CN118222683A - 检测细胞复制时序的Repli-tag方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及检测细胞复制时序的Repli‑tag方法，属于生物技术领域。本发明的Repli‑Tag方法相比主流Repli‑seq具有更高的分辨水平，能够更准确定位DNA复制起始。同时实验步骤简单，能简化文库构建操作，大幅降低时间、试剂和耗材成本。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及检测细胞复制时序的Repli-tag方法及其应用。
背景技术
DNA复制确保遗传信息能准确无误地传递给子代细胞，是细胞***过程中的关键步骤，因此探测DNA复制时空状态是分子生物学和细胞生物学研究中的一个重要方面。通过绘制整个基因组的DNA复制时序图谱，对于理解复制时序与基因表达的关系、研究细胞周期调控机制以及揭示遗传稳定性调控机制具有重要意义。随着分子生物学和基因组学领域的发展，科学家已经开发出多种技术来探究DNA复制过程。基于高通量测序技术，结合细胞周期的同步化处理和时间序列样本的收集，研究者可以在单碱基分辨率水平分析全基因组的DNA复制模式。目前，检测DNA复制时序图谱的主流方法是Repli-seq(Replicationsequencing)。通过收集不同复制时序的细胞样本进行测序，检测不同复制时序期间新合成的DNA，Repli-seq允许研究者详细地绘制全基因组的DNA复制时序图谱。现有Repli-seq技术流程一般包括：对细胞进行胸腺嘧啶碱基类似物BrdU标记，使用流式分选技术得到不同S期的细胞；纯化不同S期细胞样品的DNA；超声打断DNA并在DNA两端连接测序文库接头；将DNA进行变性，用BrdU抗体捕获带有BrdU的DNA片段；经DNA纯化后进行文库扩增，得到二代测序文库。
Repli-seq技术的优势在于其高通量和全基因组范围的分析能力，但是该方法需要的细胞量较大，进行流式分选后一般需要数十万个细胞；并且由于所使用的是高通量测序方法，实验涉及的二代文库构建试剂盒和超声专用耗材价格昂贵；另外，Repli-seq整体实验流程冗长，完成整个流程至少需要2-3天；操作复杂，包括费时、昂贵的DNA免疫共沉淀步骤，依赖昂贵仪器的DNA超声打断步骤等，需要进行繁复的预实验。最后，由于碱基类似物的标记时长为2小时，获得的DNA复制图谱分辨率有限(数百Kb至Mb)，不能准确定位DNA复制起始事件(DNA复制起始于数Kb至数十Kb的复制起始区域)。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，从而提供一种具有高分辨率、操作方便快速的检测细胞复制时序的Repli-tag方法及其应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
第一方面，本发明提供了检测细胞复制时序的Repli-tag方法，包括以下步骤：
(1)向待检测的细胞中加入碱基似物进行标记，离心收集得到细胞；
(2)用DNA染剂给步骤(1)所述离心收集的细胞进行染色后进行流式分选，收集其中的早/晚-S期细胞后，用磁珠吸附细胞，得到分选细胞；
(3)向步骤(2)所述分选得到的细胞中加入抗体并进行孵育，得到抗体标记的分选细胞；
(4)向步骤(3)所述抗体标记的分选细胞中加入pA/G-Tn5并进行酶切，得到DNA片段化的细胞；
(5)裂解步骤(4)所述DNA片段化的细胞后，纯化DNA并进行文库构建和测序分析。
本发明提供了检测细胞复制时序的Repli-tag方法，仅需标记新合成DNA-细胞分选-抗体识别新合成DNA-加入pA/G-Tn5片段化-直接文库构建并测序，即可获得DNA复制时序图谱。相比主流的DNA复制时序图谱获取方法，本发明不需要进行超声打断DNA、DNA免疫共沉淀富集新合成DNA、末端补平、A-tailing、接头连接等步骤，大幅简化实验流程和文库构建，降低时间成本。同时，由于本发明在DNA片段化的同时直接加上测序接头，一方面免去了超声打断的步骤，另一方面提高了文库构建效率和新合成DNA的检测效率，提高所获得的细胞DNA复制时序图谱的分辨率，使其可以更准确地定位DNA复制起始事件。同时，本发明可以降低细胞用量。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述碱基类似物包括能被抗体直接识别的胸腺嘧啶类似物或能进行Click-it反应的胸腺嘧啶或胞嘧啶类似物。
进一步地，所述能被抗体直接识别的胸腺嘧啶类似物，由于在胸腺嘧啶的5位上引入了可以改变其电子性质的卤素原子(如溴、氯或碘)，卤素原子的加入使其具有与胸腺嘧啶不同的分子大小、形状以及电荷分布，能够被特定的抗体识别。
进一步地，所述能进行Click-it反应的碱基类似物上具有能够与叠氮化合物进行反应形成稳定共价键的官能团，因此具有良好的选择性。同时，基于Click-it反应进行的标记，反应条件温和，操作简便，不需进行DNA变性操作。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述能被抗体直接识别的胸腺嘧啶类似物包括BrdU、CldU或IdU中的一种；更优选地，所述能被抗体直接识别的胸腺嘧啶类似物为BrdU；所述能进行Click-it反应的碱基类似物包括EdU或EdC中的一种；更优选地，所述能进行Click-it反应的碱基类似物为EdU。
所述BrdU为5-溴脱氧尿苷，通过替换脱氧尿苷(dU)被嵌入新合成的DNA中，而CldU为5-氯脱氧尿苷，其嘧啶环中的溴被氯取代。CldU也可以被嵌入新合成的DNA中。EdU为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷，其末端具有一个炔基，能够与叠氮-生物素化合物进行Click-iT反应，从而形成稳定的共价键从而实现EdU的生物素标记，且反应具有非常高效、选择性强、不需进行DNA变性的优点。EdC为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺，与EdU同样是新型碱基类似物。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(3)中，所述抗体包括一抗和二抗；所述一抗包括生物素抗体或碱基类似物的抗体，所述碱基类似物的抗体包括BrdU抗体、CldU抗体或IdU抗体中的一种；所述二抗为识别对应一抗的抗体。
作为本发明所述方法的优选实施方式，所述pA/G-Tn5中的Tn5转座酶上预先包埋含有Tn5结合基序和文库接头的序列；所述序列为TCGTCGGCAGCGTCAGAT GTGTATAAGAGACAG或GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG中的一种，其中结合基序为AGATGTGTATAAGAGACAG，文库接头序列为TCGTC GGCAGCGTC或GTCTCGTGGGCTCGG。该序列需预先与CTGTCTCTTATACACA TCT退火，在结合基序处形成双链，再与Tn5包埋。
进一步地，所述pA/G-Tn5可替换为pA-Tn5或pG-Tn5。
本发明所述步骤(3)-步骤(4)中，由于只有新合成的DNA带有相应的胸腺嘧啶碱基类似物EdU/BrdU，因此所述步骤(3)直接在细胞中进行一抗二抗孵育后，步骤(4)中的pA/G可特异结合到抗体上，与之相连的转座酶Tn5同样能够特异性靶向结合到EdU/BrdU附近的DNA上进行DNA剪切。由于涉及的反应均为特异性结合反应，反应效率高，因此可大幅度缩短EdU/BrdU标记时间，提高DNA复制时间图谱的分辨率；另一方面，不需要进行常规的DNA打断和染色质免疫共沉淀步骤，缩短了实验流程，减少了细胞用量。最后，由于Tn5转座酶在进行DNA片段化的同时，能够直接加上测序接头，一方面免去了超声打断的步骤，另一方面提高了文库构建效率，进一步缩短实验流程。
作为本发明所述方法的优选实施方式，具体包括以下步骤：
(1A)向待检测的细胞中加入EdU进行标记，离心收集得到EdU标记细胞；对所述EdU标记细胞进行固定和重悬后，用含生物素的反应液对细胞进行标记，随后离心收集EdU-生物素标记细胞；
(2A)用DNA染剂给步骤(1A)所述EdU-生物素标记细胞进行染色后，进行流式分选，收集其中的早/晚-S期细胞后，用磁珠吸附细胞，得到不同S期的EdU-生物素标记细胞；
(3A)向步骤(2A)所述不同S期的EdU-生物素标记细胞中加入生物素抗体和对应的二抗进行孵育，得到抗体标记的分选细胞；
(4A)向步骤(3A)所述抗体标记的分选细胞中加入pA/G-Tn5并进行酶切，得到DNA片段化的细胞；
(5A)裂解步骤(4A)所述DNA片段化的细胞后，纯化DNA并进行文库构建和测序分析。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1A)中，所述含生物素的反应液加入体积比例为含生物素的反应液:细胞悬液＝1:9；所述含生物素的反应液为含100μM叠氮生物素、80mM CuSO4和400mM抗坏血酸的Click-it反应液。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1A)中，所述标记和孵育的起始细胞量为0.1-10million，标记和孵育时细胞密度为1-5million/mL。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1A)中，所述向待检测的细胞中加入EdU进行标记时，所述EdU在体系中的终浓度为10μmol/L。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(3A)中，所述不同S期的EdU-生物素标记细胞悬液中的细胞数量为10k-100k；所述生物素抗体的浓度为1.0mg/mL；所述二抗的浓度为1.0mg/mL。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(3A)中，所述细胞悬液、一抗和二抗的体积比为细胞悬液:一抗:二抗＝50:1:1。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(4A)中，所述pA/G-Tn5的浓度为4.0μmol/L；所述pA/G-Tn5和细胞悬液的体积比pA/G-Tn5:细胞悬液＝1:100。
作为本发明所述方法的优选实施方式，具体包括以下步骤：
(1B)向待检测的细胞中加入BrdU进行标记和孵育，离心收集得到BrdU标记细胞；对所述BrdU标记细胞进行固定和重悬后，用细胞变性缓冲液对细胞进行变性，随后加入中和体系停止变性，离心收集BrdU标记细胞；
(2B)用DNA染剂对步骤(1B)所述BrdU标记细胞进行染色后，进行流式分选，收集中早/晚-S期细胞后用磁珠吸附细胞，得到不同S期的BrdU标记细胞；
(3B)向步骤(2B)所述不同S期的BrdU标记细胞中依次加入BrdU抗体和对应的二抗进行孵育，得到抗体标记的分选细胞；
(4B)向步骤(3B)所述抗体标记的分选细胞中加入pA/G-Tn5并进行酶切，得到DNA片段化的细胞；
(5B)裂解步骤(4B)所述DNA片段化的细胞后，纯化DNA并进行文库构建和测序分析。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(1B)中，向待检测的细胞中加入BrdU进行标记时，所述BrdU在体系中的终浓度为100μmol/L。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(3B)中，所述不同S期的BrdU标记细胞悬液中的细胞数量为10k-100k；所述BrdU抗体的浓度为1.0mg/mL；所述二抗的浓度为1.0mg/mL。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(3B)中，所述细胞悬液、一抗和二抗的体积比为细胞悬液:一抗:二抗＝50:1:1。
作为本发明所述方法的优选实施方式，步骤(4B)中，所述pA/G-Tn5的浓度为4.0μmol/L；所述pA/G-Tn5和细胞悬液的体积比pA/G-Tn5:细胞悬液＝1:100。
第二方面，本发明提供了上述检测细胞复制时序的Repli-tag方法在获得细胞DNA复制时间图谱中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1.提高效率：本发明提供的检测细胞复制时序的Repli-tag方法，由于EdU/BrdU等碱基类似物标记与抗体孵育、pA/G-Tn5片段化DNA等反应均在细胞内完成，在保证了反应特异性的同时，能够大幅度缩短碱基类似物的标记时间，提高所得DNA复制时序图谱的分辨率。同时，本发明不需要主流检测细胞复制时序方法中进行的DNA超声打断、免疫共沉淀、末端补平、A-tailing、接头连接等步骤，大幅简化实验流程和文库构建方案，能够在一天内完成全部操作，相比主流方法实验耗时缩短50％-70％。
2.降低成本：由于建库简化，因此不需要使用约400元/样的二代文库构建试剂盒，大幅降低实验成本；同时实验过程所使用的仪器不涉及昂贵的超声仪和约110元/样的超声专用耗材，在提高实验的可行性的同时降低耗材成本；免疫沉淀往往需要使用5-10微克价格昂贵的一抗抗体，而本实验仅需1微克一抗和1微克价格优惠的二抗，节省了试剂成本；并且，基于效率的提升，所需要的细胞数量更少，进一步降低了实验所需成本；
3.分辨率高：相比主流方法，本申请的方法获得的细胞DNA复制时间图谱可以检测到更多信号变化的细节，信号分辨率更高，能够更准确定位DNA复制起始，便于实验人员进一步研究细胞状态变化过程中DNA复制程序的改变。
4.实验步骤简单，不需要复杂的预实验，降低对实验操作人员的技术水平要求。
附图说明
图1为检测细胞复制时序的Repli-tag方法流程图；
图2为检测细胞复制时序的Repli-tag方法与Repli-seq方法的对比图，说明Repli-tag方法检测得到的数据的准确性和可信度高；
图3为Repli-tag方法与Repli-seq方法所得的细胞DNA复制时序图谱对比图，说明Repli-tag方法检测得到的数据分辨率更高。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
(1)碱基类似物标记：在一瓶/皿指数增长的GM12878细胞中加入BrdU，细胞初始数量为1million，所述BrdU在体系中的终浓度为100μmol/L，在37℃下孵育10min以标记新合成的DNA。
(2)细胞固定：离心收集步骤(1)中的细胞，将细胞重悬在PBS+1％ FBS的重悬缓冲液中，细胞在重悬缓冲液的密度不超过20million/mL；向体系中加入3倍体积在-20℃预冷过夜的酒精，将体系置于-20℃冰箱15分钟以固定细胞；在4℃下，2000rpm离心固定的细胞，去除上清，加入PBS缓冲液重悬细胞，重悬的体系中细胞密度不超过5million/mL，在常温下2000rpm离心收集细胞。
(3)细胞透化和变性：将步骤(2)中的细胞重悬在2N HCl+0.5％ Triton X-100的细胞透化变性溶液中，细胞在透化变性溶液体系中的密度不超过5million/mL；在常温下常温孵育15min进行细胞变性和透化，随后向体系加入6倍体积的0.1M的硼酸钠，孵育5min进行PH值中和，离心收集细胞。
(4)DNA染色：在步骤(3)中透化中和后的细胞中加入PBS-1％ BSA缓冲液进行细胞清洗，用PI/DAPI或其它DNA染剂给细胞中的所有DNA进行荧光染色。
(5)细胞分选：步骤(4)中经过DNA染剂染色后，通过流式分选收集早/晚-S期的细胞，每一时期至少收集1万个细胞；随后使用刀豆蛋白磁珠吸附分选得到的细胞，用50μL抗体缓冲液重悬磁珠上的细胞，所述抗体缓冲液含0.02M HEPES pH7.5、150mM NaCl、0.5μMspermidine、0.05％digitonin、2μM EDTA和0.1％BSA。
(6)抗体标记：向步骤(5)获得的不同S期的细胞中加入小鼠来源的BrdU单克隆抗体(试剂名称：BrdU Mouse mAb；试剂厂商：ABclonal；货号：A1482；浓度：1mg/mL)，加入的体积比例为小鼠BrdU单克隆抗体:细胞悬液＝1:50，孵育120min；随后去除上清，将细胞重悬在50μL Dig-Wash Buffer(含0.02M HEPES pH7.5、150mM NaCl、0.5μM spermidine和0.05％digitonin)中，加入兔抗小鼠二抗IgG(试剂名称：rabbitα-mouse antibody；厂商：Abcam；货号：ab46540；浓度：1mg/mL)进行孵育，二抗的加入体积比例为二抗:细胞悬液＝1:50，孵育时间为40min。孵育结束后，清洗细胞，得到抗体标记的分选细胞，重悬在50μL Dig-Wash Buffer中。
(7)DNA片段化：向步骤(6)中的抗体标记的分选细胞加入pA/G-Tn5(诺唯赞，货号Cat#：S614)，反应比例为1:100，反应60min；清洗细胞，随后将细胞重悬在含有镁离子的反应液中，所述含有镁离子的反应液为300μL含0.02MHEPES pH7.5、300mM NaCl、0.5μMspermidine、0.01％digitonin和10μM MgCl2，在37℃孵育60min；激活Tn5，对BrdU附近的DNA进行片段化；孵育结束后向体系中加入10μL 0.5M EDTA、3μL 20％ SDS以及2.5μL20mg/mL的蛋白酶K，在55℃下孵育1小时，以终止DNA片段化反应、裂解细胞并水解蛋白。
(8)纯化DNA：纯化步骤(7)中的细胞裂解体系中的DNA，按照纯化试剂盒(试剂盒：基因组DNA纯化试剂盒；厂商：Zymo；货号：D4011)的说明进行，使用7倍体系体积的ChIPbuffer。
(9)通过PCR扩增步骤(8)纯化后的DNA，构建二代测序文库，经测序、数据分析，得到相应的细胞DNA复制时序图谱。
实施例2
(1)碱基类似物标记：在一瓶/皿指数增长的GM12878细胞中加入EdU，细胞初始数量为1million，所述EdU在体系中的终浓度为10μmol/L，在37℃下孵育10min以标记新合成的DNA。
(2)细胞固定：离心收集步骤(1)中的细胞，将细胞重悬在PBS+1％ FBS重悬缓冲液中，细胞在重悬缓冲液的密度不超过20milion/mL；向体系中加入3倍体积在-20℃预冷过夜的酒精，将体系置于-20℃冰箱15分钟以固定细胞；在4℃下，2000rpm离心固定的细胞，去除上清，加入PBS缓冲液重悬细胞，重悬的体系中细胞密度不超过5milion/mL，在常温下2000rpm离心收集细胞。
(3)生物素标记：将步骤(2)所述细胞重悬后，加入Click-IT反应液静置30min以标记EdU；其中所述Click-IT反应液中含有：100μM叠氮生物素、80mM CuSO4和400mM抗坏血酸；所述Click-IT反应液加入的体积为细胞悬液体积1/9。
(4)DNA染色：在步骤(3)中生物素标记后的细胞中加入PBS-1％ BSA缓冲液进行细胞清洗，用PI/DAPI或其它DNA染剂给细胞中的所有DNA进行荧光染色。
(5)细胞分选：步骤(4)中经过DNA染剂染色后，通过流式分选收集早/晚-S期的细胞，每一时期至少收集1万个细胞；随后使用刀豆蛋白磁珠吸附分选得到的细胞；
(6)抗体标记：向步骤(5)获得的不同S期的细胞中加入生物素抗体(试剂名称：Purified anti-Biotin mouse抗体；试剂厂商：Biolegend；货号：409002；浓度：1mg/mL)，所述生物素抗体和细胞悬液的体积比例为生物素抗体:细胞悬液＝1:50，孵育120min；随后去除上清，将细胞重悬在50μL Dig-Wash Buffer(含0.02MHEPES pH 7.5、150mM NaCl、0.5μMspermidine和0.05％digitonin)中，加入兔抗小鼠二抗IgG(试剂名称：rabbitα-mouseantibody；厂商：Abcam；货号：ab46540；浓度：1mg/mL)进行孵育，二抗孵育时间为40min，所述二抗和细胞悬液的体积比例为二抗:细胞悬液＝1:50，二抗的浓度为1mg/mL，孵育后清洗细胞，得到抗体标记的分选细胞，重悬在50μL Dig-Wash Buffer中。
(7)DNA片段化：向步骤(6)中的抗体标记的分选细胞加入pA/G-Tn5(诺唯赞，货号Cat#：S614)，所述pA/G-Tn5的浓度为4.0μmol/L；所述pA/G-Tn5和细胞悬液的体积比pA/G-Tn5:细胞悬液＝1:100，反应60min；清洗后，将细胞重悬在含有镁离子的反应液中，所述含有镁离子的反应液为300μL含0.02M HEPES pH7.5、300mM NaCl、0.5μM spermidine、0.01％digitonin和10μM MgCl2，在37℃下孵育60min；激活Tn5，对EdU附近的DNA进行片段化；向体系中加入10μL 0.5MEDTA、3μL 20％ SDS以及2.5μL 20mg/mL的蛋白酶K，在55℃下孵育1小时，以终止DNA片段化反应、裂解细胞并水解蛋白；
(8)纯化DNA：纯化步骤(7)中的细胞裂解体系中的DNA，按照纯化试剂盒(试剂盒：基因组DNA纯化试剂盒；厂商：Zymo；货号：D4011)的说明进行，使用7倍体系体积的ChIPbuffer。
(9)通过PCR扩增步骤(8)纯化后的DNA，构建二代测序文库，经测序、数据分析，得到相应的细胞DNA复制时序图谱。
对比例1Repli-seq方法
所述Repli-seq方法参考：https://doi.org/10.1038/nprot.2017.148
(1)碱基类似物标记：在一瓶/皿指数增长的细胞中加入BrdU，在37℃下孵育120min以标记新合成的DNA；
(2)细胞固定：离心收集步骤(1)中的细胞，使用酒精进行细胞固定35min，清洗并收集固定后的细胞；
(3)酶处理：将步骤(2)中的细胞用RNase处理30min；
(4)DNA染色：将步骤(3)中RNase处理后的细胞用缓冲液进行清洗后，用PI/DAPI或其它DNA染剂给细胞中的所有DNA进行荧光染色，染色时间为20min；
(5)细胞分选：步骤(4)中经过DNA染剂染色后，通过流式分选收集处于早/晚-S期的细胞，每一时期至少收集6万个细胞；
(6)纯化DNA：通过市售DNA纯化试剂盒进行纯化；
(7)超声片段化DNA：将上述步骤(6)中纯化后的DNA进行超声打断，反应至少进行60min；
(8)再次纯化DNA，步骤同(6)；
(9)DNA建库前处理：对步骤(8)中再次纯化后的DNA进行末端补平，反应60min；随后进行A-tailing，反应30min；进行接头连接，反应30min；最后使用USER酶处理30min；
(10)纯化步骤(9)中带有接头的DNA，纯化步骤同步骤(6)；
(11)DNA变性：使用高温对步骤(10)纯化后的DNA进行变性，变性反应20min；
(12)富集新合成的DNA：使用BrdU抗体以及相应的二抗对上述变性后的DNA进行免疫共沉淀，富集新合成的DNA，免疫共沉淀反应18h；
(13)对步骤(12)富集后的DNA再次纯化，费时80min；
(14)通过PCR扩增步骤(13)纯化后的DNA，构建得到二代测序文库，经测序、数据分析，获得相应的细胞DNA复制时序图谱。
通过实施例1(Repli-tag)和对比例1(Repli-seq)方法获得的细胞DNA复制时序图谱如图2A所示。两种技术检测到的DNA复制时序信号高度相似，早/晚复制时期的分布高度一致；图2B为两种技术所得DNA复制时序数据的相关性分析，结果显示，两种技术得到的DNA复制时序图谱相关性为0.8。这些数据说明通过Repli-tag方法得到的DNA复制时间图谱的准确度和可信度高。此外，相比Repli-seq数据，实施例1的Repli-tag方法所获得的图谱中可以检测到更多细节，比如绿色阴影处显示在晚复制区域也有相对较早进行复制的亚区域，而对比例1Repli-seq所得数据在该区域不能反应这个细节，说明实施例1的Repli-tag方法得到的DAN复制时间图谱的分辨率更高。
DNA复制在早复制区域起始，随着复制的进行，DNA复制叉向两边移动，从早复制区域转移到晚复制区域，最后来自相邻早复制区的DNA复制叉在较晚复制的区域汇合，完成DNA复制。但是，已有的DNA复制时序检测技术存在分辨率不足的情况，不能准确反映同一个早复制区是否包含多个DNA复制起始事件，以及晚复制区是否存在晚复制时启动的DNA复制起始事件等。
图3为Repli-tag方法与Repli-seq方法在GM12878细胞中得到的DNA复制时序图谱。OK-seq在同一细胞中所获得DNA复制图谱(RFD)作为参照，其中RFD信号从下往上的转折代表DNA复制起始区域(图3最底部的灰色短线标记-Initiation zone)。将DNA复制起始区域分别与Repli-tag与Repli-seq所得的DNA复制时序图谱进行对比，可以看到，Repli-tag与Repli-seq数据中早复制区均能对应到DNA复制起始区域，说明两种技术均能较准确地反应DNA复制起始。但是，图3中蓝色高亮标记的区域同样也是DNA复制起始区，相比RFD信号，Repli-seq技术得到的图谱并未出现峰值信号(较早复制区)，说明该方法获得的复制时序信号分辨率过低，不能反映这些DNA复制起始事件；而Repli-Tag技术在对应的区域检测到了峰值信号，即早复制时序信息，说明Repli-Tag能够更准确定位DNA复制起始事件，相比Repli-seq具有更高的分辨水平。
进一步统计实施例1和对比例1中所有步骤的操作时长和整体实验流程时长，结果如下表1所示：
表1实验流程对比
相比对比例1代表的主流DNA复制图谱方法，本发明的Repli-tag方法在操作和整体实验流程上耗时缩短69.8％，可在一天内完成全部操作。同时，本发明不需要另外进行染色质免疫共沉淀、DNA片段化、末端补平、A-tailing、接头连接的步骤，大幅简化实验流程和文库构建操作，降低实验操作的时间成本和费用。并且本发明的Repli-tag方法不需进行超声操作，因此不需要用到价格昂贵的超声片段仪大幅降低试剂和耗材成本，拓展了实验可操作性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (10)
1.检测细胞复制时序的Repli-tag方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)向待检测的细胞中加入碱基类似物进行标记，离心收集得到细胞；
(2)用DNA染剂标记步骤(1)所述离心收集的细胞并流式分选，收集其中早/晚-S期细胞后用磁珠吸附分选得到的细胞；
(3)向步骤(2)所述分选得到的细胞中加入抗体并进行孵育，得到抗体标记的分选细胞；
(4)向步骤(3)所述抗体标记的分选细胞中加入pA/G-Tn5并进行孵育，得到DNA片段化的细胞；
(5)裂解步骤(4)所述DNA片段化的细胞后，纯化DNA并进行文库构建和测序分析。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碱基类似物包括能被抗体直接识别的碱基类似物或能进行Click-it反应的碱基类似物。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述能被抗体直接识别的碱基类似物包括BrdU、CldU或IdU中的一种；所述能进行Click-it反应的碱基类似物包括Edu或EdC中的一种。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述抗体包括一抗和二抗；所述一抗包括生物素抗体、BrdU抗体、CldU抗体或IdU抗体中的一种；所述二抗为识别对应一抗的抗体。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1A)向待检测的细胞中加入EdU进行标记和孵育，离心收集得到EdU标记细胞；对所述EdU标记细胞进行固定和重悬后，用含生物素的反应液对细胞进行标记，随后离心收集EdU-生物素标记细胞；
(2A)用DNA染剂给步骤(1A)所述EdU-生物素标记细胞进行染色后，进行流式分选，收集中早/晚-S期细胞后，用磁珠吸附细胞，得到不同S期的EdU-生物素标记细胞；
(3A)向步骤(2A)所述不同S期的EdU-生物素标记细胞中加入所述生物素抗体和二抗进行孵育，得到抗体标记的分选细胞；
(4A)向步骤(3A)所述抗体标记的分选细胞中加入pA/G-Tn5并进行酶切，得到DNA片段化的细胞；
(5A)裂解步骤(4A)所述DNA片段化的细胞后，纯化DNA并进行文库构建和测序分析。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(1A)中，所述含生物素的反应液加入体积为所述EdU标记细胞悬液体积的1/9；所述含生物素的反应液为含100μM叠氮生物素、80mMCuSO4和400mM抗坏血酸的Click-it反应液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1A)中，所述向待检测的细胞中加入EdU进行标记时，所述EdU在体系中的终浓度为10μmol/L。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
(1B)向待检测的细胞中加入BrdU进行标记和孵育，离心收集得到BrdU标记细胞；对所述BrdU标记细胞进行固定和重悬后，用细胞变性缓冲液对细胞进行变性，随后加入中和体系停止变性，离心收集BrdU标记细胞；
(2B)用DNA染剂对步骤(1B)所述BrdU标记细胞进行染色后进行流式分选，收集中早/晚-S期细胞后用磁珠吸附细胞，得到不同S期的BrdU标记细胞；
(3B)向步骤(2B)所述不同S期的BrdU标记细胞中依次加入BrdU抗体和二抗进行孵育，得到抗体标记的分选细胞；
(4B)向步骤(3B)所述抗体标记的分选细胞中加入pA/G-Tn5并进行酶切，得到DNA片段化的细胞；
(5B)裂解步骤(4B)所述DNA片段化的细胞后，纯化DNA并进行文库构建和测序分析。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1B)中，向待检测的细胞中加入BrdU进行标记时，所述BrdU在体系中的终浓度为100μmol/L。
10.权利要求1-9任一项所述的检测细胞复制时序的Repli-tag方法在获得细胞DNA复制时序图谱中的应用。
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