CN117070613A - 极小量细胞dna蛋白相互作用捕获方法 - Google Patents

极小量细胞dna蛋白相互作用捕获方法 Download PDF

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Abstract

本发明提出了极小量细胞DNA蛋白相互作用捕获的方法，包括：先将能够和抗体特异性结合的pA/G‑Tn5预孵育，然后通过细胞裂解液裂解细胞后，依靠Tn5和特异抗体的复合体，识别并剪切目的蛋白结合的DNA序列，最终将获得片段进行建库，获得可以用于二代测序的文库。本方法能够同时获得高质量的全基因组范围的DNA蛋白相互作用数据，尤其适用于胚胎、癌症和免疫细胞等数量稀缺的研究样本，从而为了解小量细胞下蛋白DNA互作提供可能性。

Description

极小量细胞DNA蛋白相互作用捕获方法
技术领域
本发明涉及DNA蛋白相互作用捕获技术和二代测序标准样品文库构建方法。
背景技术
近年来，随着二代测序技术的发展，出现了更多的技术帮助人们了解生物学中的各个事件。而检测DNA和蛋白在细胞核中全基因组的相互作用则可以帮助我们理解这些反式调控元件和顺式调控元件在基因表达调控等方面的机制。近些年来，人们进一步优化了传统的ChIP-seq技术，以实现在数百个细胞中检测组蛋白修饰的目的。借助这类方法手段，2016年三个研究组分别独立报道了小鼠早期胚胎发育过程中组蛋白H3K4me3和H3K27me3修饰的动态变化，为研究早期胚胎发育过程中的表观遗传学动态和机制提供了重要的依据和参考，推动了相关领域的发展。
然而，不同于组蛋白修饰的检测，诸如RNA聚合酶II，CTCF，诸多转录因子等重要的蛋白与DNA的结合没有如同组蛋白以核小体的形式与DNA密切结合的模式，这也使得我们即便已有可以在低至百级别量级的高灵敏检测组蛋白修饰的优化的ChIP-seq不能够应用在检测RNA聚合酶II以及其他转录因子与DNA的相互作用的实验目的上。
鉴于以上事实和遇到的困难，通过开发新方法，而非优化已有的ChIP-seq方法，来实现在小量细胞下检测RNA聚合酶II在全基因组上分布的目的。
事实上，前人的研究结果显示，检测DNA和蛋白在全基因组上的相互作用的策略，除了传统的ChIP手段外，还有ChIC(chromatin immuno cleavage)和ChEC(chromatinendogenous cleavage)策略。不同于ChIP中基于抗体免疫共沉淀的方法，ChIC/ChEC的基本原理是基于通过抗体与proteinA/G的相互作用，将结合在proteinA/G上的核酸酶带到抗体识别的目的蛋白与DNA的结合位点，实现在原位的剪切，再通过下游的富集和扩增，鉴定与目的蛋白结合的DNA的序列信息。
近些年来，在分子生物学和测序相关的实验方法中，来自原核细胞的转座酶Tn5被广泛的应用在DNA片段化和DNA文库构建中。由于其转座酶的特性，Tn5可以实现在切割DNA的同时将自带的接头序列连接到目的DNA片段上，其“剪切即连接”的出色性能，较传统方法先切割DNA后再通过DNA连接酶连接接头序列的过程更加稳定和高效，因而备受青睐。诸多广泛应用的测序相关方法都会采用Tn5建库，例如SMART-seq2，ChIA-PET，Hi-C以及ATAC-seq。考虑到Tn5的出色特性，结合我们的实验目的，我们猜想，将Tn5和ChIC策略整合，可以有效的提高ChIC策略的灵敏度，建立基于Tn5和ChIC的极小量细胞DNA蛋白相互作用捕获技术。
发明内容
本发明主要解决的问题是针对于极小量细胞DNA蛋白相互作用捕获技术。该方法能够检测起始细胞量低至几十的全基因DNA蛋白相互作用。实验步骤和实验涉及的关键工具酶Tn5为全新设计和开发。
本发明提出了一种DNA蛋白相互作用捕获和二代测序标准样品文库构建方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
将细胞裂解缓冲液进行裂解处理，以便得到细胞裂解液；
将pA/G-Tn5和抗体共孵育，以便得到Tn5抗体复合体；
将所述Tn5抗体复合体加入细胞裂解液中，加入镁离子后，并进行加热处理，利用Tn5剪切目的蛋白结合的DNA；
利用所述DNA产物PCR获得文库，并对文库进行测序。
传统的DNA蛋白相互作用捕获技术实验由于步骤繁琐，导致方法周期长，效率低。至今，传统方法仍然需要百万级的细胞起始量完成一次实验。在本方法中，通过各个步骤的改进和简化后，本技术能够在1天内，使用极少数数目的细胞(低至几百个)来获得高质量的全基因组DNA蛋白相互作用数据，从而为揭示少量细胞转录层次的调控提供可能性。如图1所示，与其他已发表的文章相比(最少也需要百万级细胞数)，本方法的所需要的细胞数量明显的低于所有方法(500个)。如图2所示，我们的方法能够在低至500个细胞的层面上，有效监测RNA聚合酶II在全基因组上的分布状态。最后经改进后的方法，具有很好的可重复性(图3)。因此综上所述，我们的极小量DNA蛋白相互作用捕获技术，能用几百个就获得原先需要百万级细胞数才能获得的实验数据。为更多无法提供大量细胞的实验提供了可行的实验方案。
根据本发明的实施例，所述细胞的个数为500～1x106个，优选500个。
根据本发明的实施例，进行所述细胞裂解处理所采用的裂解缓冲液体积为6μL。
根据本发明的实施例，所述裂解缓冲液包括：10mM Tris-HCl，pH＝7.4；150mM的NaCl；0.5mM Spermidine；1x Roche complete。
根据本发明的实施例，所述第一裂解处理的时间为5～15分钟。
根据本发明的实施例，所述DNA蛋白互作DNA文库是通过下列方式获得的：
将所述细胞进行裂解，得到细胞裂解液；
将pA/G-Tn5和抗体共孵育，得到Tn5抗体复合体；
将所述Tn5抗体复合体加入细胞裂解液中，酶切PCR后得到DNA文库；
其中，所述预扩增的程序中循环次数为8～20次。
根据本发明的实施例，所述蛋白DNA互作DNA文库是通过下列方式获得的：
(1)利用裂解液裂解细胞，加入抗体Tn5复合体；
(2)通过抗体Tn5复合体剪切目的蛋白结合的DNA；
(3)通过PCR和二代测序，得到蛋白结合DNA文库的具体序列。
在本发明的另一方面，本发明提出了一种小量细胞下检测DNA蛋白相互作用的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：
(1)提供如下试剂：
裂解缓冲液，包括：10mM Tris-HCl，pH＝7.4；150mM的NaCl；0.5mM Spermidine；1xRoche complete；
无水乙醇
超纯水
protein A/G-Tn5融合蛋白(pA-Tn5或pG-Tn5)
AMPure beads
Qubit
酚氯仿
载体RNA(carrier RNA)
醋酸钠(3M)
糖原(glycogen)
5x TTBL(Vazyme，TD502)
PCR试剂盒(Vazyme，TD601)
Digitonin
PCR引物试剂盒(Vazyme，TD202)
掺入的内参DNA(spike-in DNA，经Tn5剪切果蝇基因组DNA，0.025pg/ul)
具体流程：
收集细胞或胚胎并打散计数，一般而言，细胞数量应在200～1百万之间，具体取决于目的蛋白丰度和抗体性能。
抗体和pA-Tn5或pG-Tn5预孵育。Protein A、G的选择主要取决于所用抗体类型。在本研究中，Pol II选择pG-Tn5而H3K4me3和H3K27ac则选用pA-Tn5。将加热完全溶解的5％digitonin加入1ml的Buffer 1中，充分混匀，配制D-B1。向低吸附的200ul EP管中加入7ulDB-1，0.5ul pA/G-Tn5和0.5ug抗体，混匀后放置在4℃ 30分钟。
在收集的细胞或胚胎中，加入6ul DB-1裂解细胞，在4℃放置10分钟。
在裂解后的细胞中加入35ul DB-1，预先制备的抗体，pA/G-Tn5复合物以及12.5ul5xTTBL缓冲液，置于水平混合仪上37℃，400rpm，30分钟。
加入2ul载体RNA，2ul内参DNA和65ul TE缓冲液。将溶液转移到Phase-lock(天根公司)试管中。再加入130ul酚氯仿，抽提纯化DNA。之后取上清，加入650ul无水乙醇，24ul醋酸钠和2ul糖原，置于-20℃冰箱过夜。
4℃低温离心机离心30分钟后留沉淀，80％乙醇洗一次后，加入29ul的水溶解，之后用TD502(Vazyme)中的PCR试剂进行PCR，500细胞对应16个PCR循环。
Qubit检测DNA浓度，2100核算分析仪检测片段大小，之后通过Hi-Seq 2500或Xten测序。
生物信息学分析。
利用本发明的方法能在较短时间(1天)内同时实现对于小量细胞DNA蛋白相互作用DNA测序文库的构建，从而为了解蛋白DNA基因组层面互作和协同调控提供可能性。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1方法效果比较，展示该方法在不同细胞数量下两个重复的效果；
图2方法捕获率展示，展示该方法在不同细胞数量下与传统方法的效果对比；
图3方法可重复性展示，展示该方法在不同细胞数量下的可重复性。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
实施例1
一、试剂准备
缓冲液1(Buffer 1)
10mM Tris-HCl
150mM NaCl
0.5mM Spermidine
1x Roche complete
其他试剂
无水乙醇
超纯水
protein A/G-Tn5融合蛋白(pA-Tn5或pG-Tn5)
AMPure beads
Qubit
酚氯仿
载体RNA(carrier RNA)
醋酸钠(3M)
糖原(glycogen)
5x TTBL(Vazyme，TD502)
PCR试剂盒(Vazyme，TD601)
Digitonin
PCR引物试剂盒(Vazyme，TD202)
掺入的内参DNA(spike-in DNA，经Tn5剪切果蝇基因组DNA，0.025pg/ul)
二、方法具体流程
1.收集细胞或胚胎并打散计数，一般而言，细胞数量应在200～1百万之间，具体取决于目的蛋白丰度和抗体性能。
2.抗体和pA-Tn5或pG-Tn5预孵育。Protein A、G的选择主要取决于所用抗体类型。在本研究中，Pol II选择pG-Tn5而H3K4me3和H3K27ac则选用pA-Tn5。将加热完全溶解的5％digitonin加入1ml的Buffer 1中，充分混匀，配制D-B1。向低吸附的200ul EP管中加入7ulDB-1，0.5ul pA/G-Tn5和0.5ug抗体，混匀后放置在4℃30分钟。
3.在收集的细胞或胚胎中，加入6ul DB-1裂解细胞，在4℃放置10分钟。
4.在裂解后的细胞中加入35ul DB-1，预先制备的抗体，pA/G-Tn5复合物以及12.5ul5xTTBL缓冲液，置于水平混合仪上37℃，400rpm，30分钟。
5.加入2ul载体RNA，2ul内参DNA和65ul TE缓冲液。将溶液转移到Phase-lock(天根公司)试管中。再加入130ul酚氯仿，抽提纯化DNA。之后取上清，加入650ul无水乙醇，24ul醋酸钠和2ul糖原，置于-20℃冰箱过夜。
6.4℃低温离心机离心30分钟后留沉淀，80％乙醇洗一次后，加入29ul的水溶解，之后用TD502(Vazyme)中的PCR试剂进行PCR，500细胞对应16个PCR循环。
7.Qubit检测DNA浓度，2100核算分析仪检测片段大小，之后通过Hi-Seq 2500或Xten测序。
8.生物信息学分析。
如图1所示，与其他已发表的文章相比(最少也需要百万级细胞数)，本方法的所需要的细胞数量明显的低于所有方法(500个)。如图2所示，我们的方法能够在低至500个细胞的层面上，有效监测RNA聚合酶II在全基因组上的分布状态。最后经改进后的方法，具有很好的可重复性(图3)。因此综上所述，我们的极小量DNA蛋白相互作用捕获技术，能用几百个就获得原先需要百万级细胞数才能获得的实验数据。为更多无法提供大量细胞的实验提供了可行的实验方案。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (5)

1.一种DNA蛋白相互作用捕获和二代测序标准样品文库构建方法，其特征在于，包括：
将细胞裂解缓冲液进行裂解处理，以便得到细胞裂解液；
将pA/G-Tn5和抗体共孵育，以便得到Tn5抗体复合体；
将所述Tn5抗体复合体加入细胞裂解液中，加入镁离子后，并进行加热处理，利用Tn5剪切目的蛋白结合的DNA；
利用所述DNA产物PCR获得文库，并对文库进行测序。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述细胞的个数为500～1x106个，优选500个。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进行所述细胞裂解处理所采用的裂解缓冲液体积为6μL；
任选地，所述裂解缓冲液包括：10mM Tris-HCl，pH＝7.4；150mM的NaCl；0.5mMSpermidine；1x Roche complete；
任选地，所述第一裂解处理的时间为5～15分钟。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述DNA蛋白互作DNA文库是通过下列方式获得的：
将所述细胞进行裂解，得到细胞裂解液；
将pA/G-Tn5和抗体共孵育，得到Tn5抗体复合体；
将所述Tn5抗体复合体加入细胞裂解液中，酶切PCR后得到DNA文库；
其中，所述预扩增的程序中循环次数为8～20次。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蛋白DNA互作DNA文库是通过下列方式获得的：
(1)利用裂解液裂解细胞，加入抗体Tn5复合体；
(2)通过抗体Tn5复合体剪切目的蛋白结合的DNA；
(3)通过PCR和二代测序，得到蛋白结合DNA文库的具体序列。
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