CN113186268A - Dna-rna杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制及在新型冠状病毒检测中应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了DNA‑RNA杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制中的应用,所述DNA‑RNA杂合双链特异性缀合物为特异识别DNA‑RNA杂合双链的抗体或结合因子。本发明使用DNA引物,以RNA为模板,或者使用RNA引物,以DNA为模板,利用DNA‑RNA杂合双链特异性缀合物提高不依赖于核酸序列的DNA引物与RNA模板或者RNA引物与DNA模板的亲和性,从而使引物设计不受序列限制,同时促进引物‑模板结构稳定性,提高转录复制效率,并提高复制后下游核酸扩增效率。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学领域,具体涉及DNA-RNA杂合双链特异性缀合物的新用途。
背景技术
DNA-RNA杂合双链是细胞生命活动中的重要中间物,DNA-RNA杂合双链的形成是DNA转录或RNA逆转录的起始。DNA转录和RNA病毒的反转录过程均会产生DNA-RNA杂合双链。
DNA-RNA杂合双链也可通过人工生成,例如在体外使用RNA模板及逆转录酶进行cDNA逆转录过程中,DNA引物及其在RNA模板链上由逆转录酶合成复制的cDNA链与RNA模板链形成DNA-RNA杂合双链。
通过逆转录反应复制的cDNA在分子生物学及临床应用有着重要用途,例如使用RT-PCR方法检测RNA病毒。而DNA引物与RNA模板形成稳定的DNA-RNA杂合双链是逆转录酶稳定合成复制cDNA的基础。
生物体中存在能够与DNA-RNA杂合双链特异结合的物质,例如抗DNA-RNA杂合双链抗体(如抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(如QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(如AbsoluteAntibody Ab01137-23.0)、结合DNA-RNA杂合双链的结合因子(如转录激活因子样效应蛋白)等。
在与人工生成DNA-RNA杂合双链相关的应用例如逆转录合成复制cDNA时,通常在引物设计上需保证引物结合模板的稳定性,而核酸双链的物理化学特性决定了理想状态下引物越长,其与模板结合的稳定性也越高。然而在实际应用中,引物设计受目标序列的限制,包括引物位置和引物长度等,通过增加引物长度来提高引物与模板结合稳定性的方法并不普遍适用。例如,对mRNA进行逆转录合成复制cDNA时,部分mRNA分子可能由于poly-A尾过短而无法与通用长度poly-T引物结合形成稳定DNA-RNA双链,从而无法产生cDNA。引物过长还可能因为包含的碱基越多,形成发卡等二级结构的机会越大,从而对结合模板序列特异性的影响也越大。此外,引物的复杂二级结构也会影响逆转录酶的保真性及cDNA合成复制效率。
而本发明应用的DNA-RNA杂合双链特异性缀合物不依赖于序列,仅依赖于DNA-RNA杂合双链三维结构,可以提高不依赖于核酸序列的DNA引物与RNA模板或者RNA引物与DNA模板的亲和性,从而促进引物-模板结构稳定性,提高转录复制效率。
目前,人们对DNA-RNA杂合双链特异性缀合物的应用主要是捕获DNA探针与待测RNA序列形成的杂合双链产物,并通过ELISA等信号放大方法完成检测分析,或分离捕获的核酸用于下游的应用。例如,USP 4743535披露了一种利用DNA-RNA杂合双链特异性抗体捕获目标RNA的方法,USP7361460则披露了使用DNA-RNA双链特异性抗体及RNA探针捕获HPV病毒,并通过偶联的化学发光过程检测HPV病毒的方法。而本发明所披露的包括抗体在内的DNA-RNA杂合双链缀合物在促进核酸复制中的应用尚未被开发应用。本发明披露一种特异结合DNA-RNA杂合双链的缀合物的新用途。
发明内容
本发明提供DNA-RNA杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制中的应用,包括用特异识别DNA-RNA杂合双链的抗体或结合因子识别DNA-RNA杂合双链结构并与之结合。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,包括使用DNA引物,以RNA为模板,或者使用RNA引物,以DNA为模板,促进互补DNA或RNA转录链的生成。优选的,利用特异结合DNA-RNA杂合双链缀合物识别DNA-RNA杂合双链结构并与之结合,提高不依赖于核酸序列的DNA引物与RNA模板或者RNA引物与DNA模板的亲和性,从而使引物设计不受序列限制,同时促进引物-模板结构稳定性,提高转录复制效率,并提高复制后下游核酸扩增效率。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,其特征在于所述DNA-RNA杂合双链特异性缀合物为DNA-RNA杂合双链的特异性抗体或者能够特异性识别DNA-RNA杂合双链的结合因子。优选的,DNA-RNA杂合体特异性缀合物选自DNA-RNA杂合体特异性抗体如抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-2.0)、DNA-RNA特异性识别抗体HB8730(如QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-23.0),和/或DNA-RNA杂合体特异性结合因子如转录激活因子样效应蛋白中的一种或几种。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,其特征在于所述DNA还包括修饰的DNA衍生物,其中所述修饰是甲基化碱基、羟甲基化碱基、RNA碱基、生物素标记等中的一种或几种,所述RNA还包括修饰的RNA衍生物,其中所述修饰是甲基化碱基、羟甲基化碱基、DNA碱基、生物素标记等中的一种或几种。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,其特征在于DNA-RNA杂合双链特异性缀合物作为促进剂用于单重靶标或多重靶标的核酸复制的PCR反应或扩增反应。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,其特征在于DNA-RNA杂合双链特异性缀合物作为核酸复制后的扩增反应促进试剂,或核酸复制后测序反应促进试剂,或核酸复制后杂交检测促进试剂。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,其特征在于DNA-RNA杂合双链特异性缀合物用于制备目的基因检测试剂或疾病诊断试剂,包括多重基因检测试剂或多重疾病诊断试剂。
本发明提供一种促进核酸复制的应用,其特征在于所述基因检测为以mRNA、microRNA、siRNA等中的一种或几种作为标志物,用于肿瘤、遗传异常、代谢异常、RNA病毒感染引起的疾病诊断的RNA检测,包括血液肿瘤、实体肿瘤如结直肠肿瘤等、重症胶原性肌营养不良等罕见孟德尔遗传病、骨代谢疾病等、新冠肺炎、甲型流感、乙型流感、人免疫缺陷综合症、丙型肝炎、手足口病等RNA病毒感染引起的疾病。
本发明提供一种新型冠状病毒检测试剂,其特征在于包括新型冠状病毒核酸检测RT-PCR扩增试剂,所述的新型冠状病毒检测扩增试剂中含有DNA-RNA杂合双链特异性缀合物,包括但不限于DNA-RNA杂合体特异性抗体如抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(如AbsoluteAntibody Ab01137-2.0)、DNA-RNA特异性识别抗体HB8730(如QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-23.0),和/或DNA-RNA杂合体特异性结合因子如转录激活因子样效应蛋白。所述扩增试剂与病毒样本核酸混合后的RT-PCR反应对病毒检测的灵敏度高于未含特异性缀合物的RT-PCR反应的病毒检测灵敏度。
本发明具体技术方案如下:
发明人通过生物化学实验发现DNA-RNA杂合双链特异性缀合物在促进核酸扩增中的应用,所述缀合物为特异识别DNA-RNA杂合双链结构的缀合物。
优选的,利用DNA-RNA杂合双链特异性缀合物提高DNA引物与RNA模板(逆转录阶段)或者RNA引物与DNA模板的结构稳定性,提高DNA的转录效率,提高扩增效率。
优选的,对逆转录病毒的检测,逆转录病毒是以RNA为遗传物质,因此,对逆转录病毒的检测需采用逆转录的方式实现扩增来完成病毒基因组的复制。在此过程中,关键一步是以病毒RNA为模板,合成与RNA互补的DNA链。逆转录酶将其复制成双链DNA,最后通过PCR或测序等方法进行检测。在病毒复制过程中,如果引物与模板能够更易结合,病毒基因组的复制就得到了促进。根据这个原理,以及DNA-RNA杂合双链特异性缀合物均可特异结合DNA-RNA杂合双链的特性,可以在RT-PCR体系中加入缀合物,使得引物与模板结合的更为紧密,从而达到检测病毒核酸的目的。
同时,利用特异结合DNA-RNA杂合双链缀合物识别DNA-RNA杂合双链结构并与之结合,提高不依赖于核酸序列的DNA引物与RNA模板或者RNA引物与DNA模板的亲和性,从而使引物设计不受序列限制,同时促进引物-模板结构稳定性,提高转录复制效率,并提高复制后下游核酸扩增效率。
DNA-RNA杂合双链特异性缀合物作为促进剂用于PCR反应。更具体的一项应用为,DNA-RNA杂合双链特异性缀合物作为PCR反应促进试剂,用于制备目的基因检测试剂或疾病诊断试剂。
本发明一个具体的示例为,将DNA-RNA杂合双链特异性缀合物用于制备新冠病毒检测RT-PCR扩增试剂。
由于所有DNA-RNA杂合双链特异性缀合物识别DNA-RNA杂合双链的分子机制相同,虽然不同的缀合物存在一定结构差异性,但是涉及实施例中特异性识别DNA-RNA杂合双链的能力也同样适用于其他不同于实施例的其他缀合物。同时,未使用实施例中缀合物,例如具有DNA-RNA杂合体特异性识别的结合因子如转录激活因子样效应蛋白,都使用相同的分子机制,也同样具有识别DNA-RNA杂合双链的能力,所以也在本专利的保护范围之内。
实施例中所采用的各种试剂,包括缓冲液、酶、载体、试剂盒等,均可通过商业途径购得或按照《分子克隆实验指南》第三版(科学出版社,2002)所推荐的方法配制。
本发明优点:
本发明首次利用DNA-RNA杂合双链特异性缀合物增进DNA引物与RNA模板的稳定性,促进逆转录酶在RNA模板上延伸引物合成cDNA,提高逆转录酶合成cDNA效率。利用这一发现,可将DNA-RNA杂合双链特异性缀合物应用于PCR反应,提高核酸扩增效率。进一步的,可利用这一发现,将DNA-RNA杂合双链特异性缀合物用于制备目的基因检测试剂或疾病诊断试剂,当样本中模板量很低时,或需要使用较短的DNA引物时,利用DNA-RNA杂合双链特异性缀合物增进DNA引物与模板的结合稳定性,从而使模板更有效地复制为cDNA而被检测到,有效提高检测的准确性和灵敏度。
本发明使用杂合双链抗体应用于新冠病毒核酸检测的数据显示,使用DNA-RNA杂合双链特异性缀合物可使逆转录更高效。
附图说明
图1为本发明技术原理示意图。图1a为使用RNA引物,以DNA为模板生成DNA;图1b为使用DNA引物,以RNA为模板生成cDNA。
图2是实施例1中RT-PCR扩增曲线图,显示了添加几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物(抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(Absolute Antibody Ab01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(Absolute AntibodyAb01137-23.0)用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测的结果与未添加缀合物组的各一代表结果对比。其中,标记1、2代表样本1、样本2,x、m、h、r分别代表样本未加缀合物、加鼠源抗体、HB8730、兔源抗体。阴性结果(Undet)未加标记。
图3是实施例2中RT-PCR扩增曲线图。显示了添加几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物(抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(Absolute Antibody Ab01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(Absolute AntibodyAb01137-23.0)用于DNA模板的人ACTB基因检测的结果与未添加缀合物组的各一代表结果对比。其中,标记1、2代表样本1、样本2,x、m、h、r分别代表样本未加缀合物、加鼠源抗体、HB8730、兔源抗体。阴性结果(Undet)未加标记。
图4是实施例3中qPCR扩增曲线图。显示了在采用三种不同长度的poly(dT)引物:(dT8/dT12/dT16)和两种不同长度poly(dA)引物(dA8/dA16)进行总mRNA逆转录时,添加几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物(抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(Absolute AntibodyAb01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(Absolute Antibody Ab01137-23.0),逆转录产物PCR扩增的Ct值与未添加缀合物组各一代表结果对比。其中,标记8、12、16分别代表引物dT8、引物dT12、引物dT16,x、m、h、r分别代表样本未加缀合物、加鼠源抗体、HB8730、兔源抗体。阴性结果(Undet)未加标记。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤,但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语,除非另有说明,一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解,这些实施例只是为了举例说明本发明,而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中,未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1:几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)口咽拭子样本检测:
本实施例及本发明所述其他实施例所述的逆转录及扩增反应采用人工合成以下序列的引物、探针。
新型冠状病毒检测,对应序列NC_045512.2;
N基因引物序列:
F1:AAATGTCTGATAATGGACCCCAA,SEQ ID No.1(对应基因中位置为28274-28294);
R1:GCCGACGTTGTTTTGATCGC,SEQ ID No.2(对应基因中位置为28378-28397);
探针序列为:
P1:FAM-CTGAG GGTCCACCAAACGTAATGC-BHQ,SEQ ID No.3(对应基因中位置为28314-28337)。
E基因引物序列为:
F2:AGTTACACTAGCCATCCTT,SEQ ID No.4(对应基因中位置为26328-26346);
R2:AGAGTAAACGTAAAAAGAAGG,SEQ ID No.5(对应基因中位置为26404-26423);
探针序列、荧光基团及其在基因中的位置为:
P2:FAM-CACACAATCGAAGCGCAGT-BHQ,SEQ ID No.6(对应基因中位置为26347-26365)。
人ACTB基因检测,对应序列NC_000007.14:c5530601-5527148Homo sapienschromosome7,GRCh38.p13 Primary Assembly。
引物序列为:
F3:TCCTCCTGAGCGCAAGTACTCC,SEQ ID No.7(对应基因中位置为5533319-5533340);
R3:AAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA,SEQ ID No.8(对应基因中位置为5533446-5533468);
探针序列为:
P3:VIC-TCCGGCCCCTCCATCGTCC-BHQ,SEQ ID No.9(对应基因中位置为5533419-5533437)。
本发明所述的以下几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物(抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(Absolute Antibody Ab01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(Absolute Antibody Ab01137-23.0)用于新型冠状病毒(SARS-CoV-2)核酸检测。
对比的方法为用临床诊断为阳性的新型冠状病毒(SARS-CoV-2)咽拭子核酸样本进行检测,通过含三种缀合物组,与不添加缀合物组,进行样本及对照组的RT-PCR扩增的Ct值对比,每个样本进行三次重复测定,来评价不同杂合双链特异性缀合物对检测效果的影响。
使用QIAGEN OneStep RT-PCR Kit构建20μL反应体系,每个反应含6μL样本模板RNA,并与100nM引物、50nM探针混合,并加入10ng抗体(或不含抗体,以水补足)。经过30分钟50℃处理及15分钟95℃处理,再按照以下参数进行40个热循环,包括:95℃15秒,60℃30秒,72℃30秒。最后72℃5分钟。
结果如表1和图2所示。
表1
上述结果表明,加入DNA-RNA杂合双链特异性缀合物的反应组,与不加缀合物组相比,Ct值明显提前,显示DNA-RNA杂合双链特异性缀合物能够提高病毒RNA的RT-PCR扩增效率,从而提高了检测灵敏度。
实施例2:DNA-RNA杂合双链特异性缀合物用于DNA检测:
本发明所述的以下几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物(抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(如QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-23.0)用于DNA模板的人ACTB基因检测。RT-PCR反应设置同实施例1。
对比的方法为采用人源基因组DNA样品(约2ng/μL)进行检测,通过含三种缀合物组,与不添加缀合物组,进行样品的RT-PCR扩增的Ct值对比,每个样本进行三次重复测定,来评价不同杂合双链特异性缀合物对DNA模板的RT-PCR检测效果的影响。
结果如表2和图3所示。
表2
上述结果表明,加入DNA-RNA杂合双链特异性缀合物的反应组的Ct值,与不加缀合物组相比,没有统计学差异,显示DNA-RNA杂合双链特异性缀合物对DNA引物和DNA模板的扩增效率无影响。结合实施例1实验结果可得出结论,上述缀合物特异性提高DNA-RNA杂合双链上发生的核酸复制与扩增。
实施例3:DNA-RNA杂合双链特异性缀合物增强人mRNA逆转录:
本发明所述的以下几种DNA-RNA杂合双链特异性缀合物(抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-2.0)、杂交瘤单克隆抗体HB8730(如QIAGEN 5198-1220)、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体(如Absolute Antibody Ab01137-23.0)用于增强mRNA逆转录效率。
对比的方法为采用人源总RNA样品(去除DNA),并合成三种不同长度的poly(dT)引物:dT8/dT12/dT16(长度分别为8/12/16碱基)进行总mRNA逆转录,然后检测其中的ACTB逆转录cDNA。通过三组分别含缀合物组,与不添加缀合物组,进行逆转录产物PCR扩增的Ct值对比,每个样本进行三次重复测定,来评价不同杂合双链特异性缀合物对dT8/dT12/dT16的逆转录效果的影响。
使用Takara PrimeScriptTMRT reagent Kit构建10μL反应体系,每个反应含5ng人源总RNA样品,并与50nM dT8或dT12或dT16引物或dA8引物或dA16引物混合,并加入5ng抗体(或不含抗体)。经过15分钟37℃处理及5秒85℃处理后,置于4℃冷却,完成cDNA逆转录。再使用Takara Probe qPCR Mix构建ACTB反应的25μL反应体系,每个反应含已完成逆转录的2μL逆转录cDNA模板,并与100nM正/反向引物、50nM探针混合。经过10分钟25℃处理及30秒95℃处理,按照以下参数进行40个热循环:95℃5秒,60℃30秒。
结果如表3和图4所示。
表3
上述结果显示,加入DNA-RNA杂合双链特异性缀合物的反应组,dT引物的RNA逆转录cDNA效率普遍高于不加缀合物组;对于不加缀合物组,RNA逆转录cDNA效率随dT引物长度的减小而下降,而加入缀合物则能相对提高dT引物对RNA逆转录cDNA效率,尤其地,对于提高较短dT引物的RNA逆转录cDNA效率更为显著。dA引物则未能与mRNA模板产生有效的ACTB基因的DNA-RNA杂合双链,从而未能逆转录为cDNA。
序列表
<110> 苏州海苗生物科技有限公司
<120> DNA-RNA杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制及在新型冠状病毒检测中应用
<141> 2021-05-07
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<210> 6
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<212> DNA
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<400> 9
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Claims (11)
1.DNA-RNA杂合双链特异性缀合物在促进核酸复制中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于包括使用DNA引物,以RNA为模板,或者使用RNA引物,以DNA为模板,促进互补DNA或RNA转录链的生成。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于利用DNA-RNA杂合双链特异性缀合物提高不依赖于核酸序列的DNA引物与RNA模板或者RNA引物与DNA模板的亲和性,从而使引物设计不受序列限制,同时促进引物-模板结构稳定性,提高转录复制效率,并提高复制后下游核酸扩增效率。
4.根据权利要求1所述的应用,其特征在于所述DNA-RNA杂合双链特异性缀合物为DNA-RNA杂合双链的特异性抗体或者能够特异性识别DNA-RNA杂合双链的结合因子。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于所述DNA-RNA杂合双链特异性缀合物选自DNA-RNA杂合双链特异性抗体如抗DNA-RNA杂合双链鼠源抗体、DNA-RNA特异性识别抗体HB8730、抗DNA-RNA杂合双链兔源抗体或转录激活因子样效应蛋白中的一种或几种。
6.根据权利要求2所述的应用,其特征在于所述DNA还包括修饰的DNA衍生物,其中所述修饰是甲基化碱基、羟甲基化碱基、RNA碱基、生物素标记中的一种或几种,所述RNA还包括修饰的RNA衍生物,其中所述修饰选自甲基化碱基、羟甲基化碱基、DNA碱基、生物素标记中的一种或几种。
7.根据权利要求1所述的应用,其特征在于DNA-RNA杂合双链特异性缀合物作为促进剂用于单重靶标或多重靶标的核酸复制的PCR反应或扩增反应。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于DNA-RNA杂合双链特异性缀合物作为核酸复制后的扩增反应促进试剂,或核酸复制后测序反应促进试剂,或核酸复制后杂交检测促进试剂。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于DNA-RNA杂合双链特异性缀合物用于制备目的基因检测试剂或疾病诊断试剂。
10.根据权利要求9所述的应用,其特征在于所述基因检测为以mRNA、microRNA、siRNA中的一种或几种作为标志物,用于肿瘤、遗传异常或代谢异常疾病、RNA病毒感染引起的疾病诊断的RNA检测。
11.根据权利要求1-10任一项所述的应用,其特征在于用于制备新型冠状病毒检测试剂,包括新型冠状病毒核酸检测RT-PCR扩增试剂,所述RT-PCR扩增试剂包含DNA-RNA杂合双链特异性缀合物。
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