CN116606918A

CN116606918A - 一种小分子-dna相互作用图谱测序方法以及试剂盒

Info

Publication number: CN116606918A
Application number: CN202310855906.0A
Authority: CN
Inventors: 李景虹; 滕续聪; 戴依聪
Original assignee: Tsinghua University
Current assignee: Tsinghua University
Priority date: 2023-07-13
Filing date: 2023-07-13
Publication date: 2023-08-18
Anticipated expiration: 2043-07-13
Also published as: CN116606918B

Abstract

本申请提出一种小分子‑DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒，其中方法包括小分子化合物与所述生物素偶联修饰的转座酶A的构建；在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有所述转座酶A和镁离子的溶液进行孵育；洗脱游离的所述转座酶A后加入含有转座酶B和镁离子的溶液继续孵育；其中所述转座酶B为在所述转座酶的剪切活性靶标位点连接第二接头形成；富集切割的DNA片段并进行PCR扩增和二代测序，完成染色质DNA结合图谱测序文库的构建。各种小分子的染色质DNA结合图谱都可以通过本方法进行检测，适用性广；且成本更低，步骤更简单，文库制备时间最快只需3小时。

Description

一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒

技术领域

本申请涉及图谱测序技术领域，尤其涉及一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒。

背景技术

与染色质DNA相互作用的小分子化合物具有重要的抗肿瘤潜力，许多染色质DNA互作分子已经作为药物在临床上广泛应用，例如Etoposide和Romidepsin (Nat Rev Genet2014, 15, 783-796.)。随着基因组结构和功能的研究越来越深入，通过小分子靶向染色质DNA或与DNA结合的相关蛋白来干预生物过程和疾病状态的策略具有广阔的发展前景。为此，在基因组水平检测小分子化合物的DNA靶标至关重要，因为小分子与染色质DNA结合位点图谱有助于解释下游的遗传学或表观遗传学机制。

蛋白质与DNA的结合位点，可以通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）、靶点剪切与标签化（CUT&Tag）等成熟的方法检测。然而，小分子与DNA结合位点的检测则面临巨大挑战。关键难点是，小分子-DNA相互作用的解离速率常数通常较大，导致小分子在洗涤步骤中会从DNA靶点脱离。已有的几种类似ChIP-seq和CUT&Tag的小分子-DNA互作位点分析方法都无法高效富集靶点DNA片段，只适用于高亲和力、低解离速率的小分子，并且具有背景高、信号弱、所需细胞量大等问题。因此，许多已在临床广泛应用的靶向细胞DNA的小分子药物的具体基因组靶点无法明确，制约了药物作用机制的研究和新药研发。快速、高效检测各种小分子与染色质DNA结合位点图谱，是该领域的迫切需求。

经典的Chem-seq方法的流程如下：首先，对小分子化合物进行生物素化修饰。其次，在活细胞或者体外甲醛交联后的细胞内，加入生物素修饰的小分子进行孵育。然后，用超声波打断染色质，使小分子化合物与小片段DNA的复合体游离至溶液中。下一步，在溶液中加入表面修饰了链霉亲和素的磁珠进行孵育，捕获目标小分子化合物及其所结合的DNA片段。接着，纯化洗脱捕获下来的DNA片段。最后，制备DNA文库并进行二代测序。其中该方法耗时长，步骤复杂，同时Chem-seq方法与相关技术（Click chemistry enablespreclinical evaluation of targeted epigenetic therapies. Science 2017, 356(6345), 1397-1401）中记载的Click-seq方法信噪比低、所需细胞量大、重现性差。近期文献报道的Chem-map方法为：首先，对小分子化合物进行生物素化修饰。其次，在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入生物素修饰的小分子进行孵育。然后依次结合生物素抗体、二抗以及pA/G-Tn5转座酶；然后在加入镁离子激活Tn5酶活性后，对小分子结合位点的DNA进行剪切，同时连接测序接头。DNA片段经过PCR扩增后，进行二代测序，其整体步骤和CUT&Tag基本一致，但该所需细胞量仍然要10万个细胞左右，且只适用于结合力强的小分子。

发明内容

本申请旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本申请的目的在于提出一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒，各种小分子的染色质DNA结合图谱都可以通过本方法进行检测，适用性广；且成本更低，步骤更简单，文库制备时间最快只需3小时。

根据本申请的第一个方面提出了一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法，包括以下步骤：

(1)利用叠氮基团修饰后的小分子化合物和生物素同时修饰在转座酶的接头序列的5位形成第一接头；所述第一接头连接在所述转座酶的剪切活性靶标位点完成所述小分子化合物与所述生物素偶联修饰的转座酶A的构建；

(2)在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有所述转座酶A和镁离子的溶液进行孵育，以使小分子化合物结合位点被切割，同时生物素修饰的所述第一接头连接在DNA的特定位点；

(3)洗脱游离的所述转座酶A后加入含有转座酶B和镁离子的溶液继续孵育，以切割所述细胞的染色质开放性区域的DNA片段；其中所述转座酶B为在所述转座酶的剪切活性靶标位点连接第二接头形成；

(4)富集切割的DNA片段并进行PCR扩增和二代测序，完成染色质DNA结合图谱测序文库的构建。

在一些实施例中，步骤(1)中，利用叠氮基团修饰所述小分子化合物的方法为：通过所述小分子化合物的侧链官能团与叠氮基团连接，并使得所述叠氮基团与所述小分子化合物的骨架之间保持设定距离。

在一些实施例中，所述叠氮基团与所述小分子化合物之间设置至少一个连接基团，用以保持两者之间的设定距离。

在一些实施例中，所述小分子化合物能够与染色质DNA相互作用，且其侧链官能团包括氨基、羟基、或羧基。

在一些实施例中，所述转座酶能特异性结合双链序列；所述转座酶包括Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10转座酶。

在一些实施例中，步骤(1)中，所述第一接头由等摩尔的DBMEA寡核苷酸和ME寡核苷酸退火杂交形成；所述DBMEA寡核苷酸通过所述叠氮基团修饰后的所述小分子化合物与DBCO-BMEA寡核苷酸经过点击化学反应得到；所述DBCO-BMEA寡核苷酸的序列如SEQ IDNO.1所示；所述ME寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示；

5’-DBCO-Biotin dT-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；SEQ ID NO.1；其中该序列中5’端DBCO修饰，第一个T碱基侧链生物素修饰；

5’-P-CTGTCTCTTATACACATCT-NH₂-3’；SEQ ID NO.2；该序列中5’端磷酸化，3’端氨基修饰。

在一些实施例中，所述第二接头的序列如SEQ ID NO.3所示；

MEB寡核苷酸：5’-GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；SEQ ID NO.3。

在一些实施例中，步骤(2)中包括步骤：

i)利用活化的刀豆蛋白A磁珠捕获细胞，使得细胞附着在所述刀豆蛋白A磁珠上；

ii)加入含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白的溶液孵育细胞用于通透所述细胞并封闭所述细胞中非特异性的染色质DNA结合位点；后进行孵育，以使小分子化合物结合位点被切割。

在一些实施例中，步骤(4)中切割的DNA片段均位于所述小分子化合物的结合位点；富集切割的DNA片段则利用链霉亲和素磁珠回收富集。

根据本申请的二个方面提出了一种用于小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂盒，包括利用上述任一实施例中所述的方法进行小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂，所述试剂包括转座酶A和转座酶B，还包括直接测序试剂、退火缓冲液、封闭缓冲液或PCR试剂中的一种或多种。

本发明提出了一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法以及试剂盒。具有以下优点：

（1）操作简单，仅需3小时即可完成文库构建的过程，优于已报道的所有方法；

（2）信噪比高、重现性强；

（3）适用于高结合力和低结合力的小分子，应用范围更广；

（4）所需细胞量进一步降低，最低只需100个细胞。

本申请附加的方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本申请的实践了解到。

附图说明

本申请上述的和/或附加的方面和优点从下面结合附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1是本申请一实施例提出的JQ-1的叠氮基团修饰示意图；

图2A是本申请一实施例提出的DBMEA-Tn5转座酶接头核酸

图2B是本申请一实施例提出的MEB-Tn5转座酶接头核酸示意图；

图3是本申请一实施例提出的小分子-DNA相互作用图谱测序方法流程图；

图4是本申请实施例1和传统的Chem-map方法中JQ-1小分子与DNA结合图谱测序结果可视化图谱。

具体实施方式

下面详细描述本申请的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本申请，而不能理解为对本申请的限制。相反，本申请的实施例包括落入所附加权利要求书的精神和内涵范围内的所有变化、修改和等同物。

根据本申请的第一个方面提出了一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法如图3所示，包括以下步骤：

(1)利用叠氮基团修饰后的小分子化合物和生物素同时修饰在转座酶的接头序列的5位形成第一接头；第一接头连接在转座酶的剪切活性靶标位点完成小分子化合物与生物素偶联修饰的转座酶A的构建；

(2)在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有转座酶A和镁离子的溶液进行孵育，以使小分子化合物结合位点被切割，同时生物素修饰的第一接头连接在DNA的特定位点；

(3)洗脱游离的转座酶A后加入含有转座酶B和镁离子的溶液继续孵育，以切割细胞的染色质开放性区域的DNA片段；其中转座酶B为在转座酶的剪切活性靶标位点连接第二接头形成；

其中具体的，步骤(1)中，小分子化合物是待测的能够与染色质DNA相互作用的，其中只要小分子化合物经过偶联，不影响其与靶标的结合力以及偶联产物的水溶性都可以通过本申请实施例提供的技术进行检测，其中通过小分子化合物的侧链官能团与叠氮基团连接，并使得叠氮基团与小分子化合物的骨架之间保持设定距离，实现小分子化合物的侧链官能团进行叠氮基团修饰。

示例的，小分子化合物的侧链官能团如氨基、羟基、羧基等，为使得叠氮基团与小分子化合物的骨架之间保持设定距离，叠氮基团与小分子化合物的骨架之间，应有合适的连接基团。其中连接基团的结构通常为1-3个。以图1为例，JQ-1分子与侧链羧基与氨基、叠氮修饰的三聚乙二醇按照1:1的摩尔比加入到10倍体积的N,N-二甲基甲酰胺溶剂中，再加入1.1当量HATU（2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯）、1.2当量三乙胺催化反应，20摄氏度反应2小时，得到叠氮修饰的JQ-1-N₃分子。

在本实施例中，小分子化合物与生物素偶联修饰的转座酶A的构建包括叠氮基团修饰的JQ-1-N₃分子修饰在Tn5转座酶接头核酸的5‘端，并且同时在5’端修饰生物素；其中

转座酶能特异性结合双链序列，其中转座酶包括Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10转座酶，可知的转座酶是一种来自原核生物的转座酶，并以二聚体形式存在，例如Tn5可特异性结合双链序列AGATGTGTATAAGAGACAG。在镁离子的催化下，Tn5转座酶可切割其他的双链DNA，并将接头序列与被切割的DNA的断裂位点相连，产生两个新的DNA片段。

示例的，以JQ-1作为小分子化合物，转座酶为Tn5转座酶为例，对本申请的步骤(1)转座酶A进行详述；其中JQ-1通过侧链羧基与氨基、叠氮基团修饰的三聚乙二醇偶联，得到叠氮基团修饰的JQ-1-N₃分子。如图2A和图2B所示，将JQ-1-N₃分子修饰在Tn5转座酶接头核酸的5‘端，并且同时在5’端修饰生物素，构建一种JQ-1与生物素偶联的Tn5转座酶（Drug&Biotinylated Mosaic-End-Adapter A Chimera Tn5，JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶），即转座酶A。其中在本实施例中，JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶的接头核酸即第一接头，由等摩尔的JQ-1DBMEA寡核苷酸和ME寡核苷酸退火杂交形成；JQ-1 DBMEA寡核苷酸通过叠氮基团修饰后的JQ-1-N₃与DBCO-BMEA寡核苷酸经过点击化学反应得到；DBCO-BMEA寡核苷酸的序列如SEQID NO.1所示；ME寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示；

5’-P-CTGTCTCTTATACACATCT-NH₂-3’；SEQ ID NO.2；其中序列中5’端磷酸化，3’端氨基修饰。

具体的转座酶A为JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶，其构建的试验步骤为：将合成JQ-1-N₃小分子溶于DMSO，得到5 mM溶液。并合成DBCO-BMEA寡核苷酸和ME寡核苷酸分别溶于退火缓冲液中，终浓度为100 μM。取10 μL 100 μM DBCO-BMEA寡核苷酸，加入0.5 μL 5 mM JQ-1-N₃溶液，混匀，室温孵育1小时，超滤去除小分子，冷冻离心浓缩，得到100 μM的JQ-1 DBMEA寡核苷酸。取10 μL 100 μM JQ-1 DBMEA寡核苷酸与10 μL 100 μM ME寡核苷酸混合，得到20 μL 50 μM JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶接头，即第一接头，第一接头95℃加热5 min，缓慢冷却退火。20 μL 50 μM JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶接头与100 μL 10 μM Tn5转座酶混合，充分混匀室温孵育1 h，得到JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶即转座酶A，其于-20℃保存备用。

在一些实施例中，步骤(2)中包括步骤：准备刀豆蛋白A磁珠，示例的，其中将10XBinding Buffer用水稀释，得到2 mL 1X Binding Buffer。取60 μL刀豆蛋白A磁珠，用500μL 1X Binding Buffer洗涤两次，重悬于60 μL 1X Binding Buffer中备用，在应用中可根据实际检测的样本量等比例调整。

在本实施例中收集细胞，用PBS洗涤两次，计数；利用活化的刀豆蛋白A磁珠捕获细胞，使得细胞附着在刀豆蛋白A磁珠上，而后加入含有洋地黄皂苷、牛血清蛋白的溶液孵育细胞用于通透细胞并封闭细胞中非特异性的染色质DNA结合位点。在刀豆蛋白A磁珠结合的细胞悬液中加入含有转座酶A和镁离子的溶液37℃孵育细胞5分钟，使小分子化合物结合位点被转座酶A切割，同时生物素修饰的第一接头连接在DNA的特定位点。

在此过程中，转座酶A的作用是通过转座酶的剪切活性在靶标位点添加转座酶的接头序列与生物素标签。在300 mM的高浓度钠离子条件下，转座酶A与DNA的非特异性结合能力很弱，无法对染色质开放性区域的DNA进行无差别的剪切，也就不会产生非特异性的标记信号。而转座酶A会基于小分子化合物与靶标的特异性结合能力，将转座酶靶向至染色质上的靶标位点。尽管小分子化合物与靶点DNA的结合是高度动态的，但本方法不需要洗涤未结合的小分子化合物，而是在小分子化合物与靶点DNA作用的同时，依靠转座酶的活性作用完成DNA剪切与接头连接，这就从原理上规避了传统方法中的洗涤过程对已经结合在靶标位点的小分子的脱除效应。

在完成步骤(2)时，小分子化合物结合位点被切割，同时生物素修饰的第一接头连接在DNA的特定位点。可洗涤细胞，洗脱游离的转座酶A，并在细胞中加入含有转座酶B和镁离子的缓冲液，37℃孵育细胞半小时，使染色质开放性区域的DNA被切割成小片段。

示例的，其中转座酶B的构建方法为：以如SEQ ID NO.3所示的MEB寡核苷酸为第二接头，合成MEB寡核苷酸并溶于退火缓冲液中，终浓度为100 μM；其中退火缓冲液包括Tris·HCl pH=7.5 20 mM，EDTA 1 mM, NaCl 100 mM。

MEB寡核苷酸：5’- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；SEQ ID NO.3。取10 μL 100 μM MEB寡核苷酸与10 μL 100 μM ME寡核苷酸混合，得到20 μL 50 μM MEB-Tn5转座酶接头，即第二接头，第二接头95℃加热5 min，缓慢冷却退火。20 μL 50 μM MEB-Tn5转座酶接头与100 μL 10 μM Tn5转座酶混合，充分混匀室温孵育1 h，得到MEB-Tn5转座酶，其于-20℃保存备用。

其中在本实施例中，在低浓度钠离子的条件下用转座酶B对细胞染色质DNA的开放性位点进行随机剪切，得到DNA小片段。在步骤（2）和步骤（3）过程中，转座酶A和转座酶B的分别处理细胞，也为目标DNA片段添加了可供PCR扩增的引物结合位点。由于步骤（2）转座酶A进行酶切时使用的是带有生物素修饰的适配体偶联的转座酶，只有小分子化合物结合位点附近才会被连接上带有生物素的DNA片段，因此回收到的片段都位于小分子化合物结合位点，从而实现本方法特异性检测小分子化合物结合位点图谱的目标，因此在步骤（3）完成后只需富集产物进行PCR扩增，即可实现染色质DNA结合图谱测序文库的构建，这也对应了上述但提及的从原理上规避了传统方法中的洗涤过程对已经结合在靶标位点的小分子的脱除效应。

步骤（4）具体方法为通过链霉亲和素磁珠的富集靶标位点DNA片段。只有在转座酶A作用时被特异性添加生物素标签的那些小片段才能被磁珠富集，从而实现对小分子化合物所结合的DNA位点的特异性的捕获。随后进行PCR建库，二代测序，数据分析。因此，在完成步骤（3）后只需对链霉亲和素磁珠富集产物进行PCR扩增，即可实现染色质DNA结合图谱测序文库的构建。

根据本申请的二个方面提出了一种用于小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂盒，包括利用上述任一实施例中的方法进行小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂，试剂包括转座酶A和转座酶B，还包括直接测序试剂、退火缓冲液、封闭缓冲液或PCR试剂中的一种或多种。

具体的，用于小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂盒包括10X Wash Buffer、10XBinding Buffer、10X Tn5 Buffer、25X 封闭缓冲液、转座酶A、转座酶B、退火缓冲液；其中各试剂的组成和用量示例性如下所示：

10X Wash Buffer：200 mM HEPES-KOH pH=7.5,1.5 M NaCl、5 mM 亚精胺；

10X Binding Buffer：200 mM HEPES-KOH pH=7.9,100 mM KCl、10 mM CaCl₂、10mM MnCl₂；

10X Tn5 Buffer：200 mM HEPES-KOH pH=7.5,1.5 M NaCl、5 mM 亚精胺；

25X 封闭缓冲液：50 mM EDTA pH=8.0,2.5% BSA；

针对特定小分子靶标的转座酶A（1:300）；

转座酶B（1:100）；

退火缓冲液：Tris·HCl pH=7.5 20 mM，EDTA 1 mM, NaCl 100 mM。

实施例1：

利用上述实施例中的试剂盒，以6个样本的人类HEK293FT细胞中JQ-1小分子与DNA结合图谱的测序为例，其中转座酶A为JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶；转座酶B为MEB-Tn5转座酶，包括以下步骤：

（1）准备缓冲液

配制Wash Buffer：750 μL 10X Wash Buffer、150 μL 50X 蛋白酶抑制剂、6600 μL水，混匀；

配制通透封闭液：300 μL Wash Buffer、3 μL 5% Digitonin、12 μL 25X 封闭缓冲液；

配制Tn5 Buffer：750 μL 10X Tn5 Buffer、150 μL 50X 蛋白酶抑制剂、6600 μL水、15 μL 5% Digitonin，混匀。

配制JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶反应液：300 μL Tn5 Buffer，3 μL 1 M MgCl₂, 1 μLJQ-1 DBMEA-Tn5转座酶，混匀。

配制MEB-Tn5转座酶反应液：300 μL Wash Buffer，0.6 μL 5% Digitonin, 3 μL1 M MgCl₂, 6 μL MEB-Tn5转座酶，混匀。

（2）准备HEK293FT细胞

HEK293FT细胞培养至密度达到90%，用0.05%胰蛋白酶消化细胞，重悬至500 μLPBS溶液中。1500 rpm离心2 min，去除上清。加入500 μL PBS，1500 rpm离心2 min，去除上清。重复洗2次。加入100 μL Wash Buffer重悬细胞。对细胞进行计数，确定细胞浓度。

（3）JQ-1小分子与DNA结合图谱的测序

准备6个1.5 mL离心管，每管加入0.5-5万个细胞，再加入Wash Buffer至总体积90μL。然后每管加入10 μL准备好的刀豆蛋白A磁珠。轻轻混匀，室温孵育10 min。

磁力架上静置1 min，去除上清，每管加入50 μL准备好的通透封闭液，室温孵育20min。

磁力架上静置1 min，去除上清，每管加入50 μL准备好的JQ-1 DBMEA-Tn5转座酶反应液，37℃孵育5 min。

磁力架上静置1 min，去除上清。每管加入500 μL准备好的Tn5 Buffer，磁力架上静置1 min，去除上清。重复洗涤两次。

每管加入50 μL MEB-Tn5转座酶反应液，37℃孵育 30 min。

每管加入1 μL 10% SDS，55℃孵育5 min。

磁力架上静置分离，取出上清，转移至新的0.2 mL PCR管中，每管加入2 μL 链霉亲和素磁珠，室温孵育20 min。

磁力架上静置1 min，去除上清。每管加入100 μL准备好的Wash Buffer，磁力架上静置1 min，去除上清。重复洗涤一次。重悬于35 μL纯水。

每管加入2.5 μL i5 PCR primer，2.5 μL i7 PCR primer，10 μL 5X PCR预混液。按照以下步骤进行PCR：72℃ 3 min，98℃ 30 s, (98℃ 15 s, 60℃ 20 s, 72℃ 10 s),16-22个循环，72℃ 2 min，12℃保持。

i5 PCR primer： 5'-AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAG ATC TAC AC [IIIIIIII]TCG TCG GCA GCG TC-3'

i7 PCR primer：5'-CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GAT [IIIIIIII] GTC TCGTGG GCT CGG-3'

其中IIIIIIII为8 bp的index序列。且实验结果如图4中所示，其中Drug-map方法得到的JQ-1小分子的测序结果与传统的Chem-map方法中得到的JQ-1小分子相比信噪比高，而传统方法Chem-map则具有较多背景信号。

需要说明的是，在本申请的描述中，术语“第一”、“第二”等仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。此外，在本申请的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。

流程图中或在此以其他方式描述的任何过程或方法描述可以被理解为，表示包括一个或更多个用于实现特定逻辑功能或过程的步骤的可执行指令的代码的模块、片段或部分，并且本申请的优选实施方式的范围包括另外的实现，其中可以不按所示出或讨论的顺序，包括根据所涉及的功能按基本同时的方式或按相反的顺序，来执行功能，这应被本申请的实施例所属技术领域的技术人员所理解。

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。

尽管上面已经示出和描述了本申请的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本申请的限制，本领域的普通技术人员在本申请的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims

1.一种小分子-DNA相互作用图谱测序方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，利用叠氮基团修饰所述小分子化合物的方法为：通过所述小分子化合物的侧链官能团与叠氮基团连接，并使得所述叠氮基团与所述小分子化合物的骨架之间保持设定距离。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述叠氮基团与所述小分子化合物之间设置至少一个连接基团，用以保持两者之间的设定距离。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述小分子化合物能够与染色质DNA相互作用，且其侧链官能团包括氨基、羟基、或羧基。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转座酶能特异性结合双链序列，所述转座酶包括Tn1、Tn2、Tn3、Tn4、Tn5、Tn6、Tn7、Tn8、Tn9或Tn10转座酶。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述第一接头由等摩尔的DBMEA寡核苷酸和ME寡核苷酸退火杂交形成；所述DBMEA寡核苷酸通过所述叠氮基团修饰后的所述小分子化合物与DBCO-BMEA寡核苷酸经过点击化学反应得到；所述DBCO-BMEA寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1所示；所述ME寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.2所示；

5’-P-CTGTCTCTTATACACATCT-NH₂ -3’；SEQ ID NO.2；该序列中5’端磷酸化，3’端氨基修饰。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二接头的序列如SEQ ID NO.3所示；

MEB寡核苷酸：5’- GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG-3’；SEQ ID NO.3。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中包括步骤：

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)中切割的DNA片段均位于所述小分子化合物的结合位点；富集切割的DNA片段则利用链霉亲和素磁珠回收富集。

10.一种用于小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂盒，其特征在于，包括利用权利要求1-9中任一所述的方法进行小分子-DNA相互作用图谱测序的试剂，所述试剂包括转座酶A和转座酶B，还包括直接测序试剂、退火缓冲液、封闭缓冲液或PCR试剂中的一种或多种。