CN112980830A - 一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法 - Google Patents

一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本申请公开了一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法。本申请的磁珠法核酸提取试剂盒包括细胞裂解液、磁珠和洗涤液，其中，细胞裂解液中含有异硫氰酸胍、Triton X‑100、3‑[3‑(胆酰胺丙基)二甲氨基]‑1‑丙磺酸和N‑月桂酰肌氨酸钠。本申请的磁珠法核酸提取试剂盒，通过对裂解缓冲液的组分进行优化，可以快速、充分的裂解细胞、变性蛋白质、使蛋白质与核酸有效分离，释放出核酸；提高了细胞裂解液的工作效率，缩短了核酸提取的时间。

Description

一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法
技术领域
本申请涉及核酸提取领域，特别是涉及一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法。
背景技术
核酸是细胞内携带遗传信息的物质，在生物体的遗传、变异和蛋白质的生物合成中具有极其重要的作用。随着分子生物学检测技术的飞速发展，基于核酸信息的分子诊断技术成为有效的疾病诊断的新型临床手段和思路，特别是在感染性疾病、肿瘤和遗传性疾病领域。新发展的感染性疾病分子诊断技术不仅有效的弥补了传统方法的不足，还为临床医生提供了细菌、真菌或病毒的感染信息以及病原体的耐药基因结果，甚至病原体的同源性分析。
基于核酸信息的分子诊断技术的发展也对核酸提取和纯化有了更高的要求，临床上病原体分子检测的有效进行除了需要得到高质量的核酸分子外，快速高效也是分子检测在临床应用的一个重要因素。比如临床上对于一些急性感染患者，快速准确的确定病原是治疗最关键的环节。此外，对于一些急性病毒引起的疫情，有时需要现场检测；对于一些特殊的部门和岗位也需要快速准确的诊断，比如海关执法人员需要快速诊断出发热旅客是否由特定的病毒或者病菌引起，这个过程往往要求在0.5～2小时内完成，否则可能会给旅客带来很大的不便，甚至可能会对其他旅客造成安全隐患。
目前市面上针对于血清、唾液、咽拭子等临床样品的微生物核酸提取方法主要采用磁珠法、吸附柱法以及快速提取核酸的Chelex100煮沸法。其中磁珠法主要是先采用溶菌酶、蛋白酶K等生物活性酶孵育结合裂解液破壁变性的方式进行核酸分离，再采用磁珠进行核酸纯化等操作；该方法可以结合自动化提取设备实现自动化操作，减少操作人员带来的污染和操作误差，提取得到的核酸得率高、纯度好；但是提取步骤繁琐、操作周期长，整个提取需要1.5小时～3小时，甚至更长者需要过夜提取，很难满足快速检测的需求。
并且，现有的磁珠法核酸提取试剂盒还存在以下缺点：第一，在裂解环节通常需要采用溶菌酶、蛋白酶K等生物活性酶再结合盐酸胍或异硫氰酸胍等胍盐等强力蛋白质变性剂，在56℃～65℃条件下孵育，破坏样本组织中的蛋白质和其他成分，释放出核酸，再通过添加一定比例的异丙醇或无水乙醇等沉淀核酸；该过程一般操作时间在25分钟～1小时，甚至过夜孵育，很难满足快速检测或现场检测的需求。第二，磁珠吸附后，通常需要采用两种洗涤液进行两步法洗涤，首先采用含有一定比例无水乙醇或异丙醇等醇类的高盐试剂洗涤液进行洗涤，去除磁珠上吸附的非特异性杂蛋白，再通过第二步高比例无水乙醇低盐试剂的洗涤液进行第二次洗涤，去除磁珠的盐离子；并且，洗涤完成后，由于洗涤有使用乙醇等PCR抑制剂，会影响后续的PCR扩增，因此，往往需要在洗脱前进行5～10分钟的开盖放置操作，使乙醇挥发去除，这样操作不仅延长了提取操作时间，并且直接开盖放置暴露在空气中容易导致样本间的交叉污染。第三，现有的磁珠法提取核酸，通常需要将磁珠吸附的核酸洗脱下来，然后吸取上清液，去除磁珠，再采用溶于上清液的核酸进行PCR扩增，这个过程难免会造成核酸损失，特别是吸取上清液和洗脱的核酸溶液转移过程中会有部分核酸被遗弃，这不利于微量样品的核酸提取和检测，也间接降低了检测灵敏度。
发明内容
本申请的目的是提供一种改进的用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法。
本申请采用了以下技术方案：
本申请的一方面公开了一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒，包括细胞裂解液、磁珠和洗涤液，其中，细胞裂解液中含有异硫氰酸胍、Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠。
需要说明的是，本申请的磁珠法核酸提取试剂盒中，通过在细胞裂解液中添加Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠，并配合异硫氰酸胍，可以快速、充分的破坏细胞，使蛋白质变性，促使蛋白与核酸的有效分离，释放出核酸；从而提高了细胞裂解液的工作效率，缩短了核酸释放的时间。并且，本申请的细胞裂解液是细胞裂解和磁珠结合的溶液，也就是说，在使用时，将细胞裂解液、磁珠和待处理细胞混合在一起进行反应，在细胞破碎释放核酸的同时，进行核酸与磁珠的结合；因此，本申请的细胞裂解液不仅能够缩短核酸释放的时间，也能够节省核酸与磁珠结合的时间，进一步提高了本申请磁珠法核酸提取试剂盒的效率。
可以理解，本申请的关键在于在细胞裂解液中添加异硫氰酸胍、Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠，至于细胞裂解液中的常规组分，例如裂解缓冲液等，可以参考现有的磁珠法核酸提取试剂盒；但是，本申请为了确保细胞裂解液的效率和质量，对裂解缓冲液等其它组分进行了限定，详见后续技术方案。另外，本申请的细胞裂解液中还可以添加其它的添加剂或功能性试剂，使细胞裂解液具备相应的功能，只要不影响异硫氰酸胍和Triton X-100等的性能即可，例如还可以添加消泡剂、金属离子螯合剂等。
优选的，细胞裂解液中，异硫氰酸胍浓度为2mol/L～4mol/L，Triton X-100含量为1vol％～5vol％，3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸含量为5～50g/L，N-月桂酰肌氨酸钠含量为1～10g/L。
需要说明的是，虽然本申请的关键在于在细胞裂解液中添加异硫氰酸胍、TritonX-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠，只要在细胞裂解液中添加这四种组分，即可不同程度的提高细胞裂解液的效率；但是，本申请进一步的研究发现，特定浓度的Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠，配合高浓度的异硫氰酸胍，可以获得更好的细胞裂解和磁珠结合效果。
优选的，细胞裂解液还含有聚乙二醇。
优选的，细胞裂解液中，聚乙二醇含量为50～200g/L。
优选的，聚乙二醇为PEG4000、PEG6000或PEG8000。
需要说明的是，本申请在细胞裂解液中添加聚乙二醇可以使沉淀的核酸进一步浓缩，促进核酸与磁珠的结合，进一步提高核酸与磁珠结合的效率，缩短磁珠结合时间。可以理解，只要添加聚乙二醇就可以达到使沉淀核酸浓缩的效果；但是，为了确保细胞裂解液其它组分的功能和效果，本申请优选的采用聚乙二醇含量为50～200g/L；在该范围内既能够很好的保障核酸浓缩，促进核酸与磁珠结合，又不会因为聚乙二醇用量太高导致细胞裂解液太粘稠。
优选的，细胞裂解液还含有裂解缓冲液、金属离子螯合剂、负电荷中和剂和消泡剂。
其中，裂解缓冲液用于为细胞裂解和磁珠与核酸结合提供反应环境；金属离子螯合剂用于与二价金属离子结合，例如Mg离子、Ca离子、Mn离子、Fe离子等；负电荷中和剂用于与核酸中的磷酸根结合，中和核酸磷酸根的负电荷，使核酸与水分子的作用力减弱，溶解度降低，从而使核酸沉淀；消泡剂用于消除细胞裂解液产生的泡沫。
需要说明的是，本申请在细胞裂解液中进一步添加金属离子螯合剂、负电荷中和剂和消泡剂，其关键在于各组分相互配合，进一步提高细胞裂解液的效率。其中，具体的裂解缓冲液可以参考常规的磁珠法；金属离子螯合剂的作用是结合二价金属离子，只要具有该作用且不会对核酸造成不利影响的金属离子螯合剂都可以用于本申请；负电荷中和剂的作用是中和核酸磷酸根的负电荷，使核酸沉淀，只要能够起到中和核酸磷酸根负电荷作用的试剂也都可以用于本申请；本申请采用负电荷中和剂使核酸沉淀，无需使用异丙醇或无水乙醇，避免了异丙醇或无水乙醇对后续工艺或检测的影响；消泡剂的作用是消除泡沫，常规的消泡剂都可以用于本申请。本申请的关键在于各组分的有机组合，至于各功能组分的具体选择可以根据其定义进行常规选择；但是，为了达到更好的效果，本申请对各组分都进行了详细限定，详见以下技术方案。
优选的，裂解缓冲液为Tris-HCL，Tris-HCL在细胞裂解液中的浓度为10mmol/L～100mmol/L。
需要说明的是，Tris-HCL只是细胞裂解液比较常规使用的缓冲液，不排除还可以采用其它缓冲液。但是，本申请考虑到细胞裂解和磁珠结合，优选采用10mmol/L～200mmol/L的Tris-HCL作为裂解缓冲液。
优选的，金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸(EDTA)，乙二胺四乙酸在细胞裂解液中的浓度为5mmol/L～50mmol/L、pH8.0。
需要说明的是，一定量的EDTA能与Mg、Ca、Mn、Fe等二价金属离子结合，抑制核酸酶的活性，保证核酸的完整性；可以理解，除EDTA以外，不排除还可以采用其它类型的金属离子螯合剂，只要不对核酸或者细胞裂解液中的其它组分造成不利影响即可。
优选的，负电荷中和剂为NaCl，NaCl在细胞裂解液中的浓度为0.28mol/L～0.5mol/L。
需要说明的是，特定比例的NaCl中，其钠离子可以中和核酸磷酸根的负电荷，使核酸与水分子之间的作用力减弱，溶解度降低，有利于核酸沉淀；可以理解，除NaCl以外，不排除还可以采用其它类型的负电荷中和剂，只要不对核酸或者细胞裂解液中的其它组分造成不利影响即可。
优选的，消泡剂为Antifoam204，Antifoam204在细胞裂解液中的浓度为0.01vol％～0.1vol％。其中，Antifoam204即消泡剂204，可以通过市售购买获得。
需要说明的是，消泡剂的作用就是消除试剂产生的泡沫，有利于生产和提取操作。可以理解，除Antifoam204以外，不排除还可以采用其它类型的消泡剂，只要不对核酸或者细胞裂解液中的其它组分造成不利影响即可。
优选的，细胞裂解液由10mmol/L～100mmol/L Tris-HCL、5mmol/L～50mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、2mol/L～4mol/L异硫氰酸胍、1vol％～5vol％Triton X-100、5～50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、1～10g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L～0.5mol/LNaCl、0.01vol％～0.1vol％Antifoam204、50～200g/L的聚乙二醇组成。
优选的，细胞裂解液由20mmol/L～50mmol/L Tris-HCL、10mmol/L～20mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍、2vol％～5vol％Triton X-100、10～50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、2～10g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L～0.3mol/LNaCl、0.05vol％～0.1vol％Antifoam204、50～100g/L的聚乙二醇组成。
优选的，细胞裂解液由25mmol/LTris-HCL、10mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、4mol/L异硫氰酸胍、2vol％TritonX-100、50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、5g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L NaCl、0.1vol％Antifoam204、100g/L的聚乙二醇组成。
需要说明的是，本申请的细胞裂解液，各组分在特定浓度和用量下相互配合，可以在5分钟～10分钟快速完成整个裂解过程，在70℃加热孵育条件下还可以进一步提升裂解强度和速度，相对于现有的磁珠法的裂解步骤，本申请的磁珠法核酸提取试剂盒缩短了核酸释放和结合磁珠的时间，缩短了试剂盒的检测时间。可以理解，以上具体浓度和用量只是本申请的一种实现方式中相对较好的方案，在要求较低的情况下，也可以在以上具体浓度和用量以外进行调整。本申请的细胞裂解液配合本申请改进的磁珠可以更好的捕获并结合核酸，优化提取效果。
优选的，洗涤液不含乙醇或异丙醇，洗涤液中含有NaCl和聚乙二醇。
需要说明的是，与现有的磁珠法洗涤液相比，本申请的洗涤液不使用乙醇或异丙醇，而是利用氯化钠降低核酸的溶解度，使核酸处于沉淀状态，以便于与磁珠结合；并利用聚乙二醇对核酸的浓缩作用，进一步促进核酸与磁珠的结合。采用本申请的洗涤液，一方面，将现有磁珠法的两步洗涤合并为一步洗涤，即采用本申请的洗涤液可以只需要进行一次洗涤，即可有效去除磁珠上残留的蛋白质等杂质，节省了洗涤的操作步骤和时间；另一方面，由于没有使用乙醇，不需要在洗涤后进行开盖放置，在进一步节省时间和操作步骤的同时，也避免了开盖放置造成的样本交叉污染；再一方面，本申请的洗涤液部分残留不会影响后续的PCR反应，因此，结合本申请改进的磁珠，可以在洗涤后不需要对核酸进行洗脱，直接将吸附核酸的磁珠添加到PCR反应体系中进行扩增反应，进一步的节省了时间和操作步骤。
可以理解，本申请的洗涤液，其关键在于采用NaCl和聚乙二醇替换乙醇或异丙醇，至于洗涤液中的其它组分，例如洗涤缓冲液或其它功能性组分，可以参考现有的磁珠法洗涤液；但是，本申请为了确保洗涤液的功能，优选的对洗涤缓冲液进行了限定，详见后续技术方案。
优选的，洗涤液中，NaCl的浓度为0.14mol/L～2mol/L，聚乙二醇的含量为50～200g/L。
需要说明的是，NaCl能够降低核酸的溶解度，使核酸沉淀，只要添加NaCl就能够不同程度的达到该效果；但是，为了更有效的降低核酸溶解度，本申请优选的采用NaCl的浓度为0.14mol/L～2mol/L。NaCl浓度太低，降低核酸溶解度的效果差；浓度太高，一方面核酸溶解度降低到一定程度后难以进一步降低，另一方面，也不利于洗涤液对磁珠杂质的洗涤。
优选的，聚乙二醇为PEG4000、PEG6000或PEG8000。
需要说明的是，本申请在洗涤液中添加聚乙二醇的作用是使沉淀的核酸进一步浓缩，促进核酸与磁珠的结合，进一步提高核酸与磁珠结合的效率，缩短磁珠结合时间。可以理解，只要添加聚乙二醇就可以达到使核酸浓缩的效果；但是，为了确保洗涤液的功能和效果，本申请优选的采用聚乙二醇含量为5％～20％；在该范围内既能够很好的保障核酸浓缩，促进核酸与磁珠结合，又不会因为聚乙二醇用量太高导致细胞裂解液太粘稠。
优选的，洗涤液还含有洗涤缓冲液。优选的，洗涤缓冲液为Tris-HCL，Tris-HCL在洗涤液中的浓度为10mmol/L～100mmol/L。
需要说明的是，Tris-HCL是比较常规使用的缓冲液，不排除还可以采用其它缓冲液。但是，本申请考虑到洗涤液对磁珠的洗涤效果，以及洗涤液不能影响后续的PCR反应，优选采用10mmol/L～100mmol/L的Tris-HCL作为洗涤液的缓冲液。
优选的，洗涤液由10mmol/L～100mmol/L的Tris-HCL、0.14mol/L～2mol/L的NaCl、50～200g/L的聚乙二醇组成。
优选的，洗涤液由20mmol/L～50mmol/L的Tris-HCL、0.3mol/L～0.6mol/L的NaCl、80～120g/L的聚乙二醇组成。
优选的，洗涤液由20mmol/L的Tris-HCL、0.5mol/L的NaCl、100g/L的聚乙二醇组成。
需要说明的是，本申请的洗涤液，各组分在特定浓度和用量下相互配合，不仅可以实现本申请的一步洗涤，而且提高了洗涤液的效率，节省了洗涤和核酸提取的时间。可以理解，以上具体浓度和用量只是本申请的一种实现方式中相对较好的方案，在要求较低的情况下，也可以在以上具体浓度和用量以外进行调整。
优选的，本申请的试剂盒中，磁珠内核为具有超顺磁性的纳米微球，外部包被树脂和硅羟基修饰材料，粒径在200～350nm之间，颗粒均匀，磁响应时间为1～2分钟。本申请的磁珠具有耐高温、在高温下不会释放金属离子等特性。
本申请的一种实现方式中，本申请的磁珠采用以下方法制备：
a)纳米微球的制备：将FeCl3-6H2O、无水乙酸钠和PEG 2000加入乙二醇溶液中，混匀，在氮气气氛下，室温搅拌30分钟～1小时；然后在氮气气氛下，150℃～200℃反应4～8小时；反应结束后，反应产物在磁场作用下，去除上清，即获得纳米微球，采用去离子水清洗纳米微球，备用；
b)纳米微球表面基团修饰：取步骤a)制备的纳米微球，加入无水乙醇和氨水的混合溶液中，在通入氮气的条件下搅拌，并缓慢滴加正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液，室温反应3～6小时，反应产物在磁场作用下，去除上清，采用去离子水清洗，即制备获得本申请的磁珠。
本申请的磁珠在超顺磁性微球外部包裹一层聚硅氧烷并进行了硅羟基修饰，该工艺处理使磁珠具有耐95℃高温的特性，在高温条件下不会释放出磁珠内核的金属离子，因此可以将该磁珠直接添加到PCR体系中，不会干扰DNA聚合酶的活性。
优选的，步骤a)中，FeCl3-6H2O、无水乙酸钠和PEG 2000的重量比为2～3:6～8:1～2。
优选的，步骤a)中，每20～30g的FeCl3-6H2O对应加入800mL～1L的乙二醇溶液。
优选的，步骤b)中，每20～30g的FeCl3-6H2O对应的步骤a)的产物加入400mL～1L无水乙醇和20～60mL 14％的氨水混合溶液，对于的缓慢滴加15～30mL的正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液。
优选的，步骤b)中，搅拌的转速为400～1000rpm/min。
优选的，步骤b)中，正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液缓慢滴加的速度为0.05～0.3mL/min。
优选的，步骤b)还包括采用去离子水或缓冲液重悬磁珠，获得磁珠悬浮液。
需要说明的是，本申请的磁珠法核酸提取试剂盒，分别对细胞裂解液、磁珠和洗涤液进行了改进；其中，细胞裂解液的改进，不仅缩短了细胞裂解的时间，还能够促进核酸与磁珠的结合；磁珠的改进，可以使本申请吸附核酸的磁珠直接添加到PCR反应体系中，无需对核酸进行洗脱，不仅节约了程序，也避免了由此造成核酸损失；洗涤液的改进，将现有的两步法洗涤改进为一步法洗涤，节约了洗涤工序，由于没有添加醇类试剂，洗涤后无需开盖放置，不仅进一步节约了洗涤试剂，而且避免了由于开盖放置造成的样本交叉污染。可以理解，本申请的试剂盒中细胞裂解液、磁珠和洗涤液的改进相对于现有的磁珠法而言都各自单独具有优点；改进的细胞裂解液、磁珠和洗涤液可以组合在本申请的试剂盒中，也可以单独与现有的磁珠法试剂组合使用。
因此，本申请的另一面分别公开了一种用于磁珠法核酸提取的细胞裂解液，一种用于磁珠法核酸提取的洗涤液，以及一种用于磁珠法核酸提取的磁珠。其中，细胞裂解液、洗涤液和磁珠即本申请试剂盒中的细胞裂解液、洗涤液和磁珠；因此，本申请的用于磁珠法核酸提取的细胞裂解液、洗涤液和磁珠的具体限定，参考本申请的磁珠法核酸提取的试剂盒。
在本申请试剂盒的磁珠制备方法的基础上，本申请的再一面公开了一种用于磁珠法核酸提取的磁珠的制备方法。该制备方法即本申请试剂盒中磁珠的制备方法。
本申请的再一面公开了本申请的磁珠法核酸提取试剂盒的使用方法，具体包括以下步骤：
步骤1：取样品至离心管中、加入磁珠和细胞裂解液，振荡混匀，室温孵育5min，中间振荡混匀1～2次；
步骤2：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体；
步骤3：将离心管从磁力架上取下，加入洗涤液，振荡混匀；
步骤4：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体；
步骤5：将离心管从磁力架上取下，加入25～50μL的PCR扩增反应液，振荡涡旋，使磁珠全部分布到PCR扩增反应液中，即完成核酸提取。
其中，步骤5是直接承接后续的PCR扩增检测，因此直接采用PCR扩增反应液重悬吸附核酸的磁珠；可以理解，如果不是立即进行PCR扩增检测，可以采用常规的水或者核酸缓冲液重悬吸附核酸的磁珠。
后续的，可以直接将混合液转移到PCR管中进行常规PCR扩增或者基于PCR扩增的检测。
本申请的使用方法中，PCR扩增反应液典型的包括PCR Buffer、引物、探针、Taq酶或/和MMLV酶、水。可以理解，以上步骤中各试剂的具体用量可以根据核酸提取对象进行调整；例如样品量可以根据具体获得的样品进行调整；磁珠的量和细胞裂解液的量也可以适应性的根据具体处理的样品量进行调整，例如，样品量多则相应的增加磁珠和细胞裂解液的量，样品量少则相应的减少用量。步骤1中的孵育时间和中间振荡混匀次数也可以根据具体的样品量调整。步骤2和步骤4中，磁力架上静置的时间，以磁珠实际有效的完全沉淀为准，一般来说，静置1min基本可以满足需求，也可以进一步优化缩短或延长静置时间，磁力架上静置1min仅供参考。
本申请的有益效果在于：
本申请的磁珠法核酸提取试剂盒，通过对裂解缓冲液的组分进行优化，可以快速、充分的裂解细胞、变性蛋白质、使蛋白质与核酸有效分离，释放出核酸；提高了细胞裂解液的工作效率，缩短了核酸提取的时间。
附图说明
图1是本申请实施例中制备的磁珠的扫描电镜图；
图2是本申请实施例中采用方案一和方案二细胞裂解液提取模拟细菌感染血清样本B1核酸的白色念珠菌实时荧光PCR检测结果；
图3是本申请实施例中采用不同配方细胞裂解液提取模拟病毒感染血清样本核酸的猪传染性胃肠炎病毒实时荧光PCR检测结果；
图4是本申请实施例中采用不同配方细胞裂解液提取模拟病毒感染血清样本核酸的鸡痘病毒实时荧光PCR检测结果；
图5是本申请实施例中采用不同核酸提取方法提取模拟细菌感染血清样本核酸的大肠杆菌实时荧光PCR检测结果；
图6是本申请实施例中采用不同核酸提取方法提取模拟细菌感染血清样本核酸的粪肠球菌实时荧光PCR检测结果；
图7是本申请实施例中采用不同核酸提取方法提取模拟细菌感染血清样本核酸的白色念珠菌实时荧光PCR检测结果；
图8是本申请实施例中采用不同核酸提取方法提取模拟病毒感染血清样本核酸的猪传染性胃肠炎病毒实时荧光PCR检测结果；
图9是本申请实施例中采用不同核酸提取方法提取模拟病毒感染血清样本核酸的鸡痘病毒实时荧光PCR检测结果。
具体实施方式
现有的磁珠法普遍存在裂解时间长的问题；并且，磁珠吸附核酸后通常采用乙醇进行清洗，至少需要两步清洗；为了去除乙醇，还必须在清洗后进行开盖放置，增加样本交叉的污染风险；磁珠清洗完成后，必须将核酸洗脱下来再加入PCR反应液中进行检测，核酸洗脱的过程容易导致部分核酸随磁珠被遗弃，使得提取得到的核酸并不能全部投入到下一步的检测环节，减低了检测灵敏度。
针对以上问题，本申请首先对细胞裂解液进行了优化，细胞裂解液除了进行细胞裂解以外，同时也是磁珠与核酸结合的缓冲液，因此，又可以称为裂解结合液。本申请的细胞裂解液，除了基础的裂解缓冲液以外，添加有异硫氰酸胍、Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠。利用这四个组分的相互配合，实现快速充分的破坏细胞、使蛋白质变性、促使蛋白与核酸的有效分离、释放出核酸。在此基础上，本申请的优选方案中，进一步的还添加有金属离子螯合剂，用于结合金属离子，从而抑制核酸酶活性，保证核酸的完整性；为了促进核酸沉淀，本申请在细胞裂解液中添加了负电荷中和剂，用于中和核酸的磷酸根的负电荷，降低核酸的溶解度，从而使核酸沉淀，这与现有的采用异丙醇或乙醇沉淀核酸的思路完全不同；为了使沉淀的核酸聚集在一起，以便于核酸与磁珠结合，本申请的细胞裂解液中还添加了聚乙二醇，例如PEG4000、PEG6000、PEG8000；最后，为了避免细胞裂解液产生泡沫影响细胞裂解液的效果，本申请的细胞裂解液中还添加了消泡剂。
本申请的细胞裂解液从细胞破碎、蛋白质变性、核酸沉淀、磁珠结合、消泡等各方面进行优化，使得细胞裂解液可以快速、充***解细胞并释放核酸，从而提高了细胞裂解液的工作效率，节约了裂解时间。
本申请进一步的优化改进了洗涤液，现有的洗涤液通常采用含乙醇的溶液进行洗涤，因为乙醇具有沉淀核酸，保持核酸与磁珠结合稳定性的作用。本申请采用聚乙二醇和NaCl，利用一定浓度NaCl中和核酸磷酸根的负电荷，降低核酸的溶解度，使核酸保持沉淀，利用聚乙二醇，例如PEG4000、PEG6000、PEG8000浓缩核酸的功能，从而起到稳定核酸与磁珠结合的作用，因此，本申请的洗涤液不需要采用乙醇。
本申请的洗涤液，通过各组分的优化，能够一步洗涤有效去除磁珠上残留的蛋白等杂质，减少了洗涤次数和操作步骤，缩短了洗涤时间。并且，本申请的洗涤液中没有添加醇类试剂，不需要洗涤后开盖放置，不仅节约了工序和时间，而且避免了由此造成的样本交叉污染；结合本申请的磁珠，可以在本申请的洗涤液洗涤后直接向其中添加PCR反应液进行PCR扩增，残留的洗涤液不会影响后续的PCR扩增，省略了洗涤后的核酸洗脱步骤，节省了检测时间，避免了由于核酸洗脱步骤造成的核酸损失。
本申请进一步的改进了磁珠，现有的磁珠在吸附核酸，并经过洗涤后，通常需要开盖放置，然后将核酸洗脱下来才能进行下一步的PCR检测。本申请创造性的提出，如果将洗涤后的吸附有核酸的磁珠直接加入PCR反应体系中，则能够省略洗脱的步骤，而且，能够将提取的核酸全部用于PCR检测，提高检测灵敏度；但是，本申请研究发现，这存在至少两个问题：第一，吸附核酸的磁珠清洗后，虽然在磁力作用下使磁珠沉淀，去除了上清的洗涤液，但是，仍然有微量的洗涤液残留，现有常规磁珠法的洗涤液会影响PCR反应，该问题可以采用本申请改进的洗涤液解决；但是，第二，更大的问题是，现有的常规硅羟基磁珠或羧羟基磁珠本身就是PCR抑制剂或在PCR环节会释放新的抑制剂，不能直接用于PCR扩增体系。
因此，本申请对磁珠进行改进，改进后的磁珠内核为具有超顺磁性的纳米微球，外部通过特殊处理包被树脂和硅羟基修饰材料，粒径在200～350nm之间，颗粒均匀，磁响应时间控制在1～2分钟，具有耐高温、在高温下不会释放金属离子等特性；并且，本申请的磁珠在吸附核酸后，可以直接添加到PCR反应体系中，不影响PCR扩增，不仅节省了洗脱操作步骤，而且避免了洗脱造成的核酸损失，使得磁珠吸附的核酸可以全部加入PCR反应中，增加了检测灵敏度，保证了检测的准确度，降低了漏检率。本申请的磁珠结合本申请的裂解缓冲液，能够更充分的捕获并结合核酸，提高核酸提取效果和质量。
本申请的试剂盒中，裂解缓冲液、磁珠和洗涤液都是分别进行改进，因此，可以单独的使用，从而产生相应的改进效果。但是，本申请的优选方案中，将改进后的裂解缓冲液、磁珠和洗涤液组装成一个优选的试剂盒；该试剂盒通过裂解缓冲液、磁珠和洗涤液的改进，整个核酸提取过程只需10～15分钟即可完成病原体DNA的提取纯化，结合下游基于PCR或等温扩增技术的核酸检测方法，可以实现1小时内完成病原体的高灵敏度的分子检测，提高了检测效率，可以用于病原体的即时检验或现场检测。
本申请的试剂盒可以用于以下样本类型的核酸提取：血浆、血清、唾液、脑脊液、肺泡灌洗液、腹水、尿液、宫颈拭子、口腔拭子、咽拭子、培养细胞上清液、血液、组织等，可以提取的病原体类型包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、假丝酵母菌、支原体、衣原体、DNA病毒、RNA病毒等。并且，在对吸附核酸的磁珠进行洗涤后，可以免洗脱，直接将后续的PCR或RealTime PCR等的反应体系添加到吸附核酸的磁珠沉淀中，混匀后进行反应。
下面通过具体实施例对本申请作进一步详细说明。以下实施例仅对本申请进行进一步说明，不应理解为对本申请的限制。
下述实施例使用的试剂、耗材和设备包括：
主要试剂：Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)RR390A和One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit(Perfect Real Time)RR064A购自TaKaRa，猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗购自哈维科，鸡痘病毒疫苗购自优倍威，正常山羊血清AR0009购自博士德。
主要耗材：200μL的八联管PCR-0208-C、0.2mL透明PCR八联管平盖PCR-02FCP-C和1.5mL的无DNase离心管MCT-150-C均购自Axygen。
主要设备：涡漩振荡器采用Vortex的QL-901，荧光定量PCR仪采用雅睿生物的MA6000P，恒温振荡金属浴为实验室常规设备。
下述实施例使用的样本的制备过程如下：
本例为更好地说明本例试剂盒在病毒样本提取方面的性能优势，采用猪传染性胃肠炎病毒疫苗作为RNA病毒代表、鸡痘病毒疫苗作为DNA病毒代表，分别制备成模拟病毒感染的血清样本，然后分别采用本例的试剂盒、其它对比试剂盒或对比试剂进行RNA和DNA的提取。其中模拟病毒感染的血清样本的制备步骤如下：
操作1：吸取2.5mL山羊血清加入到猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻、猪轮状病毒三联活疫苗瓶中，吹打混匀后，待用；
操作2：吸取2.5mL山羊血清加入到鸡痘病毒疫苗瓶中，吹打混匀后，待用；
操作3：将上述操作1和操作2的混合液添加到一起混匀，即得到5mL模拟病毒感染的血清样本原液，标记为V1；
操作4：采用9mL山羊血清，加入操作3的1mL的V1血清溶液中，涡旋混匀，标记为V2，依次按10倍梯度稀释操作，分别标记为V3、V4、V5、V6。
下述实施例为更好地说明本例试剂盒在病毒样本提取方面的性能优势，采用大肠杆菌标准菌株作为革兰氏阴性菌株代表、粪肠球菌作为革兰氏阳性菌株代表、白色念珠菌作为假丝酵母菌代表制备成模拟细菌感染的血清样本，然后分别采用本例的试剂盒、其它对比试剂盒或对比试剂进行RNA和DNA的提取。其中模拟细菌感染的血清样本的制备步骤如下：
操作1：准备3支1.5mL离心管，第一支离心管加入1.5mL的OD值为1的大肠杆菌菌液、第二支离心管加入1.5mL的OD值为1的粪肠球菌菌液、第三支离心管加入1.5mL的OD值为1的白色念珠菌菌液，3支离心管8000rpm离心5min，去除上清液，分别加入1mL山羊血清吹打混匀底部菌株沉淀，吹打混匀后吸出菌液加入到同一管15mL离心管中，再补加2mL山羊血清，混匀后得到5mL混合菌液，标记为B1。
操作2：采用9mL正常山羊血清，加入操作1的1mL的B1血清溶液，涡旋混匀，标记为B2，依次10倍梯度稀释操作，分别得到B3、B4、B5、B6。
下述实施例使用的引物和探针：
采用的核酸检测技术为TaqMan探针法荧光定量PCR技术，针对检测对象分别设计引物和探针，引物和探针的序列如表1所示。
表1实施例用引物和探针
Figure BDA0002324598710000131
表1中，所有探针的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。
实施例1细胞裂解液配方初步优化
本实施例设计了两种细胞裂解液配方，用于进行初步的试验方案筛选。
方案一的配方为：25mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)、1％SDS、1％3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、0.5％N-月桂酰肌氨酸钠、1MNaCl、0.1％Antifoam204、10％PEG6000。
方案二的配方为：25mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)、4M异硫氰酸胍、5vol％Triton X-100、10g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、5g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28MNaCl、0.1vol％Antifoam204、100g/LPEG 6000。
本实施例采用的洗涤液配方为20mM Tris-HCL、0.5M NaCL、100g/LPEG6000。
本实施例的磁珠采用以下方法制备：
a)制备纳米微球：称取30g FeCl3-6H2O、80g无水乙酸钠和20g PEG2000加入到三口烧瓶中，再加入1L乙二醇溶液，机械搅拌混匀，同时通入氮气，室温搅拌持续反应1小时；将上述溶液转移至反应釜中，并通入氮气排除反应釜中上方空气，将反应釜放入烘箱，200℃反应6小时；反应结束后，等反应釜冷却至室温后，将产物转移至烧杯，将烧杯加上磁场，在磁场作用下，去除上清，并采用去离子水清洗磁珠4次，即获得本实施例的纳米微球；
b)纳米磁珠的表面基团修饰：取步骤a)制备的纳米微球转移至三口烧杯中，加入1L无水乙醇、60mL 14％的氨水溶液，在通入氮气的条件下机械搅拌，转速设定在800rpm/min，采用蠕动泵缓慢滴入30mL正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液，调整滴速为0.15mL/min。在室温条件下反应5小时。将产物转移至新的烧杯中，在磁场的作用下分离磁珠，去除上清溶液，并采用去离子水清洗磁珠4次，即获得本实施例的磁珠。
磁珠采用去离子水清洗，去上清后，采用磁珠缓冲液重悬，获得磁珠悬浮液；本例进一步的，用磁珠缓冲液将磁珠悬浮液稀释为5mg/mL浓度。其中，磁珠缓冲液由5mM Tris-HCL和10g/LPEG6000组成。
采用扫描电镜观察本实施例制备的磁珠，结果如图1所示，图1的结果显示，本实施例制备获得了粒径均匀的磁珠。
本实施例采用模拟细菌感染的血清样本B1作为核酸提取样本，并通过提取的核酸中的白色念珠菌核酸的含量作为核酸提取质量的判定标准。
核酸提取步骤如下：
步骤1：取200μL血清样本B1至1.5mL离心管中，加入10μL本实施例制备的磁珠和200μL的细胞裂解液，充分振荡混匀，70℃孵育5min，中间振荡混匀2次。其中，细胞裂解液为方案一的配方或方案二的配方。
步骤2：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤3：将离心管从磁力架上取下，加入200μL本实施例的洗涤液，振荡10s混匀。
步骤4：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤5：将离心管从磁力架上取下，加入25μLPCR扩增液，振荡涡旋使磁珠全部分布到PCR扩增液中。
步骤6：将PCR扩增液转移到PCR管中进行下一步PCR扩增即可。
其中，25μL PCR扩增液包括：2×PCR Mix、2.5μLprimerMix(包括1μL 10nM CalF、1μL 10nM CalR和0.5μL 10nM CalP)、5μL H2O、5μLDNA模板。
白色念珠菌检测采用的PCR扩增程序设置为：95℃预变性3min，然后进入40个循环：95℃10s、55℃30s，在循环的过程中，于55℃收集FAM荧光信号。
本实施例分别对采用方案一的配方提取的核酸和采用方案二的配方提取的核酸进行三次重复的白色念珠菌PCR扩增检测，结果如表2和图2所示。
表2白色念珠菌PCR扩增检测Ct值
Figure BDA0002324598710000151
表2和图2的结果显示，方案一配方的细胞裂解液对白色念珠菌代表的假丝酵母菌的核酸提取性能不佳，满足不了检测需求，方案二配方的细胞裂解液可以提取白色念珠菌DNA，因此本例均采用方案二配方的细胞裂解液，及其对应使用的洗涤液作为验证配方。
实施例2细胞裂解液配方优化
为进一步优化细胞裂解液配方，本实施例针对实施例1中方案二的配方中的异硫氰酸胍、TritonX100、PEG6000、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸等主要成分的浓度进行优化试验。优化方案如表3所示，表3中配方9在配置完成后放置于室温会出现结晶现象，不适合做细胞裂解液。
表3细胞裂解液配方优化
编号 组分1 组分2 组分3 组分4 组分5 组分6 组分7 组分8 组分9
配方1 2M 1vol％ 0 5 5 0.28M 0.1vol％ 10mM 10mM
配方2 2M 2vol％ 100 10 5 0.28M 0.1vol％ 10mM 10mM
配方3 2M 5vol％ 200 50 5 0.28M 0.1vol％ 10mM 10mM
配方4 3M 5vol％ 0 10 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方5 3M 1vol％ 100 50 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方6 3M 2vol％ 200 5 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方7 4M 2vol％ 0 50 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方8 4M 5vol％ 100 5 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方9 4M 1vol％ 200 10 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
表3中，组分1为异硫氰酸胍、组分2为Triton X-100、组分3为PEG 6000、组分4为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、组分5为N-月桂酰肌氨酸钠、组分6为NaCl、组分7为Antifoam 204、组分8为Tris、组分9为EDTA。表3中，组分3、组分4和组分5的单位为“g/L”。
本实施例的洗涤液与实施例1的相同，并采用实施例1相同的磁珠进行核酸提取。本实施例采用实施例1相同的模拟细菌感染的血清样本B1作为核酸提取样本，并通过提取的核酸中的白色念珠菌核酸的含量作为核酸提取量的判定标准。核酸提取和白色念珠菌检测都与实施例1相同。提取步骤和检测方法同实施例1，本例进行三次重复的白色念珠菌PCR扩增检测，结果如表4所示。
表4不同配方提取的核酸样品白色念珠菌PCR扩增检测Ct值
Figure BDA0002324598710000161
根据表4的检测结果，进一步统计异硫氰酸胍、Triton X100、PEG6000、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸四个组分在不同浓度下的Ct值，结果如表5所示。
表5各组分不同浓度提取的核酸样品白色念珠菌PCR扩增检测Ct值
组分1 Ct 组分2 Ct 组分3 Ct 组分4 Ct
2M 24.04 1vol％ 23.4 0 38.1 5g/L 23.3
3M 23.47 2vol％ 22.3 10g/100mL 15.7 10g/L 23.5
4M 21.32 5vol％ 23.2 20g/100mL 15.1 50g/L 22.0
表5的中，组分1为异硫氰酸胍，组分2为Triton X-100，组分3为PEG 6000，组分4为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸；各组分下对应的浓度是指该组份在细胞裂解液中的浓度，对应的Ct值是九个配方中，所有该组份浓度相同的配方检测获得的三个重复Ct平均值的平均，例如组分1的异硫氰酸胍，浓度为2M对应的Ct值24.04，该Ct值是九个配方中所有异硫氰酸胍浓度为2M的配方检测的三个重复Ct平均值的平均，具体的，即配方1三个重复Ct平均值、配方2三个重复Ct平均值和配方3三个重复Ct平均值，三者的平均，(40.00+16.60+15.52)÷3＝24.04。其余组分类同。
表4和表5的结果显示，PEG6000对于核酸结合具有关键作用，但是当PEG6000浓度过高时，导致细胞裂解液比较粘稠，平行样本测试数据来看，200g/L的PEG6000的变异系数较大，数据不稳定，因此采用100g/L的PEG6000可以满足要求。
为进一步优化细胞裂解液配方，本实施例针对实施例1中方案二的配方中的异硫氰酸胍、Antifoam204、Tris-HCl、EDTA(pH8.0)等成分的浓度进一步优化试验。优化方案如表6所示。
表6细胞裂解液配方进一步优化
编号 组分1 组分2 组分3 组分4 组分5 组分6 组分7 组分8 组分9
配方10 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方11 4M 2vol％ 100 50 5 0M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方12 4M 2vol％ 100 50 5 0.5M 0.1vol％ 25mM 10mM
配方13 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 0vol％ 25mM 10mM
配方14 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 1vol％ 25mM 10mM
配方15 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 0.1vol％ 50mM 10mM
配方16 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 0.1vol％ 100mM 10mM
配方17 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 20mM
配方18 4M 2vol％ 100 50 5 0.28M 0.1vol％ 25mM 25mM
表6中组分1为异硫氰酸胍、组分2为TritonX-100、组分3为PEG 6000、组分4为3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、组分5为N-月桂酰肌氨酸钠、组分6为NaCl、组分7为Antifoam 204、组分8为Tris、组分9为EDTA。其中，组分3、组分4和组分5的单位为“g/L”。
本例进行三次重复的白色念珠菌PCR扩增检测，结果如表7所示。
表7不同配方提取的核酸样品白色念珠菌PCR扩增检测Ct值
Figure BDA0002324598710000171
Figure BDA0002324598710000181
表6和表7的结果显示，NaCl的最佳浓度为0.28M，Antifoam204主要功能是消除裂解液产生的泡沫，浓度为0.1％时效果满足需求，浓度达到1％时对于核酸的提取没有影响，去除泡沫效果与0.1vol％一致，因此Antifoam204的推荐浓度采用0.1vol％。Tris-HCl和EDTA的浓度对提取性能的影响不显著，综合考虑分别推荐浓度为25mM和10mM。通过以上数据可以看出细胞裂解液更优配方为25mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)、4M异硫氰酸胍、2vol％Triton X-100、50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、5g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28MNaCl、0.1vol％Antifoam 204、100g/L的PEG 6000，后续实施例均采用该配方进行。
实施例3洗涤液配方优化
为进一步优化洗涤液配方，本实施例针对洗涤液主要组分浓度进行优化，如表8所示。本实施例的细胞裂解液为实施例2优化的配方，采用实施例1相同的磁珠进行核酸提取。本实施例采用实施例1相同的模拟细菌感染的血清样本B1作为核酸提取样本，并通过提取的核酸中的白色念珠菌核酸的含量作为核酸提取量的判定标准。核酸提取和白色念珠菌检测都与实施例1相同。同样的，每个配方提取的核酸样品、提取步骤和检测方法同实施例1，本例进行三次重复的白色念珠菌PCR扩增检测，结果如表9所示。
表8洗涤液配方进一步优化
Figure BDA0002324598710000182
Figure BDA0002324598710000191
表9不同配方的洗涤液提取的核酸样品白色念珠菌PCR扩增检测Ct值
Figure BDA0002324598710000192
根据表9的检测结果，进一步统计PEG 6000、NaCl和Tris三个组分在不同浓度下的Ct值，结果如表10所示。
表10不同配方的洗涤液提取的核酸样品白色念珠菌PCR扩增检测Ct值
PEG6000 Ct CV％ NaCl Ct CV％ Tris Ct CV％
50g/L 19.164 2.3 0.14M 16.24 2.85 10mM 16.10 3.65
100g/L 15.052 1.8 0.5M 15.80 3.61 20mM 16.09 4.88
150g/L 15.067 5.1 1M 16.10 2.92 50mM 16.08 2.70
200g/L 15.101 5.3 2M 16.24 5.11 100mM 16.12 3.26
表8、表9和表10的结果显示，PEG6000的浓度在100g/L至200g/L之间，提取性能最好，且不同浓度之间的提取性能差异不显著，但是聚乙二醇浓度达到150g/L以上，洗涤液变得粘稠，不同平行样本之间的变异系数差异较大，因此最佳浓度为100g/L；NaCl最佳浓度为0.5M，Tris-HCl的浓度对提取性能的影响不显著，综合考虑推荐浓度为20mM。通过以上数据可以看出洗涤液更优配方为20mmol/L的Tris-HCL、0.5mol/L的NaCl、100g/L的聚乙二醇，后续实施例均采用该配方进行。
实施例4不同核酸提取方法提取血清中病毒DNA和RNA的对比试验
本实施例对比分析了本例试剂盒核酸提取方法，以及常规磁珠法、Chelex100煮沸法提取血清中的DNA病毒和RNA病毒的核酸提取性能。
其中，常规磁珠法是由蛋白酶K溶液、裂解液、蛋白洗涤液、盐离子洗涤液、洗脱液等组分组成。常规磁珠法的中各组分的详细配方如下：
裂解液由50mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)、5M异硫氰酸胍、10％Triton X-100组成。
蛋白洗涤液由20mM Tris-HCl、10mM EDTA(pH8.0)、3M异硫氰酸胍、56％乙醇组成。
盐离子洗涤液由10mM Tris-HCl、80％乙醇组成。
洗脱液为RNasefree的去离子纯化水。
Chelex100煮沸法的裂解液配方为：10mM Tris-HCL、2mM EDTA、1％NP-40、5％Chelex100。
常规磁珠法的核酸提取步骤如下：
步骤1：取200μL样品至1.5mL离心管中，加入20μL蛋白酶K溶液、200μL裂解液，充分振荡混匀，56℃孵育15min，中间振荡混匀2次。
步骤2：加入250μL异丙醇溶液，充分振荡混匀，再加入20μL磁珠溶液，充分振荡混匀，室温下静置5分钟，中间振荡混匀2次。
步骤3：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤4：将离心管从磁力架上取下，加入500μL蛋白洗涤液，振荡10s混匀。
步骤5：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤6：将离心管从磁力架上取下，加入500μL去盐离子洗涤液，振荡10s混匀。
步骤7：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤8：重复步骤6～7。
步骤9：用移液器吸弃管的底部液体残留，室温开盖放置5min。
步骤10：加入100μL洗脱液于管内，56℃孵育5min。
步骤11：置磁力架上，静置2min，吸取上清液至新的离心管中备用，即完成核酸提取。
Chelex100煮沸法核酸提取步骤如下：
步骤1：取100μL样品至1.5mL离心管中加入100μL Chelex100裂解液，充分振荡混匀，90℃孵育5min，中间振荡混匀2次。
步骤2：将1.5mL离心管置于离心机上，8000rpm，离心5min。
步骤3：转移100μL上清液至新的离心管中备用，即完成核酸提取。
本实施例试剂盒中的细胞裂解液为实施例2优化的配方，洗涤液为实施例3优化的配方，其余参考实施例1。
所不同的是，本实施例采用模拟病毒感染的血清样本V1、V2、V3、V4、V5、V6作为核酸提取样本，分别采用本例试剂盒的磁珠法、常规磁珠法和Chelex100煮沸法，分别提取血清样本V1、V2、V3、V4、V5、V6的核酸，然后通过检测提取核酸中的猪传染性胃肠炎病毒核酸和鸡痘病毒核酸的含量，作为核酸提取质量的判定标准。
猪传染性胃肠炎病毒PCR扩增反应体系为25μL，包括：12.5μL 2×PCR MIX、2.5μLPrimer MIX(包括1μL10nM上游引物、1μL10nM下游引物、0.5μL10nM探针)、5μL H2O、5μLDNA模板。
猪传染性胃肠炎病毒检测采用的PCR扩增程序设置为：50℃恒温20min，95℃预变性3min，然后进入40个循环：95℃10s、55℃30s，在循环的过程中，于55℃收集FAM荧光信号。
鸡痘病毒PCR扩增反应体系为25μL，包括：12.5μL 2×PCR MIX、2.5μL PrimerMIX(包括1μL10nM上游引物、1μL10nM下游引物、0.5μL10nM探针)、5μL H2O、5μLDNA模板。
鸡痘病毒检测采用的PCR扩增程序设置为：95℃预变性3min，然后进入40个循环：95℃10s、55℃30s，在循环的过程中，于55℃收集FAM荧光信号。
提取的每个核酸样品进行三次重复试验检测，猪传染性胃肠炎病毒的检测结果如表11和图3所示，鸡痘病毒的检测结果如表12和图4所示。
表11不同核酸提取方法获得的核酸样品的猪传染性胃肠炎病毒的检测结果
Figure BDA0002324598710000221
表12不同核酸提取方法获得的核酸样品的鸡痘病毒的检测结果
Figure BDA0002324598710000222
表11、表12、图3和图4的结果显示，Chelex100煮沸法适合提取DNA病毒样本，不适合提取RNA病毒的核酸，同时可以看出本例试剂盒在提取高浓度样本中的DNA病毒和RNA病毒的核酸性能上与常规磁珠法一致，在提取低浓度样本中的DNA病毒和RNA病毒的核酸性能上显著性的优于常规磁珠法和Chelex100法。
实施例5不同核酸提取方法提取血清中细菌DNA对比试验
本实施例对比分析了本例试剂盒核酸提取方法，以及常规磁珠法、Chelex100煮沸法提取血清中的细菌DNA的核酸提取性能。
本实施例采用的常规细菌核酸提取磁珠法是由溶菌酶溶液、蛋白酶K溶液、裂解液、蛋白洗涤液、盐离子洗涤液、洗脱液组成。其中，裂解液、蛋白洗涤液、盐离子洗涤液、洗脱液都与实施例4相同。
本实施例采用的Chelex100煮沸法裂解液配方与实施例4相同。
细菌核酸提取的常规磁珠法步骤如下：
步骤1：取200μL样品至1.5mL离心管中、10000rpm离心5min，去除上清液、加入100μL溶菌酶溶液，充分振荡混匀，37℃孵育15min，中间振荡混匀2次。
步骤2：加入20μL蛋白酶K溶液、300μL裂解液，充分振荡混匀，65℃孵育15min，中间振荡混匀2次。
步骤3：加入350μL异丙醇溶液，充分振荡混匀，再加入20μL磁珠溶液，充分振荡混匀，室温下静置5分钟，中间振荡混匀2次。
步骤4：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤5：将离心管从磁力架上取下，加入500μL蛋白洗涤液，振荡10s混匀。
步骤6：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤7：将离心管从磁力架上取下，加入500μL去盐离子洗涤液，振荡10s混匀。
步骤8：将离心管放置磁力架上静置1min，磁珠完全吸附后吸弃上清液体。
步骤9：重复步骤7～8。
步骤10：用移液器吸弃管的底部液体残留，室温开盖干燥5min。
步骤11：加入100μL洗脱液于管内，56℃孵育5min。
步骤12：置磁力架上，静置2min，吸取上清液至新的离心管中备用，即完成核酸提取。
Chelex100煮沸法提取核酸步骤与实施例4相同。
本实施例试剂盒中的细胞裂解液为实施例2优化的配方，洗涤液为实施例3优化的配方，其余参考实施例1。
所不同的是，本实施例采用模拟细菌感染的血清样本B1、B2、B3、B4、B5、B6作为核酸提取样本，分别采用本例试剂盒的磁珠法、常规磁珠法和Chelex100煮沸法，分别提取血清样本B1、B2、B3、B4、B5、B6的核酸，然后通过检测提取核酸中的大肠杆菌核酸、粪肠球菌核酸、白色念珠菌核酸的含量，作为核酸提取质量的判定标准。
大肠杆菌核酸、粪肠球菌核酸、白色念珠菌核酸的PCR扩增反应体系相同，所不同的仅仅是各检测体系添加相应的引物和探针，PCR扩增反应体系为25μL，包括：12.5μL 2×PCRMIX、2.5μLPrimer MIX(包括1μL10nM上游引物、1μL10nM下游引物、0.5μL10nM探针)、5μLH2O、5μLDNA模板。
大肠杆菌核酸、粪肠球菌核酸、白色念珠菌核酸的PCR扩增程序相同，PCR扩增程序设置为：95℃预变性3min，然后进入40个循环：95℃10s、55℃30s，在循环的过程中，于55℃收集FAM荧光信号。
大肠杆菌核酸的检测结果如表13和图5所示，粪肠球菌核酸的检测结果如表14和图6所示，白色念珠菌核酸的检测结果如表15和图7所示。
表13不同核酸提取方法获得的核酸样品的大肠杆菌的检测结果
样本 常规磁珠法Ct值 Chelex100煮沸法Ct值 本例试剂盒磁珠法Ct值
B1 15.10 16.88 11.92
B2 19.13 20.87 15.09
B3 21.72 23.91 20.21
B4 24.84 25.62 23.57
B5 27.72 30.10 26.50
B6 35.90 37.02 30.54
表14不同核酸提取方法获得的核酸样品的粪肠球菌的检测结果
样本 常规磁珠法Ct值 Chelex100煮沸法Ct值 本例试剂盒磁珠法Ct值
B1 15.06 19.81 15.68
B2 19.46 20.89 18.11
B3 22.81 24.28 22.99
B4 25.88 29.76 27.35
B5 29.67 33.24 29.82
B6 33.62 NA 32.50
表15不同核酸提取方法获得的核酸样品的白色念珠菌的检测结果
样本 常规磁珠法Ct值 Chelex100煮沸法Ct值 本例试剂盒磁珠法Ct值
B1 25.55 28.23 22.80
B2 28.93 30.84 25.37
B3 31.20 35.38 28.33
B4 33.53 36.84 31.11
B5 34.89 36.32 33.49
B6 40.00 NA 37.68
表13、表14、表15、图5、图6和图7的结果显示，Chelex100煮沸法在提取革兰氏阳性菌、假丝酵母菌等样本上性能相对于常规磁珠法和本例试剂盒的磁珠法性能较差，灵敏度差一个数量级，不适合革兰氏阳性菌和真菌等核酸的提取。本例试剂盒磁珠法在提取高浓度革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、假丝酵母菌等类型的核酸性能上与常规磁珠法一致，在提取低浓度样本中的细菌核酸性能上显著性的优于常规磁珠法和Chelex100煮沸法。
实施例6不同核酸提取方法提取血清中病毒DNA和RNA的对比试验
专利申请CN105420230A一种磁珠法提取核酸的裂解液(以下简称对比试验)，其主要提供了一种裂解液改进的磁珠法试剂盒以及相应的核酸提取磁珠法，该专利申请与本申请部分类似，即都是通过细胞裂解液优化，加快裂解进程；所不同的是，专利申请CN105420230A的裂解液具体组份，与本申请的细胞裂解液具体组份不同；因此，两者的优化效果和功能也有所不同。
本例对比分析了本例试剂盒磁珠法与对比试验磁珠法提取血清中的DNA病毒和RNA病毒的核酸提取性能。
其中，对比试验的裂解液和洗涤液都是专利申请CN105420230A中最终优化的裂解液和洗涤液配方，即其“实施例3”的裂解液和洗涤液配方，具体的，其裂解液由0.3N氢氧化钠、0.45M氯化钾、0.03％N-月桂酰肌氨酸钠、5mM EDTA、0.45M Tris-HCL、1％曲通X-100和3mM DTT组成。洗涤液为0.3M氯化钾，并用乙酸将pH值调至4。其中，裂解液中没有添加溴酚蓝，洗涤液中没有添加石绿，因为，这两者仅仅是用于直观的通过颜色变化观察，对裂解和洗涤本身没有促进作用；而本试验后续需要采用实时荧光PCR检测，为了避免染料影响后续的PCR检测，因此不添加溴酚蓝和石绿。
对比试验的核酸提取步骤参考专利申请CN105420230A。
本实施例试剂盒中的细胞裂解液为实施例2优化的配方，洗涤液为实施例3优化的配方，其余参考实施例1。
本例采用模拟病毒感染的血清样本V1、V3、V5、V6作为核酸提取样本，分别采用本例试剂盒的磁珠法和专利申请CN105420230A对比试验的磁珠法，分别提取血清样本V1、V3、V5、V6的核酸，然后通过检测提取核酸中的猪传染性胃肠炎病毒核酸和鸡痘病毒核酸的含量，作为核酸提取质量的判定标准。
猪传染性胃肠炎病毒和鸡痘病毒的检测反应体系和反应条件与实施例4相同。
提取的每个核酸样品进行三次重复试验检测，猪传染性胃肠炎病毒的检测结果如表16和图8所示，鸡痘病毒的检测结果如表17和图9所示。
表16不同核酸提取方法获得的核酸样品的猪传染性胃肠炎病毒的检测结果
Figure BDA0002324598710000251
Figure BDA0002324598710000261
表17不同核酸提取方法获得的核酸样品的鸡痘病毒的检测结果
Figure BDA0002324598710000262
表16、表17、图8和图9的结果显示，专利申请CN105420230A的磁珠法对病毒感染的血清样本的病毒DNA提取效果较差，而本例试剂盒磁珠法对鸡痘病毒核酸提取效果显著优于对比试验，如表17所示。对于病毒RNA的提取效果，本例试剂盒磁珠法也具有更好的效果，如表16所示。
总的来说，本例试剂盒磁珠法的核酸提取步骤包括，细胞裂解液裂解、上磁力架、洗涤液洗涤，并且，洗涤后不需要洗脱步骤；常规磁珠法主要包括酶消化步骤、裂解液裂解步骤、裂解后核酸与磁珠结合步骤、上磁力架、第一次洗涤、第二次洗涤、开盖放置以及洗脱；Chelex100煮沸法主要包括裂解液裂解、核酸与磁珠结合以及离心分离；专利申请CN105420230A磁珠法主要包括裂解液裂解、上磁力架、洗涤液洗涤；以上各方法各步骤所用时间以及总时间统计结果如表18所示。
表18不同核酸提取方法的各步骤所用时间以及总耗时(min)
步骤 本例磁珠法 常规磁珠法 Chelex100煮沸法 对比试验磁珠法
酶消化步骤 0 15 0 0
裂解液 5 15 5 5
磁珠结合 0 5 5 0
上磁力架 2 2 0 2
第一洗涤 3 3 0 3
第二洗涤 0 5 0 0
开盖放置 0 10 0 0
洗脱 0 5 0 0
总时间 10 60 10 10
表18中，Chelex100煮沸法的“磁珠结合”时间实际上是其裂解后的“离心”时间，Chelex100煮沸法不存在磁珠结合，Chelex100煮沸法实际上就只有裂解液裂解和离心分离步骤，因此，其它步骤的时间都是0；上磁力架的时间是总的两次上磁力架的时间之和；“本例磁珠法”中“裂解液”裂解时间5min实际上也是磁珠结合的时间，也就是说，细胞裂解释放核酸和磁珠结合是同时进行的，因此，“磁珠结合”的时间为0；“对比试验磁珠法”即专利申请CN105420230A“实施例3”的磁珠法方案。
表18的结果显示，从总时间来看，本例试剂盒、Chelex100煮沸法和对比试验都能够达到快速提取核酸的目的；但是，根据以上试验可见，本例试剂盒对病毒DNA、病毒RNA和细菌核酸都有较好的提取效果，且无论是高浓度还是低浓度的病毒或细菌，本例试剂盒磁珠法的核酸提取效果都优于常规磁珠法、Chelex100煮沸法和对比试验。根据表18的结果，从各步骤比较来看，本例试剂盒磁珠法与对比试验磁珠法很接近，但是，根据实施例6的表16和表17的结果可见，本例试剂盒磁珠法的核酸提取效果显著优于对比试验。
因此，本例试剂盒磁珠法具有操作简单、提取时间短等特点，单个样本可以在10分钟左右完成核酸的高质量提取，且适用于病毒DNA、病毒RNA和细菌核酸等各种病原菌的核酸提取，能够满足现场检测和即时检验(POCT)的需求。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换。
SEQUENCE LISTING
<110> 深圳华大智造科技有限公司
<120> 一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒、磁珠及其制备方法
<130> 19I29285
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atcacagtta caacaaccyg ca 22
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gaacttatgg tttaacctrc act 23
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagggytcac cacctactac c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
agacacacga tttgttatct 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
caaggaccya tttccrtga 19
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acatctccrc crtcgcaact t 21
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
atggaatttc gccgattttg 20
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
attgtttgcc tccctgctg 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
caaggcatat tgcgcgttg 19
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcyccatcaa catcatccgc a 21
<210> 11
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ctacaacaaa gccgtccact a 21
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<212> DNA
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<400> 12
cattaaatgt accacggatt tt 22
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cctaagccat tgtcaaagc 19
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
tgcctgtttg agcgtcgtt 19
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccttaccact accgtctttc 20

Claims (10)

1.一种用于磁珠法核酸提取的试剂盒，包括细胞裂解液、磁珠和洗涤液，其特征在于：所述细胞裂解液中含有异硫氰酸胍、Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞裂解液中，异硫氰酸胍浓度为2mol/L～4mol/L，Triton X-100含量为1vol％～5vol％，3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸含量为5～50g/L，N-月桂酰肌氨酸钠含量为1～10g/L；
优选的，所述细胞裂解液还含有聚乙二醇；
优选的，所述细胞裂解液中，聚乙二醇含量为50～200g/L；
优选的，所述聚乙二醇为PEG4000、PEG6000或PEG8000；
优选的，所述细胞裂解液还含有裂解缓冲液、金属离子螯合剂、负电荷中和剂和消泡剂；
优选的，所述裂解缓冲液为Tris-HCL，Tris-HCL在细胞裂解液中的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
优选的，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸在细胞裂解液中的浓度为5mmol/L～50mmol/L、pH8.0；
优选的，所述负电荷中和剂为NaCl，NaCl在细胞裂解液中的浓度为0.28mol/L～0.5mol/L；
优选的，所述消泡剂为Antifoam204，Antifoam204在细胞裂解液中的浓度为0.01vol％～0.1vol％。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述细胞裂解液由10mmol/L～100mmol/L Tris-HCL、5mmol/L～50mmol/L pH8.0的乙二胺四乙酸、2mol/L～4mol/L异硫氰酸胍、1vol％～5vol％的Triton X-100、5～50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、1～10g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L～0.5mol/LNaCl、0.01vol％～0.1vol％的Antifoam204、50～200g/L聚乙二醇组成；
优选的，所述细胞裂解液由20mmol/L～50mmol/L Tris-HCL、10mmol/L～20mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍、2vol％～5vol％的Triton X-100、10～50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、2～10g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L～0.3mol/L NaCl、0.05vol％～0.1vol％的Antifoam204、50～100g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述细胞裂解液由25mmol/LTris-HCL、10mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、4mol/L异硫氰酸胍、2vol％的Triton X-100、50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、5g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/LNaCl、0.1vol％的Antifoam204、100g/L的聚乙二醇组成。
4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述洗涤液不含乙醇或异丙醇，所述洗涤液中含有NaCl和聚乙二醇；
优选的，所述洗涤液中，NaCl的浓度为0.14mol/L～2mol/L，聚乙二醇的含量为50～200g/L；
优选的，所述聚乙二醇为PEG4000、PEG6000或PEG8000；
优选的，所述洗涤液还含有洗涤缓冲液；
优选的，所述洗涤缓冲液为Tris-HCL，Tris-HCL在所述洗涤液中的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
优选的，所述洗涤液由10mmol/L～100mmol/L的Tris-HCL、0.14mol/L～2mol/L的NaCl、50～200g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述洗涤液由20mmol/L～50mmol/L的Tris-HCL、0.3mol/L～0.6mol/L的NaCl、80～120g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述洗涤液由20mmol/L的Tris-HCL、0.5mol/L的NaCl、100g/L的聚乙二醇组成。
5.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于：所述磁珠内核为具有超顺磁性的纳米微球，外部包被树脂和硅羟基修饰材料，所述磁珠的粒径为200～350nm，磁响应时间为1～2分钟。
6.一种用于磁珠法核酸提取的细胞裂解液，其特征在于：所述细胞裂解液中含有异硫氰酸胍、Triton X-100、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸和N-月桂酰肌氨酸钠；
优选的，所述细胞裂解液中，异硫氰酸胍浓度为2mol/L～4mol/L，Triton X-100含量为1vol％～5vol％，3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸含量为5～50g/L，N-月桂酰肌氨酸钠含量为1～10g/L；
优选的，所述细胞裂解液还含有聚乙二醇；
优选的，所述细胞裂解液中，聚乙二醇含量为50～200g/L；
优选的，所述聚乙二醇为PEG4000、PEG6000或PEG8000；
优选的，所述细胞裂解液还含有裂解缓冲液、金属离子螯合剂、负电荷中和剂和消泡剂；
优选的，所述裂解缓冲液为Tris-HCL，Tris-HCL在细胞裂解液中的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
优选的，所述金属离子螯合剂为乙二胺四乙酸，乙二胺四乙酸在细胞裂解液中的浓度为5mmol/L～50mmol/L、pH8.0；
优选的，所述负电荷中和剂为NaCl，NaCl在细胞裂解液中的浓度为0.14mol/L～0.5mol/L；
优选的，所述消泡剂为Antifoam204，Antifoam204在细胞裂解液中的浓度为0.01vol％～0.2vol％。
7.根据权利要求6所述的细胞裂解液，其特征在于：所述细胞裂解液由10mmol/L～100mmol/L Tris-HCL、5mmol/L～50mmol/L pH8.0的乙二胺四乙酸、2mol/L～4mol/L异硫氰酸胍、1vol％～5vol％Triton X-100、5～50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、1～10g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L～0.5mol/LNaCl、0.01vol％～0.1vol％Antifoam204、50～200g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述细胞裂解液由20mmol/L～50mmol/L Tris-HCL、10mmol/L～20mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、3mol/L～4mol/L异硫氰酸胍、2vol％～5vol％Triton X-100、10～50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、2～10g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L～0.3mol/LNaCl、0.05vol％～0.1vol％Antifoam204、50～100g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述细胞裂解液由25mmol/LTris-HCL、10mmol/LpH8.0的乙二胺四乙酸、4mol/L异硫氰酸胍、2vol％Triton X-100、50g/L的3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸、5g/L的N-月桂酰肌氨酸钠、0.28mol/L NaCl、0.1vol％Antifoam204、100g/L的聚乙二醇组成。
8.一种用于磁珠法核酸提取的洗涤液，其特征在于：所述洗涤液不含乙醇或异丙醇，所述洗涤液中含有NaCl和聚乙二醇；
优选的，所述洗涤液中，NaCl的浓度为0.14mol/L～2mol/L，聚乙二醇的含量为50～200g/L；
优选的，所述聚乙二醇为PEG4000、PEG6000或PEG8000；
优选的，所述洗涤液还含有洗涤缓冲液；
优选的，所述洗涤缓冲液为Tris-HCL，Tris-HCL在洗涤液中的浓度为10mmol/L～100mmol/L；
优选的，所述洗涤液由10mmol/L～100mmol/L的Tris-HCL、0.14mol/L～2mol/L的NaCl、50～200g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述洗涤液由20mmol/L～50mmol/L的Tris-HCL、0.3mol/L～0.6mol/L的NaCl、80～120g/L的聚乙二醇组成；
优选的，所述洗涤液由20mmol/L的Tris-HCL、0.5mol/L的NaCl、100g/L的聚乙二醇组成。
9.一种用于磁珠法核酸提取的磁珠，其特征在于：所述磁珠内核为具有超顺磁性的纳米微球，外部包被树脂和硅羟基修饰材料，所述磁珠的粒径为200～350nm，磁响应时间为1～2分钟。
10.根据权利要求9所述的磁珠的制备方法，其特征在于：包括以下步骤，
a)纳米微球的制备：将FeCl3-6H2O、无水乙酸钠和PEG 2000加入乙二醇溶液中，混匀，在氮气气氛下，室温搅拌30分钟～1小时；然后在氮气气氛下，150℃～200℃反应4～8小时；反应结束后，反应产物在磁场作用下，去除上清，即获得纳米微球，采用去离子水清洗纳米微球，备用；
b)纳米微球表面基团修饰：取步骤a)制备的纳米微球，加入无水乙醇和氨水的混合溶液中，在通入氮气的条件下搅拌，并缓慢滴加正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液，室温反应3～6小时，反应产物在磁场作用下，去除上清，采用去离子水清洗，即制备获得所述磁珠；
优选的，所述步骤a)中，FeCl3-6H2O、无水乙酸钠和PEG 2000的重量比为2～3:6～8:1～2；
优选的，所述步骤a)中，每20～30g的FeCl3-6H2O对应加入800mL～1L的乙二醇溶液；
优选的，所述步骤b)中，每20～30g的FeCl3-6H2O对应的步骤a)的产物加入400mL～1L无水乙醇和20～60mL 14％氨水的混合溶液，对应的缓慢滴加15～30mL的正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液；
优选的，所述步骤b)中，所述搅拌的转速为400～1000rpm/min；
优选的，所述步骤b)中，所述正硅酸乙酯和聚硅氧烷混合液缓慢滴加的速度为0.05～0.3mL/min；
优选的，所述步骤b)还包括采用去离子水或缓冲液重悬所述磁珠，获得磁珠悬浮液。
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Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462683A (zh) * 2021-07-22 2021-10-01 上海思路迪生物医学科技有限公司 适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒
CN113584128A (zh) * 2021-07-29 2021-11-02 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法
CN113699145A (zh) * 2021-09-06 2021-11-26 上海伯杰医疗科技有限公司 基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用
CN113913494A (zh) * 2021-09-14 2022-01-11 苏州锐讯生物科技有限公司 快速便捷提取体液中病毒dna的试剂盒及提取方法
CN114058615A (zh) * 2021-11-25 2022-02-18 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种基于全自动纳米磁珠法提取唾液中核酸rna的通用试剂组合
CN114196669A (zh) * 2021-12-24 2022-03-18 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种用于核酸提取的漂洗液
CN114277026A (zh) * 2021-12-21 2022-04-05 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒
CN114317524A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 国家粮食和物资储备局科学研究院 用于粮食籽粒附着真菌dna提取的试剂、试剂盒及提取方法
CN114657231A (zh) * 2022-04-27 2022-06-24 珠海宝锐生物科技有限公司 一种带磁珠进行荧光定量pcr检测的快速dna提取试剂盒及其提取方法
CN114807120A (zh) * 2022-04-06 2022-07-29 无锡百泰克生物技术有限公司 一种高灵敏度病毒核酸提取试剂盒
CN114934041A (zh) * 2022-04-27 2022-08-23 北京金豪制药股份有限公司 一种核酸提取的试剂和方法
CN116555248A (zh) * 2023-07-10 2023-08-08 北京凡知医学科技有限公司 一种细菌中高分子量dna提取试剂盒及提取方法
CN116891849A (zh) * 2023-09-11 2023-10-17 成都斯马特科技有限公司 一种快速从鼻咽拭子中提取核酸的试剂盒及提取方法
CN116949036A (zh) * 2023-09-11 2023-10-27 成都斯马特科技有限公司 一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法

Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100029925A1 (en) * 2008-05-23 2010-02-04 Life Technologies Corporation, A Delaware Corporation Methods and kits for extraction of dna
CN102181434A (zh) * 2009-08-05 2011-09-14 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化人体脱落细胞dna的方法
US20130017552A1 (en) * 2010-04-08 2013-01-17 Greiner Bio - One Gmbh Method and kit for separating viral and prokaryotic nucleic acids from eukaryotic nucleic acids
US20150252354A1 (en) * 2012-09-28 2015-09-10 Cepheid Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
US20150275269A1 (en) * 2012-10-26 2015-10-01 The Emerther Company Method for purifying nucleic acid and kit
CN105368820A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 南京先进激光技术研究院 一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用
CN105420230A (zh) * 2016-01-14 2016-03-23 北京纳捷诊断试剂有限公司 一种磁珠法提取核酸的裂解液
CN109022417A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 益善生物技术股份有限公司 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法
CN109750030A (zh) * 2019-01-21 2019-05-14 上海科华生物工程股份有限公司 一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒

Patent Citations (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20100029925A1 (en) * 2008-05-23 2010-02-04 Life Technologies Corporation, A Delaware Corporation Methods and kits for extraction of dna
CN102181434A (zh) * 2009-08-05 2011-09-14 公安部物证鉴定中心 一种提取纯化人体脱落细胞dna的方法
US20130017552A1 (en) * 2010-04-08 2013-01-17 Greiner Bio - One Gmbh Method and kit for separating viral and prokaryotic nucleic acids from eukaryotic nucleic acids
US20150252354A1 (en) * 2012-09-28 2015-09-10 Cepheid Methods for dna and rna extraction from fixed paraffin-embedded tissue samples
US20150275269A1 (en) * 2012-10-26 2015-10-01 The Emerther Company Method for purifying nucleic acid and kit
CN105368820A (zh) * 2015-12-22 2016-03-02 南京先进激光技术研究院 一种基于磁珠法的全血dna提取试剂盒及其应用
CN105420230A (zh) * 2016-01-14 2016-03-23 北京纳捷诊断试剂有限公司 一种磁珠法提取核酸的裂解液
CN109022417A (zh) * 2018-08-13 2018-12-18 益善生物技术股份有限公司 一种磁珠法核酸提取转化试剂盒及其使用方法
CN109750030A (zh) * 2019-01-21 2019-05-14 上海科华生物工程股份有限公司 一种基于磁珠法的快速、不加热的核酸提取试剂盒

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113462683A (zh) * 2021-07-22 2021-10-01 上海思路迪生物医学科技有限公司 适用于多种样本核酸提取的无醇清洗液及核酸提取试剂盒
CN113584128A (zh) * 2021-07-29 2021-11-02 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 用于处理生物样本的固相颗粒材料及生物样本处理方法
CN113699145A (zh) * 2021-09-06 2021-11-26 上海伯杰医疗科技有限公司 基于磁珠法病原体核酸提取的裂解结合液及其产品与应用
CN113913494A (zh) * 2021-09-14 2022-01-11 苏州锐讯生物科技有限公司 快速便捷提取体液中病毒dna的试剂盒及提取方法
CN114058615A (zh) * 2021-11-25 2022-02-18 重庆威斯腾生物医药科技有限责任公司 一种基于全自动纳米磁珠法提取唾液中核酸rna的通用试剂组合
CN114277026A (zh) * 2021-12-21 2022-04-05 深圳市易瑞生物技术股份有限公司 核酸提取用磁珠及其制备方法、用于磁珠法核酸提取的试剂盒
CN114196669B (zh) * 2021-12-24 2023-02-28 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种用于核酸提取的漂洗液
CN114196669A (zh) * 2021-12-24 2022-03-18 南京诺唯赞生物科技股份有限公司 一种用于核酸提取的漂洗液
CN114317524A (zh) * 2021-12-28 2022-04-12 国家粮食和物资储备局科学研究院 用于粮食籽粒附着真菌dna提取的试剂、试剂盒及提取方法
CN114807120A (zh) * 2022-04-06 2022-07-29 无锡百泰克生物技术有限公司 一种高灵敏度病毒核酸提取试剂盒
CN114657231A (zh) * 2022-04-27 2022-06-24 珠海宝锐生物科技有限公司 一种带磁珠进行荧光定量pcr检测的快速dna提取试剂盒及其提取方法
CN114934041A (zh) * 2022-04-27 2022-08-23 北京金豪制药股份有限公司 一种核酸提取的试剂和方法
CN114934041B (zh) * 2022-04-27 2023-12-15 北京金豪制药股份有限公司 一种核酸提取的试剂和方法
CN116555248A (zh) * 2023-07-10 2023-08-08 北京凡知医学科技有限公司 一种细菌中高分子量dna提取试剂盒及提取方法
CN116555248B (zh) * 2023-07-10 2023-10-20 北京凡知医学科技有限公司 一种细菌中高分子量dna提取试剂盒及提取方法
CN116891849A (zh) * 2023-09-11 2023-10-17 成都斯马特科技有限公司 一种快速从鼻咽拭子中提取核酸的试剂盒及提取方法
CN116949036A (zh) * 2023-09-11 2023-10-27 成都斯马特科技有限公司 一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法
CN116891849B (zh) * 2023-09-11 2023-11-17 成都斯马特科技有限公司 一种快速从鼻咽拭子中提取核酸的试剂盒及提取方法
CN116949036B (zh) * 2023-09-11 2023-12-15 成都斯马特科技有限公司 一种快速从腹水中提取核酸的试剂盒及提取方法

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