CN114369594A - 一种粪便内微生物的总dna的提取试剂盒和提取方法 - Google Patents

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CN114369594A CN202210163958.7A CN202210163958A CN114369594A CN 114369594 A CN114369594 A CN 114369594A CN 202210163958 A CN202210163958 A CN 202210163958A CN 114369594 A CN114369594 A CN 114369594A
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Abstract

本发明公开了一种粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，包括预处理液、裂解液、第一去污剂、第二去污剂、磁珠混合液和结合液；预处理液包含乙二胺四乙酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和聚乙烯吡咯烷酮；裂解液包含十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵和吐温20；第一去污剂包含三羟甲基氨基甲烷、乙酸钾和十六烷基三甲基溴化铵；第二去污剂包含三羟甲基氨基甲烷、硫酸铝和硫酸铵；结合液包含胍盐、乙酸钠和异丙醇。本发明还公开了粪便内微生物的总DNA的提取方法。本发明更加节省时间，提取流程更加简单，纯度更高。

Description

一种粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒和提取方法
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，尤其涉及一种粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒和提取方法。
背景技术
自沃森-克里克的DNA双螺旋模型诞生以后，生物学进入到了一个全新的时代，在生物学界，无论是进行病原微生物的检测、物种鉴定，还是进行物种起源、多样性评估及其亲缘关系、***进化等的研究，首先都需要对核酸进行分离纯化，因此对DNA的提取成为生物医药领域甚至农林牧渔等领域内所有学科进行科学研究的基础。而能否提取出高质量的核酸则是核酸分子生物学试验中的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。因此核酸提取是分子生物学的基本方法，也是核酸分析中最关键的方法。
由此开发出了一系列的核酸提取方法，包括经典的酚氯仿抽提法，新发展的硅胶膜吸附法等。而随着基因诊断在临床疾病的诊断和监测中发挥着日益重要的作用，基因诊断对核酸检测赖以完成的前提技术——核酸提取技术提出了新的要求，高效、便捷、环保、大通量、自动化成为核酸提取技术发展的主流方向。
与手工方法相比，自动化方法(即磁珠法)有以下优势：节省时间，程序简化，提取效率高，纯化程度高，重复性好，因此能很好地避免假阴性与交叉感染。
发明内容
为了解决现有技术的上述问题，本发明提供一种粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，包括预处理液、裂解液、第一去污剂、第二去污剂、磁珠混合液和结合液；所述预处理液包含乙二胺四乙酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和聚乙烯吡咯烷酮；所述裂解液包含十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵和吐温20(tween-20)；所述第一去污剂包含三羟甲基氨基甲烷、乙酸钾和十六烷基三甲基溴化铵；所述第二去污剂包含三羟甲基氨基甲烷、硫酸铝和硫酸铵；所述结合液包含胍盐、乙酸钠和异丙醇。
在一些实施方案中，所述预处理液包含100mmol/L乙二胺四乙酸、0.5-1mol/L氯化钠、1％-2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、100mmol/L磷酸氢二钠以及100mmol/L磷酸二氢钠；所述预处理液的pH＝6-7。
在一些实施方案中，所述裂解液包含5-10％质量分数的十二烷基苯磺酸钠、0.5-1.5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵以及10-20％(v/v)tween-20。
在一些实施方案中，所述第一去污剂包含100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、3-5mol/L乙酸钠以及0.1-1％质量分数的十六烷基三甲基溴化铵；所述第一去污剂的pH＝5-6。
在一些实施方案中，所述第二去污剂包含100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、100-200mmol/L硫酸铝以及100-200mmol/L硫酸铵。
在一些实施方案中，所述结合液包含0.5-2M胍盐、100-200mmol/L乙酸钠以及50％-80％(v/v)异丙醇。
进一步地，所述结合液的pH＝5-6。
在一些实施方案中，所述磁珠混合液包含磁珠和水；所述磁珠为二氧化硅包被的纳米磁性微球；所述磁珠的粒径为300-500nm。进一步地，所述磁珠混合液中的水选用超纯水。
在一些实施方案中，还包括漂洗液、玻璃珠、磁力架和蛋白酶K；所述漂洗液包含70-80％(v/v)乙醇；所述玻璃珠的直径为0.1-0.5mm。
进一步地，所述漂洗液的pH＝5-6。
另一方面，本发明还提供一种粪便内微生物的总DNA的提取方法，采用如上所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒进行提取；所述方法包括以下步骤：
S1、将粪便加入装有玻璃珠的研磨管中，加入所述预处理液，混匀，用研磨仪研磨，得到研磨后的样本；
S2、向所述步骤S1得到的研磨后的样本中加入蛋白酶K、所述裂解液，混匀，65-90℃孵育20-30min，得到裂解后的样本；
S3、将所述步骤S2得到的裂解后的样本离心，弃沉淀，向上清液中加入所述第一去污剂和所述第二去污剂，混匀，-20℃放置5-10min，得到去污后的样本；
S4、将所述步骤S3得到的去污后的样本离心，弃沉淀，向上清液中加入所述磁珠混合液，混匀，得到带磁珠的样本；
S5、将所述步骤S4得到的带磁珠的样本置于磁力架上，静置后，弃上清液，加入所述结合液，混匀，得到加入结合液后的样本；
S6、将所述步骤S5得到的加入结合液后的样本置于磁力架上，静置后，弃上清液，加入所述漂洗液，混匀，得到第一样本；
S7、将所述步骤S6得到的第一样本控干，加入DNase-free水，得到粪便内微生物的总DNA。
进一步地，S2、向所述步骤S1得到的研磨后的样本中加入蛋白酶K、所述裂解液，混匀，70℃孵育25min，得到裂解后的样本；
进一步地，S3、将所述步骤S2得到的裂解后的样本离心，弃沉淀，向上清液中加入所述第一去污剂和所述第二去污剂，混匀，-20℃放置5min，得到去污后的样本。
在一些实施方案中，所述步骤S7还包括重复1-2次所述步骤S6后，再将所述步骤S6得到的第一样本控干，加入DNase-free水，得到粪便内微生物的总DNA。
在一些实施方案中，所述步骤S1中的玻璃珠的直径为0.1-0.5mm；所述步骤S3和S4中的离心分别独立的为12000-13000r/min,室温离心5min。
在一些实施方案中，所述步骤S2中加入的裂解液是所述步骤S1中加入的预处理液的0.1-0.15倍。所述步骤S3中加入的第一去污剂的量是所述步骤S3中吸取的上清液的0.4-0.5倍。所述步骤S3中加入的第二去污剂的量是所述步骤S3中吸取的上清液的0.25-0.315倍。所述步骤S4中加入的磁珠混合液的量是所述步骤S4中上清液的0.05-0.1倍；所述步骤S5中加入的结合液必须与所述步骤S4中上清液等体积。
本发明的原理是：利用二氧化硅包被的纳米磁性微球(粒径300-500nm的磁珠)的超顺磁性，在高盐低pH缓冲溶液中，特异并高效捕获从粪便等样本中分离出的DNA。
本发明中，几种试剂具有如下所述的作用，但不限于如下所列的作用：预处理液的作用有在提取过程中对DNA进行保存并能够去除一部分杂质；裂解液的作用有裂解微生物释放DNA；第一去污剂的作用有去除分离出来的蛋白、多糖等杂质；第二去污剂的作用有去除粪便内的腐殖酸等杂质；磁珠混合液的作用有特异性吸附释出来的DNA；结合液的作用有提供一个适合磁珠吸附的缓冲环境并在一定程度上去除蛋白质等生物大分子杂质；漂洗液的作用有去除盐离子(例如胍盐等)。
本发明的优点：
1、与传统的提取方案相比，更加节省时间，提取流程更加简单，纯度更高；
2、与现有的商业化柱法提取试剂盒相比，磁珠法能够结合仪器实现高通量自动化提取，节省更多的人力成本，提取流程更加便捷；
3、与现有的磁珠法提取DNA相比：1)样本的针对性更强。针对复杂的粪便样本，选用的磁珠颗粒大小以及配套的试剂不同于现有技术。2)去除杂质更加彻底，提取出来的DNA的纯度更高。在步骤S1、S3以及S4中，均会对样本内的杂质以及分离出来的杂质进行去除。3)磁珠用的粒径不同，会影响DNA的得率；本发明是根据粪便样本以及配套的相关提取试剂特异性选择出来的；在此粒径条件下，DNA得率比较高且纯度好。
以下将结合附图对本发明的构思、具体结构及产生的技术效果作进一步说明，以充分地了解本发明的目的、特征和效果。
附图说明
图1是粪便DNA的PCR检测电泳图。图中，M表示Marker(DL2000)，其上样量为25μl；1、2泳道为传统方法提取扩增结果；3、4泳道为本发明方法提取扩增结果；5、6为商业化提取试剂盒的柱膜法提取扩增结果。
图2是粪便内细菌多样性分布图。图中，Y轴代表菌门水平的相对丰度；X-轴中F_5/6为商业化提取试剂盒扩增建库上机的结果；F_3/4为本发明方法提取扩增建库上机的结果。
具体实施方式
为了使发明实现的技术手段、创造特征、达成目的和功效易于明白了解，下结合具体图示，进一步阐述本发明。但本发明不仅限于以下实施的案例。
一种粪便内微生物的总DNA的提取方法，包括下列步骤：
1)预处理液制备，预处理液pH＝6-7，通过磁力搅拌器搅拌过夜，高压灭菌得到预处理液，所述预处理液包括乙二胺四乙酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠以及聚乙烯吡咯烷酮；
2)裂解液制备，所述裂解液包括十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵以及tween-20；
3)第一去污剂制备，第一去污剂pH＝5-6，所述第一去污剂包括三羟甲基氨基甲烷、乙酸钾以及十六烷基三甲基溴化铵；
4)第二去污剂制备，所述去污液2包括三羟甲基氨基甲烷、硫酸铝以及硫酸铵；
5)磁珠混合液，所述磁珠混合液包括粒径300-500nm磁珠以及超纯水；
6)结合液制备，结合液pH＝5-6，所述结合液包括胍盐、乙酸钠以及异丙醇；
7)漂洗液制备，漂洗液pH＝5-6，所述漂洗液包括70-80％乙醇；
8)称取250mg玻璃珠(直径0.1-0.5mm)于2ml灭菌的研磨管中，加入0.6-0.8ml预处理液，放置于研磨仪中，选择参数：60Hz，180s，进行研磨；
9)往所述离心管中加入20μl-40μl蛋白酶K，加入60μl-80μl裂解液，混匀，70℃孵育25min；
10)12000-13000r/min,室温离心5min；
11)取400μl-600μl上清液，加入200μl-300μl第一去污剂，加入100-150μl第二去污剂，上下颠倒混匀，-20℃放置5min；
12)12000-13000r/min,室温离心5min；
13)取400μl上清液，加入400μl结合液，加入40μl磁珠混合液，涡旋混匀5min；
14)将所述的离心管放置于磁力架上，静置30s；
15)弃上清液，加入500μl结合液，涡旋混匀5min；
16)将所述的离心管放置于磁力架上，静置30s；
17)弃上清液，加入800μl漂洗液，涡旋混匀1min；
18)弃上清液，加入800μl漂洗液，涡旋混匀1min；
19)控干，加入50μl DNase-free水，得到土壤与粪便内微生物的总DNA。所述步骤1)中预处理液包含100mmol/L乙二胺四乙酸、0.5-1mol/L氯化钠、1％-2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、100mmol/L磷酸氢二钠以及100mmol/L磷酸二氢钠。
所述步骤2)中所述裂解液包括5-10％质量分数的十二烷基苯磺酸钠、0.5-1.5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵以及10-20％(v/v)tween-20。
所述步骤3)中所述去污剂1包括100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、3-5mol/L乙酸钠以及0.1-1％质量分数的十六烷基三甲基溴化铵,pH＝5-6。
所述步骤4)中第二去污剂包括100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、100-200mmol/L硫酸铝以及100-200mmol/L硫酸铵。
所述步骤5)中磁珠混合液包括粒径300-600nm磁珠以及超纯水。
所述步骤6)中结合液包括0.5-2M胍盐、100-200mmol/L乙酸钠以及50％-80％(v/v)异丙醇。
所述步骤7)中漂洗液包括70-80％(v/v)乙醇。
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。
实施例1：制备提取相关试剂
配制50ml预处理液：包含100mmol/L乙二胺四乙酸、0.5-1mol/L氯化钠、1％-2％(w/v)聚乙烯吡咯烷酮、100mmol/L磷酸氢二钠以及100mmol/L磷酸二氢钠，溶液pH＝8.0(用浓盐酸或2M氢氧化钠调pH值到8.0)；置于磁力搅拌器上至完全溶解，高压灭菌；得到预处理液待用。
配置50ml裂解液：包括5-10％质量分数的十二烷基苯磺酸钠、0.5-1.5％(w/v)十六烷基三甲基溴化铵以及10-20％(v/v)tween-20；置于磁力搅拌器上至完全溶解，过0.2um的过滤器进行灭菌，得到裂解液待用。
配置50ml去污剂1：包括100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、3-5mol/L乙酸钠以及0.1-1％质量分数的十六烷基三甲基溴化铵，pH＝5-6；置于磁力搅拌器上至完全溶解，高压灭菌，得到去污剂1待用。
配置50ml第二去污剂：包括100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、100-200mmol/L硫酸铝以及100-200mmol/L硫酸铵；置于磁力搅拌器上至完全溶解，高压灭菌，得到第二去污剂待用。
配置20ml磁珠混合液：包括100mg/ml粒径300-600nm磁珠(购自瑞贝西生物科技有限公司)以及超纯水
配置100ml结合液：包括0.5-2M胍盐、100-200mmol/L乙酸钠以及50％-80％(v/v)异丙醇，pH＝5.5-6；置于磁力搅拌器上至完全溶解，过0.2um的过滤器进行灭菌，得到结合液待用。
配置100ml漂洗液：包括70-80％(v/v)乙醇；置于磁力搅拌器上至完全溶解，过0.2um的过滤器进行灭菌，得到结合液待用。
实施例2：提取粪便总DNA-传统方法
1)称取250mg玻璃珠(粒径0.1-0.5mm)于2ml灭菌的离心管中；
2)取200mg粪便于步骤1所述的离心管中，加入0.5ml 2×CTAB buffer(十六烷基三甲基溴化铵缓冲液，购自北京索莱宝科技有限公司)，涡旋混匀；
3)转移上述离心管至研磨仪器中，选择参数：60Hz，180s，进行研磨；
4)加入50μl溶菌酶，5μl RNA酶，混匀，37℃孵育30min；
5)加入20μl蛋白酶K，加入25μl SDS溶液，混匀，56℃孵育20min；
6)加入加入等体积的有机溶剂混合液，该有机溶剂混合液为酚、氯仿和异戊醇混合液，且酚：氯仿：异戊醇＝24：25：1(v/v/v)，上下颠倒混匀；
7)10000-12000r/min,室温离心5min；
8)取上清液，加入等体积的氯仿，上下颠倒混匀；
9)10000-12000r/min,室温离心5min；
10)取上清液加入1/3体积的醋酸钠，2倍体积无水乙醇，混匀，-20℃孵育30min；
11)10000-12000r/min,室温离心10min；
12)弃上清液，重复清洗一次
13)控干乙醇，加入50μl DNase-free水，得到粪便总DNA。
实施例3：提取粪便总DNA-本发明方法
1)称取250mg玻璃珠(直径0.1-0.5mm)于2ml灭菌的研磨管中，
2)取200mg粪便于步骤1所述的离心管中，加入0.6-0.8ml预处理液，涡旋混匀，转移至研磨仪中，选择参数：60Hz，180s，进行研磨；
3)往所述离心管中加入20μl-40μl蛋白酶K，加入60μl-80μl裂解液，混匀，70℃孵育25min；
4)12000-13000r/min,室温离心5min；
5)取400μl-600μl上清液，加入200μl-300μl第一去污剂，加入100-150μl第二去污剂，上下颠倒混匀，-20℃放置5min；
6)12000-13000r/min,室温离心5min；
7)取400μl上清液，加入400μl结合液，加入40μl磁珠混合液，涡旋混匀5min；
8)将所述的离心管放置于磁力架(购自北京普利莱基因技术有限公司)上，静置30s；
9)弃上清液，加入500μl结合液，涡旋混匀5min；
10)将所述的离心管放置于磁力架上，静置30s；
11)弃上清液，加入800μl漂洗液，涡旋混匀1min；
12)将所述的离心管放置于磁力架上，静置30s；
13)重复步骤11与12一次；
14)控干，加入50μl DNase-free水，得到粪便内微生物的总DNA。
实施例4：提取粪便总DNA-商业化柱膜法
按照商业提取试剂盒(Stool Genomic DNA Extraction Kit，购自北京索莱宝科技有限公司)-柱膜法的操作步骤进行提取。
将实施例1-4所得的产物利用紫外分光光度计检测浓度和纯度(表1)，表中序号1、2为实施例2的CTAB提取(传统方法)结果；序号3、4为实施例1和3的本发明提取结果；序号5、6为实例4的商业化提取试剂盒提取结果，然后取适量DNA进行PCR扩增(图1)；
扩增程序：98℃/5min；98℃/30s、53℃/30s、72℃/45s，28个循环；72℃/5min；12℃/∞。
扩增标准细菌16S V3V4基因的引物序列：正向引物Link_338F001(SEQ ID NO.1)：5’-CTACACGACGCTCTTCCGATCTACACAGTACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’；反向引物Link_806R(SEQID NO.2)：5’-CAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。标准细菌16S V3V4基因的扩增情形能够用于分析粪便样本中细菌的多样性(即细菌的种类以及每个种类的相对含量)，从而判断总DNA提取试剂盒的提取质量。总DNA提取试剂盒越好，其扩增的条带越亮，数据分析后的细菌的数量以及相对含量越高。
扩增体系(以25μl体系为例)：5×缓冲液(buffer)5μl；dNTP 2μl；正向引物(5μM)1μl；反向引物(5μM)1μl；DNA模板2μl；Fast pfu DNA聚合酶0.25μl；ddH2O 14.75μl。
最后，取适量的扩增产物进行建库测序(其中传统方法由于PCR产物浓度过低，建库失败)，分析对应样本内的微生物组成(图2)
表1紫外分光光度计检测结果
Figure BDA0003515299370000071
Figure BDA0003515299370000081
从表1可以看出，3-4泳道的260/280的OD值比传统方法以及商业化提取试剂盒都稍微偏高一些，而260/230的OD值整体偏低一些，表明本发明的提取方法要比其他两种提取方案提取的DNA纯度更高一些。
从图1中可以看出，实施例2中传统方法(泳道1和2)提取的DNA进行扩增后，目的片段较弱(目的片段430bp左右)；实施例4(泳道5和6)商业化提取试剂盒提取的DNA进行扩增后有条带，但是条带的亮度明显弱于采用本发明方法提取的DNA进行扩增出来的目标条带(泳道3和4)。
从图2中可以看出，采用商业化提取试剂盒与本发明的方法提取出来的DNA进行扩增建库上机，得出来的细菌分布情况基本一致。其中变形菌门(Proteobacteria)细菌的含量还是本发明方法占比更多一些，表明本发明方法提取并回收到的微生物的DNA含量要比商业化提取试剂盒要高，从而说明在提取质量上本发明方法(含本发明提取试剂盒)要比商业化提取试剂盒要好。综上所述，本发明方法和试剂盒在提取粪便总DNA上有着比较明显的优势。
实施例5：磁珠粒径对DNA得率和纯度的影响
选用：100-200nm粒径磁珠；300-320nm粒径磁珠；400-500nm粒径磁珠；500-600nm粒径磁珠。
测试说明：
1、选用1管浓度为50ng/μl的DNA。
2、分别在4管1.5ml EP管中，加入20μl DNA溶液，补水至400μl。
3、加入400μl结合液，加入不同粒径大小的磁珠混合液。
4、以下步骤均参考步骤S6-S7。
实验结果：
100-200nm粒径磁珠提取到的DNA总量为：695.25ng
260/280:1.75；260/230:0.10
300-320nm粒径磁珠提取到的DNA总量为：629.34ng
260/280:1.90 260/230:0.65
400-500nm粒径磁珠提取到的DNA总量为：580.35ng
260/280:1.89 260/230:0.67
500-600nm粒径磁珠提取到的DNA总量为：540.44ng
260/280:1.92 260/230:0.68
粒径300-320nm的磁珠的DNA回收量(相当于DNA得率)虽然排在第二，但DNA的纯度较好；粒径100-200nm的磁珠的DNA回收量虽然排名第一，但是DNA的纯度没有其他几款磁珠的好。综合考虑，选用300-320nm粒径大小的磁珠效果最好。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
序列表
<110> 上海派森诺生物科技有限公司
<120> 一种粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒和提取方法
<130> WHL012211434
<141> 2022-02-21
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 48
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctacacgacg ctcttccgat ctacacagta ctcctacggg aggcagca 48
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
cagacgtgtg ctcttccgat ctggactach vgggtwtcta at 42

Claims (10)

1.一种粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，包括预处理液、裂解液、第一去污剂、第二去污剂、磁珠混合液和结合液；所述预处理液包含乙二胺四乙酸、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和聚乙烯吡咯烷酮；所述裂解液包含十二烷基苯磺酸钠、十六烷基三甲基溴化铵和吐温20；所述第一去污剂包含三羟甲基氨基甲烷、乙酸钾和十六烷基三甲基溴化铵；所述第二去污剂包含三羟甲基氨基甲烷、硫酸铝和硫酸铵；所述结合液包含胍盐、乙酸钠和异丙醇。
2.如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述预处理液包含100mmol/L乙二胺四乙酸、0.5-1mol/L氯化钠、1％-2％聚乙烯吡咯烷酮、100mmol/L磷酸氢二钠以及100mmol/L磷酸二氢钠；所述预处理液的pH＝6-7。
3.如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包含5-10％质量分数的十二烷基苯磺酸钠、0.5-1.5％十六烷基三甲基溴化铵以及10-20％tween-20。
4.如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述第一去污剂包含100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、3-5mol/L乙酸钠以及0.1-1％质量分数的十六烷基三甲基溴化铵；所述第一去污剂的pH＝5-6。
5.如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述第二去污剂包含100-200mmol/L三羟甲基氨基甲烷、100-200mmol/L硫酸铝以及100-200mmol/L硫酸铵；所述结合液包含0.5-2M胍盐、100-200mmol/L乙酸钠以及50％-80％异丙醇。
6.如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，所述磁珠混合液包含磁珠和水；所述磁珠为二氧化硅包被的纳米磁性微球；所述磁珠的粒径为300-500nm。
7.如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒，其特征在于，还包括漂洗液、玻璃珠、磁力架和蛋白酶K；所述漂洗液包含70-80％乙醇；所述玻璃珠的直径为0.1-0.5mm。
8.一种粪便内微生物的总DNA的提取方法，其特征在于，采用如权利要求1所述的粪便内微生物的总DNA的提取试剂盒进行提取；所述方法包括以下步骤：
S1、将粪便加入装有玻璃珠的研磨管中，加入所述预处理液，混匀，用研磨仪研磨，得到研磨后的样本；
S2、向所述步骤S1得到的研磨后的样本中加入蛋白酶K、所述裂解液，混匀，65-90℃孵育20-30min，得到裂解后的样本；
S3、将所述步骤S2得到的裂解后的样本离心，弃沉淀，向上清液中加入所述第一去污剂和所述第二去污剂，混匀，-20℃放置5-10min，得到去污后的样本；
S4、将所述步骤S3得到的去污后的样本离心，弃沉淀，向上清液中加入所述磁珠混合液，混匀，得到带磁珠的样本；
S5、将所述步骤S4得到的带磁珠的样本置于磁力架上，静置后，弃上清液，加入所述结合液，混匀，得到加入结合液后的样本；
S6、将所述步骤S5得到的加入结合液后的样本置于磁力架上，静置后，弃上清液，加入所述漂洗液，混匀，得到第一样本；
S7、将所述步骤S6得到的第一样本控干，加入DNase-free水，得到粪便内微生物的总DNA。
9.如权利要求8所述的粪便内微生物的总DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤S7还包括重复1-2次所述步骤S6后，再将所述步骤S6得到的第一样本控干，加入DNase-free水，得到粪便内微生物的总DNA。
10.如权利要求8所述的粪便内微生物的总DNA的提取方法，其特征在于，所述步骤S1中的玻璃珠的直径为0.1-0.5mm；所述步骤S3和S4中的离心分别独立的为12000-13000r/min,室温离心5min。
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