CN117089595A - 一种亚细胞结构中rna的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种亚细胞结构中RNA的检测方法,包括如下步骤:S1、将细胞依次进行固定、透化、封闭;S2、将封闭好的细胞、靶向于蛋白质的一抗混合孵育;S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7‑N9启动子混合,得到二抗复合物;S4、将一抗孵育细胞与二抗复合物混合孵育;S5、将二抗孵育细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA‑cDNA杂交体,并合成cDNA第二条链;S6、将cDNA第二条链进行体外转录,得到扩增的RNA,将RNA建库后进行测序,即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及分布。与现有技术相比,本发明无需高端仪器、昂贵试剂和高昂测序成本就能进行亚细胞的RNA定位。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域,尤其是涉及一种亚细胞结构中RNA的检测方法。
背景技术
RNA的亚细胞定位与其功能密切相关,不对称分布的RNA是生物发育、局部蛋白质翻译和染色质结构的基础,RNA在细胞内的位置可能决定其是否会被储存、加工、翻译和降解。因此,解析RNA的亚细胞定位对其功能研究至关重要。
目前已经开发了许多方法来研究RNA定位,但只有少数方法在转录组范围内得到了应用。其中最经典的方法是通过生化离心分层来获取各种细胞器,然后进行RNA测序(“fractionation-seq”),然而fractionation-seq的主要限制是它不能应用于无法纯化的细胞器,例如很多重要的亚细胞区域核纤层和线粒体外膜等,而且这种方法也导致引入很多杂质分子。另外,近年来出现的新型RNA荧光原位杂交成像技术,虽然可以同时获取单细胞中上千种RNA的空间信息,但这种基于荧光探针杂交的方案需要设计靶向感兴趣的RNA的探针组,也并不能获得RNA的全部序列信息,并且此技术需要昂贵复杂的自动化仪器,无法适用于大部分实验室。
因此,亟需一种无需昂贵仪器、适用范围广的RNA定位检测方法。
发明内容
本发明的目的就是为了克服现有技术对检测对象要求高、检测结果受限、依赖高昂仪器等缺陷而提供一种亚细胞结构中RNA的检测方法。通过使用特异性抗体靶向与RNA相互作用的蛋白质和链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7-N9启动子结合捕获亚细胞定位的RNA,以实现对亚细胞定位RNA种类和功能的研究。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现:
本发明的技术方案为提供一种亚细胞结构中RNA的检测方法,包括如下步骤:
S1、将培养好的细胞依次进行固定、透化、封闭;
S2、将S1步骤封闭好的细胞、靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗进行混合孵育;
S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7-N9启动子混合,得到二抗复合物;
S4、将S2步骤孵育后的细胞与S3步骤得到的二抗复合物进行混合孵育;
S5、将S4孵育后的细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA-cDNA杂交体,并合成cDNA第二条链;
S6、将S5得到的cDNA第二条链进行体外转录,即得到扩增后的RNA,将扩增得到的RNA建库后进行测序,即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及其分布。
在一些具体实施方式中,于S1步骤,培养好的细胞为细胞汇合度在70%~90%的细胞。
在一些具体实施方式中,于S2步骤,将靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗与细胞的比例为(0.6-0.7)μL:1×105个细胞。
在一些具体实施方式中,于S2步骤,孵育的温度为25℃,孵育的时间为2h,孵育的转速为70rpm。
在一些具体实施方式中,于S3步骤,二抗复合物的制备工艺为:将体积比为98.3:1:0.7的一抗洗涤缓冲液、12.5μM生物素化的T7-N9启动子、链霉亲和素偶联的二抗混合,在4℃孵育20min,再加入4倍总体积的一抗洗涤缓冲液,用蛋白质截留分子量为100kD的超滤管过滤,得到浓缩10倍体积的浓缩液,再加入与浓缩液同等体积的一抗洗涤缓冲液,即为二抗复合物。
在一些具体实施方式中,于S3步骤,生物素化T7-N9启动子的序列从5’端至3’端依次包括生物素标记、连接臂序列、T7启动子序列、缓冲序列、cDNA接头的反向序列以及若干个随机碱基序列,所述连接臂序列用于增加生物素化T7-N9启动子的序列的灵活性,所述缓冲序列用于提高T7 RNA聚合酶的转录效率,所述若干个随机碱基序列用于与RNA随机配对。
优选的,于S3步骤,生物素化的T7-N9启动子中的序列如SEQ ID NO.1所示。
在一些具体实施方式中,于S4步骤,二抗复合物与细胞的比例为100μL:1×105个细胞。
在一些具体实施方式中,于S4步骤,孵育的温度为25℃,孵育的时间为大于等于45min,孵育的转速为70rpm。
在一些具体实施方式中,于S6步骤,利用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明为一种针对目标蛋白结合的转录本定点逆转录后进行扩增测序的技术(Target Transcript Amplification and Sequencing,TATA-Seq),使用特异性抗体靶向与RNA相互作用的蛋白质,然后定位逆转录产生RNA/cDNA杂交体,随后通过T7 RNA聚合酶进行体外扩增后进行建库测序。抗体定位和T7 RNA聚合酶体外扩增的高效性使得本发明特别适用于亚细胞区域RNA定位的快速低成本研究,尤其是对揭示无膜细胞器中RNA的定性和定量检测,有利于更深入地了解RNA的生物功能。此外,本发明无需高端复杂仪器设备、昂贵实验试剂和高昂测序成本,本发明的成功研发,将为基础领域的科学家和临床领域的医生提供切实可用的先进工具。
附图说明
图1为本发明检测方法的流程示意图,图中的ROI为Amplified RNA Of Interest。
图2为Hela G3BP1抗体组、Hela IgG抗体组的分布图(A)和热图(B)。
图3为Hela G3BP1抗体组、Hela IgG抗体组的富集信号可视化图。
图4为Hela G3BP1抗体组(A)、Hela IgG抗体组(B)的文库质检图谱。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。本实施例以本发明技术方案为前提进行实施,给出了详细的实施方式和具体的操作过程,但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下各实施例和对比例中,如无特别说明的原料或处理技术,则表明其均为本领域的常规市售原料产品或常规处理技术。
一抗:Hela G3BP1抗体(实验组,abcam,ab181150)、Hela IgG抗体(对照组,abclone,AC005)
链霉亲和素偶联的二抗:guinea pig anti-rabbit抗体(Antibodies Online,catalogno.ABIN101961)通过abcam公司的Streptavidin偶联试剂盒(ab102921)进行链霉亲和素偶联。
实施例1
一种亚细胞结构中RNA的检测方法,如图1所示的流程,包括如下步骤:
1、样本准备:将Hela细胞铺在48细胞孔板中,培养至细胞汇合度达到70%~90%,每孔约为1×105个细胞。
2、细胞固定:先用200μL PBS缓冲液洗涤细胞2次,加入100μL 4%多聚甲醛,25℃孵育15min,然后用200μL PBS缓冲液将细胞孔板洗两次。
3、细胞透化与封闭:
(1)向细胞孔板中每孔加入100μL透化缓冲液(10mM Tris-HCl pH 7.5,10mMNaCl,0.5% NP-40裂解液,0.3% Triton X-100裂解液,0.1% Tween 20,1×proteaseinhibitors,200U/mL RNase inhibitor),在冰上孵育15min。
(2)用100μL封闭液(5% BSA牛血清白蛋白,10%normal guinea pig serum豚鼠血清,2μg yeast tRNA,1μg white egg avidin protein白蛋亲和素蛋白,1×PBST缓冲液(PBS+0.1% Tween 20)),25℃,封闭细胞1h后,吸掉封闭液(不要清洗)。
4、一抗孵育:将一抗与Antibody Buffer(抗体缓冲液)中按1:150的体积比例进行稀释,每孔加入100μL抗体稀释液,将细胞孔板置于旋转摇床上,在70rpm、25℃下孵育2h。
Antibody Buffer抗体缓冲液按表1进行配置:
表1Antibody Buffer抗体缓冲液的组分组成
5、二抗复合物:
(1)在1.5mL EP管中加入98.3μL Primary antibody wash Buffer(一抗洗涤缓冲液),1μL浓度为12.5μM的生物素化T7-N9启动子和0.7μL链霉亲和素偶联的二抗,将EP管放在旋转摇床上,4℃孵育20min。
Primary antibody wash Buffer一抗洗涤缓冲液按表2进行配置:
表2 Primary antibody wash Buffer一抗洗涤缓冲液的组分组成
(2)孵育结束后加入400μL Primary antibody wash Buffer,使最终体积为500μL。用超滤管(Millipore,cutoff=100kD)纯化,去除过量的生物素化T7-N9启动子,即将500μL混合物浓缩为50μL,再加入50μL Primary antibody wash Buffer,将体积补充至100μL,得到二抗复合体,即可用于后续的孵育。
其中,生物素化的T7-N9启动子从5’端至3’端依次包括生物素标记(/Biotin-T/)和如SEQ ID NO.1所示的序列,
SEQ ID NO.1:
CACTGTAGTTGTACAGACTCCATAATACGACTCACTATAGGGATAATGAGCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTNNNNNNNNN。
6、二抗结合:将上述100μL的二抗复合物加入到细胞孔板中,置于摇床上,在70rpm、25℃下至少孵育45min。
7、洗涤:
(1)二抗孵育结束后,吸掉液体,首先加入100μL的Primary antibody WashBuffer洗孔板3次,每次需置于摇床上,在70rpm、25℃下孵育5min,吸掉液体。
(2)然后用100μL Wash BufferII(0.5×SSC/15%甲酰胺)洗涤孔板3次,每次需置于摇床上,在70rpm、25℃下孵育5min,吸掉液体。
(3)再次用100μL 1×PBST缓冲液(PBS+0.1% Tween 20)洗涤孔板3次,每次需置于摇床上,在70rpm、25℃下孵育5min,吸掉液体。
(4)最后用100μL 1×PBS缓冲液洗涤细胞孔板2次后,吸掉液体,再加入100μL 1×PBS缓冲液,在37℃孵育2min,转至25℃孵育5min,吸掉液体。
8、逆转录:
按照下表3配置逆转录反应液:
表3逆转录反应液
(1)将表3的逆转录反应液加入细胞孔板中,37℃孵育1h后,吸掉上清。
(2)用100μL 10mM Tris HCl pH 7.5缓冲液将孔板清洗一次后,加入下表4反应液。
9、cDNA第二条链的合成:
按照下表4配置合成cDNA第二条链的反应液
表4合成cDNA第二条链的反应液
(1)将上述混合液加入细胞孔板中,置于16℃孵育2h后,加入1μL的T4 DNA聚合酶,再次置于16℃孵育5min。
(2)加入5μL of蛋白酶K,22μL of 5×蛋白酶K buffer,55℃孵育45min。
(3)将上清转移到新的1.5mL EP管,用86μL的1×PBS清洗孔板两次,并将洗涤液转移到同一管中,采用Zymo Research的DNA clean&concentrator kit进行DNA纯化。
10、T7 RNA Polymerase体外转录:
按照下表5配置T7 RNA Polymerase体外转录反应液
表5T7 RNA Polymerase体外转录反应液
将上述配置好的反应液轻轻混匀,37℃孵育3h左右,且将PCR管置于磁力架中离心,保留上清,上清中即为扩增后的RNA,之后用silane beads(购买于Thermo FisherScientific货号37002D)进行纯化。
11、文库构建:
(1)RT primer的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示:
ACACGACGCTCTTCCGATCT。
(2)逆转录:
按照下表6配置RNA逆转录反应液
表6 RNA逆转录的反应液
将上述反应液轻轻混匀后,置于42℃孵育1h后,加入1μL RNase H除去原始RNA,之后用1.2×Ampure beads(Beckman A63881)进行纯化,最后采用UltraTMIIDNALibrary Prep Kit for Illumina试剂盒进行建库。
12、测序
G3BP1抗体(实验组)为感兴趣抗体靶向定位人HEK293T细胞的应激颗粒(StressGranule),通过本发明方法可以富集到应激颗粒中的特异性RNA,Hela IgG为阴性对照组,两组进行对比,可以比对出存在于应激小体中的特异性RNA。
利用Deeptools软件,以差异的Peak的中心计算reads的富集程度,可以明显看到在这些区域有差异性富集,揭示了应激颗粒中RNA的特异性分布。
(1)图2为Hela G3BP1抗体组(实验组)、Hela IgG抗体组(对照组)的分布图和热图,从图中可以看出,与Hela IgG抗体组(对照组)相比,Hela G3BP1抗体组(实验组)有明显的富集峰,P<0.05。
(2)图3为Hela G3BP1抗体组(实验组)、Hela IgG抗体组(对照组)的富集信号可视化图,从该图中可以看出,实验组相对于对照组的多个基因在基因组不同处有特异性的富集峰。
(3)使用Agilent 2100/4200Bioanalyzer/Qseq400对文库进行质控,获得文库质检图谱,如图4所示,说明建库效果良好。
上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改,并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此,本发明不限于上述实施例,本领域技术人员根据本发明的揭示,不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,包括如下步骤:
S1、将培养好的细胞依次进行固定、透化、封闭;
S2、将S1步骤封闭好的细胞、靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗进行混合孵育;
S3、将一抗洗涤缓冲液、链霉亲和素偶联的二抗与生物素化的T7-N9启动子混合,得到二抗复合物;
S4、将S2步骤孵育后的细胞与S3步骤得到的二抗复合物进行混合孵育;
S5、将S4孵育后的细胞进行洗涤、逆转录得到mRNA-cDNA杂交体,并合成cDNA第二条链;
S6、将S5得到的cDNA第二条链进行体外转录,即得到扩增后的RNA,将扩增得到的RNA建库后进行测序,即可知细胞中与一抗靶向蛋白质相互作用的特异性RNA及其分布。
2.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S1步骤,培养好的细胞为细胞汇合度在70%~90%的细胞。
3.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S2步骤,将靶向于与待扩增RNA相互作用的蛋白质的一抗与细胞的比例为(0.6-0.7)μL:1×105个细胞。
4.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S2步骤,孵育的温度为25℃,孵育的时间为2h,孵育的转速为70rpm。
5.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S3步骤,二抗复合物的制备工艺为:将体积比为98.3:1:0.7的一抗洗涤缓冲液、12.5μM生物素化的T7-N9启动子、链霉亲和素偶联的二抗混合,在4℃孵育20min,再加入4倍总体积的一抗洗涤缓冲液,用蛋白质截留分子量为100kD的超滤管过滤,得到浓缩10倍体积的浓缩液,再加入与浓缩液同等体积的一抗洗涤缓冲液,即为二抗复合物。
6.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S3步骤,生物素化T7-N9启动子的序列从5’端至3’端依次包括生物素标记、连接臂序列、T7启动子序列、缓冲序列、cDNA接头的反向序列以及若干个随机碱基序列,所述连接臂序列用于增加生物素化T7-N9启动子的序列的灵活性,所述缓冲序列用于提高T7 RNA聚合酶的转录效率,所述若干个随机碱基序列用于与RNA随机配对。
7.根据权利要求6所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S3步骤,生物素化的T7-N9启动子中的序列如SEQ ID NO.1所示。
8.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S4步骤,二抗复合物与细胞的比例为100μL:1×105个细胞。
9.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S4步骤,孵育的温度为25℃,孵育的时间为大于等于45min,孵育的转速为70rpm。
10.根据权利要求1所述的一种亚细胞结构中RNA的检测方法,其特征在于,于S6步骤,利用T7 RNA聚合酶进行体外转录。
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