JP2003500013A - 固形支持体からの核酸の切断 - Google Patents
固形支持体からの核酸の切断Info
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Abstract
(57)【要約】
本発明は、核酸分子内の所定部位において特異ヌクレオチドが取り込まれており、該特異ヌクレオチドの部位で選択的に該核酸分子を切断することを含む方法であって、該核酸分子が結合している固形支持体から該核酸分子を切り離す方法を提供する。該核酸分子は核酸(ヌクレオチド配列)および異なる化学的特質を有する他の分子成分を含むキメラ分子であってもよい。本発明により、所定位置で親和性結合の基またはレポーター基であってもよい官能基に結合した、選択的切断が可能な特異ヌクレオチドを有するヌクレオチドリンカー配列を含むキメラ分子(構成体)を提供される。本発明は、核酸合成、増幅、配列決定などの分子生物学的操作、核酸分離、親和性に基づく分離やアッセイの操作など多数の応用において有用である。
Description
【0001】
本発明は、固形支持体からの核酸、および核酸を含有する分子または構成体の
切断に関する。
切断に関する。
【0002】
今日、生化学/バイオテクノロジーおよびその関連する分野において一般に用い
られている現行の多くの方法では、生物的または化学的な存在物(たとえば生体
分子)を固形支持体に結合させ(すなわち固定化させ)、次いでその支持体から
切り離すことはしばしば望ましいことである。このような可逆的な固定化は当業
界で知られた分離、精製、および単離操作において、具体的には細胞の単離(た
とえば免疫磁気的分離)、アフィニティクロマトグラフィーなどの多くの手法に
おいて著しい有用性を見出している。固定化、とりわけオリゴヌクレオチド、核
酸の固定化は多くの分子生物学的操作において頻繁に用いられている。さらに核
酸の精製ばかりでなく通常使用されている多くの技術、たとえば配列決定、イン
ビトロ増幅、cDNAの調製、鋳型の調製、DNA関係のアッセイ、突然変異操
作などもまた、固相での使用向けに適合化が図られてきている。これにより、取
り扱いが容易となり、試料の処理効率が上昇し、自動化などが可能となるであろ
う。固相での操作を行い得る能力はしばしば有益と見なされている。
られている現行の多くの方法では、生物的または化学的な存在物(たとえば生体
分子)を固形支持体に結合させ(すなわち固定化させ)、次いでその支持体から
切り離すことはしばしば望ましいことである。このような可逆的な固定化は当業
界で知られた分離、精製、および単離操作において、具体的には細胞の単離(た
とえば免疫磁気的分離)、アフィニティクロマトグラフィーなどの多くの手法に
おいて著しい有用性を見出している。固定化、とりわけオリゴヌクレオチド、核
酸の固定化は多くの分子生物学的操作において頻繁に用いられている。さらに核
酸の精製ばかりでなく通常使用されている多くの技術、たとえば配列決定、イン
ビトロ増幅、cDNAの調製、鋳型の調製、DNA関係のアッセイ、突然変異操
作などもまた、固相での使用向けに適合化が図られてきている。これにより、取
り扱いが容易となり、試料の処理効率が上昇し、自動化などが可能となるであろ
う。固相での操作を行い得る能力はしばしば有益と見なされている。
【0003】
しかしながら、固定化は、その固有の問題を持ち込むであろう。このため今日
使用される多くの固定化系は、所望する対象物の支持体への結合を実現するため
に親和性の結合をする、一対の相手同士間の結合に依存している。たとえばこれ
は抗原抗体のペアの結合、具体的には細胞表面抗原、あるいは固定化を望むタン
パク質または他の分子への固定化抗体の結合に基づいてもよい。分子生物学にお
いて、核酸またはオリゴヌクレオチドの結合は、通常ビオチン−ストレプトアビ
ジン(もしくはアビジン)連結により行なわれる。これは固定化されたタンパク
質(ストレプトアビジンもしくはアビジン)がビオチニル化された分子(たとえ
ば、ビオチニル化オリゴヌクレオチド)に結合することによる。
使用される多くの固定化系は、所望する対象物の支持体への結合を実現するため
に親和性の結合をする、一対の相手同士間の結合に依存している。たとえばこれ
は抗原抗体のペアの結合、具体的には細胞表面抗原、あるいは固定化を望むタン
パク質または他の分子への固定化抗体の結合に基づいてもよい。分子生物学にお
いて、核酸またはオリゴヌクレオチドの結合は、通常ビオチン−ストレプトアビ
ジン(もしくはアビジン)連結により行なわれる。これは固定化されたタンパク
質(ストレプトアビジンもしくはアビジン)がビオチニル化された分子(たとえ
ば、ビオチニル化オリゴヌクレオチド)に結合することによる。
【0004】
そうした連結を逆方向にすること(切断すること)は困難であり、結合した部
分を切り離すという問題に直面するであろう。このため、たとえば連結の切断は
苛酷な条件、具体的には高いpH、若しくは塩の条件、および/または高い温度
を要するかも知れず、それは結合した部分にとり有害であるに違いない。 親和性による結合に代わって用い得る他の連結/結合の形態、すなわち共有結
合に基づく連結であっても切断することは難しいであろう(つまり固形支持体に
共有結合的に結合されている固定化オリゴヌクレオチド捕獲プローブに核酸が結
合することであり、容易にはその支持体から切り離されない)。
分を切り離すという問題に直面するであろう。このため、たとえば連結の切断は
苛酷な条件、具体的には高いpH、若しくは塩の条件、および/または高い温度
を要するかも知れず、それは結合した部分にとり有害であるに違いない。 親和性による結合に代わって用い得る他の連結/結合の形態、すなわち共有結
合に基づく連結であっても切断することは難しいであろう(つまり固形支持体に
共有結合的に結合されている固定化オリゴヌクレオチド捕獲プローブに核酸が結
合することであり、容易にはその支持体から切り離されない)。
【0005】
通常使用される先行技術の固定化系にあるもう一つの不利な点は、固定化され
た部分の分離により、しばしば「固定化している連結」の一部が問題の部分、具
体的には結合するリガンドまたはその一部、たとえばビオチンまたはリンカーの
腕の一部に結合したままになることである。このことは引き続く操作または固定
化部分の下流の処理工程、具体的には核酸のクローニングもしくは他の処理、ま
たは、細胞の生存能力の研究、タンパク質のコンホーメーション研究、さらなる
精製などの妨げとなるであろう。
た部分の分離により、しばしば「固定化している連結」の一部が問題の部分、具
体的には結合するリガンドまたはその一部、たとえばビオチンまたはリンカーの
腕の一部に結合したままになることである。このことは引き続く操作または固定
化部分の下流の処理工程、具体的には核酸のクローニングもしくは他の処理、ま
たは、細胞の生存能力の研究、タンパク質のコンホーメーション研究、さらなる
精製などの妨げとなるであろう。
【0006】
したがって、当業界では生物的もしくは化学的対象物を固定化し次いで切り離
す改良方法が引き続き必要とされている。本発明はこの要求と取りくもうと試み
る。 このように固定化の方法は開発されてきたが、当該方法は、固定化する部分に
、選択的に切断される部位を有する核酸配列を包含することに基づくものである
。この部位は、ヌクレオチド配列には通常存在しないヌクレオチドにより与えら
れ、たとえば該ヌクレオチドの存在に対して特異的である酵素などを使用した選
択的切断を受けやすい。さらに、固定化された部分の切り離しは、その特異的部
位で選択的にヌクレオチド配列を切り離すことにより容易に達成できる。したが
ってこのような新規の方法により、固形支持体からある核酸あるいはある核酸を
含む分子を正確な部位で想定する様式により効率的に分離することが可能となる
。
す改良方法が引き続き必要とされている。本発明はこの要求と取りくもうと試み
る。 このように固定化の方法は開発されてきたが、当該方法は、固定化する部分に
、選択的に切断される部位を有する核酸配列を包含することに基づくものである
。この部位は、ヌクレオチド配列には通常存在しないヌクレオチドにより与えら
れ、たとえば該ヌクレオチドの存在に対して特異的である酵素などを使用した選
択的切断を受けやすい。さらに、固定化された部分の切り離しは、その特異的部
位で選択的にヌクレオチド配列を切り離すことにより容易に達成できる。したが
ってこのような新規の方法により、固形支持体からある核酸あるいはある核酸を
含む分子を正確な部位で想定する様式により効率的に分離することが可能となる
。
【0007】
そうした分離能はヌクレオチドの存在に依存するため、本発明の新しい方法は
、核酸類(すなわち任意のヌクレオチド配列)の固定化、ならびに核酸/ヌクレ
オチド配列の処理操作および調製操作に関する利用に特に好適である。しかしな
がら、本方法は、たとえばタンパク質または他の有機分子などといった核酸以外
の部分とある核酸との結合体のような、切断可能な部位を取り込めるヌクレオチ
ド配列を含むいずれの対象物または分子にも適用できる。
、核酸類(すなわち任意のヌクレオチド配列)の固定化、ならびに核酸/ヌクレ
オチド配列の処理操作および調製操作に関する利用に特に好適である。しかしな
がら、本方法は、たとえばタンパク質または他の有機分子などといった核酸以外
の部分とある核酸との結合体のような、切断可能な部位を取り込めるヌクレオチ
ド配列を含むいずれの対象物または分子にも適用できる。
【0008】
それゆえ本発明は、ある面では、核酸分子と結合している固形支持体から核酸
分子を分離する方法を提供するものである。当該方法は、該核酸分子内の所定部
位で、特異なヌクレオチドが取り込まれており、その特異ヌクレオチド部位で選
択的に該核酸分子を切断することを特徴としている。 核酸分子はいかなるヌクレオチド配列のものであってもよく(リボヌクレオチ
ド配列もしくはデオキシリボヌクレオチド配列、つまりDNAもしくはRNAあ
るいはそれらの任意の修飾体であってもよく)、またはあるヌクレオチド配列を
含有するか取り込んでいる任意の分子であってもよい。このため、ある核酸(類
)のみから成る分子だけでなく、核酸成分と他の成分、例えばタンパク質もしく
はペプチドあるいは他の有機分子、ラベル、リガンド(一対の親和性結合パート
ナーの一方)、酵素基質などといった別の分子成分とからなるキメラ分子、すな
わち任意の他の分子的もしくは生物的もしくは化学的実体物もまた含まれるもの
である。
分子を分離する方法を提供するものである。当該方法は、該核酸分子内の所定部
位で、特異なヌクレオチドが取り込まれており、その特異ヌクレオチド部位で選
択的に該核酸分子を切断することを特徴としている。 核酸分子はいかなるヌクレオチド配列のものであってもよく(リボヌクレオチ
ド配列もしくはデオキシリボヌクレオチド配列、つまりDNAもしくはRNAあ
るいはそれらの任意の修飾体であってもよく)、またはあるヌクレオチド配列を
含有するか取り込んでいる任意の分子であってもよい。このため、ある核酸(類
)のみから成る分子だけでなく、核酸成分と他の成分、例えばタンパク質もしく
はペプチドあるいは他の有機分子、ラベル、リガンド(一対の親和性結合パート
ナーの一方)、酵素基質などといった別の分子成分とからなるキメラ分子、すな
わち任意の他の分子的もしくは生物的もしくは化学的実体物もまた含まれるもの
である。
【0009】
したがって、「核酸分子」なる用語は、ある核酸(ヌクレオチド配列)ならび
に核酸に対して異なる化学的特質を有する別の分子成分(たとえばタンパク質、
脂質、炭水化物、小有機分子、無機分子、放射活性マーカーなど)を含む構成体
をも包含するものである。 「特異ヌクレオチド」なる用語は、取り込む核酸分子中には、通常は見出され
ないヌクレオチドを意味する。すなわち、ある与えられたヌクレオチド配列(つ
まり核酸分子)に関していうと、該ヌクレオチドは、その配列にとり最初からの
ものではない。したがってたとえば、DNAについては、ウラシル塩基(以下“
U”)を含むヌクレオチドは、特異ヌクレオチドということができる。Uは、R
NAにあってもDNAには通常見出されないからである。同様にDNAについて
、リボース含有ヌクレオチドは、特異ヌクレオチドとなるであろう(反対にデオ
キシリボヌクレオチドはRNAにあれば特異となるであろう)。他の特異ヌクレ
オチドとしては、自然界には通常見出されない修飾ヌクレオチドがあり、具体的
には化学的に誘導体化されたヌクレオチド類がある。かくして、DNAヌクレオ
チド配列については、特異ヌクレオチドとはA、T、CもしくはG以外の任意の
ヌクレオチドであることになり(ただしA、T、CもしくはGの修飾物は特異ヌ
クレオチドに含まれる)、RNAについては、特異ヌクレオチドは、A、U、C
もしくはG以外の任意のヌクレオチドとなるであろう(ただし同様に、それらの
修飾物も含む)。
に核酸に対して異なる化学的特質を有する別の分子成分(たとえばタンパク質、
脂質、炭水化物、小有機分子、無機分子、放射活性マーカーなど)を含む構成体
をも包含するものである。 「特異ヌクレオチド」なる用語は、取り込む核酸分子中には、通常は見出され
ないヌクレオチドを意味する。すなわち、ある与えられたヌクレオチド配列(つ
まり核酸分子)に関していうと、該ヌクレオチドは、その配列にとり最初からの
ものではない。したがってたとえば、DNAについては、ウラシル塩基(以下“
U”)を含むヌクレオチドは、特異ヌクレオチドということができる。Uは、R
NAにあってもDNAには通常見出されないからである。同様にDNAについて
、リボース含有ヌクレオチドは、特異ヌクレオチドとなるであろう(反対にデオ
キシリボヌクレオチドはRNAにあれば特異となるであろう)。他の特異ヌクレ
オチドとしては、自然界には通常見出されない修飾ヌクレオチドがあり、具体的
には化学的に誘導体化されたヌクレオチド類がある。かくして、DNAヌクレオ
チド配列については、特異ヌクレオチドとはA、T、CもしくはG以外の任意の
ヌクレオチドであることになり(ただしA、T、CもしくはGの修飾物は特異ヌ
クレオチドに含まれる)、RNAについては、特異ヌクレオチドは、A、U、C
もしくはG以外の任意のヌクレオチドとなるであろう(ただし同様に、それらの
修飾物も含む)。
【0010】
特異ヌクレオチドは、かくして“特異な”塩基類を有するものを含むものであ
り、それらは通常の塩基(DNAではA、T、CもしくはG;RNAではA、U
、CもしくはG)の修飾体、誘導体または類似体であろう。“非本来的”(すな
わち意図的に修飾された)ヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドの本来の形態も
含まれる。たとえばウラシルおよびヒポキサンチンは、本来塩基であるが、本発
明の目的からするとそれらの対応するヌクレオチドは、DNA内に取り込まれれ
ば、特異ヌクレオチドである。
り、それらは通常の塩基(DNAではA、T、CもしくはG;RNAではA、U
、CもしくはG)の修飾体、誘導体または類似体であろう。“非本来的”(すな
わち意図的に修飾された)ヌクレオチドに加えて、ヌクレオチドの本来の形態も
含まれる。たとえばウラシルおよびヒポキサンチンは、本来塩基であるが、本発
明の目的からするとそれらの対応するヌクレオチドは、DNA内に取り込まれれ
ば、特異ヌクレオチドである。
【0011】
“非本来的な”修飾ヌクレオチドには、アルキル化されたヌクレオチド類、お
よびアルキルヒドロキシル化あるいはその他の化学的な修飾もしくは誘導体化に
より修飾されたヌクレオチド類も含まれる。代表的な例としてN−7−メチルグ
アニン、8−オキソグアニン、デオキシウリジン、デオキシイノシン、デオキシ
5',6'−ジヒドロキシチミン(O5O4処理DNAより)、5',6'−ジヒドロキシチ
ミン、デオキシ3'−メチルアデノシン、および3'−メチルアデノシンが挙げられ
る。他の特異ヌクレオチドには、損傷DNAに発生することが観察される他の塩
基も含まれ、たとえば開環されたピリミジン由来の誘導体や他の酸化産物である
(例えば次を参照のこと;Sancar およびSancar,(1988) Annu.Rev.Biochem. 57,
29-67)。
よびアルキルヒドロキシル化あるいはその他の化学的な修飾もしくは誘導体化に
より修飾されたヌクレオチド類も含まれる。代表的な例としてN−7−メチルグ
アニン、8−オキソグアニン、デオキシウリジン、デオキシイノシン、デオキシ
5',6'−ジヒドロキシチミン(O5O4処理DNAより)、5',6'−ジヒドロキシチ
ミン、デオキシ3'−メチルアデノシン、および3'−メチルアデノシンが挙げられ
る。他の特異ヌクレオチドには、損傷DNAに発生することが観察される他の塩
基も含まれ、たとえば開環されたピリミジン由来の誘導体や他の酸化産物である
(例えば次を参照のこと;Sancar およびSancar,(1988) Annu.Rev.Biochem. 57,
29-67)。
【0012】
核酸分子に取り込まれた特異ヌクレオチドは、取り込んだ該核酸分子の選択的
切断部位を与える。したがって特異ヌクレオチドは、あるヌクレオチド配列に取
り込まれ得るヌクレオチドである。具体的には、ポリメラーゼ反応に加わること
ができ、かつ、本来の(通常に見られる)ヌクレオチドと特異的に対を構成する
ことができ、さらに選択的切断が可能なものである。
切断部位を与える。したがって特異ヌクレオチドは、あるヌクレオチド配列に取
り込まれ得るヌクレオチドである。具体的には、ポリメラーゼ反応に加わること
ができ、かつ、本来の(通常に見られる)ヌクレオチドと特異的に対を構成する
ことができ、さらに選択的切断が可能なものである。
【0013】
“選択的切断”もしくは“選択的に切断可能”等の用語は、核酸分子が、他の
部位ではなく、当該特異ヌクレオチドの部位において特異的に切断されることを
意味する。したがって、切断は、“指示”されてもよく、換言すると切断がコン
トロールされて選択的部位において起こってもよい。このようにして選択的部位
は、所望により1以上取り込まれても良く、1以上の特異ヌクレオチドが取り込ま
れるだろう。
部位ではなく、当該特異ヌクレオチドの部位において特異的に切断されることを
意味する。したがって、切断は、“指示”されてもよく、換言すると切断がコン
トロールされて選択的部位において起こってもよい。このようにして選択的部位
は、所望により1以上取り込まれても良く、1以上の特異ヌクレオチドが取り込ま
れるだろう。
【0014】
しかしながら、いかなる生物系においても同様に切断の絶対的特異性は常には
保証され得ないため、なんらかの“寛容性”が系に認められることは理解される
であろう。かくして特異ヌクレオチド部位以外の部位で非特異的な切断のケース
が少数もしくは僅かでも起こることは、認容されてもよい。要件とされることは
、切断が実質的に特異ヌクレオチドの部位のみで起こることである。
保証され得ないため、なんらかの“寛容性”が系に認められることは理解される
であろう。かくして特異ヌクレオチド部位以外の部位で非特異的な切断のケース
が少数もしくは僅かでも起こることは、認容されてもよい。要件とされることは
、切断が実質的に特異ヌクレオチドの部位のみで起こることである。
【0015】
便宜上、そうした選択的な切断は問題とする特定の特異ヌクレオチドに特異的
である酵素を使用することにより酵素的に行なわれてもよい(この意味において
“特異的”という用語は、酵素とその対応する基質、逆にいえば、対応する酵素
により認識される基質との関係を表す)。要求されることは、酵素が区別する様
式で他のヌクレオチド(すなわち核酸分子中に存在する通常のヌクレオチド)で
はなく、当該特異ヌクレオチドを認識しそこで切断することである。
である酵素を使用することにより酵素的に行なわれてもよい(この意味において
“特異的”という用語は、酵素とその対応する基質、逆にいえば、対応する酵素
により認識される基質との関係を表す)。要求されることは、酵素が区別する様
式で他のヌクレオチド(すなわち核酸分子中に存在する通常のヌクレオチド)で
はなく、当該特異ヌクレオチドを認識しそこで切断することである。
【0016】
そのような特異的酵素は、代表的には特定の塩基または複数の特定塩基に特異
性を有するDNAグリコシラーゼであるかもしれない。このようなグリコシラー
ゼ酵素は、塩基類のうちの一つのみもしくは特定のグループのみを認識し作用す
るものとして存在する。当該酵素は、塩基を切断するDNA修復過程に関与して
いると考えられており、当該酵素は正常塩基と不適切な塩基(すなわち不適切な
塩基対形成)または欠陥(損傷された)塩基とを認識し区別することができる。
DNAグリコシラーゼは、N−グリコシド結合を切断することによってDNAの
デオキシリボース−リン酸バックボーンから認識される特定塩基を切断すること
により作用する。この反応により生じた、もはや塩基でない(非プリン/非ピリ
ミジン)部位は不安定であり、主として高いpHまたは高い温度で容易に切断さ
れ得る。しかしながら非塩基性部位に対する様々な切断方法が利用でき、ヌクレ
オチド配列のホスホジエステル結合を切断する化学試薬または酵素を使用する手
法などが含まれる。これらはさらに下記において論ずる。これにより本発明に基
づく選択的切断の機構が提供される。
性を有するDNAグリコシラーゼであるかもしれない。このようなグリコシラー
ゼ酵素は、塩基類のうちの一つのみもしくは特定のグループのみを認識し作用す
るものとして存在する。当該酵素は、塩基を切断するDNA修復過程に関与して
いると考えられており、当該酵素は正常塩基と不適切な塩基(すなわち不適切な
塩基対形成)または欠陥(損傷された)塩基とを認識し区別することができる。
DNAグリコシラーゼは、N−グリコシド結合を切断することによってDNAの
デオキシリボース−リン酸バックボーンから認識される特定塩基を切断すること
により作用する。この反応により生じた、もはや塩基でない(非プリン/非ピリ
ミジン)部位は不安定であり、主として高いpHまたは高い温度で容易に切断さ
れ得る。しかしながら非塩基性部位に対する様々な切断方法が利用でき、ヌクレ
オチド配列のホスホジエステル結合を切断する化学試薬または酵素を使用する手
法などが含まれる。これらはさらに下記において論ずる。これにより本発明に基
づく選択的切断の機構が提供される。
【0017】
多くのそうした酵素が研究され、文献に記載されている(Cleaver およびLayh
er,(1995) Cell,80,825-827 ;Sancar およびSancer、上掲)。本発明において
は、特異ヌクレオチドのような対応する基質とともに、そうしたいずれの酵素を
用いることができる。 しかしながら本発明は、選択的切断を行なうために酵素の使用のみに限定され
るものではなく、切断のための任意の好適な機構もしくは系を利用してもよい。
したがってたとえばDNAヌクレオチド配列に取り込まれたリボヌクレオチドは
、高いpHといった条件、Mg2+、Mn2+などのイオンに対し敏感であり、単に
そうした処理によりなされる選択的切断の部位を与えることができる。専らデオ
キシリボヌクレオチド(たとえばdT、C,G,A,U)からなる配列は、その
ような処理により影響を受けない。したがってデオキシリボースに代わるリボー
スの存在は、一つの位置で選択的に切断する方法を与える。下記の実施例3は、
cDNA合成の方法におけるそうした切断の系の利用を記載する。
er,(1995) Cell,80,825-827 ;Sancar およびSancer、上掲)。本発明において
は、特異ヌクレオチドのような対応する基質とともに、そうしたいずれの酵素を
用いることができる。 しかしながら本発明は、選択的切断を行なうために酵素の使用のみに限定され
るものではなく、切断のための任意の好適な機構もしくは系を利用してもよい。
したがってたとえばDNAヌクレオチド配列に取り込まれたリボヌクレオチドは
、高いpHといった条件、Mg2+、Mn2+などのイオンに対し敏感であり、単に
そうした処理によりなされる選択的切断の部位を与えることができる。専らデオ
キシリボヌクレオチド(たとえばdT、C,G,A,U)からなる配列は、その
ような処理により影響を受けない。したがってデオキシリボースに代わるリボー
スの存在は、一つの位置で選択的に切断する方法を与える。下記の実施例3は、
cDNA合成の方法におけるそうした切断の系の利用を記載する。
【0018】
本発明の好ましい態様においては、核酸分子はDNA分子、特異ヌクレオチド
はUであり、選択的切断は、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)酵素(ウ
ラシルN−グリコシラーゼまたはUNGとしても知られている)を使用すること
により行なわれる。これは手を加えていない酵素でも修飾された酵素であっても
よく、本来的な酵素および修飾された酵素の両方を含む、様々なUDG酵素につ
いて当業界では知られており、文献に記載されている(たとえばCleaver およびL
ayher, 上掲およびUS-A-5,035,996; US-A-5,536,649, Longoら, Gene(1990), 93
, 125-128を参照のこと。これはPCRにおける「持ち越し」汚染を制御する際
のUDGの使用について記載しており、UDG酵素のための供給源を提供してい
る。またWO92/01814では、UDGだけでなく他のグリコシラーゼ酵素を使用す
るPCR「持ち越し」の制御および特異ヌクレオチドについて記載されている。
さらに本発明においても利用できる、異なるUDG酵素の範囲ならびにそれらの
供給源が記載されている)。熱安定な形態(Koulis,A.ら, FEMS Microbiology L
etters (1996), 143,267-271; Kaboev, O.K.ら, Letters (1981) 132(2),337-34
0)および熱不安定な形態(HKTMUNG、エピセンター・テクノロジー社)が知
られている。UDGは、アマシャム・ライフサイエンス社(英国)、ベーリンガ
ー・マンハイム社(ドイツ)、エピセンター・テクノロジー社(米国)といった
商業的供給業者から入手できる。
はUであり、選択的切断は、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UDG)酵素(ウ
ラシルN−グリコシラーゼまたはUNGとしても知られている)を使用すること
により行なわれる。これは手を加えていない酵素でも修飾された酵素であっても
よく、本来的な酵素および修飾された酵素の両方を含む、様々なUDG酵素につ
いて当業界では知られており、文献に記載されている(たとえばCleaver およびL
ayher, 上掲およびUS-A-5,035,996; US-A-5,536,649, Longoら, Gene(1990), 93
, 125-128を参照のこと。これはPCRにおける「持ち越し」汚染を制御する際
のUDGの使用について記載しており、UDG酵素のための供給源を提供してい
る。またWO92/01814では、UDGだけでなく他のグリコシラーゼ酵素を使用す
るPCR「持ち越し」の制御および特異ヌクレオチドについて記載されている。
さらに本発明においても利用できる、異なるUDG酵素の範囲ならびにそれらの
供給源が記載されている)。熱安定な形態(Koulis,A.ら, FEMS Microbiology L
etters (1996), 143,267-271; Kaboev, O.K.ら, Letters (1981) 132(2),337-34
0)および熱不安定な形態(HKTMUNG、エピセンター・テクノロジー社)が知
られている。UDGは、アマシャム・ライフサイエンス社(英国)、ベーリンガ
ー・マンハイム社(ドイツ)、エピセンター・テクノロジー社(米国)といった
商業的供給業者から入手できる。
【0019】
所望する特性を有するグリコシラーゼ酵素を天然資源から単離してもよい。た
とえば低温、具体的には4℃でも良好な活性を有する酵素を、寒冷な環境の生物
体、たとえば北極海エビなどから選び出してもよい。 グリコシラーゼ遺伝子が同定されクローン化された(J.Biol.Chem., 1984,(25
9):13723-13729[大腸菌], J.Biol.Chem., 1989,264:9911-9914[ヒト])。UDG
に代わって、他のグリコシラーゼが入手可能であり、利用できる。その中には以
下が含まれる:ヒポキサンチン-DNAグリコシラーゼ、3-メチルアデニン-D
NAグリコシラーゼI、3-メチルアデニン-DNAグリコシラーゼII、ヒドロキ
シメチルウラシル-DNAグリコシラーゼ、およびホルムアミド-ピリミジンDN
Aグリコシラーゼ。グリコシラーゼならびに対応基質の説明が次の表に示されて
いる。
とえば低温、具体的には4℃でも良好な活性を有する酵素を、寒冷な環境の生物
体、たとえば北極海エビなどから選び出してもよい。 グリコシラーゼ遺伝子が同定されクローン化された(J.Biol.Chem., 1984,(25
9):13723-13729[大腸菌], J.Biol.Chem., 1989,264:9911-9914[ヒト])。UDG
に代わって、他のグリコシラーゼが入手可能であり、利用できる。その中には以
下が含まれる:ヒポキサンチン-DNAグリコシラーゼ、3-メチルアデニン-D
NAグリコシラーゼI、3-メチルアデニン-DNAグリコシラーゼII、ヒドロキ
シメチルウラシル-DNAグリコシラーゼ、およびホルムアミド-ピリミジンDN
Aグリコシラーゼ。グリコシラーゼならびに対応基質の説明が次の表に示されて
いる。
【0020】
【表1】
【0021】
特異ヌクレオチドは、所定の位置において取り込まれ、切断される。このこと
は、簡潔には、切断が核酸分子の所望する場所の正確な部位で起こり得るように
、取り込みの部位(つまり切断の位置)が予め選択され得る(あるいは制御もし
くは指定される)ことを意味するものである。特異ヌクレオチドは核酸分子の限
定した位置に取り込んでもよい。
は、簡潔には、切断が核酸分子の所望する場所の正確な部位で起こり得るように
、取り込みの部位(つまり切断の位置)が予め選択され得る(あるいは制御もし
くは指定される)ことを意味するものである。特異ヌクレオチドは核酸分子の限
定した位置に取り込んでもよい。
【0022】
先に述べたように本発明の方法は、核酸分子に関する任意の固定化の方法にお
いて有用性を有するものである。 すなわち、本発明は、別の面から核酸分子を可逆的に固定化する方法を提供す
るものであり、当該方法は、 (a)特異ヌクレオチドを該核酸分子に所定の部位で取り込む段階 (b)該核酸分子を固形支持体に結合する段階、引き続いて (c)該特異ヌクレオチド部位で該核酸分子を選択的に切断する段階 を含む。
いて有用性を有するものである。 すなわち、本発明は、別の面から核酸分子を可逆的に固定化する方法を提供す
るものであり、当該方法は、 (a)特異ヌクレオチドを該核酸分子に所定の部位で取り込む段階 (b)該核酸分子を固形支持体に結合する段階、引き続いて (c)該特異ヌクレオチド部位で該核酸分子を選択的に切断する段階 を含む。
【0023】
選択的切断の段階(c)は、支持体からその核酸分子を分離することになる。
段階(a)と(b)は順にあるいは同時に行なってもよいことは理解されるだろ
う。したがって、たとえば核酸分子を固形支持体に結合してから、その核酸分子
に特異ヌクレオチドを取り込んでもよい。つまり該特異ヌクレオチドを含むヌク
レオチドまたはヌクレオチド配列を連結させることによる。
う。したがって、たとえば核酸分子を固形支持体に結合してから、その核酸分子
に特異ヌクレオチドを取り込んでもよい。つまり該特異ヌクレオチドを含むヌク
レオチドまたはヌクレオチド配列を連結させることによる。
【0024】
代わりに後で詳細に記載するが、固形支持体に結合させる前に、核酸分子へ特
異ヌクレオチドを取り込ませてもよい。これは、たとえば固相合成法により、酵
素的によりもしくは化学的なカップリングまたは他の結合反応(具体的には親和
性による結合)により行なわれる。後で詳述するように、たとえば特異ヌクレオ
チドを含む固定化プライマー配列を用いることにより、プライマー伸長により核
酸分子を形成するように、「取り込み」と「結合」とを同時に起こさせるような
手法もある。
異ヌクレオチドを取り込ませてもよい。これは、たとえば固相合成法により、酵
素的によりもしくは化学的なカップリングまたは他の結合反応(具体的には親和
性による結合)により行なわれる。後で詳述するように、たとえば特異ヌクレオ
チドを含む固定化プライマー配列を用いることにより、プライマー伸長により核
酸分子を形成するように、「取り込み」と「結合」とを同時に起こさせるような
手法もある。
【0025】
便宜上、本発明の方法において特異ヌクレオチドは、核酸分子に導入されるか
または取り込まれることになるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列
の一部として導入してもよい。 このヌクレオチド配列は、ヌクレオチドからなる「係留綱」もしくは「リンカ
ー配列」として目され、隣接していてもいなくてもよい1ヶ所以上で特異ヌクレ
オチドを取り込むものである。この「リンカー配列」は、具体的には長さにして
4〜100個のヌクレオチドであってもよく、たとえば5〜50個、好都合には10〜30
個または12〜21個であろう。さらに完全に特異ヌクレオチドからなるものであっ
てもよく、あるいは選択により異なる場所で1個以上の特異ヌクレオチドを含む
ものであってもよい。
または取り込まれることになるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列
の一部として導入してもよい。 このヌクレオチド配列は、ヌクレオチドからなる「係留綱」もしくは「リンカ
ー配列」として目され、隣接していてもいなくてもよい1ヶ所以上で特異ヌクレ
オチドを取り込むものである。この「リンカー配列」は、具体的には長さにして
4〜100個のヌクレオチドであってもよく、たとえば5〜50個、好都合には10〜30
個または12〜21個であろう。さらに完全に特異ヌクレオチドからなるものであっ
てもよく、あるいは選択により異なる場所で1個以上の特異ヌクレオチドを含む
ものであってもよい。
【0026】
この点での利用のためにポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド配列を合
成する手法は、この分野ではよく知られ文献にも記載されており、任意の公知の
方法を使用することができる。特異ヌクレオチドは任意の好都合なやり方でリン
カーに取り込むことができ、たとえば、適当なヌクレオチドを用いる固相合成法
あるいは酵素的なやり方、たとえばポリメラーゼ酵素を使用して与えられる近似
のヌクレオチドを取り込むことによる。あるいは、特異ヌクレオチドは、特異的
な酵素を使用してリンカーに取り込んでもよい。たとえば、対応するNTP(こ
こでのケースではUTP)前駆体からのUMPといったモノヌクレオチドを付加
することができる末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼといったトラ
ンスフェラーゼ酵素である。
成する手法は、この分野ではよく知られ文献にも記載されており、任意の公知の
方法を使用することができる。特異ヌクレオチドは任意の好都合なやり方でリン
カーに取り込むことができ、たとえば、適当なヌクレオチドを用いる固相合成法
あるいは酵素的なやり方、たとえばポリメラーゼ酵素を使用して与えられる近似
のヌクレオチドを取り込むことによる。あるいは、特異ヌクレオチドは、特異的
な酵素を使用してリンカーに取り込んでもよい。たとえば、対応するNTP(こ
こでのケースではUTP)前駆体からのUMPといったモノヌクレオチドを付加
することができる末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼといったトラ
ンスフェラーゼ酵素である。
【0027】
同様にリンカー配列を公知のあるいは文献に記載された何らかの好都合なまた
は所望するやり方で核酸分子中に導入してもよい。たとえば連結によるか、ある
いは鋳型により指示されポリメラーゼにより触媒される鎖伸長反応のためのプラ
イマーの形態でもよく、この場合該プライマー(すなわちリンカー)は、鎖伸長
反応の産物に取り込まれることとなる。換言すると本発明の核酸分子は、プライ
マー伸長反応の産物となる。このことについては下記でさらに論ずる。
は所望するやり方で核酸分子中に導入してもよい。たとえば連結によるか、ある
いは鋳型により指示されポリメラーゼにより触媒される鎖伸長反応のためのプラ
イマーの形態でもよく、この場合該プライマー(すなわちリンカー)は、鎖伸長
反応の産物に取り込まれることとなる。換言すると本発明の核酸分子は、プライ
マー伸長反応の産物となる。このことについては下記でさらに論ずる。
【0028】
核酸を他の分子にカップリングさせる方法もまた、当該技術分野では知られて
おり後で詳細に述べる。 固形支持体は、固定化、分離などに現在広く使用されまたは提案されているい
ずれの公知の支持体、またはマトリックスであってもよい。これらは粒子、シー
ト、ゲル、ろ紙、膜、あるいはミクロタイター・ストリップ、チューブもしくは
プレート、繊維、あるいは毛細管の形態をとり、好適には、たとえば、アガロー
ス、セルロース、アルギン酸塩、テフロン(R)、ラテックス、またはポリスチレ
ンなどのポリマー材料からできていてもよい。たとえばNilssonらに記載された
ように(Anal. Biochem.(1995),224,400-408)、小規模実験の系を与える固形
支持体としてバイオチップを使用してもよい。粒子材料、とりわけビーズが一般
的に好ましく、特にポリマー・ビースが好ましく、その広範なものが当業界では
知られている。操作と分離を支援するために、磁気化できる(「磁性の」)ビー
ズが好ましい。好ましくはそうした磁性粒子は残留磁気を防止し、よって凝集を
防止するために超常磁性であるべきであり、均一な運動性と分離を与えるために
は単分散であることが有利である。超常磁性単分散粒子の製造がSintefによりEP
-A-106873に記載されている。
おり後で詳細に述べる。 固形支持体は、固定化、分離などに現在広く使用されまたは提案されているい
ずれの公知の支持体、またはマトリックスであってもよい。これらは粒子、シー
ト、ゲル、ろ紙、膜、あるいはミクロタイター・ストリップ、チューブもしくは
プレート、繊維、あるいは毛細管の形態をとり、好適には、たとえば、アガロー
ス、セルロース、アルギン酸塩、テフロン(R)、ラテックス、またはポリスチレ
ンなどのポリマー材料からできていてもよい。たとえばNilssonらに記載された
ように(Anal. Biochem.(1995),224,400-408)、小規模実験の系を与える固形
支持体としてバイオチップを使用してもよい。粒子材料、とりわけビーズが一般
的に好ましく、特にポリマー・ビースが好ましく、その広範なものが当業界では
知られている。操作と分離を支援するために、磁気化できる(「磁性の」)ビー
ズが好ましい。好ましくはそうした磁性粒子は残留磁気を防止し、よって凝集を
防止するために超常磁性であるべきであり、均一な運動性と分離を与えるために
は単分散であることが有利である。超常磁性単分散粒子の製造がSintefによりEP
-A-106873に記載されている。
【0029】
単分散ポリマーの超常磁性ビーズが「ダイナビーズ(商品名)」としてDynal
AS(オスロ、ノルウェー)社から市販されており、本発明の使用に特に好適である
。 核酸分子は固形支持体に任意の好都合な手段により結合させるか、付着させて
もよい。たとえば、特異ヌクレオチドが切断されやすいものであるかぎり、任意
の化学的、物理的な手段であってもよい。これにはたとえば、静電結合により、
具体的には水素結合、捕獲、あるいはもっと都合のよいのは共有結合によるもの
が挙げられる。たとえば固形支持体上のある基と「リンカー」または核酸分子の
5’末端にある機能性結合の基との共有結合により達成されるであろう。核酸分
子はこれまた固形の不溶性支持体に上記の何らかの手段により結合される他の分
子と直接的または間接的に結合してもよい。
AS(オスロ、ノルウェー)社から市販されており、本発明の使用に特に好適である
。 核酸分子は固形支持体に任意の好都合な手段により結合させるか、付着させて
もよい。たとえば、特異ヌクレオチドが切断されやすいものであるかぎり、任意
の化学的、物理的な手段であってもよい。これにはたとえば、静電結合により、
具体的には水素結合、捕獲、あるいはもっと都合のよいのは共有結合によるもの
が挙げられる。たとえば固形支持体上のある基と「リンカー」または核酸分子の
5’末端にある機能性結合の基との共有結合により達成されるであろう。核酸分
子はこれまた固形の不溶性支持体に上記の何らかの手段により結合される他の分
子と直接的または間接的に結合してもよい。
【0030】
核酸を固形支持体に結合させる方法が文献に記載され、さらにヌクレオチド配
列を結合させまたは担持するために、固形支持体の表面を修飾し適合させるため
の方法もまた記載されている(一般的な総説は、たとえばGreg T. Hermansonに
よる「バイオコンジュゲート技術」Academic Press,Inc.1996 ISBN 0-12-342335
, 第17章,核酸およびオリゴヌクレオチドの修飾と結合、および、Mohammed As
lamおよび Alastair Dentによる「バイオコンジュゲーション−バイオメディカ
ルサイエンスのためのタンパク質カップリング技術」、 Macmillan Reference L
td., 1998 ISBN 0-333-583752、第7章,タンパク質−核酸コンジュゲートの調
製を参照のこと)。
列を結合させまたは担持するために、固形支持体の表面を修飾し適合させるため
の方法もまた記載されている(一般的な総説は、たとえばGreg T. Hermansonに
よる「バイオコンジュゲート技術」Academic Press,Inc.1996 ISBN 0-12-342335
, 第17章,核酸およびオリゴヌクレオチドの修飾と結合、および、Mohammed As
lamおよび Alastair Dentによる「バイオコンジュゲーション−バイオメディカ
ルサイエンスのためのタンパク質カップリング技術」、 Macmillan Reference L
td., 1998 ISBN 0-333-583752、第7章,タンパク質−核酸コンジュゲートの調
製を参照のこと)。
【0031】
オリゴヌクレオチドを磁性ビーズに結合させることは、たとえばEP-A-0640626
に記載されている。 直接的な共有結合のカップリングに加えて、核酸は固形支持体に間接的に親和
性結合によるペアにより結合されてもよい。すなわち、結合パートナーの一方が
固形支持体上にあり、他方が固定化される核酸分子上にある。ビオチン‐ストレ
プトアビジン(アビジン)系の利用が、分子生物学では核酸を固定化する手段と
して良く知られており、ビオチニル化したヌクレオチドは容易に入手でき、スト
レプトアビジンを担持する固形支持体も同様である。たとえば、ストレプトアビ
ジン‐被覆磁性ビーズがDynal AS(オスロ、ノルウェー)社から入手でき、ストレ
プトアビジン‐被覆チューブおよびマイクロウェル・プレートがロッシュ・モレ
キュール・バイオケミカル社から入手できる。
に記載されている。 直接的な共有結合のカップリングに加えて、核酸は固形支持体に間接的に親和
性結合によるペアにより結合されてもよい。すなわち、結合パートナーの一方が
固形支持体上にあり、他方が固定化される核酸分子上にある。ビオチン‐ストレ
プトアビジン(アビジン)系の利用が、分子生物学では核酸を固定化する手段と
して良く知られており、ビオチニル化したヌクレオチドは容易に入手でき、スト
レプトアビジンを担持する固形支持体も同様である。たとえば、ストレプトアビ
ジン‐被覆磁性ビーズがDynal AS(オスロ、ノルウェー)社から入手でき、ストレ
プトアビジン‐被覆チューブおよびマイクロウェル・プレートがロッシュ・モレ
キュール・バイオケミカル社から入手できる。
【0032】
ビオチン/ストレプトアビジンの代わりに異なる親和性結合のパートナーを使
ってもよく、これにはたとえば抗原/ハプテンと抗体、酵素と基質などがある。
この点についても商業的に入手可能な一連の製品が存在し、たとえばロッシュ・
モレキュール・バイオケミカル社から抗ジゴキシゲニン抗体を担持する磁性粒子
、抗フルオレセイン抗体、抗ビオチン抗体が出ている。核酸分子はまた支持体に
担持された特異的なDNA結合プローブにより認識されるヌクレオチド配列(標
的部位)を取り込んでもよい。たとえばlacオペロンに結合するlacリプレッサー
Lac Iである。
ってもよく、これにはたとえば抗原/ハプテンと抗体、酵素と基質などがある。
この点についても商業的に入手可能な一連の製品が存在し、たとえばロッシュ・
モレキュール・バイオケミカル社から抗ジゴキシゲニン抗体を担持する磁性粒子
、抗フルオレセイン抗体、抗ビオチン抗体が出ている。核酸分子はまた支持体に
担持された特異的なDNA結合プローブにより認識されるヌクレオチド配列(標
的部位)を取り込んでもよい。たとえばlacオペロンに結合するlacリプレッサー
Lac Iである。
【0033】
特異ヌクレオチドをプライマーとして取り込むことは本発明の好ましい態様で
ある。上記のようにこれは特異ヌクレオチドを取り込み、固定化される核酸分子
を調製するためのすぐに使える手法を提供する。すなわち核酸分子は鎖伸長反応
においてプライマーを伸長することにより形成され、特異ヌクレオチドはプライ
マーに取り込まれて提供される。これは特異ヌクレオチド(NTP)をプライマ
ー配列に含めること、つまり合成DNAプライマーにおいて1つ以上の限定した
位置で通常のヌクレオチドを特異ヌクレオチドに置き換えることを必要とするだ
けである。そのような操作は本発明の多くの利用の基盤を形成する。
ある。上記のようにこれは特異ヌクレオチドを取り込み、固定化される核酸分子
を調製するためのすぐに使える手法を提供する。すなわち核酸分子は鎖伸長反応
においてプライマーを伸長することにより形成され、特異ヌクレオチドはプライ
マーに取り込まれて提供される。これは特異ヌクレオチド(NTP)をプライマ
ー配列に含めること、つまり合成DNAプライマーにおいて1つ以上の限定した
位置で通常のヌクレオチドを特異ヌクレオチドに置き換えることを必要とするだ
けである。そのような操作は本発明の多くの利用の基盤を形成する。
【0034】
プライマー伸長反応は、これがDNAまたはRNAの合成であっても、たとえば、単
純な線形の伸長反応といった、当業界において知られているこのような反応のい
ずれかであってもよい。したがって、DNA鋳型からのDNA合成のみならず、RNA鋳
型からのDNA合成(逆転写)、DNA鋳型からのRNA合成などもカバーされている。
プライマー伸長原理を基礎としたインビトロ増幅反応、指数関数的か否かを問わ
ず、たとえば、PCRおよびその変法なども含まれる。プライマー伸長反応は、今
日の用法において、多くの分子生物学的手順の基盤を形成する。したがって、核
酸分子は、PCR産物、配列決定の産物、cDNA合成産物、または、鋳型生成産物な
どであってもよい。
純な線形の伸長反応といった、当業界において知られているこのような反応のい
ずれかであってもよい。したがって、DNA鋳型からのDNA合成のみならず、RNA鋳
型からのDNA合成(逆転写)、DNA鋳型からのRNA合成などもカバーされている。
プライマー伸長原理を基礎としたインビトロ増幅反応、指数関数的か否かを問わ
ず、たとえば、PCRおよびその変法なども含まれる。プライマー伸長反応は、今
日の用法において、多くの分子生物学的手順の基盤を形成する。したがって、核
酸分子は、PCR産物、配列決定の産物、cDNA合成産物、または、鋳型生成産物な
どであってもよい。
【0035】
便宜上、固形支持体に固定化するための手段を提供するリンカー配列(例:プ
ライマー)を用いてもよい。このような手段は、固形支持体上に連結され、対応
する結合パートナーに結合し得るもので、たとえば、ビオチンなどの親和性結合
のパートナーであってもよく、あるいは、固形支持体上のカルボキシ基またはCN
Br活性化ヒドロキシ基と相互作用できるもので、たとえばアミノ基または末端
ヌクレオシドなどといった、化学的連結反応を行い得る官能基であってもよい。
ライマー)を用いてもよい。このような手段は、固形支持体上に連結され、対応
する結合パートナーに結合し得るもので、たとえば、ビオチンなどの親和性結合
のパートナーであってもよく、あるいは、固形支持体上のカルボキシ基またはCN
Br活性化ヒドロキシ基と相互作用できるもので、たとえばアミノ基または末端
ヌクレオシドなどといった、化学的連結反応を行い得る官能基であってもよい。
【0036】
特異なヌクレオチドを組み込んでいるビオチニル化ポリヌクレオチドまたはオ
リゴヌクレオチドは、本発明の特に好ましい面を形成するが、本発明のこの面に
は、固定化するための何らかの手段を付与された特異なヌクレオチドを組み込ん
でいるポリ-またはオリゴヌクレオチドも含まれる。 本発明のPCR(または類似のもの)の態様では、PCR反応を、固形支持体上にプ
ライマーを固定化する前または後に実行してもよい。すなわち、PCRプライマー
は、単に固定化のための手段を提供するというより、むしろ、固形支持体にすで
に結合されたまま用いられてもよい。
リゴヌクレオチドは、本発明の特に好ましい面を形成するが、本発明のこの面に
は、固定化するための何らかの手段を付与された特異なヌクレオチドを組み込ん
でいるポリ-またはオリゴヌクレオチドも含まれる。 本発明のPCR(または類似のもの)の態様では、PCR反応を、固形支持体上にプ
ライマーを固定化する前または後に実行してもよい。すなわち、PCRプライマー
は、単に固定化のための手段を提供するというより、むしろ、固形支持体にすで
に結合されたまま用いられてもよい。
【0037】
したがって、特異なヌクレオチドを組み込んでいる固定化されたポリ-または
オリゴヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。このような固定化ポリ-また
はオリゴヌクレオチドは、好ましくは、末端への結合を介して、磁性ビーズに結
合されていることが好ましく、また、5'末端で結合されていることが好ましい。 実施例の方法により、本発明の利点を利用する典型的なPCR反応が記載される
であろう。
オリゴヌクレオチドも、本発明の範囲に含まれる。このような固定化ポリ-また
はオリゴヌクレオチドは、好ましくは、末端への結合を介して、磁性ビーズに結
合されていることが好ましく、また、5'末端で結合されていることが好ましい。 実施例の方法により、本発明の利点を利用する典型的なPCR反応が記載される
であろう。
【0038】
1または複数の位置(例:ビオチン−GTAATACGACTCACTAUAGGGC)でdTMPに代わ
ってdUMPを有するビオチニル化合成オリゴヌクレオチドをPCRに使用することが
でき、また、オリゴヌクレオチドを含有するdTMPと同じ方法で、dsDNA産物に組
み込むことができる。PCRおよび固形支持体への結合の後で内部dUMP部位は、UDG
活性の標的となる。さらに、非塩基性部位(もはや塩基でない部位)は高温また
は高いpHにより切断することができ、固形支持体からPCR産物が放出される。代
わりに、ビオチニル化されていない相補的鎖が、熱変性によって最初に放出され
、固形支持体に固定化されたビオチニル化鎖は残される。その後、一本鎖DNAをU
DGを用いて切断し、それを放出させ、両方の鎖を別々に回収して、精製してもよ
い。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖がハイブリダイゼーションのプロー
ブに必要である場合またはcDNAサブトラクションライブラリーの調製に必要であ
る場合に有用であろう。
ってdUMPを有するビオチニル化合成オリゴヌクレオチドをPCRに使用することが
でき、また、オリゴヌクレオチドを含有するdTMPと同じ方法で、dsDNA産物に組
み込むことができる。PCRおよび固形支持体への結合の後で内部dUMP部位は、UDG
活性の標的となる。さらに、非塩基性部位(もはや塩基でない部位)は高温また
は高いpHにより切断することができ、固形支持体からPCR産物が放出される。代
わりに、ビオチニル化されていない相補的鎖が、熱変性によって最初に放出され
、固形支持体に固定化されたビオチニル化鎖は残される。その後、一本鎖DNAをU
DGを用いて切断し、それを放出させ、両方の鎖を別々に回収して、精製してもよ
い。これは、センス鎖およびアンチセンス鎖がハイブリダイゼーションのプロー
ブに必要である場合またはcDNAサブトラクションライブラリーの調製に必要であ
る場合に有用であろう。
【0039】
他の特異なヌクレオチド/切断系、および/または、たとえば、シークェンシ
ングプライマー−系反応などの他のプライマー伸長反応を利用して、同様の手順
を行ってもよい。 本発明の別の重要な用途は、cDNAの調製におけるものである。所望のmRNAに結
合できるオリゴヌクレオチド捕獲プローブを使用することにより、cDNA合成のた
めのmRNAを単離する方法は、今や確立されている。さらに、結合した捕獲プロー
ブを、逆転写酵素(例:このような固相を基礎としたcDNA合成のアプローチが記
載されているDynal ASのEP-A-0444119を参照)を使用して、後続のcDNA合成反応
におけるプライマーとして使用してもよい。このような捕獲プローブ/プライマ
ーは、本発明の”リンカー配列”を構成することができる。
ングプライマー−系反応などの他のプライマー伸長反応を利用して、同様の手順
を行ってもよい。 本発明の別の重要な用途は、cDNAの調製におけるものである。所望のmRNAに結
合できるオリゴヌクレオチド捕獲プローブを使用することにより、cDNA合成のた
めのmRNAを単離する方法は、今や確立されている。さらに、結合した捕獲プロー
ブを、逆転写酵素(例:このような固相を基礎としたcDNA合成のアプローチが記
載されているDynal ASのEP-A-0444119を参照)を使用して、後続のcDNA合成反応
におけるプライマーとして使用してもよい。このような捕獲プローブ/プライマ
ーは、本発明の”リンカー配列”を構成することができる。
【0040】
全mRNAを単離するには、常套的には、オリゴdT捕獲プローブ/プライマーを、
すべてのmRNA上に存在するポリAテイルに結合させるために使用してもよい。こ
のようなオリゴdTは、たとえばUなどの1以上の特異なヌクレオチドを組み込むこ
とにより、本発明の使用に適応されることができる。好適には、ポリまたはオリ
ゴdUを用いてもよい。これは、調製を簡単なものにするという利点がある。
すべてのmRNA上に存在するポリAテイルに結合させるために使用してもよい。こ
のようなオリゴdTは、たとえばUなどの1以上の特異なヌクレオチドを組み込むこ
とにより、本発明の使用に適応されることができる。好適には、ポリまたはオリ
ゴdUを用いてもよい。これは、調製を簡単なものにするという利点がある。
【0041】
オリゴ(dU)塩基の対形成は、mRNAのポリ(A)テイルに対するオリゴ(dT)の
それよりも強力であり、mRNAの捕獲を改良するであろうから、その用途に対して
著しい利点をもたらす点に留意すべきである。 したがって、本発明のさらなる好適な面は、固形支持体に対し、固定化するた
めの手段、好ましくはビオチンが与えられた、あるいは、固形支持体、好ましく
は磁性ビーズに結合させたオリゴdUまたはポリdUを提供することである。
それよりも強力であり、mRNAの捕獲を改良するであろうから、その用途に対して
著しい利点をもたらす点に留意すべきである。 したがって、本発明のさらなる好適な面は、固形支持体に対し、固定化するた
めの手段、好ましくはビオチンが与えられた、あるいは、固形支持体、好ましく
は磁性ビーズに結合させたオリゴdUまたはポリdUを提供することである。
【0042】
したがって、固形支持体からのcDNA産物の除去は、本発明の好ましい態様を表
わす。 オリゴ(dT)を担持している固形支持体上に固定化されているmRNAの鋳型は、cD
NA中に複製され得る。この逆転写反応の間、生産されたcDNAは、オリゴ(dT)プラ
イマーを介して固形支持体に共有結合することとなる。それゆえ、cDNAの切り離
しは、現行の方法を用いたのでは難しい。dUMPをオリゴ(dT)(例:5'TTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTU)に組み込むことにより、UDG活性の標的となる部位が形成され
る。続いて、高温または高いpHによる非塩基性部位の切断により、固形支持体か
らcDNAが分離される。代わりに、多数の標的部位を導入することもできる(例:
5'UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU)。逆転写の後、UDG切断により結合したcDNA産物を
放出させる前に、たとえばRNase HなどのRNase消化により、または、高いpHなど
の他の任意の手段によりRNA鎖を除去することは、好都合であり、有効であろう
。
わす。 オリゴ(dT)を担持している固形支持体上に固定化されているmRNAの鋳型は、cD
NA中に複製され得る。この逆転写反応の間、生産されたcDNAは、オリゴ(dT)プラ
イマーを介して固形支持体に共有結合することとなる。それゆえ、cDNAの切り離
しは、現行の方法を用いたのでは難しい。dUMPをオリゴ(dT)(例:5'TTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTTTU)に組み込むことにより、UDG活性の標的となる部位が形成され
る。続いて、高温または高いpHによる非塩基性部位の切断により、固形支持体か
らcDNAが分離される。代わりに、多数の標的部位を導入することもできる(例:
5'UUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUUU)。逆転写の後、UDG切断により結合したcDNA産物を
放出させる前に、たとえばRNase HなどのRNase消化により、または、高いpHなど
の他の任意の手段によりRNA鎖を除去することは、好都合であり、有効であろう
。
【0043】
プライマー伸長を基礎とする方法に加え、本発明の方法は、リガーゼ連鎖反応
(LCR)およびQβレプリカーゼ系(WO87/06240)などのような、他のインビトロ
増幅方法と結合させてもよい。したがって、核酸分子は、たとえば、連結(liga
tion)などの他の方法によって形成されてもよい。特異なヌクレオチドは、LCR
反応で連結される1以上のオリゴヌクレオチド中に含めることができる。したが
って、LCRオリゴヌクレオチドは、本発明のリンカー配列として扱われてもよい
。
(LCR)およびQβレプリカーゼ系(WO87/06240)などのような、他のインビトロ
増幅方法と結合させてもよい。したがって、核酸分子は、たとえば、連結(liga
tion)などの他の方法によって形成されてもよい。特異なヌクレオチドは、LCR
反応で連結される1以上のオリゴヌクレオチド中に含めることができる。したが
って、LCRオリゴヌクレオチドは、本発明のリンカー配列として扱われてもよい
。
【0044】
本発明の上記態様において、核酸分子は、主に、DNA分子またはDNA-RNA分子で
あってもよい。しかしながら、他の構成体の形態、具体的には、一端を固定化す
るための手段が与えられ、他端では、たとえば、さらなるDNA配列、RNA配列、RN
A-DNA配列または二本鎖DNAに連結させている”リンカー配列”をとることも可能
であることが理解されるであろう。したがって、単に”核酸含有”核酸分子の様
々な形態が可能である。このような核酸分子は、当業界でよく知られた技術に従
って、任意の従来からある方法、または便利な方法で調製されるであろう。たと
えば、RNA-DNA構成体は、オリゴヌクレオチド合成機を用いて容易に合成される
であろう。あるいは、RNAおよびDNAは、RNAリガーゼを用いて連結してもよい(R
NAリガーゼは、DNAをDNAに、RNAをRNAにも連結させるであろう)。個々のdNTPま
たはrNTPは、たとえば、T7 DNAポリメラーゼといったDNAポリメラーゼの突然変
異体などの好適なポリメラーゼ酵素を用いて、酵素的にヌクレオチド鎖に導入す
ることができる(SausaおよびPadilla(1995) EMBO J. 14, 4609-4621)。
あってもよい。しかしながら、他の構成体の形態、具体的には、一端を固定化す
るための手段が与えられ、他端では、たとえば、さらなるDNA配列、RNA配列、RN
A-DNA配列または二本鎖DNAに連結させている”リンカー配列”をとることも可能
であることが理解されるであろう。したがって、単に”核酸含有”核酸分子の様
々な形態が可能である。このような核酸分子は、当業界でよく知られた技術に従
って、任意の従来からある方法、または便利な方法で調製されるであろう。たと
えば、RNA-DNA構成体は、オリゴヌクレオチド合成機を用いて容易に合成される
であろう。あるいは、RNAおよびDNAは、RNAリガーゼを用いて連結してもよい(R
NAリガーゼは、DNAをDNAに、RNAをRNAにも連結させるであろう)。個々のdNTPま
たはrNTPは、たとえば、T7 DNAポリメラーゼといったDNAポリメラーゼの突然変
異体などの好適なポリメラーゼ酵素を用いて、酵素的にヌクレオチド鎖に導入す
ることができる(SausaおよびPadilla(1995) EMBO J. 14, 4609-4621)。
【0045】
さらに、上述したように、他の構成体または核酸分子のキメラ体も可能である
。 したがって、核酸分子は、好適には、タンパク質(またはペプチドまたはポリ
ペプチド)に連結するリンカー配列を含むことができる。このようなタンパク質
は、たとえば、抗体またはその断片(一本鎖抗体のような、抗体の誘導体および
合成抗体を含む)、酵素または受容体タンパク質あるいはその他の結合タンパク
質またはそれらの結合領域もしくはその断片(たとえば、ストレプトアビジン、
プロテインA、Gタンパク質、プロテインL、またはその断片、あるいは、実際に
知られている合成もしくは修飾された(たとえば、遺伝的に修飾された)抗体、
レクチンなどの親和性結合タンパク質)であってもよい。代わりに、リンカー配
列を、酵素基質、レセプターリガンド、抗原/ハプテン、または、その断片など
に連結させていてもよい。したがって、好適には、キメラ核酸分子の「第二」の
成分は、親和性結合基、すなわち、親和性結合パートナーのペアのうちの一方で
ある。
。 したがって、核酸分子は、好適には、タンパク質(またはペプチドまたはポリ
ペプチド)に連結するリンカー配列を含むことができる。このようなタンパク質
は、たとえば、抗体またはその断片(一本鎖抗体のような、抗体の誘導体および
合成抗体を含む)、酵素または受容体タンパク質あるいはその他の結合タンパク
質またはそれらの結合領域もしくはその断片(たとえば、ストレプトアビジン、
プロテインA、Gタンパク質、プロテインL、またはその断片、あるいは、実際に
知られている合成もしくは修飾された(たとえば、遺伝的に修飾された)抗体、
レクチンなどの親和性結合タンパク質)であってもよい。代わりに、リンカー配
列を、酵素基質、レセプターリガンド、抗原/ハプテン、または、その断片など
に連結させていてもよい。したがって、好適には、キメラ核酸分子の「第二」の
成分は、親和性結合基、すなわち、親和性結合パートナーのペアのうちの一方で
ある。
【0046】
このようなキメラ核酸分子には、具体的には、たとえば細胞またはタンパク質
または他の分子の分離および精製の手順あるいはアッセイなどにおいて、親和性
結合を基礎とする任意の固相工程または手順において有用性がある。 したがって、本発明のさらなる面は、固形支持体に結合させ、かつ、続いて、
そこから切り離すための構成体を調製する方法であって、該方法は、該構成体に
、選択的切断を可能とする特異なヌクレオチドを所定の部位に含むヌクレオチド
配列を組み込む工程を含むことを特徴としている。
または他の分子の分離および精製の手順あるいはアッセイなどにおいて、親和性
結合を基礎とする任意の固相工程または手順において有用性がある。 したがって、本発明のさらなる面は、固形支持体に結合させ、かつ、続いて、
そこから切り離すための構成体を調製する方法であって、該方法は、該構成体に
、選択的切断を可能とする特異なヌクレオチドを所定の部位に含むヌクレオチド
配列を組み込む工程を含むことを特徴としている。
【0047】
別な面においては、本発明はまた、官能基、好ましくは、親和性結合の基また
はレポーター基と連結されており、所定部位での選択的切断を可能とする特異な
ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカー配列を含むキメラ分子(または構成体
)を提供するものである。 上述したように、好適には、このようなキメラ分子中のリンカー配列は、さら
に固定化される(すなわち、固形支持体に結合される)か、あるいは、固形支持
体に固定化するための手段が与えられる。
はレポーター基と連結されており、所定部位での選択的切断を可能とする特異な
ヌクレオチドを含むヌクレオチドリンカー配列を含むキメラ分子(または構成体
)を提供するものである。 上述したように、好適には、このようなキメラ分子中のリンカー配列は、さら
に固定化される(すなわち、固形支持体に結合される)か、あるいは、固形支持
体に固定化するための手段が与えられる。
【0048】
官能基は、たとえば、アッセイまたは分離手順で有用な結合活性、あるいは検
出可能なもしくはシグナル付与活性などの特性を有するいずれかの基であっても
よい。好適には、上述したように、官能基は親和性結合の基である。このような
親和性結合の基は、上述したように、親和性結合のタンパク質、またはその誘導
体であってもよい。あるいはたとえば、ハプテン/抗原またはビオチンまたは任
意の有機分子などの、親和性結合の特性を示す任意のリガンドであってもよい。
実際には、親和性結合をする基の新しい世代がどれも開発されている。たとえば
、合成のまたはキメラ抗体または他の抗体誘導体および抗体擬似物(たとえば、
一本鎖抗体またはそれらの誘導体)またはランダムにライブラリーで発生するま
たはディスプレーで発生する任意の結合分子である。代わりに、レポーター基で
あってもよい。これは、本明細書では、検出可能なシグナルを提供し得る、また
は、シグナル発生反応に参加できる任意の基を含むように定義される。したがっ
て、基には、たとえば、酵素基質、あるいは、マーカーまたはラベル、具体的に
は放射性ラベルを含んでも良い。
出可能なもしくはシグナル付与活性などの特性を有するいずれかの基であっても
よい。好適には、上述したように、官能基は親和性結合の基である。このような
親和性結合の基は、上述したように、親和性結合のタンパク質、またはその誘導
体であってもよい。あるいはたとえば、ハプテン/抗原またはビオチンまたは任
意の有機分子などの、親和性結合の特性を示す任意のリガンドであってもよい。
実際には、親和性結合をする基の新しい世代がどれも開発されている。たとえば
、合成のまたはキメラ抗体または他の抗体誘導体および抗体擬似物(たとえば、
一本鎖抗体またはそれらの誘導体)またはランダムにライブラリーで発生するま
たはディスプレーで発生する任意の結合分子である。代わりに、レポーター基で
あってもよい。これは、本明細書では、検出可能なシグナルを提供し得る、また
は、シグナル発生反応に参加できる任意の基を含むように定義される。したがっ
て、基には、たとえば、酵素基質、あるいは、マーカーまたはラベル、具体的に
は放射性ラベルを含んでも良い。
【0049】
本発明は、たとえば、親和性結合の基がそれ自体別に、たとえば、ラベルのよ
うなレポーター基を与えられる構成体を含んでも良い。これは、たとえば、放射
性ラベルまたは他の検出可能なラベル、具体的には、着色された、色素沈着され
た、発色体の、蛍光性の、または、化学ルミネセンスのラベルまたは酵素マーカ
ーなどの、当該分野で知られている、あるいは、文献に記載されているラベルの
いずれかであってもよい。
うなレポーター基を与えられる構成体を含んでも良い。これは、たとえば、放射
性ラベルまたは他の検出可能なラベル、具体的には、着色された、色素沈着され
た、発色体の、蛍光性の、または、化学ルミネセンスのラベルまたは酵素マーカ
ーなどの、当該分野で知られている、あるいは、文献に記載されているラベルの
いずれかであってもよい。
【0050】
典型的な官能基は、必要に応じて標識化されていてもよい抗体またはストレプ
トアビジンなどの結合タンパク質を包含するだろう;たとえば、西洋ワサビペル
オキシダーゼ(HRP)またはアルカリフォスファターゼ(AP)などの酵素;たと
えばペプチドなどの酵素基質、たとえばHIVタンパク分解酵素といった研究中の
酵素の基質またはチロシンキナーゼのリン酸化部位などであってもよい、または
実際に、酵素アッセイのための任意の基質(例:テストステロンまたは他の生体
分子);炭水化物;脂質;ハプテン(例:小さな有機分子);およびラベルも含
まれるであろう。
トアビジンなどの結合タンパク質を包含するだろう;たとえば、西洋ワサビペル
オキシダーゼ(HRP)またはアルカリフォスファターゼ(AP)などの酵素;たと
えばペプチドなどの酵素基質、たとえばHIVタンパク分解酵素といった研究中の
酵素の基質またはチロシンキナーゼのリン酸化部位などであってもよい、または
実際に、酵素アッセイのための任意の基質(例:テストステロンまたは他の生体
分子);炭水化物;脂質;ハプテン(例:小さな有機分子);およびラベルも含
まれるであろう。
【0051】
このような構成体では、リンカー配列は、オリゴdUまたはポリdU配列であるこ
とが好ましく、さらには、固定化の手段として、ビオチン基を担持していること
が好ましい。 好ましい官能基は、抗体またはその断片または誘導体、あるいはハプテンであ
る。
とが好ましく、さらには、固定化の手段として、ビオチン基を担持していること
が好ましい。 好ましい官能基は、抗体またはその断片または誘導体、あるいはハプテンであ
る。
【0052】
ヌクレオチド配列を他の分子に連結させるための方法は、当該分野ではよく知
られており、このような構成体は、たとえば、Hermanson(前出)およびAslamと
Dent(前出)に記載されている方法にしたがって調製されていてもよい。オリゴ
ヌクレオチド(修飾されていてもよい)を他の分子に連結するための手順および
方法の一般的な手引きは、また、R. Helmuth(1990)のPCRプロトコル:手法およ
び応用の手引き、第15章, Academic Press, Inc.およびY.M. Dennis Lo.ら、(19
90) PCRプロトコル:手法および応用の手引き、第14章, Academic Press, Inc.
に見られるであろう。
られており、このような構成体は、たとえば、Hermanson(前出)およびAslamと
Dent(前出)に記載されている方法にしたがって調製されていてもよい。オリゴ
ヌクレオチド(修飾されていてもよい)を他の分子に連結するための手順および
方法の一般的な手引きは、また、R. Helmuth(1990)のPCRプロトコル:手法およ
び応用の手引き、第15章, Academic Press, Inc.およびY.M. Dennis Lo.ら、(19
90) PCRプロトコル:手法および応用の手引き、第14章, Academic Press, Inc.
に見られるであろう。
【0053】
”修飾”オリゴヌクレオチドは、合成中に、たとえば、レポーター基、具体的
には、TAMRA、ローダミン、または任意の他の公知の蛍光ラベルなどのラベルと
いった追加する化学的基をオリゴヌクレオチドに、付加することにより調製でき
ることは、良く知られている。このような化学的基は、たとえば、抗体と結合す
るための標的を提供するジゴキシゲニン、エストラジオール、または、ジニトロ
フェノール(DNP)のようなハプテン、ビオチン(ストレプトアビジン/アビジ
ンと結合している)、または、たとえばフルオレセインなどのように抗体と結合
するためレポーター基であるとともに抗原/ハプテンでもある実体など、上述し
たような親和性結合のパートナーであってもよい。多くのこのような修飾化オリ
ゴヌクレオチドは、たとえば、Oswell research Products Ltd., (Southampton
英国)より商業的に入手できる。先に説明したように、本発明のキメラ分子では
、単一のオリゴヌクレオチドは、具体的に、ビオチンなどの固定する部分(すな
わち、固定化のための手段)および親和性結合の基(例:ハプテン)、またはレ
ポーター基(例:ラベル)などの1以上の付加的な「化学的基」(または「修飾
ユニット」)を担持していてもよい。たとえば、本発明のキメラ分子は、5'末端
でビオチン分子を、3'末端でアミノ基を担持しているオリゴヌクレオチドの形態
をとっていてもよく、該アミノ基は、アミノ反応性の分子をオリゴヌクレオチド
に結びつけるための手段を提供することができるので、たとえばラベル化のため
に用いられていてもよい。あるいは、その3'末端で、オリゴヌクレオチドは、ジ
ゴキシゲニンのようなハプテンを担持していてもよい。ラベル化のため、ジゴキ
シゲニンは、抗ジゴキシゲニン抗体を介して西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP
)のような酵素に連結されていてもよい。
には、TAMRA、ローダミン、または任意の他の公知の蛍光ラベルなどのラベルと
いった追加する化学的基をオリゴヌクレオチドに、付加することにより調製でき
ることは、良く知られている。このような化学的基は、たとえば、抗体と結合す
るための標的を提供するジゴキシゲニン、エストラジオール、または、ジニトロ
フェノール(DNP)のようなハプテン、ビオチン(ストレプトアビジン/アビジ
ンと結合している)、または、たとえばフルオレセインなどのように抗体と結合
するためレポーター基であるとともに抗原/ハプテンでもある実体など、上述し
たような親和性結合のパートナーであってもよい。多くのこのような修飾化オリ
ゴヌクレオチドは、たとえば、Oswell research Products Ltd., (Southampton
英国)より商業的に入手できる。先に説明したように、本発明のキメラ分子では
、単一のオリゴヌクレオチドは、具体的に、ビオチンなどの固定する部分(すな
わち、固定化のための手段)および親和性結合の基(例:ハプテン)、またはレ
ポーター基(例:ラベル)などの1以上の付加的な「化学的基」(または「修飾
ユニット」)を担持していてもよい。たとえば、本発明のキメラ分子は、5'末端
でビオチン分子を、3'末端でアミノ基を担持しているオリゴヌクレオチドの形態
をとっていてもよく、該アミノ基は、アミノ反応性の分子をオリゴヌクレオチド
に結びつけるための手段を提供することができるので、たとえばラベル化のため
に用いられていてもよい。あるいは、その3'末端で、オリゴヌクレオチドは、ジ
ゴキシゲニンのようなハプテンを担持していてもよい。ラベル化のため、ジゴキ
シゲニンは、抗ジゴキシゲニン抗体を介して西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP
)のような酵素に連結されていてもよい。
【0054】
構成体は、標準的な公知技術を用いて分離手順において利用することができる
。したがって、たとえば、抗体官能基の場合、構成体は、分離を望む、たとえば
、細胞またはタンパク質などの任意の標的実体に結合させるために用いられても
よい。標的実体に結合する前か、後のいずれかにおいて、構成体の固定化は、標
的実体の分離を可能とし、その後、本発明によれば、標的実体は、リンカー配列
の切断によって切り離されるだろう。
。したがって、たとえば、抗体官能基の場合、構成体は、分離を望む、たとえば
、細胞またはタンパク質などの任意の標的実体に結合させるために用いられても
よい。標的実体に結合する前か、後のいずれかにおいて、構成体の固定化は、標
的実体の分離を可能とし、その後、本発明によれば、標的実体は、リンカー配列
の切断によって切り離されるだろう。
【0055】
たとえば、タンパク質精製の手順で、問題のタンパク質に対する親和性結合の
基(すなわち、リガンド)を、本発明のオリゴヌクレオチド“リンカー”配列を
介して固形支持体に連結することができる。この構成体中では、本発明のキメラ
分子は、所望する標的のタンパク質用に、固定化手段、切断可能な“リンカー配
列”、および親和性捕獲リガンドを含んでいる。
基(すなわち、リガンド)を、本発明のオリゴヌクレオチド“リンカー”配列を
介して固形支持体に連結することができる。この構成体中では、本発明のキメラ
分子は、所望する標的のタンパク質用に、固定化手段、切断可能な“リンカー配
列”、および親和性捕獲リガンドを含んでいる。
【0056】
典型的な親和性捕獲リガンドは、チロキシン結合タンパク質を精製するための
L-チロキシン(PenskyおよびMarshall(1969)Arch. Biochem. Biophys. 135:304
)、葉酸エステル(or塩)結合タンパク質を捕獲するための葉酸(Salter ら.,
(1972) FEBS Lett. 20: 302)、および、リポタンパク質を捕獲するためのコレ
ステリルヘミスクシネート(HDLおよびLDL)(Wichman(1979) Biochem. J. 181:
691)を含んでいる。それぞれの場合、リガンドは、支持体から切断され、タン
パク質および結合したリガンドの回収が可能となる。リガンドはまた、L-リジン
のような小分子、プロテインAのようなタンパク質、D(+)メリビオースのような
炭水化物またはコンカナバリンAのようなレクチンであり得るであろう。全酵素
の3分の1がヌクレオチド補酵素を必要とするために、ヌクレオチドリガンドは、
特に、酵素精製のためには好適であり、したがって精製のための手段を提供する
(Barkerら、(1972) J. Biol. Chem. 247: 7235)。リガンド−タンパク質相互
作用は、立体障害を軽減するために、切断可能なオリゴヌクレオチドリンカー配
列およびリガンドとの間のスペーサーアームの使用することにより増強されるで
あろう。たとえば、ヌクレオチドリガンドは、しばしば、8、9または11原子
のスペーサーアームと、アデノシン5'一リン酸に対し、N-6のような塩基を介し
て、連結により固定化されている(Catalogue No. A3019, Sigma-Aldrich Compa
ny)(Chaffotteら、(1977) Eur. Biochem. 78: 309)。
L-チロキシン(PenskyおよびMarshall(1969)Arch. Biochem. Biophys. 135:304
)、葉酸エステル(or塩)結合タンパク質を捕獲するための葉酸(Salter ら.,
(1972) FEBS Lett. 20: 302)、および、リポタンパク質を捕獲するためのコレ
ステリルヘミスクシネート(HDLおよびLDL)(Wichman(1979) Biochem. J. 181:
691)を含んでいる。それぞれの場合、リガンドは、支持体から切断され、タン
パク質および結合したリガンドの回収が可能となる。リガンドはまた、L-リジン
のような小分子、プロテインAのようなタンパク質、D(+)メリビオースのような
炭水化物またはコンカナバリンAのようなレクチンであり得るであろう。全酵素
の3分の1がヌクレオチド補酵素を必要とするために、ヌクレオチドリガンドは、
特に、酵素精製のためには好適であり、したがって精製のための手段を提供する
(Barkerら、(1972) J. Biol. Chem. 247: 7235)。リガンド−タンパク質相互
作用は、立体障害を軽減するために、切断可能なオリゴヌクレオチドリンカー配
列およびリガンドとの間のスペーサーアームの使用することにより増強されるで
あろう。たとえば、ヌクレオチドリガンドは、しばしば、8、9または11原子
のスペーサーアームと、アデノシン5'一リン酸に対し、N-6のような塩基を介し
て、連結により固定化されている(Catalogue No. A3019, Sigma-Aldrich Compa
ny)(Chaffotteら、(1977) Eur. Biochem. 78: 309)。
【0057】
アッセイで、同様のまたは類似の原理、たとえば、ELISAアッセイ、または、
当該分野で知られている別のアッセイ原理を用いてもよい。 抗体−酵素複合体を、固形支持体から切断するために本発明が可能とする能力
は、ELISA アッセイに有用性を見い出している。通常、ELISAのようなアッセイ
では、一つのリガンド(すなわち、アッセイ標的)だけを検出することができ、
ウェルにつき定量され得る。しかしながら、改良により、いくつかのリガンドを
多重的アプローチにより検出されることが可能となるであろう。たとえば、2以
上のリガンド(この場合は、アッセイ標的)は、各リガンドに特異的な抗体を用
いて同時にELISAプレートのウェルで捕獲されるであろう。さらに、第一のリガ
ンドに特異的な二次抗体が加えられてもよく、それにより酵素あるいはポリ(dU
)のような本発明に基づく切断可能なリンカー配列を介する他の検出方法に結び
付けられる。通常のウェルの処理後、酵素を複合体から分離して、切断可能なリ
ンカーを使用することにより洗い流してもよい。これは、第二のリガンドに特異
的な第二の二次抗体をウェルに加えることができ、最初ものに関して、酵素アッ
セイを行わせる。プロセス全体は、数回くり返されてもよく、ELISAアッセイの
多重性を許容する。
当該分野で知られている別のアッセイ原理を用いてもよい。 抗体−酵素複合体を、固形支持体から切断するために本発明が可能とする能力
は、ELISA アッセイに有用性を見い出している。通常、ELISAのようなアッセイ
では、一つのリガンド(すなわち、アッセイ標的)だけを検出することができ、
ウェルにつき定量され得る。しかしながら、改良により、いくつかのリガンドを
多重的アプローチにより検出されることが可能となるであろう。たとえば、2以
上のリガンド(この場合は、アッセイ標的)は、各リガンドに特異的な抗体を用
いて同時にELISAプレートのウェルで捕獲されるであろう。さらに、第一のリガ
ンドに特異的な二次抗体が加えられてもよく、それにより酵素あるいはポリ(dU
)のような本発明に基づく切断可能なリンカー配列を介する他の検出方法に結び
付けられる。通常のウェルの処理後、酵素を複合体から分離して、切断可能なリ
ンカーを使用することにより洗い流してもよい。これは、第二のリガンドに特異
的な第二の二次抗体をウェルに加えることができ、最初ものに関して、酵素アッ
セイを行わせる。プロセス全体は、数回くり返されてもよく、ELISAアッセイの
多重性を許容する。
【0058】
細胞の単離方法において、本発明の可逆的な固定化方法の使用は、好ましく、
有効な面を表している。 すなわち、本発明のこの面は、サンプルから標的細胞を分離するための方法を
提供し、該方法は、従前に定義したようなキメラ分子の手段により、当該標的細
胞を固形支持体に結合させる工程を含み、当該官能基は特に当該細胞に結合する
親和性結合の基であることを特徴としている。この方法で分離される細胞は、当
該ヌクレオチドリンカー配列を切断することにより固形支持体から分離すること
ができる。
有効な面を表している。 すなわち、本発明のこの面は、サンプルから標的細胞を分離するための方法を
提供し、該方法は、従前に定義したようなキメラ分子の手段により、当該標的細
胞を固形支持体に結合させる工程を含み、当該官能基は特に当該細胞に結合する
親和性結合の基であることを特徴としている。この方法で分離される細胞は、当
該ヌクレオチドリンカー配列を切断することにより固形支持体から分離すること
ができる。
【0059】
したがって、さらに詳しくは、本発明のこの面は、
(a) 当該細胞に特異的に結合する親和性結合のパートナーの手段により固形
支持体に当該標的細胞を結合させ、該結合パートナーと該支持体との間の結合は
、所定部位で選択的に切断可能な特異なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を
含有しており、 (b) 支持体に結合された細胞をサンプルから分離し、 (c) 特異なヌクレオチドの部位で、選択的に当該ヌクレオチド配列を切断す
ることにより、当該標的細胞を支持体から放出することを含む。
支持体に当該標的細胞を結合させ、該結合パートナーと該支持体との間の結合は
、所定部位で選択的に切断可能な特異なヌクレオチドを含むヌクレオチド配列を
含有しており、 (b) 支持体に結合された細胞をサンプルから分離し、 (c) 特異なヌクレオチドの部位で、選択的に当該ヌクレオチド配列を切断す
ることにより、当該標的細胞を支持体から放出することを含む。
【0060】
細胞という用語は、本明細書では、すべての原核(古細菌を含む)および真核
細胞、および、ウイルスおよびマイコプラズマのようなその他の生育力のあるあ
るいは膜で覆われた実体、ならびに、オルガネラのような亜細胞性の成分を含む
ように用いられる。代表的な“細胞”は、したがって、すべての種類のほ乳類お
よび非ほ乳動物の細胞、藻類を含む植物細胞、プロトプラスト、菌類、シアノバ
クテリア(藍藻)を含む細菌、マイコプラズマ、原生動物、バクテリオファージ
を含むウイルス、およびオルガネラを含む。
細胞、および、ウイルスおよびマイコプラズマのようなその他の生育力のあるあ
るいは膜で覆われた実体、ならびに、オルガネラのような亜細胞性の成分を含む
ように用いられる。代表的な“細胞”は、したがって、すべての種類のほ乳類お
よび非ほ乳動物の細胞、藻類を含む植物細胞、プロトプラスト、菌類、シアノバ
クテリア(藍藻)を含む細菌、マイコプラズマ、原生動物、バクテリオファージ
を含むウイルス、およびオルガネラを含む。
【0061】
したがって、サンプルは、このような細胞を含む任意の材料であってもよく、
たとえば、食物、類似の製品、医療用および環境用サンプルを含む。それゆえ、
サンプルは、生物的サンプルであってもよく、すべての原核または真核細胞、ウ
イルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、およびオルガ
ネラを含む、任意のウイルス性または細胞性の材料を含んでいてもよい。したが
って、このような生物的材料は、すべての種類のほ乳類および非ほ乳動物細胞、
植物細胞、藍藻を含む藻類、菌類、細菌、原生動物などを含んでもよい。代表的
なサンプルは、したがって、全血および血漿または軟膜などの血液由来の産品、
尿、便、髄液または任意の他の体液、組織、細胞培養物、細胞懸濁物などを含み
、土壌、水などの環境サンプルまたは食物サンプルもまた含む。
たとえば、食物、類似の製品、医療用および環境用サンプルを含む。それゆえ、
サンプルは、生物的サンプルであってもよく、すべての原核または真核細胞、ウ
イルス、バクテリオファージ、マイコプラズマ、プロトプラスト、およびオルガ
ネラを含む、任意のウイルス性または細胞性の材料を含んでいてもよい。したが
って、このような生物的材料は、すべての種類のほ乳類および非ほ乳動物細胞、
植物細胞、藍藻を含む藻類、菌類、細菌、原生動物などを含んでもよい。代表的
なサンプルは、したがって、全血および血漿または軟膜などの血液由来の産品、
尿、便、髄液または任意の他の体液、組織、細胞培養物、細胞懸濁物などを含み
、土壌、水などの環境サンプルまたは食物サンプルもまた含む。
【0062】
サンプルには、他の細胞分離方法により得られる半ば純粋な調製物などの比較
的純粋な、または、部分的に精製した原料もまた含まれてもよい。 DNAグリコシラーゼを用いる酵素的切断を、結合した細胞を放出するために用
いる場合に、ある状況では、グリコシラーゼ作用により生成する非塩基性部位を
切断するのに従来より使用されている、より激しい切断条件(例:高い温度およ
び/またはpH)を避けることは、望ましいであろう。したがって、生きた細胞に
好ましいより生理的な条件下で切断を行うためには、酵素消化された(すなわち
分解された)ヌクレオチドリンカーを破壊するための機械的ストレスと生理的条
件下での酵素的切断との組み合わせを基礎にした細胞分離工程において、DNAグ
リコシダーゼを、用いてもよい。このような機械的ストレスは、外的に、たとえ
ば、撹拌、混合、ピペットで移す、振動などにより提供されるであろう。しかし
、単に、連結された実体物、すなわち、細胞および固形支持体によって、結合に
想定される機械的ストレスで十分であろう。
的純粋な、または、部分的に精製した原料もまた含まれてもよい。 DNAグリコシラーゼを用いる酵素的切断を、結合した細胞を放出するために用
いる場合に、ある状況では、グリコシラーゼ作用により生成する非塩基性部位を
切断するのに従来より使用されている、より激しい切断条件(例:高い温度およ
び/またはpH)を避けることは、望ましいであろう。したがって、生きた細胞に
好ましいより生理的な条件下で切断を行うためには、酵素消化された(すなわち
分解された)ヌクレオチドリンカーを破壊するための機械的ストレスと生理的条
件下での酵素的切断との組み合わせを基礎にした細胞分離工程において、DNAグ
リコシダーゼを、用いてもよい。このような機械的ストレスは、外的に、たとえ
ば、撹拌、混合、ピペットで移す、振動などにより提供されるであろう。しかし
、単に、連結された実体物、すなわち、細胞および固形支持体によって、結合に
想定される機械的ストレスで十分であろう。
【0063】
しかしながら、必要に応じて、別の方法も、DNAグリコシラーゼ作用により生
じる非塩基性部位の切断を促進するために使用することができ、たとえば、非塩
基性部位で切断するエクソヌクレアーゼIIIまたはE. ColiエンドヌクレアーゼIV
などの酵素または化学試薬のような“切断試薬”の使用を含む。これにより、ま
た、穏やかな切断手順を採用することが可能となる。このような切断方法は、さ
らに、後述の実施例で説明される。
じる非塩基性部位の切断を促進するために使用することができ、たとえば、非塩
基性部位で切断するエクソヌクレアーゼIIIまたはE. ColiエンドヌクレアーゼIV
などの酵素または化学試薬のような“切断試薬”の使用を含む。これにより、ま
た、穏やかな切断手順を採用することが可能となる。このような切断方法は、さ
らに、後述の実施例で説明される。
【0064】
たとえば、上述したような、北極のエビといった寒冷環境の生物体由来の酵素
など、細胞の分離および取り扱いに資する低温(例えば4℃)でよく機能し得る
「低温適応の」または「低温耐性の」酵素を使用することは、細胞の分離手順に
は、特に好ましい。 本発明の主な利点は、容易に多重化できることである。さらに詳しくは、本発
明は、1以上の(実際には、多くの)他の種類が存在する場合に、一種類の結合
を選択的に切断する能力を付与しうることである。この能力は、多くの領域で、
価値ある可能性を有している。したがって、異なる特異なヌクレオチドは、異な
る核酸分子、たとえば核酸分子を生み出すのに用いられる、異なるリンカー配列
に組み込まれてもよい。これにより、核酸分子の多様性が生じ、各核酸分子(ま
たは各集団または分子の“種類”など)は特異なヌクレオチド/リンカー配列の
性質の点で異なる。このことは、核酸分子のようなもの(たとえば、リンカー配
列)が、(異なる核酸分子/リンカー配列の存在下で)、特に、関心ある特異な
ヌクレオチドに特異的な適当な切断系(すなわち、グリコシラーゼ酵素)を利用
して、選択的に切断され得ることを意味する。したがって、このことは、(同じ
でも異なっていてもよい)固形支持体に固定化されている、異なる多数の核酸分
子(または分子の異なる“種類”または集団)にも可能性を広げるものである。
このような分子(または“種類”または“集団”)のそれぞれは、たとえば選択
的に分離可能なリンカー配列などの選択的に切断可能な特異なヌクレオチドの存
在によって固形支持体から選択的に分離される。換言すると、“異なる”リンカ
ー配列(特異なヌクレオチドの特質の点で異なっている)は、異なる核酸分子を
固形支持体に繋ぎ留めるまたは連結するために使用できる、異なる“係留”また
は結合の体系の範囲を表す。そして、このことは、このような各リンカー配列が
、他のリンカー配列の存在下、選択的に切断されることを可能とし、それによっ
て、リンカー配列を通して結合している部分(すなわち、核酸分子)を選択的分
離させる。
など、細胞の分離および取り扱いに資する低温(例えば4℃)でよく機能し得る
「低温適応の」または「低温耐性の」酵素を使用することは、細胞の分離手順に
は、特に好ましい。 本発明の主な利点は、容易に多重化できることである。さらに詳しくは、本発
明は、1以上の(実際には、多くの)他の種類が存在する場合に、一種類の結合
を選択的に切断する能力を付与しうることである。この能力は、多くの領域で、
価値ある可能性を有している。したがって、異なる特異なヌクレオチドは、異な
る核酸分子、たとえば核酸分子を生み出すのに用いられる、異なるリンカー配列
に組み込まれてもよい。これにより、核酸分子の多様性が生じ、各核酸分子(ま
たは各集団または分子の“種類”など)は特異なヌクレオチド/リンカー配列の
性質の点で異なる。このことは、核酸分子のようなもの(たとえば、リンカー配
列)が、(異なる核酸分子/リンカー配列の存在下で)、特に、関心ある特異な
ヌクレオチドに特異的な適当な切断系(すなわち、グリコシラーゼ酵素)を利用
して、選択的に切断され得ることを意味する。したがって、このことは、(同じ
でも異なっていてもよい)固形支持体に固定化されている、異なる多数の核酸分
子(または分子の異なる“種類”または集団)にも可能性を広げるものである。
このような分子(または“種類”または“集団”)のそれぞれは、たとえば選択
的に分離可能なリンカー配列などの選択的に切断可能な特異なヌクレオチドの存
在によって固形支持体から選択的に分離される。換言すると、“異なる”リンカ
ー配列(特異なヌクレオチドの特質の点で異なっている)は、異なる核酸分子を
固形支持体に繋ぎ留めるまたは連結するために使用できる、異なる“係留”また
は結合の体系の範囲を表す。そして、このことは、このような各リンカー配列が
、他のリンカー配列の存在下、選択的に切断されることを可能とし、それによっ
て、リンカー配列を通して結合している部分(すなわち、核酸分子)を選択的分
離させる。
【0065】
本発明のこの態様は、したがって、一般的な意味においては、結合している固
形支持体から異なる多様な核酸分子を選択的に分離する方法を提供することが理
解される。特異なヌクレオチドは、それぞれの核酸分子中の所定部位で組み込ま
れ、それぞれの異なる核酸分子は、異なる特異なヌクレオチドを組み込むことを
特徴としている。さらに、該方法は、それぞれの核酸分子を、特異なヌクレオチ
ドの部位で選択的に切断する工程を含んでいる。
形支持体から異なる多様な核酸分子を選択的に分離する方法を提供することが理
解される。特異なヌクレオチドは、それぞれの核酸分子中の所定部位で組み込ま
れ、それぞれの異なる核酸分子は、異なる特異なヌクレオチドを組み込むことを
特徴としている。さらに、該方法は、それぞれの核酸分子を、特異なヌクレオチ
ドの部位で選択的に切断する工程を含んでいる。
【0066】
1以上の多様な核酸分子(すなわち、1以上の異なる種類)は、かくして、選択
に応じて、選択的に分離される。 上述したように、固形支持体は、異なる各核酸分子に対して、同じであっても
異なっていてもよく、このような異なる核酸分子の選択的な切断は、別々に(た
とえば、異なる部分で、または、空間的に分離されて)または連続して起きても
よい。
に応じて、選択的に分離される。 上述したように、固形支持体は、異なる各核酸分子に対して、同じであっても
異なっていてもよく、このような異なる核酸分子の選択的な切断は、別々に(た
とえば、異なる部分で、または、空間的に分離されて)または連続して起きても
よい。
【0067】
上述したように、異なる“核酸分子”は、異なる核酸分子の種類または集団で
あってもよい。本明細書で用いられる“多重(様)”という用語は、2以上とい
う意味である。 同様に、本発明はまた、多数の異なる核酸分子を(上述したように)可逆的に
固定化する方法を提供するものであり、それは異なる特異なヌクレオチドをそれ
ぞれの異なる核酸分子に組み込むことを特徴としている。
あってもよい。本明細書で用いられる“多重(様)”という用語は、2以上とい
う意味である。 同様に、本発明はまた、多数の異なる核酸分子を(上述したように)可逆的に
固定化する方法を提供するものであり、それは異なる特異なヌクレオチドをそれ
ぞれの異なる核酸分子に組み込むことを特徴としている。
【0068】
この方法での多重化は、親和性を基礎とした分離またはアッセイの分野におい
て有用な応用が見い出されている。なぜなら、それは、異なる親和性の部分(す
なわち、異なる親和性結合の基)が結合している標的類を選択的に放出させられ
るからである。したがって、細胞分離の関係においては、たとえば、複数の異な
る種類の細胞を、本発明の切断可能なリンカー配列に結合された、親和性部(ま
たは他の親和性結合の基)を含む構成体を介して固形支持体(例:ビーズ)に結
合させてもよい。各種の抗体(すなわち、各親和性結合の基)は、切断可能な異
なるリンカー配列(たとえば、ポリU、メチルアデニンなど)を有していてもよ
い。かくして、細胞の全集団を、抗体−ビーズ混合物とインキュベートすること
ができ、選択的に切断可能な標識(すなわち、リンカー)を介してビーズに結合
させることができる。さらに、使用者は、次のようにして細胞のある種類(たと
えば、細胞タイプ“A”という)を分離することを選ぶことができる。細胞タイ
プ“A”に結合する抗体が係留されている(係留“1”という)リンカー配列に
特異的なグリコシラーゼを加えることによる。他方、他のリンカー配列(たとえ
ば、係留“2”用)に特異的なグリコシダーゼが加えられるまでは、他のいずれ
の細胞タイプ(たとえば、細胞タイプ“B”)も分離しない。これは、細胞サン
プルが貴重で、わずか限られた数の細胞のみ利用可能な場合には魅力的である。
たとえば、同じ試験管中で、CD4−細胞を、CD8+細胞とともに精製することがで
き、さらに、各細胞集団は、順番に、グリコシダーゼ1、2などを加えることに
よって分離しうる。
て有用な応用が見い出されている。なぜなら、それは、異なる親和性の部分(す
なわち、異なる親和性結合の基)が結合している標的類を選択的に放出させられ
るからである。したがって、細胞分離の関係においては、たとえば、複数の異な
る種類の細胞を、本発明の切断可能なリンカー配列に結合された、親和性部(ま
たは他の親和性結合の基)を含む構成体を介して固形支持体(例:ビーズ)に結
合させてもよい。各種の抗体(すなわち、各親和性結合の基)は、切断可能な異
なるリンカー配列(たとえば、ポリU、メチルアデニンなど)を有していてもよ
い。かくして、細胞の全集団を、抗体−ビーズ混合物とインキュベートすること
ができ、選択的に切断可能な標識(すなわち、リンカー)を介してビーズに結合
させることができる。さらに、使用者は、次のようにして細胞のある種類(たと
えば、細胞タイプ“A”という)を分離することを選ぶことができる。細胞タイ
プ“A”に結合する抗体が係留されている(係留“1”という)リンカー配列に
特異的なグリコシラーゼを加えることによる。他方、他のリンカー配列(たとえ
ば、係留“2”用)に特異的なグリコシダーゼが加えられるまでは、他のいずれ
の細胞タイプ(たとえば、細胞タイプ“B”)も分離しない。これは、細胞サン
プルが貴重で、わずか限られた数の細胞のみ利用可能な場合には魅力的である。
たとえば、同じ試験管中で、CD4−細胞を、CD8+細胞とともに精製することがで
き、さらに、各細胞集団は、順番に、グリコシダーゼ1、2などを加えることに
よって分離しうる。
【0069】
多重化のアプローチのさらなる応用は、PCR生産物の分離または精製の分野に
おいて存在する。したがって、たとえば、特異的なリンカーが、各ビオチニル化
されたPCRプライマーに加えられてもよい。典型的な例として、順行および逆行P
CRプライマーは、各々異なる特異なヌクレオチドを組み込むことができるであろ
う。たとえば、プライマーT3には、Uを組み込んでもよく、また、プライマーT7
にはメチルアデニン(MA)に組み込んでもよい(すなわち、T3UおよびT7MA)。
増殖させ、ストレプトアビジンビーズに結合させ、さらに鎖を分離するために変
性した後、PCR生産物の各鎖を、グリコシラーゼUDGまたはメチルアデニン(MA)
グリコシラーゼを用いて、順に分離することができる。このことは、各鎖を精製
するために別々の精製用試験管を準備する必要性を単純化したものである。
おいて存在する。したがって、たとえば、特異的なリンカーが、各ビオチニル化
されたPCRプライマーに加えられてもよい。典型的な例として、順行および逆行P
CRプライマーは、各々異なる特異なヌクレオチドを組み込むことができるであろ
う。たとえば、プライマーT3には、Uを組み込んでもよく、また、プライマーT7
にはメチルアデニン(MA)に組み込んでもよい(すなわち、T3UおよびT7MA)。
増殖させ、ストレプトアビジンビーズに結合させ、さらに鎖を分離するために変
性した後、PCR生産物の各鎖を、グリコシラーゼUDGまたはメチルアデニン(MA)
グリコシラーゼを用いて、順に分離することができる。このことは、各鎖を精製
するために別々の精製用試験管を準備する必要性を単純化したものである。
【0070】
代わりに、多重RT-PCR反応物は、遺伝子発現レベルを比較するために、同時に
精製され得るであろう。換言すると、発現レベルまたは異なる遺伝子のパターン
は、異なる遺伝子のためのRTプライマーを用いることにより比較することができ
る。該プライマーは、それぞれ、異なる特異なヌクレオチドを有し、このためそ
れぞれの異なるRT産物が相対的に切断されることとなるであろう。このような方
法の典型例として、あるアッセイを想定することができる。たとえば、GAPDHの
ためのアッセイは、U(例:GAPDH-FU)を含む順行(または逆行)ビオチニル化
プライマーを有するであろう。さらに、関心あるmRNAに関するアッセイ、たとえ
ばp53は、ビオチンp53-FMAを有するであろう。そのPCR反応は、蛍光デオキシヌ
クレオチドをGAPDHおよびp53 のPCR産物の両方に取り込むであろう。これらは、
たとえば、ストレプトアビジン−ビーズ(一例としてDynal ASA社製 M-280 ダイ
ナビーズ)などのビオチン結合固形支持体を含む同一の試験管中で両方一緒に精
製され得るであろう。洗浄などをして、組み込まれていないヌクレオチドを除い
た後、GAPDH PCR産物の量は、UDGを添加してビーズから放出された蛍光の量を分
析することにより測定しうるであろう。同様に、p53は、メチルアデニングリコ
シラーゼの添加により測定しうるであろう。
精製され得るであろう。換言すると、発現レベルまたは異なる遺伝子のパターン
は、異なる遺伝子のためのRTプライマーを用いることにより比較することができ
る。該プライマーは、それぞれ、異なる特異なヌクレオチドを有し、このためそ
れぞれの異なるRT産物が相対的に切断されることとなるであろう。このような方
法の典型例として、あるアッセイを想定することができる。たとえば、GAPDHの
ためのアッセイは、U(例:GAPDH-FU)を含む順行(または逆行)ビオチニル化
プライマーを有するであろう。さらに、関心あるmRNAに関するアッセイ、たとえ
ばp53は、ビオチンp53-FMAを有するであろう。そのPCR反応は、蛍光デオキシヌ
クレオチドをGAPDHおよびp53 のPCR産物の両方に取り込むであろう。これらは、
たとえば、ストレプトアビジン−ビーズ(一例としてDynal ASA社製 M-280 ダイ
ナビーズ)などのビオチン結合固形支持体を含む同一の試験管中で両方一緒に精
製され得るであろう。洗浄などをして、組み込まれていないヌクレオチドを除い
た後、GAPDH PCR産物の量は、UDGを添加してビーズから放出された蛍光の量を分
析することにより測定しうるであろう。同様に、p53は、メチルアデニングリコ
シラーゼの添加により測定しうるであろう。
【0071】
この多重化アプローチの制限は、異なるグリコシラーゼの数のみである。10
個のグリコシラーゼ酵素および4つの蛍光ヌクレオチドの場合には、多重化によ
り、同じ試験管のビーズに由来する40個の異なるPCR産物の放出を測定するこ
とが可能になるであろう。 多重化アプローチの別な応用は、配列決定および、特に、多重配列決定反応の
精製におけるものであろう。
個のグリコシラーゼ酵素および4つの蛍光ヌクレオチドの場合には、多重化によ
り、同じ試験管のビーズに由来する40個の異なるPCR産物の放出を測定するこ
とが可能になるであろう。 多重化アプローチの別な応用は、配列決定および、特に、多重配列決定反応の
精製におけるものであろう。
【0072】
本発明は、いくつかの配列決定反応が一緒に精製されることに関する可能性を
与える。このことは、異なる特異なヌクレオチドを組み込んでいる異なるシーク
ェンシングプライマーを用いることにより可能とされる。精製を容易とするため
に、異なるプライマーには、同じであっても異なっていてもよいが、好適には、
同じである、たとえばビオチン(ストレプトアビジンを担持する固形支持体、た
とえばビーズに結合している)のような固定化手段を付与してもよい。具体的に
は、配列中のどこかにウラシルを有する(T3U)(1)または、配列中にメチルアデ
ニンを有する(T3MA)(2)などのような、いくつかの形態で存在するビオチニル
化T3シークェンシングプライマーを用いることができる。最初の配列決定反応は
、プライマーT3Uを使用し、第二の分離反応はプライマーT3MAを使用する。配列
決定反応が終了した後、第一および第二の反応は一緒に混合され、ストレプトア
ビジンビーズ上で精製される。洗浄の後、反応1の放出は、UDGの添加によりも
たらされ、次いで、当該反応は、“読まれ(read)”てもよく(例:配列決定ゲ
ル上にロードされる)、メチルアデニングリコシラーゼの添加による反応2の放
出が読まれる。明確には、放出されるであろう配列決定反応の数は、利用可能な
異なるグリコシラーゼの数によってしか制限されない。このような多重化アプロ
ーチは、高処理量のシークェンシング研究所では、好適なものであろう。ビーズ
-配列決定反応の混合物を含有する96-ウェルプレートでは、UDGを、すべての96-
ウェルに加え、最初の96反応物を除去し、その後、メチルアデニングリコシラー
ゼを同じ96-ウェルに加え、96反応の第二のバッチを除くことなどが可能である
。必要とされる生産物は、単にT3UおよびUDG、T3MAおよびメチルアデニングリコ
シラーゼなどであろう。ビーズからのDNAの放出だけで、精製の配列決定反応に
対し、変化が加えられる必要はないであろう。
与える。このことは、異なる特異なヌクレオチドを組み込んでいる異なるシーク
ェンシングプライマーを用いることにより可能とされる。精製を容易とするため
に、異なるプライマーには、同じであっても異なっていてもよいが、好適には、
同じである、たとえばビオチン(ストレプトアビジンを担持する固形支持体、た
とえばビーズに結合している)のような固定化手段を付与してもよい。具体的に
は、配列中のどこかにウラシルを有する(T3U)(1)または、配列中にメチルアデ
ニンを有する(T3MA)(2)などのような、いくつかの形態で存在するビオチニル
化T3シークェンシングプライマーを用いることができる。最初の配列決定反応は
、プライマーT3Uを使用し、第二の分離反応はプライマーT3MAを使用する。配列
決定反応が終了した後、第一および第二の反応は一緒に混合され、ストレプトア
ビジンビーズ上で精製される。洗浄の後、反応1の放出は、UDGの添加によりも
たらされ、次いで、当該反応は、“読まれ(read)”てもよく(例:配列決定ゲ
ル上にロードされる)、メチルアデニングリコシラーゼの添加による反応2の放
出が読まれる。明確には、放出されるであろう配列決定反応の数は、利用可能な
異なるグリコシラーゼの数によってしか制限されない。このような多重化アプロ
ーチは、高処理量のシークェンシング研究所では、好適なものであろう。ビーズ
-配列決定反応の混合物を含有する96-ウェルプレートでは、UDGを、すべての96-
ウェルに加え、最初の96反応物を除去し、その後、メチルアデニングリコシラー
ゼを同じ96-ウェルに加え、96反応の第二のバッチを除くことなどが可能である
。必要とされる生産物は、単にT3UおよびUDG、T3MAおよびメチルアデニングリコ
シラーゼなどであろう。ビーズからのDNAの放出だけで、精製の配列決定反応に
対し、変化が加えられる必要はないであろう。
【0073】
本発明の方法を行うために必要とされる成分、あるいは手段が、好適には、キ
ットの形式で供給されてもよい。 すなわち、本発明のさらなる面は、従前に定義したような、本発明の方法にお
いて使用するキットを提供するものであり、該キットは、 (a) 特異なヌクレオチドを核酸分子に導入するための手段;および (b) 該特異ヌクレオチドを選択的に切断するための手段 を含む。
ットの形式で供給されてもよい。 すなわち、本発明のさらなる面は、従前に定義したような、本発明の方法にお
いて使用するキットを提供するものであり、該キットは、 (a) 特異なヌクレオチドを核酸分子に導入するための手段;および (b) 該特異ヌクレオチドを選択的に切断するための手段 を含む。
【0074】
手段(a)は、好適には、当該特異なヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド
配列、たとえば、上述したリンカー配列、好ましくはプライマーであってもよい
。 手段(b)は、好適には、DNAグリコシラーゼ酵素であってもよい。 キットは、さらに、追加的に、固形支持体のような成分、または固形支持体に
固定化するための手段を含んでいてもよい。好ましくは、当該キットは、固形支
持体、好ましくはビオチンに固定化するための手段が付与された、あるいは固形
支持体に、好ましくは磁性ビーズに結合されたオリゴdUまたはポリdUを含んでい
ても良い。
配列、たとえば、上述したリンカー配列、好ましくはプライマーであってもよい
。 手段(b)は、好適には、DNAグリコシラーゼ酵素であってもよい。 キットは、さらに、追加的に、固形支持体のような成分、または固形支持体に
固定化するための手段を含んでいてもよい。好ましくは、当該キットは、固形支
持体、好ましくはビオチンに固定化するための手段が付与された、あるいは固形
支持体に、好ましくは磁性ビーズに結合されたオリゴdUまたはポリdUを含んでい
ても良い。
【0075】
本発明の用途および応用としては、以下のものを含む:
1. cDNAの第一および第二鎖は、固形支持体上で造られることができ、その後
、ライブラリーの調製のようなクローニングを目的として、または、たとえば、
バイオチップ(遺伝子チップ)とともにハイブリダイゼーション手順で用いるた
めのプローブの調製のために、選択的切断により放出され、配列決定反応の後、
しかし、ロードする前に、組み込まれていないdNTPを除去する。 2. センス鎖およびアンチセンス鎖プローブの両方を、同じds cDNA調製物よ
り調製することができ、工程を単純化できる。 3. 逆サブトラクション・ハイブリダイゼーションが可能で、第一鎖cDNAは、
支持体から除去され、固形支持体上に固定化されたmRNAとともにハイブリダイズ
され得る。 4. 通常、連結を阻害する5'末端にビオチン分子があるので、PCR産物のよう
なDNAを優位にクローンすることができる。 5. 細胞は、細胞に結合して残っている「外来」物質が最小限の範囲内のまま
、支持体から容易に放出される形式で、親和性結合を基礎にした固形支持体の手
順(たとえば、免疫磁気的分離(IMS))により容易に分離することができる。こ
れにより、治療における使用のため、および/または、その後の刺激のために、
細胞分離に特別な応用が見出される。したがって、たとえば、治療のためのT細
胞(例:その後の、患者への再導入)が、IMSにより単離され、刺激され(例:
これもIMSを含む手順により)、そしてその後、再導入のためにIMS支持体から分
離されるであろう。 6. 切断可能なヌクレオチド配列は、切断部位が、親和性結合の部位に可能な
限り近づくようにその位置が定められるような方法で、開発されている親和性結
合分子の新世代(たとえば、一本鎖抗体およびその誘導体(例:パラトープに縮
小されたもの)、またはペプチドライブラリーの生成分子)に容易に連結され、
あるいは、結合させてもよい。これにより、分離された実体(すなわち、親和性
結合基の結合「パートナー」)に結合している「外来」物質が、可能な限り僅か
しか残らないように、切断が生じることを可能とする。
、ライブラリーの調製のようなクローニングを目的として、または、たとえば、
バイオチップ(遺伝子チップ)とともにハイブリダイゼーション手順で用いるた
めのプローブの調製のために、選択的切断により放出され、配列決定反応の後、
しかし、ロードする前に、組み込まれていないdNTPを除去する。 2. センス鎖およびアンチセンス鎖プローブの両方を、同じds cDNA調製物よ
り調製することができ、工程を単純化できる。 3. 逆サブトラクション・ハイブリダイゼーションが可能で、第一鎖cDNAは、
支持体から除去され、固形支持体上に固定化されたmRNAとともにハイブリダイズ
され得る。 4. 通常、連結を阻害する5'末端にビオチン分子があるので、PCR産物のよう
なDNAを優位にクローンすることができる。 5. 細胞は、細胞に結合して残っている「外来」物質が最小限の範囲内のまま
、支持体から容易に放出される形式で、親和性結合を基礎にした固形支持体の手
順(たとえば、免疫磁気的分離(IMS))により容易に分離することができる。こ
れにより、治療における使用のため、および/または、その後の刺激のために、
細胞分離に特別な応用が見出される。したがって、たとえば、治療のためのT細
胞(例:その後の、患者への再導入)が、IMSにより単離され、刺激され(例:
これもIMSを含む手順により)、そしてその後、再導入のためにIMS支持体から分
離されるであろう。 6. 切断可能なヌクレオチド配列は、切断部位が、親和性結合の部位に可能な
限り近づくようにその位置が定められるような方法で、開発されている親和性結
合分子の新世代(たとえば、一本鎖抗体およびその誘導体(例:パラトープに縮
小されたもの)、またはペプチドライブラリーの生成分子)に容易に連結され、
あるいは、結合させてもよい。これにより、分離された実体(すなわち、親和性
結合基の結合「パートナー」)に結合している「外来」物質が、可能な限り僅か
しか残らないように、切断が生じることを可能とする。
【0076】
本発明を限定するものでない以下の実施例に基づき、図を参照しながら、本発
明をさらに詳細に説明する。
明をさらに詳細に説明する。
【0077】
【実施例1】
固体支持体からのcDNA産物の除去
方法
1. Jakobsen、K.S.ら、Advances in Biomagnetic Separation、Uhlen、M.編E
aton Publishing、(1994) pp61-71に記載されているように、あるいはDynalのmR
NA捕獲のための説明書に従って、ダイナビーズ、オリゴ5’TTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTUまたは5’UUUUUUUUUUUUUUUUUU
UUUUUを用いて、1μgのmRNAを捕獲、洗浄、調製する。
aton Publishing、(1994) pp61-71に記載されているように、あるいはDynalのmR
NA捕獲のための説明書に従って、ダイナビーズ、オリゴ5’TTTTTTTTT
TTTTTTTTTTTTUまたは5’UUUUUUUUUUUUUUUUUU
UUUUUを用いて、1μgのmRNAを捕獲、洗浄、調製する。
【0078】
2. mRNAとビーズの複合体を1X逆転写緩衝液(Life Technologies、Inc.)50
μl中で2回洗浄する。 3. 200ユニットのSuper Script II逆転写酵素を含む20μlの逆転写反応物を5
00nM dNTP類、33P dATP(3000mCi/mmol)、100mM DTTおよび2.5mM MgCl2を含有
する1X逆転写酵素緩衝液(Life Technologies, Inc)において混合する。
μl中で2回洗浄する。 3. 200ユニットのSuper Script II逆転写酵素を含む20μlの逆転写反応物を5
00nM dNTP類、33P dATP(3000mCi/mmol)、100mM DTTおよび2.5mM MgCl2を含有
する1X逆転写酵素緩衝液(Life Technologies, Inc)において混合する。
【0079】
4. 37℃で20分間、42℃で20分間、55℃で20分間、インキュベートする。
5. 1μlのRNaseHとともに37℃で15分間、70℃で10分間インキュベートする。
6. 50μlのUDG反応緩衝液(10mM Tris-HCl, pH8.9, 50mM KClおよび25mM MgC
l2)で2回洗浄する。 7. 20μlのUDG反応緩衝液にある1ユニットのウラシル-DNAグリコシラーゼ(
ベーリンガーマンハイム社)を添加し、37℃で10分間インキュベートする。
l2)で2回洗浄する。 7. 20μlのUDG反応緩衝液にある1ユニットのウラシル-DNAグリコシラーゼ(
ベーリンガーマンハイム社)を添加し、37℃で10分間インキュベートする。
【0080】
8. 95℃で3分間インキュベートし、DNAを非塩基性部位で切断させる。
9. 磁石を利用して、遊離したcDNAを含む上清を集める。
結果
図1は、オリゴ(dT)の場合と比較して、UDGをオリゴ(dTU)とインキュベートし
た場合に、第一鎖を標識したcDNAの遊離が著しく増加することを示す。それぞれ
20%未満のものと比較して、cDNAのおよそ80%が遊離する。
た場合に、第一鎖を標識したcDNAの遊離が著しく増加することを示す。それぞれ
20%未満のものと比較して、cDNAのおよそ80%が遊離する。
【0081】
【実施例2】
M-280ストレプトアビジンビーズからのPCR産物の除去
方法
1. 1つには内部にdUMPを有するビオチニル化したプライマー、たとえばビオ
チン−GTAATACGACTCACTAUAGGGCと、好適な鋳型を有する
未修飾PCRプライマーと、反応成分(dUMPを含むビオチニル化PCRプライマーを用
いる場合は、同一の未修飾プライマーと比較して何ら変更する必要はない)とを
含有するPCRを実施する。
チン−GTAATACGACTCACTAUAGGGCと、好適な鋳型を有する
未修飾PCRプライマーと、反応成分(dUMPを含むビオチニル化PCRプライマーを用
いる場合は、同一の未修飾プライマーと比較して何ら変更する必要はない)とを
含有するPCRを実施する。
【0082】
2. 製造者の説明書を用いてCentricon-50 スピンカラム(Amicon Inc.)で、
取り込まれていないビオチニル化プライマーを除去することができる。 3. 精製したPCR産物(100ng〜5μg)を100μlのB&W緩衝液(2M NaCl、10mM T
ris-HCl(pH7.5)および1mM EDTA)中で、100μlのM-280ストレプトアビジン磁
性ビーズ(Dynal)上に50℃で3時間、回転させながら、固定化する。
取り込まれていないビオチニル化プライマーを除去することができる。 3. 精製したPCR産物(100ng〜5μg)を100μlのB&W緩衝液(2M NaCl、10mM T
ris-HCl(pH7.5)および1mM EDTA)中で、100μlのM-280ストレプトアビジン磁
性ビーズ(Dynal)上に50℃で3時間、回転させながら、固定化する。
【0083】
4. 上記実施例1の6〜9ステップを進める。
5. 遊離した2本鎖または1本鎖のPCR産物を集め、クローニングのような下流
部門の応用に利用できる。 結果 図2は、M-280ストレプトアビジンビーズからの放射能標識したビオチニル化PC
R産物の遊離を示す。bioT3Uは、ビオチン−AATTAACCCTCACUAA
AGGGである。bioT7Uは、ビオチン−GTAATACGACTCACTAUA
GGGCである。
部門の応用に利用できる。 結果 図2は、M-280ストレプトアビジンビーズからの放射能標識したビオチニル化PC
R産物の遊離を示す。bioT3Uは、ビオチン−AATTAACCCTCACUAA
AGGGである。bioT7Uは、ビオチン−GTAATACGACTCACTAUA
GGGCである。
【0084】
UDGの存在下では、非存在下よりも顕著に増加した量のPCR産物が遊離する。
【0085】
【実施例3】
特異ヌクレオチドとしてリボヌクレオチドを用いた場合の固体支持体からのcD NA産物の除去
1. Jakobsenらが1994年に記載されているように、Daynabeads オリゴ5’末端
ビオチンTTTTTTTTTrUTTTTTTTTTを用いて、1μgのmRNAを
捕獲、洗浄、調製する。
ビオチンTTTTTTTTTrUTTTTTTTTTを用いて、1μgのmRNAを
捕獲、洗浄、調製する。
【0086】
2〜4. 実施例1と同様。
5. 100mM NaOH 20μlを2ロット添加して、オリゴヌクレオチドを含むRNA(rU
)を切断させ、付着していたcDNAを遊離させる。 6. 磁石を利用し、遊離したcDNAを含む上清を集める。 7. 必要であれば100mM HCl 40μl、または適切な量の1M Tris-HCl緩衝溶液(
pH7)を添加してアルカリを中和する。
)を切断させ、付着していたcDNAを遊離させる。 6. 磁石を利用し、遊離したcDNAを含む上清を集める。 7. 必要であれば100mM HCl 40μl、または適切な量の1M Tris-HCl緩衝溶液(
pH7)を添加してアルカリを中和する。
【0087】
【実施例4】
特異ヌクレオチドとしてリボヌクレオチドを用いた固体支持体からのcDNA産物 の除去
1〜4. 上記実施例3と同様。
5. 最終的なMg2+またはMn2+濃度が少なくとも10mMになるように25mM MgCl2ま
たはMnCl2溶液10μlを添加して、オリゴヌクレオチドを含むRNA(rU)を切断さ
せ、付着していたcDNAを遊離させる。94℃で5分間加熱する。
たはMnCl2溶液10μlを添加して、オリゴヌクレオチドを含むRNA(rU)を切断さ
せ、付着していたcDNAを遊離させる。94℃で5分間加熱する。
【0088】
6. 磁石を利用し、遊離したcDNAを含む上清を集める。
【0089】
【実施例5】
非プリン塩基部位を切断させるエキソヌクレアーゼIIIの使用
方法
1-7ステップは実施例1に記載の通りである。
8. 150ユニットのエキソヌクレアーゼIII(Promega Corp. USA)を加え、37
℃で30分間インキュベートする。
℃で30分間インキュベートする。
【0090】
9. 磁石を利用し、遊離したcDNAを含む上清を集める。
記. エキソヌクレアーゼIIIはAPヌクレアーゼとし総体的に知られる非塩基
性部位開裂酵素群のクラスに属する(LindahlとAnderson(1972)Biochemistry
11:3618-3623)。エキソヌクレアーゼIIIは、2本鎖に特異的なDNase活性も有し
ており、2本鎖DNA、たとえばPCR産物を破壊するが、1本鎖DNAは破壊しない。そ
れゆえ、本実施例で述べたように1本鎖DNA中に限って、エキソヌクレアーゼIII
で非塩基性部位を開裂させることが好ましい。非塩基性部位を開裂させる他の好
適な酵素としては、E. coliエンドヌクレアーゼIV(DempleとHarrison,(1994) A
nnu. Rev. Biochem. 63:915-948)が挙げられ、本実施例においてエキソヌクレ
アーゼIIIの代わりに用いてもよい。
性部位開裂酵素群のクラスに属する(LindahlとAnderson(1972)Biochemistry
11:3618-3623)。エキソヌクレアーゼIIIは、2本鎖に特異的なDNase活性も有し
ており、2本鎖DNA、たとえばPCR産物を破壊するが、1本鎖DNAは破壊しない。そ
れゆえ、本実施例で述べたように1本鎖DNA中に限って、エキソヌクレアーゼIII
で非塩基性部位を開裂させることが好ましい。非塩基性部位を開裂させる他の好
適な酵素としては、E. coliエンドヌクレアーゼIV(DempleとHarrison,(1994) A
nnu. Rev. Biochem. 63:915-948)が挙げられ、本実施例においてエキソヌクレ
アーゼIIIの代わりに用いてもよい。
【0091】
【実施例6】
リンカー開裂および細胞精製
1. ダイナビーズ CD4(細胞分離とタンパク質精製、Technical Handbook、第
2版、Dynal)に記載されたようにして、ビオチン−ポリU−アンチ−CD4で細胞の
単離を行う。
2版、Dynal)に記載されたようにして、ビオチン−ポリU−アンチ−CD4で細胞の
単離を行う。
【0092】
2. ロゼット状の細胞を100mlの細胞培養培地に再懸濁する。
3. 100ユニットのUDG(Roche Molecular Biochemicals)と1500ユニットのエ
キソヌクレアーゼIIIを加える。 4. 37℃で45〜60分間インキュベートする。 5. 磁気分離器を用いて遊離したビーズを除去する。
キソヌクレアーゼIIIを加える。 4. 37℃で45〜60分間インキュベートする。 5. 磁気分離器を用いて遊離したビーズを除去する。
【0093】
6. 細胞を含む上清を集める。
【0094】
【実施例7】
リンカー開裂およびタンパク質精製
方法
1. 1×107の組織培養細胞をPBS中で3回洗浄する。
2. 50μg/ml TLCKおよびTPCK、200μg/ml PMSFを含む2% Triton X-100 1ml中
において細胞を溶解させる。
において細胞を溶解させる。
【0095】
3. 細胞溶解物を40μlのダイナビーズ−開裂可能なリンカー−親和性分子(
たとえば、ダイナビーズ−ポリ(dU)−8−炭素スペーサー−アデノシン5’末
端モノホスフェート)とともにインキュベートする。 4. 磁石を用いてビーズを集め、PBSで3回洗浄する。 5. 40μlのUDG反応緩衝液(10mM Tris-HCl, pH8.9, 50mM KClおよび25mM MgC
l2)中にビーズを再懸濁する。
たとえば、ダイナビーズ−ポリ(dU)−8−炭素スペーサー−アデノシン5’末
端モノホスフェート)とともにインキュベートする。 4. 磁石を用いてビーズを集め、PBSで3回洗浄する。 5. 40μlのUDG反応緩衝液(10mM Tris-HCl, pH8.9, 50mM KClおよび25mM MgC
l2)中にビーズを再懸濁する。
【0096】
6. 2ユニットのウラシル−DNAグリコシラーゼ(ベーリンガーマンハイム)を
加える。 7. 37℃で30分間インキュベートする。 8. 15ユニットのエキソヌクレアーゼIII(Promega Corp.USA)を加え、37℃
で30分間インキュベートする。
加える。 7. 37℃で30分間インキュベートする。 8. 15ユニットのエキソヌクレアーゼIII(Promega Corp.USA)を加え、37℃
で30分間インキュベートする。
【0097】
9. 磁石を利用して、遊離したタンパク質とリガンドを含む上清を集める。
【図1】図1は、UDGで処理したdTMPまたはdUMPオリゴヌクレオチドプライマー
とともに分離したDNA%を示しているグラフである。
とともに分離したDNA%を示しているグラフである。
【図2】図2は、dUMP PCRプライマー-PCR産物(UDGの存在下または非存在下で
遊離したCPM(000’s))の分離を示しているグラフである。
遊離したCPM(000’s))の分離を示しているグラフである。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(81)指定国 EP(AT,BE,CH,CY,
DE,DK,ES,FI,FR,GB,GR,IE,I
T,LU,MC,NL,PT,SE),OA(BF,BJ
,CF,CG,CI,CM,GA,GN,GW,ML,
MR,NE,SN,TD,TG),AP(GH,GM,K
E,LS,MW,SD,SL,SZ,TZ,UG,ZW
),EA(AM,AZ,BY,KG,KZ,MD,RU,
TJ,TM),AE,AG,AL,AM,AT,AU,
AZ,BA,BB,BG,BR,BY,CA,CH,C
N,CR,CU,CZ,DE,DK,DM,DZ,EE
,ES,FI,GB,GD,GE,GH,GM,HR,
HU,ID,IL,IN,IS,JP,KE,KG,K
P,KR,KZ,LC,LK,LR,LS,LT,LU
,LV,MA,MD,MG,MK,MN,MW,MX,
NO,NZ,PL,PT,RO,RU,SD,SE,S
G,SI,SK,SL,TJ,TM,TR,TT,TZ
,UA,UG,US,UZ,VN,YU,ZA,ZW
Claims (28)
- 【請求項1】 核酸分子内の所定部位において特異ヌクレオチドが取り込まれており、該特異
ヌクレオチドの部位で選択的に該核酸分子を切断する段階を含む、該核酸分子が
結合している固形支持体から該核酸分子を切り離す方法。 - 【請求項2】 (a)特異ヌクレオチドを核酸分子内の所定の部位に取り込む段階 (b)該核酸分子を固形支持体に結合する段階、(a)および(b)の両段階は順にあ
るいは同時に行なってもよく、引き続いて (c)該特異ヌクレオチド部位で該核酸分子を選択的に切断する段階 を含む核酸分子を可逆的に固定化する方法。 - 【請求項3】 前記核酸分子が、核酸成分と別個の非核酸成分とを含むキメラ分子であること
を特徴とする請求項1または2に記載の方法。 - 【請求項4】 前記特異ヌクレオチドが、ウラシル、ヒポキサンチン、リボヌクレオチド、N
−7−メチルグアニン、8−オキソグアニン、デオキシウリジン、デオキシイノ
シン、デオキシ5',6'−ジヒドロキシチミン、5',6'−ジヒドロキシチミン、デ
オキシ3'−メチルアデノシン、または3'−メチルアデノシンであることを特徴と
する請求項1〜3のいずれかに記載の方法。 - 【請求項5】 前記選択的切断が酵素的に行なわれることを特徴とする請求項1〜4のいずれ
かに記載の方法。 - 【請求項6】 前記選択的切断がDNAグリコシラーゼ酵素を使用して行なわれることを特徴
とする請求項5に記載の方法。 - 【請求項7】 前記核酸分子がDNAを含み、前記特異ヌクレオチドがウラシル(U)であり
、前記選択的切断がウラシルDNAグリコシラーゼ酵素(UDG)を使用して行
なわれることを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の方法。 - 【請求項8】 前記特異ヌクレオチドがリンカー配列の一部分として前記核酸分子内に取り込
まれることを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の方法。 - 【請求項9】 前記リンカー配列がプライマーであることを特徴とする請求項8に記載の方法
。 - 【請求項10】 前記核酸分子がプライマー伸長産物であることを特徴とする請求項1〜9のい
ずれかに記載の方法。 - 【請求項11】 前記支持体が磁性ビーズであることを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項12】 前記リンカー配列に固形支持体への固定化のための手段が与えられることを特
徴とする請求項8〜11のいずれかに記載の方法。 - 【請求項13】 前記核酸分子がcDNAであるか、あるいはインビトロ増幅反応または配列決
定反応の産物であることを特徴とする請求項10〜12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項14】 前記核酸分子が、タンパク質、酵素基質、レセプターリガンド、抗原もしくは
ハプテン、またはそれらのフラグメントに結合した、あるいは親和性結合基もし
くはレポーター基に結合したリンカー配列を含むことを特徴とする請求項8、11
または12のいずれかに記載の方法。 - 【請求項15】 選択的切断を可能とする特異ヌクレオチドを所定の部位において含んでいるヌ
クレオチドリンカー配列を構成体に取り込む段階を含み、固形支持体に結合させ
、後に切り離すために該構成体を調製する方法。 - 【請求項16】 官能基に結合し、選択的に切り離し得る特異ヌクレオチドを所定の部位で含有
するヌクレオチドリンカー配列を含むキメラ分子。 - 【請求項17】 前記官能基が親和性結合基もしくはレポーター基であることを特徴とする請求
項16に記載のキメラ分子。 - 【請求項18】 前記リンカー配列が固形支持体に固定化されているか、または固定化のための
手段を付与されていることを特徴とする、請求項15に記載の方法あるいは請求項
16または17に記載のキメラ分子。 - 【請求項19】 前記親和性結合基が抗体もしくはそのフラグメントまたはそれらの誘導体、あ
るいはハプテンであることを特徴とする請求項16〜18のいずれかに記載のキメラ
分子。 - 【請求項20】 請求項16〜19のいずれかに定義されたキメラ分子により固形支持体に標的細胞
を結合させる段階を含み、前記官能基が該標的細胞に特異的に結合する親和性結
合基であることを特徴とする該標的細胞を試料から分離する方法。 - 【請求項21】 多数の異なる核酸分子またはキメラ分子が固形支持体に付着しまたは結合して
おり、該異なる分子の各々が異なる特異ヌクレオチドを取り込んでいることを特
徴とする請求項1〜14、18または20のいずれかに記載の方法。 - 【請求項22】 (a)特異ヌクレオチドを核酸分子に導入するための手段;および (b)該特異ヌクレオチドを選択的に切断するための手段 を含むキットであり、請求項1〜14のいずれかに定義された方法に利用されるキ
ット。 - 【請求項23】 特異ヌクレオチドを取り込んでおり、固形支持体に固定化されているかあるい
は固定化手段を担持しているポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項24】 前記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがポリdUまたはオリゴdU
である、請求項23に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項25】 前記ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドがプライマーである、請求項
23に記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項26】 前記固定化手段がビオチンであることを特徴とする請求項23〜25のいずれかに
記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項27】 前記固形支持体が磁性ビーズからなることを特徴とする請求項23〜25のいずれ
かに記載のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。 - 【請求項28】 異なるポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの各々が異なる特異ヌクレ
オチドを取り込んでいることを特徴とする、請求項23および25〜27のいずれかに
定義された多数のポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド。
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Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB9907245.6 | 1999-03-29 | ||
GBGB9907245.6A GB9907245D0 (en) | 1999-03-29 | 1999-03-29 | Cleavage of nucleic acids from solid supports |
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