；
S6：在S5步骤的溶液中加入MEB-Tn5转座酶，37℃孵育细胞半小时，使染色质开放性区域的DNA被切割成小片段；
S7：用链霉亲和素磁珠回收酶切后的片段；由于S6步骤酶切时使用的是带有生物素修饰的适配体偶联的Tn5转座酶，只有转录因子附近才会被连接上带有生物素的DNA片段，因此回收到的片段都位于转录因子位点，从而实现本方法特异性检测染色质DNA结合位点的目标；
S8：PCR建库，二代测序，数据分析。
在一些实施例中，Tn5转座酶由Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn8转座酶、Tn9转座酶或Tn10转座酶替代。
本发明实施例还提供了一种试剂盒，包括：BAMEA-Tn5转座酶；
BAMEA-Tn5转座酶为将特异性识别转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到的。
在一些实施例中，试剂盒还包括：MEB-Tn5转座酶；
MEB-Tn5转座酶为5’端含有常规接头序列的Tn5转座酶。
在一些实施例中，核酸适配体序列为DNA序列，其能够在细胞原位状态下与细胞内转录因子进行特异性结合，结合力Kd值小于100nM。
在一些实施例中，BAMEA-Tn5转座酶的5’端的修饰基团为生物素(Biotin)、HaloTag配体分子氯化烷烃或SNAP Tag配体分子苯甲基鸟嘌呤。优选为生物素。
在一些实施例中，BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中BAMEA-Tn5接头序列由等摩尔的BAMEA序列和ME序列退火杂交形成，ME序列如SEQ ID No.2所示；BAMEA序列的结构为5’-B-A-L-MEA-3’，其中，B为生物素，A为核酸适配体序列，L为连接臂，MEA的序列如SEQ ID No.1所示。5’-TCG TCG GCA GCG TCA GATGTG TAT AAG AGA CAG-3’(SEQ ID No.1)；
5’-P-CTG TCT CTT ATA CAC ATC TGA CGC TGC CGA CGA-3’(5’磷酸化)(SEQ IDNo.2)。
在一些实施例中，BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后室温下孵育1h获得。
在一些实施例中，BAMEA序列中的连接臂为T10核酸(TTTTTTTTTT)、C6接头、C12接头、S9接头、S18接头中的一种。C6接头、C12接头、S9接头、S18接头的结构如图4所示。
在一些实施例中，MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中MEB-Tn5接头序列由等摩尔的MEB序列和ME序列退火杂交形成，ME序列为5’端修饰有磷酸基团的SEQ ID No.2；MEB序列如SEQ ID No.3所示。
5’-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-3’(SEQ ID No.3)。
在一些实施例中，试剂盒还包括封闭序列，封闭序列如SEQ ID No.4所示。
ATAGGCTGCGAAGGCGATAG(SEQ ID No.4)
在一些实施例中，试剂盒还包括以下组中的一种或多种：洗涤缓冲液、结合缓冲液、反应缓冲液、封闭缓冲液、退火缓冲液。
在一些实施例中，10X洗涤缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.5,1.5M NaCl、5mM亚精胺。
在一些实施例中，10X结合缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.9,100mM KCl、10mM CaCl2、10mM MnCl2。
在一些实施例中，10X反应缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.5,3M NaCl、5mM亚精胺。
在一些实施例中，25X封闭缓冲液包括：50mM EDTA pH＝8.0，2.5％ BSA。
在一些实施例中，退火缓冲液包括：10mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA,100mMNaCl。
作为一个具体示例，染色质DNA结合图谱测序试剂盒的组成包括
(1)10X洗涤缓冲液(200mM HEPES-KOH pH＝7.5,1.5M NaCl、5mM亚精胺)
(2)10X结合缓冲液(200mM HEPES-KOH pH＝7.9,100mM KCl、10mM CaCl2、10mMMnCl2)
(3)10X反应缓冲液(200mM HEPES-KOH pH＝7.5,3M NaCl、5mM亚精胺)
(4)封闭序列(ATAGGCTGCGAAGGCGATAG，10μM水溶液)
(5)25X封闭缓冲液(50mM EDTA pH＝8.0,2.5％ BSA)
(6)BAMEA-Tn5转座酶(1:100)
(7)MEB-Tn5转座酶(1:100)
(8)退火缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA,100mM NaCl)
在一些实施例中，试剂盒还包括测序引物。
在一些实施例中，Tn5转座酶由Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn8转座酶、Tn9转座酶或Tn10转座酶替代。
本发明实施例还提供了上述试剂盒在染色质DNA结合图谱测序中的应用。
在一些实施例中，试剂盒用于临床病理穿刺或手术切除的组织样本。用于研究与疾病相关细胞的表观调控机制，对于临床研究具有重要意义。
本发明实施例及对比例的试剂来源为：
核酸序列由自生工生物工程(上海)股份有限公司、北京睿博兴科生物科技有限公司或通用生物(安徽)股份有限公司合成，蛋白酶抑制剂购自Roche公司(04693132001)，兔抗FOXM1抗体购自CST公司(#20459)，兔同型对照抗体购自Abcam公司(ab172730)，刀豆蛋白A磁珠、pA/G磁珠和Tn5转座酶(裸酶)购自苏州近岸蛋白质科技股份有限公司。实施例1人类HEK293FT细胞转录因子FOXM1与DNA结合图谱的测序(FOXM1AptaChC-seq)
1、FOXM1 BAMEA-Tn5转座酶与MEB-Tn5转座酶的制备
采用常规方法合成以下三种核酸链，分别溶于退火缓冲液(10mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA,100mM NaCl)中，终浓度为100μM。
FOXM1 BAMEA：5’-Biotin-TCA CTT CAC ACC GCA TCT CTA CGT CCG GTT GCG CTTTCC TTT-TTT TTT TTT T-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG-3’(5’生物素化)(SEQ ID No.6)；
MEB：5’-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA TAA GAG ACA G-3’(SEQ ID No.3)；
ME:5’-P-CTG TCT CTT ATA CAC ATC TGA CGC TGC CGA CGA-3’(5’磷酸化)(SEQID No.2)；
取10μL 100μM FOXM1 BAMEA与10μL 100μM ME混合，得到20μL 50μM FOXM1BAMEA-Tn5接头。取10μL 100μM MEB与10μL 100μM ME混合，得到20μL 50μM MEB-Tn5接头。两种接头95℃加热5min，缓慢冷却退火。
20μL 50μM FOXM1 BAMEA-Tn5接头与100μL 10μM Tn5转座酶混合，充分混匀室温孵育1h，得到FOXM1 BAMEA-Tn5转座酶。20μL 50μM MEB-Tn5接头与100μL 10μM Tn5转座酶混合，充分混匀室温孵育1h，得到MEB-Tn5转座酶。两种转座酶于-20℃保存备用。
2、准备刀豆蛋白A磁珠
以下各步描述的试剂量为6个样本的试剂量，可根据实际检测的样本量等比例调整。
10X结合缓冲液(200mM HEPES-KOH pH＝7.9,100mM KCl、10mM CaCl2、10mM MnCl2)用水稀释，得到2mL 1X结合缓冲液。取60μL刀豆蛋白A磁珠，用500μL 1X结合缓冲液洗涤两次，重悬于60μL 1X结合缓冲液中备用。
3、准备缓冲液
配制洗涤液:750μL 10X洗涤缓冲液(200mM HEPES-KOH pH＝7.5,1.5M NaCl、5mM亚精胺)、150μL 50X蛋白酶抑制剂、6600μL水，混匀。
配制通透封闭液：300μL洗涤液、3μL 5％洋地黄皂苷、12μL 25X封闭缓冲液(50mMEDTA pH＝8.0，2.5％ BSA)、3μL10μM封闭序列(ATAGGCTGCGAAGGCGATAG，(SEQ ID No.4)10μM水溶液)。
配制Tn5反应液：750μL 10X反应缓冲液、150μL 50X蛋白酶抑制剂、6600μL水、15μL5％洋地黄皂苷，混匀。
配制BAMEA-Tn5孵育液：300μL Tn5反应液、6μL BAMEA-Tn5转座酶，混匀。
配制Tn5切割缓冲液：300μL Tn5反应液、3μL 1M MgCl2,混匀。
4、准备HEK293FT细胞
HEK293FT细胞培养至密度达到90％，用0.05％胰蛋白酶消化细胞，重悬至500μLPBS溶液中。加入72μL 4％多聚甲醛，室温交联5min，随后加入64μL 1.25M甘氨酸，室温孵育5min。
1500rpm离心2min，去除上清。加入500μL冰上预冷的PBS，1500rpm离心2min，去除上清。重复洗2次。加入100μL洗涤液重悬细胞。对细胞进行计数，确定细胞浓度。
5、转录因子FOXM1与DNA结合图谱的测序
准备6个1.5mL离心管，每管加入0.5-10万个细胞，再加入洗涤液至总体积90μL。然后每管加入10μL准备好的刀豆蛋白A磁珠。轻轻混匀，室温孵育10min。
磁力架上静置1min，去除上清，每管加入50μL准备好的通透封闭液，室温孵育30min。
磁力架上静置1min，去除上清，每管加入50μL准备好的BAMEA-Tn5孵育液，室温孵育30min。
磁力架上静置1min，去除上清。每管加入500μL准备好的Tn5反应液，磁力架上静置1min，去除上清。重复洗涤一次。
每管加入50μL Tn5切割缓冲液，37℃孵育30min。再加入1μL准备好的MEB-Tn5转座酶(1:100)，37℃孵育30min。
每管加入1μL 10％ SDS，5μL 20mg/mL蛋白酶K。55℃孵育15min。
每管加水100μL，然后转移至Phase Lock管中，加入150μL DNA提取液(苯酚：氯仿：异戊醇＝25:24:1，pH＞7.8)，上下颠倒混匀20次。15000rpm离心5min。再加入150μL氯仿，上下颠倒混匀20次。15000rpm离心5min。
取出上清，转移至新的0.2mL PCR管中，每管加入2μL链霉亲和素磁珠，室温孵育20min。
磁力架上静置1min，去除上清。每管加入100μL准备好的洗涤液，磁力架上静置1min，去除上清。重复洗涤一次。重悬于35μL纯水。
每管加入2.5μL i5 PCR引物，2.5μL i7 PCR引物，10μL 5X PCR预混液。按照以下步骤进行PCR：72℃3min，98℃30s,(98℃15s,60℃20s,72℃10s),16-22个循环，72℃2min，12℃保持。
i5 PCR引物：5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC AC NNNNNNNN TCG TCGGCA GCG TC-3'(SEQ ID No.7)
i7 PCR引物：5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT NNNNNNNN GTC TCG TGGGCT CGG-3'(SEQ ID No.8)
其中NNNNNNNN为8bp的index序列，N为A、T、G、C中任一碱基。
将建好的文库进行二代测序。
对比例:1：(Control AptaChC-seq)
在Control AptaChC-seq的实验中，所用Control BAMEA的序列为
5’-Biotin-TCA TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT TTT GCG CTT TCC TTT-TTTTTT TTT T-TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG-3’(5’生物素化)(SEQ IDNo.9)，作为FOXM1 BAMEA的对照组，其中的核酸适配体部分为没有特异性结合能力的核酸序列。
其他实验材料和步骤与实施例1完全相同。
对比例2：FOXM1 ChIP-seq
FOXM1 ChIP-seq实验按照文献(Science,316(2007)1497-1502.)报道的步骤进行。简要地，首先用1％甲醛对活细胞进行交联，使蛋白与其结合的DNA片段共价连接；其次，用超声波打断染色质，使蛋白与小片段DNA的复合体游离至溶液中；然后，在溶液中加入偶联了兔抗FOXM1抗体的pA/G磁珠进行孵育，捕获FOXM1蛋白及其所结合的DNA片段；下一步，纯化捕获下来的DNA片段；最后，制备DNA文库并进行二代测序。
对比例3：Control ChIP-seq
在Control ChIP-seq实验中，所用抗体为兔同型对照抗体。其他实验材料与步骤与对比例2完全相同。
对比例4：ATAC-seq
人类HEK293FT细胞系的ATAC-seq实验按照文献(Nat Methods,14(2017)959-962.)报道的步骤进行。简要地，首先提取细胞核；其次加入带有接头的Tn5转座酶孵育，进行剪切和接头连接；然后纯化回收所得的DNA片段；最后制备DNA文库并进行二代测序。
图6为FOXM1转录因子染色质富集位点可视化图谱，通过图6可以看出，AptaChC-seq的信号富集位点均为染色质开放性位点，且与ChIP-seq方法获得的位点重合。使用Negative IgG或Negative Aptamer的对照组均无富集信号。AptaChC-seq的背景信号低于ChIP-seq。
图7为不同方法获得的FOXM1染色质富集位点数目统计，通过图7可以看出，AptaChC-seq信号数量与ChIP-seq相当，远低于染色性开放性位点数，说明获得的信号是特异性的。
图8为不同方法获得的FOXM1染色质富集位点韦恩图，通过图8可以看出，AptaChC-seq捕获到了大多数的ChIP-seq位点，且测到更多的特异性信号。
图9FOXM1染色质富集位点与染色质开放性位点韦恩图，通过图9可以看出，在基于靶向剪切的染色质图谱测序原理中，染色质开放性位点是潜在的非特异性富集信号来源，AptaChC-seq富集信号位于染色质开放性位点，但并非所有的染色质开放性位点都能产生富集信号。这一结果进一步说明了本发明实施例方法的特异性。
图10为FOXM1 AptaChC-seq方法的重现性，通过图10可以看出，三次平行实验AptaChC-seq得到的测序信号的皮尔森相关系数在0.8以上，表明本发明实施例方法的重现性较好。
图11为AptaChC-seq获取的FOXM1转录因子在染色质不同区域的分布，通过图11可以看出，FOXM1转录因子测序信号主要集中在启动子区域，在转录起始位点附近高度富集，与预期相符，进一步印证了本发明实施例方法所得测序结果的正确性。
图12为基于核酸适配体的AptaChC-seq性能的稳定性，通过图12可以看出，BAMEA-Tn5在室温下放置3天，所得的测序结果无明显差异。从三个不同公司购买的BAMEA序列，所得的测序结果无明显差异。这一数据体现出基于核酸适配体的分子识别方法的可靠性强。
在本发明中，术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (18)
1.一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)收集细胞，加入甲醛溶液，使转录因子与DNA交联；(2)将活化后的磁珠加入细胞中孵育，再分离收集磁珠；(3)加入通透封闭液进行孵育，再分离收集磁珠；(4)加入含BAMEA-Tn5转座酶且不含转座酶激活剂的溶液孵育，再分离收集磁珠；(5)洗涤细胞后，再加入含有转座酶激活剂的缓冲液孵育；(6)向步骤(5)的溶液中再加入MEB-Tn5转座酶，继续孵育细胞；(7)用链霉亲和素磁珠回收酶切后的片段；(8)PCR建库，二代测序；其中，
所述BAMEA-Tn5转座酶为将特异性识别所述转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到的；所述MEB-Tn5转座酶为5’端含有常规接头序列的Tn5转座酶。
2.根据权利要求1所述一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，所述核酸适配体序列为DNA序列，其能够在细胞原位状态下与细胞内所述转录因子进行特异性结合，结合力Kd值小于100nM。
3.根据权利要求1所述一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，所述BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述BAMEA-Tn5接头序列由等摩尔的BAMEA序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述BAMEA序列的结构为5’-B-A-L-MEA-3’，其中，B为生物素，A为核酸适配体序列，L为连接臂，所述MEA的序列如SEQ ID No.1所示；
进一步地，所述连接臂为T10核酸、C6接头、C12接头、S9接头、S18接头中的一种。
4.根据权利要求1所述一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，所述MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述MEB-Tn5接头序列由等摩尔的MEB序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述MEB序列如SEQ ID No.3所示。
5.根据权利要求1所述一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，
所述磁珠为刀豆蛋白A磁珠；
和/或，所述通透封闭液为含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白、随机单链核酸的溶液；
和/或，所述转座酶激活剂为二价金属离子，优选地，所述转座酶激活剂为Mg2+。
6.根据权利要求1所述一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，
步骤(1)为：收集细胞，用0.1％-0.5％甲醛交联5min，0.125M甘氨酸中和5min，使转录因子与DNA交联，然后用PBS缓冲液洗涤3次，去除甲醛与甘氨酸的残留；
和/或，步骤(3)中的细胞孵育的温度为4-25℃，时间为30min；
和/或，步骤(4)中的细胞孵育的温度为4-25℃，时间为30min；
和/或，步骤(5)中的细胞孵育的温度为37℃，时间为30min；
和/或，步骤(6)中的细胞孵育的温度为37℃，时间为30min。
7.根据权利要求1-6中任一项所述一种染色质DNA结合图谱测序方法，其特征在于，所述Tn5转座酶由Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn8转座酶、Tn9转座酶或Tn10转座酶替代。
8.一种试剂盒，其特征在于，包括：BAMEA-Tn5转座酶；
所述BAMEA-Tn5转座酶为将特异性识别所述转录因子的核酸适配体序列添加到Tn5转座酶的接头序列的5’端，且5’端带有修饰基团，进而构建得到的。
9.根据权利要求8所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：MEB-Tn5转座酶，所述MEB-Tn5转座酶为5’端含有常规接头序列的Tn5转座酶。
10.根据权利要求8所述的一种试剂盒，其特征在于，所述核酸适配体序列为DNA序列，其能够在细胞原位状态下与细胞内所述转录因子进行特异性结合，结合力Kd值小于100nM。
11.根据权利要求8所述的一种试剂盒，其特征在于，所述BAMEA-Tn5转座酶是将BAMEA-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述BAMEA-Tn5接头序列由等摩尔的BAMEA序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述BAMEA序列的结构为5’-B-A-L-MEA-3’，其中，B为生物素，A为核酸适配体序列，L为连接臂，所述MEA的序列如SEQ ID No.1所示。
进一步地，所述连接臂为T10核酸、C6接头、C12接头、S9接头、S18接头中的一种。
12.根据权利要求9所述的一种试剂盒，其特征在于，所述MEB-Tn5转座酶是将MEB-Tn5接头序列与Tn5转座酶等摩尔混合后孵育获得；其中所述MEB-Tn5接头序列由等摩尔的MEB序列和ME序列退火杂交形成，所述ME序列如SEQ ID No.2所示；所述MEB序列如SEQ ID No.3所示。
13.根据权利要求9所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭序列，所述封闭序列如SEQ ID No.4所示。
14.根据权利要求8-12中任一项所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括以下组中的一种或多种：洗涤缓冲液、结合缓冲液、反应缓冲液、封闭缓冲液、退火缓冲液。
15.根据权利要求14所述的一种试剂盒，其特征在于，10X洗涤缓冲液包括：200mMHEPES-KOH pH＝7.5，1.5M NaCl、5mM亚精胺；
和/或，10X结合缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.9，100mM KCl、10mM CaCl2、10mMMnCl2；
和/或，10X反应缓冲液包括：200mM HEPES-KOH pH＝7.5，3M NaCl、5mM亚精胺；
和/或，25X封闭缓冲液包括：50mM EDTA pH＝8.0，2.5％BSA；
和/或，退火缓冲液包括：10mM Tris-HCl pH＝7.5，1mM EDTA,100mM NaCl。
16.根据权利要求8-13中任一项所述的一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括测序引物。
17.根据权利要求8-13中任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述Tn5转座酶由Tn1转座酶、Tn2转座酶、Tn3转座酶、Tn4转座酶、Tn6转座酶、Tn7转座酶、Tn8转座酶、Tn9转座酶或Tn10转座酶替代。
18.权利要求1-17中任一项所述的试剂盒在染色质DNA结合图谱测序中的应用。
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| CN116606918B (zh) * | 2023-07-13 | 2023-10-20 | 清华大学 | 一种小分子-dna相互作用图谱测序方法以及试剂盒 |
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