CN112410326A - 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒 - Google Patents

核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN112410326A
CN112410326A CN202011335595.8A CN202011335595A CN112410326A CN 112410326 A CN112410326 A CN 112410326A CN 202011335595 A CN202011335595 A CN 202011335595A CN 112410326 A CN112410326 A CN 112410326A
Authority
CN
China
Prior art keywords
target
random library
aptamer
library
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202011335595.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112410326B (zh
Inventor
向宇
顾春梅
徐潇
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Tsinghua University
Original Assignee
Tsinghua University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Tsinghua University filed Critical Tsinghua University
Priority to CN202011335595.8A priority Critical patent/CN112410326B/zh
Publication of CN112410326A publication Critical patent/CN112410326A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112410326B publication Critical patent/CN112410326B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1048—SELEX
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C12N2320/13—Applications; Uses in screening processes in a process of directed evolution, e.g. SELEX, acquiring a new function

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Bioinformatics & Computational Biology (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提出了核酸适配体的体外筛选方法，所述方法包括：提供随机文库，所述随机文库上具有硫代磷酸酯基修饰和结合基团修饰，所述结合基团适于与靶标分子相结合，所述硫代磷酸酯基与结合基团相结合；将所述随机文库与靶标接触，分离与所述靶标分子相结合随机文库，作为筛选所得目标核酸适配体。本发明采用的随机文库中修饰有硫代磷酸酯基和结合基团，结合基团通过与靶标产生亲和作用，拉近随机文库和靶标的距离，从而赋予随机文库与靶标结合的初始活性，从而使得随机文库与靶标更易结合，核酸适配体更易被筛选成功。

Description

核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的 试剂盒
技术领域
本发明涉及生物领域。具体地，本发明涉及核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒。
背景技术
核酸适配体(aptamer)是指能形成一定空间结构并与目标物质特异性结合的RNA或单链DNA，其目标物质范围很广，包括蛋白质、小分子、金属离子甚至全细胞。aptamer与目标物质结合的作用力主要为各种弱作用力，包括氢键、分子间作用力、静电吸附或碱基堆积力等。相对于抗体(一种蛋白质)而言，aptamer有几个优势：a、可以人工合成，生产成本低且性能稳定；b、可耐受“高温-低温”的转变，无需苛刻的贮存条件；c、体外筛选所得，因此无需考虑目标物是否具有免疫原性；d、结构灵活，易修饰其他基团。
aptamer通常通过一种被称为指数富集型***进化技术(Systematic Evolutionof Ligands by EXponential enrichment,SELEX)的体外筛选技术筛选所得。首先，用组合化学的方法合成一个含1014-1015种不同DNA序列的随机DNA文库，这些不同的DNA序列将会形成无数种不同的空间结构，从而为随机DNA文库中存在某几种能与靶标特异性结合的DNA序列提供了可能。第一轮筛选时，将所构建的随机文库与靶标孵育，孵育完后，通过一定的方法将能与靶标结合的DNA序列和不能与靶标结合的DNA序列分离。而后PCR扩增能与靶标结合的序列，使这部分DNA序列得到指数富集。随后，单链分离PCR扩增产物，并将分离所得的单链DNA文库继续与靶标孵育，进入下一轮筛选。经过若干轮筛选后，能与靶标特异性结合且不与靶标类似物结合的DNA序列被从DNA文库中分离出。
研究表明，在aptamer上进行一定的化学修饰可以使得其与靶标的结合能力更强。然而，在已有aptamer上进行化学修饰具有一定的盲目和随机性。修饰位点的选择是其中一个需要考虑的关键因素，对于某些关键位点，在其上进行化学修饰可能会导致aptamer难以与靶标结合。这给对已有aptamer进行化学修饰以提高其与靶标的亲和力的合理设计带来了挑战。另一方面，传统SELEX的随机文库仅由A、T、G、C四种碱基构成，所形成结构带有很强的随机性，没有与靶标结合的初始活性，导致aptamer筛选很困难。因此，通过在随机文库中引入可与靶标结合的官能团对于aptamer的成功筛选是积极的。传统化学修饰SELEX通常通过引入非天然碱基修饰实现，这种方法首先需要合成新的非天然碱基单体分子，然后通过PCR将新的碱基分子引入随机文库中，使得随机文库能形成的序列和结构更加丰富。然而，这种方法一方面单体合成困难，另一方面，以含非天然碱基DNA为模板及非天然碱基单体进行PCR时，PCR扩增时所能选择的聚合酶有限，PCR产物的保真度存在挑战。
因此，目前核酸适配体的体外筛选方法仍有待研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。
在本发明的一个方面，本发明提出了一种核酸适配体的体外筛选方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：提供随机文库，所述随机文库上具有硫代磷酸酯基修饰和结合基团修饰，所述结合基团适于与靶标分子相结合，所述硫代磷酸酯基与结合基团相结合；将所述随机文库与靶标接触，分离与所述靶标分子相结合随机文库，作为筛选所得目标核酸适配体。
根据本发明实施例的方法中采用的随机文库具有硫代磷酸酯基修饰和结合基团修饰，利用结合基团与靶标之间的亲和力以拉近随机文库与靶标的距离，容易筛选。相比传统非天然碱基合成，本发明基于PS-随机文库与结合基团的反应，合成修饰各种官能团的随机文库。该方法可以根据靶标分子的不同，从而在随机文库上修饰不同的分子或官能团，合成方法简单、适用性广。
另外，筛选好目标核酸适配体后，可以轻松除去结合基团。相比于携带非天然碱基的DNA为模板与靶标分子进行PCR，以具有硫代磷酸酯基修饰的核酸适配体作为PCR模板对聚合酶更为友好，PCR更加容易。
根据本发明的实施例，上述核酸适配体的体外筛选方法还可以具有下列附加技术特征：
根据本发明的实施例，所述硫代磷酸酯基是通过下列方式修饰在随机文库上：以随机文库为模板，用硫代单体进行PCR反应，得到具有硫代磷酸酯基修饰的随机文库，其中，所述硫代单体选自硫代dATP、硫代dTTP、硫代dGTP和/或硫代dCTP。相比于传统化学修饰SELEX直接利用非天然碱基进行GPCR扩增，本发明采用硫代单体进行PCR扩增，可以使用高保证聚合酶进行PCR反应，PCR产物保真度更高。
根据本发明的实施例，以硫代dATP作为硫代单体，并且固定碱基A为2-10。
根据本发明的实施例，所述PCR反应所采用的DNA聚合酶选自phusion酶、Q5酶或taq酶。由此，可以提高PCR产物的保真度。根据本发明的优选实施例，聚合酶为Phusion酶。
根据本发明的实施例，所述结合基团是通过将待结合分子与所述硫代磷酸酯基发生烷基化反应而修饰到随机文库上的。
根据本发明的实施例，所述待结合分子选自溴代苯硼酸(式1)、4-醛基苄基溴(式2)、4-溴甲基苯硫酚(式3)。
Figure BDA0002797059150000031
根据本发明的实施例，当所述待结合分子为溴代苯硼酸时，所述靶标分子为多羟基化合物，如腺苷、多糖；当所述待结合分子为4-醛基苄基溴时，所述靶标分子为各种含氨基的化合物或蛋白分子，如链霉亲和素；当所述待结合分子为4-溴甲基苯硫酚时，所述靶标分子为可与巯基发生作用的化合物，如砷酸。
根据本发明的实施例，分离与所述靶标序列相结合随机文库之后，将所得文库与碱液接触，使得结合基团脱除，得到目标文库。通过碱液与文库接触，可以有效地除去结合基团，得到可用于进行PCR扩增的目标文库。相比传统化学修饰SELEX中以带非天然碱基的DNA为模板进行PCR，本发明中以经碱液脱除结合基团的目标随机文库作为PCR模板对聚合酶更为友好，PCR保真度更高。
根据本发明的实施例，所述碱液的pH值为10～13。由此，以快速、有效地脱除结合基团，例如苯硼酸。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种核酸适配体。根据本发明的实施例，所述核酸适配体上具有硫代磷酸酯基及结合基团修饰；所述核酸适配体是通过前面所述核酸适配体的体外筛选方法所获得的。由此，根据本发明实施例的核酸适配体可以特异性地与靶标分子结合。
在本发明的又一方面，本发明提出了一种检测靶标分子的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒包括：核酸适配体，所述核酸适配体具有硫代磷酸酯基修饰和结合基团修饰，所述结合基团适于与靶标分子相结合。利用根据本发明实施例的试剂盒可以特异性地检测靶标分子。
根据本发明的实施例，所述核酸适配体是通过前面所述核酸适配体的体外筛选方法所获得的。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了在随机文库修饰与靶标有亲和力的官能团(R-随机文库)的方法流程示意图；
图2显示了PS修饰单体的结构式；
图3显示了R-随机文库上R基的脱除方法流程示意图；
图4显示了基于PS后修饰反应的化学修饰SELEX流程图；
图5显示了以硫代dATP、dTTP、dCTP、dGTP为单体进行PCR的结果图；
图6显示了PS-随机文库与Br-BO反应的变性PAGE表征示意图；
图7显示了碱液对BO-随机文库上BO脱除的变性PAGE表征示意图；
图8显示了S.A.随筛选轮数的推进程度示意图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
本发明提供了一种新的核酸适配体的体外筛选方法，参见图4，该方法基于硫代磷酸酯(PS)的反应活性，在随机文库上引入可与靶标分子特异性结合的分子或官能团，从而赋予随机文库与靶标的初始亲和力，拉近随机文库和靶标的距离，使得aptamer的筛选变得容易。
本发明首先建立一个随机文库，随机文库除两端引物外，中间为5nt-60nt的N碱基。初始随机文库为固相合成所得，以之为模板，用硫代单体进行PCR，得到PS修饰的随机文库(参见图1)。以腺苷作为筛选靶标为例，腺苷为邻羟基化合物，因此选择在随机文库上面修饰苯硼酸。硼酸和邻羟基化合物易形成动态化学键硼酸酯，因此，理论上，在随机文库中引入苯硼酸后，苯硼酸-随机文库会通过苯硼酸与腺苷的作用力而拉近随机文库和腺苷之间的距离，使得易形成能与腺苷结合的结构的核酸序列有机会接近腺苷并成功结合至腺苷上。
具体地，采用structure-switching SELEX进行核酸适配体筛选，随机文库序列为：ATACCAGCTTATTCAATT-N20-GGTCTTTCTGTTCT-N30-AGATAGTAAGTGCAATCT，B-DNA序列为：biotin-AAAAAAAAAAAAAGAACAGAAAGACC，随机文库可通过中间的GGTCTTTCTGTTCT序列与B-DNA杂交，再通过B-DNA上的biotin连接到avidin修饰的磁球上。正向引物为AP1：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'，反向引物为TER-AP2：5'-A20-Spacer18-AGATTGCACTTACTATCT-3‘，硫代单体选用硫代dATP(2'-Deoxyadenosine-5'-O-(1-Thiotriphosphate))，其他单体选用普通单体dTTP、dGTP、dCTP(参见图2)，PCR结果如图5所示。切取100ntPS-随机文库条带并纯化回收。
PS-随机文库继而与溴代结合分子反应，得到修饰有结合分子的随机文库。下面以溴带分子Br-R为例，将PS-随机文库与Br-R作为反应物，两反应物溶解于pH在4-10之间的缓冲体系,如磷酸盐缓冲、MES(4-吗啉乙磺酸)缓冲、MOPS(3-(N-吗啉基)丙磺酸)缓冲、HEPES(羟乙基哌嗪乙硫磺酸)缓冲等。加入有机溶剂，以彻底溶解溴代分子，PS-随机文库的反应浓度为10nM-1mM，Br-R的反应浓度为100μM-100mM，在10℃-60℃下反应0.5h-200h。反应完可通过超滤器(Amicon)去除过量的小分子，对产物(随机文库-R)进行纯化，也可以对反应混合物进行变性PAGE，然后对产物进行切胶回收、纯化。
反应产物用变性PAGE进行表征，结果如图6所示。PO-随机文库与Br-BO反应后，反应产物相对PO-随机文库变性PAGE无位移变化，PS-随机文库与Br-BO反应后，变性PAGE上的反应产物迁移速度比反应物更慢。这表明BO被成功修饰到了PS-随机文库上。参见图3，本发明随后测试了碱液处理BO-随机文库是否可成功将BO从随机文库上脱除，结果如图7所示，经碱液处理后所得产物的跑胶位移与PS-随机文库相当，表明碱液可有效将随机文库上的小分子脱除，恢复成PS-随机文库。与以BO-随机文库作为模板进行PCR相比，以PS-随机文库作为模板进行PCR，产物保真度更高。
BO-随机文库随后与B-DNA进行杂交，并通过biotin-avidin反应，将其成功固定至avidin磁球上。而后将该磁球与腺苷分子于缓冲液中，放置室温孵育。孵育一段时间后，能与腺苷结合的BO-随机文库将会从磁球上解离。收集从磁球上解离的BO-随机文库，用碱液进行处理以脱除BO，BO-随机文库水解成PO-随机文库(天然无修饰随机文库)，而后以得到的PO-随机文库为模板，以thiol-dATP、dTTP、dGTP、dCTP为单体进行PCR扩增，变性PAGE表征及切胶回收，得到新一轮的PS-随机文库。再按照上面程序，进行BO-随机文库合成、与靶标孵育、有亲和力核酸序列的洗脱、BO脱除、PCR扩增及新一轮PS-随机文库的切胶回收。如此往复，经过若干轮筛选后，富集得到与腺苷亲和力较强的核酸序列。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
1、PS-随机文库的构建
先通过固相合成获得一个随机文库，序列为ATACCAGCTTATTCAATT-N20-GGTCTTTCTGTTCT-N30-AGATAGTAAGTGCAATCT，此外合成B-DNA，其序列为：biotin-AAAAAAAAAAAAAGAACAGAAAGACC，随机文库可通过中间的GGTCTTTCTGTTCT序列与B-DNA杂交，再通过B-DNA上的biotin连接到avidin修饰的磁球上。同时，合成用于PCR的引物，正向引物为AP1：5'-ATACCAGCTTATTCAATT-3'，反向引物为TER-AP2：5'-A20-Spacer18-AGATTGCACTTACTATCT-3’，硫代单体选用硫代dATP，其他单体选用天然单体dTTP、dGTP、dCTP。向200μl的PCR管中加入2.5μl AP1、2.5μl TER-AP2、1μl10mM硫代dATP、0.5μl dTTP、0.5μl dGTP、0.5μl dCTP、41.5μl H2O、0.5μl Phusion酶及0.5μl随机文库模板。将上述PCR体系置于PCR仪上，按98℃3min变性，98℃20s变性，56℃20s退火，72℃20s延伸，循环30次后，72℃延伸5min，而后4℃保持。PCR产物跑10％变性PAGE进行鉴定，结果如图5所示。随后，切取目标片段(100nt PS-随机文库)的胶条至1.5mL离心管中，向其中加入300μl PBS缓冲液后用旋涡振荡器混合均匀，而后放置在旋转架上室温摇晃过夜。第二天，取上清液，并对其中的PS-随机文库进行乙醇沉淀回收。
2、苯硼酸(BO)-随机文库的制备
将PS-随机文库溶于30μl水中，并向其中加入30μl 100mM PBS缓冲液(pH＝6)、30μl溶解于DMF的50mM 4-(溴甲基)苯硼酸(Br-BO)以及30μl DMF，用旋涡振荡器混合均匀后，置于旋转架上室温反应20h。反应产物跑变性PAGE进行鉴定，结果如图6所示。反应完全后用Amicon-10k超滤管和水离心洗涤6次，12000rpm，每次12分钟，以除去过量未反应的Br-BO。
3、将BO-随机文库固定至磁球
BO-随机文库通过与其互补配对的DNA序列(B-DNA：biotin-AAAAAAAAAAAAAGAACAGAAAGACC)杂交，然后在通过B-DNA上的生物素与磁球上的亲和素反应，从而固定至磁球上。将1当量的BO-随机文库与5当量的B-DNA混合于筛选缓冲液(50mMMOPS、1mM MgCl2、100mM NaCl和5mM KCl，pH为7.4)中，98℃加热5min，而后缓慢冷却至室温。而后，将BO-随机文库-B-DNA与亲和素磁球于室温下混合摇晃30min。反应完后，去除上清液，并用筛选缓冲液清洗磁球10次。
4、随机文库与靶标的孵育
因随机文库-BDNA复合物一直处于解离平衡中，故而总是有一部分DNA文库会在不加腺苷的情况下也从树脂柱上解离。在DNA固定到磁球，并清洗完10次后，先进行背景收集。为了便于比较不同筛选轮数中DNA文库自身解离情况，我们在每一轮筛选时会设置一个空白解离时间——同样的孵育时间，不加腺苷，用来测定其自身解离量。例如，当孵育时间为1h，我们先将清洗完10次的DNA复合物-磁球置于室温下静置1h，1h后加入500μL筛选缓冲液，收集第一次流出物(B1)，紧接着再加入500μL筛选缓冲液，收集第二次流出物(B2)。随后加入小体积的饱和腺苷溶液，用移液枪温和搅拌均匀，将上述混合液置于室温下孵育1h。1h后，向磁球加入500μL筛选缓冲液，收集第一次流出物(E1)，紧接着再加入500μL筛选缓冲液，收集第二次流出物(E2)，如此这般，继续收集E3、E4及E5等。用E1/B1来表征靶标与DNA文库的亲和力(structure-switching activity，S.A.)。结果如图8所示，经过8轮筛选后，S.A.有显著提高。
5、BO-随机文库上BO的脱除
将BO-随机文库上的BO脱除是为了下一步PCR时模板更为简单，更利于聚合酶的识别和延伸，以免PCR的保真度受影响。由于与靶标结合的BO-随机文库的量极小，难以通过变性PAGE进行表征，因此，本发明采用新鲜制备的BO-随机文库进行BO脱除实验。将5pmol-BO加入pH为13的NaOH溶液，并置于室温反应20min，反应产物加入一定的醋酸，以对之进行中和。反应完后，用10％变性PAGE对产物进行表征，结果如图7所示。
6、与靶标结合的随机文库的指数扩增
具体参见步骤1。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
SEQUENCE LISTING
<110> 清华大学
<120> 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒
<130> PIDC3204336
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 50
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 1
<220>
<221> misc_feature
<222> (19)..(20)
<223> 含有20个N
<220>
<221> misc_feature
<222> (32)..(33)
<223> 含有30个N
<400> 1
ataccagctt attcaattgg tctttctgtt ctagatagta agtgcaatct 50
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 2
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 连接biotin
<400> 2
aaaaaaaaaa aaagaacaga aagacc 26
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 3
<400> 3
ataccagctt attcaatt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 4
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> 连接20个A和Spacer18
<400> 4
agattgcact tactatct 18

Claims (9)

1.一种核酸适配体的体外筛选方法，其特征在于，包括：
提供随机文库，所述随机文库上具有硫代磷酸酯基修饰和结合基团修饰，所述结合基团适于与靶标分子相结合，所述硫代磷酸酯基与结合基团相结合；
将所述随机文库与靶标接触，分离与所述靶标分子相结合随机文库，作为筛选所得目标核酸适配体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述硫代磷酸酯基是通过下列方式修饰在随机文库上：
以随机文库为模板，用硫代单体和dNTP进行PCR反应，得到具有硫代磷酸酯基修饰的随机文库，
其中，所述硫代单体选自硫代dATP、硫代dTTP、硫代dGTP和/或硫代dCTP；
优选地，以硫代dATP作为硫代单体，并且固定碱基A为2-10。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应所采用的DNA聚合酶选自phusion酶、Q5酶或taq酶；
优选地，聚合酶为Phusion酶。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述结合基团是通过将待结合分子与所述硫代磷酸酯基发生烷基化反应而修饰到随机文库上的；
任选地，所述待结合分子选自溴代苯硼酸、4-醛基苄基溴、4-溴甲基苯硫酚；
当所述待结合分子为溴代苯硼酸时，所述靶标分子为多羟基化合物；
当所述待结合分子为4-醛基苄基溴时，所述靶标分子为各种含氨基的化合物或蛋白分子；
当所述待结合分子为4-溴甲基苯硫酚时，所述靶标分子为可与巯基发生作用的化合物。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，分离与所述靶标序列相结合随机文库之后，将所得文库与碱液接触，使得结合基团脱除，得到可用于进行PCR扩增的目标文库。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述碱液的pH值为10～13。
7.一种核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体上具有硫代磷酸酯基以及结合基团修饰；
所述核酸适配体是通过权利要求5和6所述核酸适配体的体外筛选方法所获得的。
8.一种检测靶标分子的试剂盒，其特征在于，包括：核酸适配体，所述核酸适配体具有硫代磷酸酯基修饰和结合基团修饰，所述结合基团适于与靶标分子相结合。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸适配体是通过权利要求1～6任一项所述核酸适配体的体外筛选方法所获得的。
CN202011335595.8A 2020-11-25 2020-11-25 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒 Active CN112410326B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011335595.8A CN112410326B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202011335595.8A CN112410326B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112410326A true CN112410326A (zh) 2021-02-26
CN112410326B CN112410326B (zh) 2023-05-12

Family

ID=74843078

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202011335595.8A Active CN112410326B (zh) 2020-11-25 2020-11-25 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN112410326B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114990122A (zh) * 2022-05-18 2022-09-02 清华大学 共价抑制剂的体外筛选方法及其应用

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2749227A1 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2006125094A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate aptamers for rnases
CN111529714A (zh) * 2020-06-12 2020-08-14 湖南大学 一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2749227A1 (en) * 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
WO2006125094A2 (en) * 2005-05-18 2006-11-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Combinatorial selection of phosphorothioate aptamers for rnases
CN111529714A (zh) * 2020-06-12 2020-08-14 湖南大学 一种全硫代磷酸酯修饰的核酸适配体药物偶联物及其制备方法和用途

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JEANNINE STEINMEYER ET AL: "Synthesis of DNA Modified with Boronic Acid: Compatibility to Copper(I)-Catalyzed Azide-Alkyne Cycloaddition", 《BIOCONJUG CHEM》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114990122A (zh) * 2022-05-18 2022-09-02 清华大学 共价抑制剂的体外筛选方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112410326B (zh) 2023-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5830643A (en) Partially double-stranded oligonucleotide and method for forming oligonucleotide
AU2775402A (en) Nucleic acid ligands to complex targets
CN107532219B (zh) 使用链置换聚合酶的固相靶核酸捕获和复制
CN110129415B (zh) 一种ngs建库分子接头及其制备方法和用途
WO2007024653A2 (en) Method and substances for isolating micro rnas
JP2008017853A (ja) 分析物の検出、定量及び増幅のための新規な組成物および方法
JPS60502155A (ja) オリゴヌクレオチドの高分子支持体系
JP2001517460A (ja) 標準化核酸ライブラリーおよびそれを作製する方法
CN109593757B (zh) 一种探针及其适用于高通量测序的对目标区域进行富集的方法
AU2016102398A4 (en) Method for enriching target nucleic acid sequence from nucleic acid sample
CN107760686B (zh) Dkk-1蛋白的核酸适配体及其应用
US20210214773A1 (en) Compositions and methods related to kethoxal derivatives
CN112795563A (zh) 生物素化的转座体在回收CUT&amp;Tag或ATAC-seq产物中的用途及方法
US10364455B2 (en) Methods and compositions for improving removal of ribosomal RNA from biological samples
CN112410326A (zh) 核酸适配体的体外筛选方法、核酸适配体和检测靶标分子的试剂盒
CN111909991B (zh) 一种捕获rna原位高级结构及相互作用的方法
CN112266949A (zh) 基于pcr反应的多核苷酸扩增方法
JP3853161B2 (ja) 微量ｍＲＮＡ及びｃＤＮＡの増幅方法
CN116218971A (zh) 一种高效染色质dna结合图谱测序方法
CN114540344A (zh) 一种筛选适配体的方法
CN114317544B (zh) 特异性结合cd133的核酸适配体、其筛选方法及应用
JP4915492B2 (ja) ノーマライズ／サブトラクトされたｃＤＮＡライブラリーの作成方法
CN106754891A (zh) 一种rna反义纯化方法
CN106283198B (zh) 用于单细胞全基因组重亚硫酸氢盐测序的文库构建方法
WO2001083696A2 (en) Methods for rapid isolation and sequence determination of gene-specific sequences

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant