CN113151397B

CN113151397B - 一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒

Info

Publication number: CN113151397B
Application number: CN202110150478.2A
Authority: CN
Inventors: 袁巧梅; 肖彩霞
Original assignee: GBA National Institute for Nanotechnology Innovation
Current assignee: GBA National Institute for Nanotechnology Innovation
Priority date: 2021-02-03
Filing date: 2021-02-03
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2041-02-03
Also published as: CN113151397A

Abstract

本发明公开了一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒，所用磁珠为硅羟基磁珠，由多种不同粒径的磁珠混合组成，粒径大小为10～1000nm。捕获核酸的能力强，更适用于微量病毒核酸提取。该试剂盒原料易得、成本低廉；常温贮存，便于运输及使用；提取步骤简便，裂解结合只需加样本、裂解液、磁珠即可进行，无需加入蛋白酶K、CarrierRNA等进口原材料。病毒DNA&RNA共提，回收率高；无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂，对操作人员安全无毒副作用；操作简便，无需离心，对仪器设备要求不高；可匹配高通量自动提取仪；适用于从环境样本，如污水、冰柜、海鲜肉类、食品内外包装等微量病毒样本中提取病毒核酸。

Description

一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒

技术领域

本发明涉及核酸提取技术领域，具体地，涉及一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒。

背景技术

核酸是遗传信息的载体，是基因表达的物质基础。核酸包括DNA和RNA两种，广泛存在于所有的动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合的状态存在。核酸分子的结构改变，必将导致生物功能的改变，如病毒的致病作用，通过病毒核酸侵入机体细胞所至，除此之外，恶性肿瘤、遗传病变、代谢病等都与核酸的分子结构和功能的改变密切相关，故无论是进行核酸结构还是功能研究，首先需要对核酸进行分离和纯化。

常见的核酸提取纯化方法包括苯酚氯仿抽提法、碱裂解法、煮沸法、离心柱法、磁珠法。苯酚氯仿抽提法因其使用了苯酚、氯仿等有毒有机溶剂，且对核酸的回收率低，操作复杂等因素，渐渐退出市场，此外因各实验室条件不同及针对的提取纯化样本不同。煮沸法和离心柱法等提取方法在临床上也有一定的应用，但煮沸法，因其需要进行加热，增加了气溶胶污染的风险，离心柱法因其需要配备高速离心机、成本高，难于实现自动化。磁珠法是较为常用的核酸提取方法，且普遍认为其对病原体的核酸提取具有简便、高效、提取浓度、纯度较高等优势。另外，不同的提取方法因其提取产物浓度、纯度的差别以及对DNA/RNA的保护程度不同，将在一定程度上影响核酸尤其是临界阳性样本的核酸检出。

相较于其他方法，磁珠法操作更加简便、高效、高质量。传统的核酸提取纯化试剂盒(磁珠法)主要由裂解液、结合液、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液、纳米磁珠等组成。磁珠法核酸提取纯化技术利用纳米技术对超顺磁性纳米颗粒的表面进行改良和表面修饰制备成超顺磁性纳米磁珠，以纳米磁珠作为固相载体，使得样本释放的核酸能特异的结合在纳米磁珠上，通过外加磁场的作用，实现对核酸的分离和纯化然后用洗涤液对样本溶液中的蛋白质、多糖、盐离子进行洗涤去除，在低盐高PH条件下使核酸与磁珠分离，从而获得高纯度的核酸溶液，因其适用于多种样品类型，且对样品要求较低，可配合自动化核酸提取仪实现提取的自动化、高通量等优势，近年来被广泛应用。

进口海产品、牛羊肉、污水、公共卫生场所的环境等样本由于其病毒载量较低，样本杂质较多、成分复杂等特点，对病毒提取提出了新的挑战和要求。目前市场上多为用于咽拭子、血液、组织等样本的核酸提取试剂盒(磁珠法)，不太适用于此次突发疫情中的环境类样本的病毒检测。

市场上较少针对环境类样本的病毒核酸提取试剂盒，且现有的大多数核酸提取试剂盒提取步骤复杂、无法实现病毒DNA/RNA共提取，对于新发突变的病毒，无法预知是DNA病毒还是RNA病毒，选择不合适的试剂盒进行核酸提取，会增加检测失败的几率和难度，同时增加检测的成本。

试剂盒组分还添加了进口原材料如：蛋白酶K，Carrier RNA等，在面对突发公共卫生事件中，进口原材料不仅购买难度大、周期长，还大大增加了试剂盒的生产成本。在面临突发公共卫生事件爆发时，进口原材料无法保证货源的供应，且成本高，大大增加了试剂盒的生产周期；若采用国产原材料代替，又无法保证试剂盒的性能。

除此之外，蛋白酶K、Carrier RNA的运输和保存条件相对苛刻，需在-20℃条件下保存，故其产品不易于保存和运输。无论是传统的核酸提取纯化试剂盒还是改良优化后的试剂盒，其为了使样本能更充分的裂解，往往会将裂解和结合步骤分开进行，使得提取纯化过程不仅耗时长，操作复杂，还增加了检测成本。

因而，开发一种既操作简便、又不需要使用进口原材料，还能将DNA/RNA共提，适合用于多类型病毒样本的核酸提取试剂盒非常重要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒，本发明针对现有市售试剂盒的不足，本发明解决了现有技术中使用有毒有机溶剂，DNA、RNA较少共提，提取需额外添加蛋白酶K，Carrier RNA等进口原材料，裂解与结合分开，操作步骤繁琐等技术问题，使本发明更适用于环境类微量病毒核酸样本的提取纯化、具有DNA和RNA共提、安全无毒、快速、高效、操作简便、有效避免污染、成本低廉的优点。

本发明的第一个目的是提供一种硅羟基磁珠组合物。

本发明的第二个目的是提供所述的硅羟基磁珠组合物在制备核酸提取和/或纯化试剂盒中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

本发明要求保护一种硅羟基磁珠组合物，以质量计，含有20～60％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，20～40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10～40％直径为500～900nm的硅羟基磁珠。

优选地，以质量计，含50％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10％直径为500～900nm的硅羟基磁珠。

本发明还要保护所述的硅羟基磁珠组合物在制备核酸提取和/或纯化试剂盒中的应用。

以及一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒，含有磁珠、裂解液、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液；其中所述磁珠为所述的硅羟基磁珠组合物。

优选地，所述磁珠为浓度为10～85mg/ml的所述的硅羟基磁珠组合物。

更优选地，所述磁珠为浓度为25mg/ml的所述的硅羟基磁珠组合物。

优选地，所述裂解液含有：2～8mol/L异硫氰酸胍、0.1～3mol/L碘化钠、0.01～0.2mol/L Tris-HCl、1～20％(v/v)非离子表面活性剂、0.1～10mol/L尿素、0.01～10mg/ml糖原、0.01～0.2mol/L金属离子络合剂；裂解液pH为4～7。

更优选地，所述非离子表面活性剂为Tween20、Triton-X100、SDS、或NP40中的至少一种。

更优选地，所述裂解液含有：4mol/L异硫氰酸胍、0.5mol/L碘化钠、0.02mol/LTris-HCl、1％(v/v)非离子表面活性剂、0.5mol/L尿素、2mg/ml糖原、0.02mol/L金属离子络合剂；裂解液pH为6。

优选地，所述洗涤液I含有：1～10％(v/v)的吐温20、0.01～1mol/L氯化钠、0.01～0.3mol/L Tris-HCl、0.2～5mol/L盐酸胍、20～60％(v/v)异丙醇。

更优选地，洗涤液I含有：3％(v/v)的吐温20、0.5mol/L氯化钠、2mol/L盐酸胍、0.1mol/LTris-HCl、30％(v/v)异丙醇。

优选地，所述洗涤液II为60～80％(v/v)乙醇。

更优选地，洗涤液II为80％(v/v)乙醇。

优选地，所述洗脱液为无核酸酶水或6～10mol/L的Tris-HCl-无核酸酶水。

更优选地，所述洗脱液为无核酸酶水。

发明人在大量的实验研究和统计分析的基础上发现，当所述试剂盒各组分组成选取上述优选值时提取病毒核酸的效果更好。可有效快速提取环境样本、血浆、血清、唾液、鼻咽拭子、尿液中的病毒核酸，在本发明的试剂盒的基础上，按比例增大/缩小的技术方案应属于本发明保护范围内。

进一步本发明要求保护一种病毒核酸提取的方法，使用所述的核酸提取试剂盒，和/或所述的硅羟基磁珠组合物。

优选地，包括如下步骤：

S1.取样本、裂解液和磁珠混合，充分混匀，常温裂解10min，每隔30～60s混匀1次；

S2.离心，磁分离，静置1～2min，弃废液；

S3.与洗涤液I混合，充分混匀，离心，磁分离，静置1～2min，弃废液；

S4.与洗涤液II混合，充分混匀，离心，磁分离，静置1～2min，弃废液；

S5.重复S4.两次；

S6.磁分离条件下晾干磁珠；

S7.与洗脱液混合，充分混匀，55℃温育5min。

S7.磁分离，静置1～2min，取上清液。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒，所用磁珠为硅羟基磁珠，由多种不同粒径的磁珠混合组成，粒径大小为10～1000nm。捕获核酸的能力强，更适用于微量病毒核酸提取。该试剂盒原料易得、成本低廉；常温贮存，便于运输及使用；提取步骤简便，裂解结合只需加样本、裂解液、磁珠即可进行，无需加入蛋白酶K、Carrier RNA等进口原材料。病毒DNA&RNA共提，回收率高；无需使用苯酚、氯仿等有机溶剂，对操作人员安全无毒副作用；操作简便，无需离心，对仪器设备要求不高；可匹配高通量自动提取仪；适用于从环境样本，如污水、冰柜、海鲜肉类、食品内外包装等微量病毒样本中提取病毒核酸。

附图说明

图1为含新型冠状病毒-假病毒的冰柜环境样本的提取效果对比。

图2为含新型冠状病毒-假病毒的污水环境样本的提取效果对比。

图3为血清乙肝病毒的提取效果对比。

图4为不同浓度假病毒的提取效果对比。

具体实施方式

下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒

一、组成

磁珠：以质量计，含有50％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10％直径为500～900nm的硅羟基磁珠组成的混合磁珠，磁珠浓度为85mg/ml。

裂解液：1mol/L异硫氰酸胍、0.5mol/L碘化钠、0.02mol/L Tris-HCl、1％(v/v)非离子表面活性剂Tween20、0.5mol/L尿素、1mg/ml糖原、0.02mol/L金属离子络合剂；裂解液pH为5；

洗涤液I：1％(v/v)的吐温20、0.5mol/L氯化钠、1mol/L盐酸胍、0.05mol/L Tris-HCl、20％(v/v)异丙醇；

洗涤液II：70％(v/v)乙醇溶液；

洗脱液：无核酸酶水。

二、使用方法

1、取200μl待测样本到1.5ml离心管中，加入400μl裂解液，加入振荡混匀的20μl磁珠，震荡混匀10s或上下颠倒数次。每种配方，重复提3次。

2、常温裂解10min，每隔30～60s混匀1次。

3、将离心管瞬时离心，保证管盖上无磁珠残留，然后将离心管置于磁力架上进行磁分离，静置1～2min，开盖，弃废液(吸净管盖及管底残液)。

4、加入600μl洗涤液I，震荡混匀30～60s，瞬时离心，保证管盖上无磁珠残留，然后将EP管置于磁力架上进行磁分离，静置1～2min，开盖，弃废液(吸净管盖及管底残液)。

5、加入600μl洗涤液II，震荡混匀30～60s，瞬时离心，保证管盖上无磁珠残留，然后将离心管置于磁力架上进行磁分离，静置1～2min，开盖，弃废液(吸净管盖及管底残液)。重复该步骤两次。

6、将离心管置于磁力架上，晾干5～10min，根据室内温度和湿度可适当延长或缩短晾干时间。

7、加入50μl洗脱液，震荡混匀1min或用移液枪轻轻吹打混匀，55℃温育5min。

8、温育结束后，将离心管置于磁力架上进行磁分离，静置1～2min，吸取上清液保存于新的离心管中，进行下游实验。

实施例2一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒

一、组成

磁珠：以质量计，含有50％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10％直径为500～900nm的硅羟基磁珠组成的混合磁珠，磁珠浓度为50mg/ml。

裂解液：6mol/L异硫氰酸胍、0.5mol/L碘化钠、0.02mol/L Tris-HCl、1％(v/v)非离子表面活性剂Tween20、0.5mol/L尿素、3mg/ml糖原、0.2mol/L金属离子络合剂；裂解液pH为7；

洗涤液I：5％(v/v)的吐温20、0.5mol/L氯化钠、3mol/L盐酸胍、0.2mol/L Tris-HCl、50％(v/v)异丙醇；

洗涤液II：60％(v/v)乙醇溶液；

洗脱液：无核酸酶水。

二、使用方法

同实施例1。

实施例3一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒

一、组成

磁珠：以质量计，含有50％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10％直径为500～900nm的硅羟基磁珠组成的混合磁珠，磁珠浓度为25mg/ml。

裂解液：4mol/L异硫氰酸胍、0.5mol/L碘化钠、0.02mol/L Tris-HCl、1％(v/v)非离子表面活性剂Tween20、0.5mol/L尿素、2mg/ml糖原、0.02mol/L金属离子络合剂；裂解液pH为6；

洗涤液I：3％(v/v)吐温20、0.5mol/L氯化钠、2mol/L盐酸胍、0.1mol/L Tris-HCl、30％(v/v)异丙醇；

洗涤液II：80％(v/v)乙醇溶液；

洗脱液：无核酸酶水。

二、使用方法

同实施例1。

实施例4含新冠假病毒的病毒保存液样本核酸的提取

一、实验方法

使用实施例1到3的试剂盒提取含新冠假病毒的病毒保存液。

用达安基因的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行荧光定量检测。扩增反应体系和反应程序分别如表1、表2。

表1：扩增反应体系

试剂名称	体积
		PCR反应液A	17μl
PCR反应液B	3μl
		RNA模板	5μl

表2：

二、实验结果

结果如表3所示，实施例1到3的试剂盒对于含新冠假病毒的病毒保存液都有很好的核酸提取效果。其中，使用实施例3的试剂盒配方提取新冠假病毒核酸时，提取效果最好，为最优试剂盒配方，后续实验将使用此配方进行提取。提取效果约比实施例2好1倍、比实施例1好3倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。

表3：

实施例5不同粒径大小的磁珠的组成对病毒核酸提取效果的影响

一、实验方法

使用不同的硅羟基磁珠组合物(硅羟基组合物由不同粒径大小的磁珠混合而成)，替换实施例3的试剂盒中的磁珠，对含新冠假病毒的保存液进行核酸提取，之后使用达安基因的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行荧光定量检测。

硅羟基磁珠组合物1：含有50％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10％直径为500～900nm的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠组合物浓度为25mg/ml。

硅羟基磁珠组合物2：含有40％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，30％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，30％直径为500～900nm的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠组合物浓度为25mg/ml。

硅羟基磁珠组合物3：含有30％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，30％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，40％直径为500～900nm的硅羟基磁珠，硅羟基磁珠组合物浓度为25mg/ml。

二、实验结果

结果如表4所示，不同的磁珠组合物对于含新冠假病毒的病毒保存液都有很好的核酸提取效果。其中，使用硅羟基磁珠组合物1提取新冠假病毒核酸时，提取效果最好，为最优磁珠组合，后续实验将使用此组合进行提取。提取效果约比硅羟基磁珠组合物3好2倍、比硅羟基磁珠组合物2好3倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。

表4

实施例6不同粒径大小的磁珠对病毒核酸提取效果的影响

一、实验方法

选用市售三款常规单一粒径的硅羟基磁珠(A、B、C)分别替代实施例3的试剂盒中的硅羟基磁珠组合物，其浓度均为实施例3的25mg/ml，按照实施例1的方法对含新冠假病毒的保存液进行核酸提取。然后用达安基因的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行荧光定量检测。

二、实验结果

实验结果如表5所示。

表5：

使用实施例3试剂盒的效果优于市售磁珠A、磁珠B、磁珠C，提取效果约比磁珠B好3倍、比磁珠A好4倍、比磁珠A好5倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。

实施例7对冰柜环境样本中新型冠状病毒-假病毒的提取检测

一、实验方法

把采样管中的棉签拭子，浸润在病毒保存液中，然后在冰柜内壁，以5cm×5cm的面积为一采样点，随机取5个点，在采样点上画井字，采样完毕，将拭子放回病毒保存液中，加入一定量的新冠假病毒，震荡混匀制成1×10⁴copies/ml含假病毒的冰柜环境模拟样本。

分别使用实施例3的试剂盒和海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取以上冰柜环境模拟样本：使用实施例3的试剂盒的提取方法如实施例1；使用海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取，样本量(与实验组所用样本一致)200μl，按试剂盒说明书进行提取，洗脱体积50μl。

提取完成后，使用达安基因的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行荧光定量检测。

二、实验结果

实验结果如表6和图1所示。

表6：

由实验结果可知,本发明试剂的提取冰柜环境模拟样本新冠假病毒核酸的效果优于对照试剂，提取效果约为对照试剂的3倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。

实施例8对污水环境样本中新型冠状病毒-假病毒的提取检测

一、实验方法

把从菜市场下水道中采样回来的污水样本，加入一定量的新冠假病毒，震荡混匀制成1×10⁴copies/ml含假病毒的污水环境模拟样本。

分别使用实施例3的试剂盒和海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取以上污水环境模拟样本：使用实施例3的试剂盒的提取方法如实施例1；使用海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取，样本量(与实验组所用样本一致)200μl，按试剂盒说明书进行提取，洗脱体积50μl。

二、实验结果

实验结果如表7和图2所示。

表7：

由实验结果可知，本发明试剂的提取污水环境模拟样本新冠假病毒核酸的效果优于对照试剂，提取效果约为对照试剂的5倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。

实施例9对血清中乙肝病毒的提取检测

一、实验方法

分别使用实施例3的试剂盒和海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取含乙肝病毒的血清(200μl)：使用实施例3的试剂盒的提取方法如实施例1；使用海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取，样本量(与实验组所用样本一致)200μl，按试剂盒说明书进行提取，洗脱体积50μl。

二、实验结果

实验结果如表8及图3所示。

表8：

由实验结果可知,本发明试剂的提取血清乙肝病毒核酸的效果优于对照试剂，提取效果约为对照试剂的5倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。

实施例10核酸提取检测限

一、实验方法

把新型冠状病毒-假病毒标准品(购自金唯智)用病毒保存液稀释为5.0×10⁴copies/ml、5.0×10³copies/ml、5.0×10²copies/ml、5.0×10¹copies/ml。

分别使用实施例3的试剂盒和海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取以上样本(200μl)：使用实施例3的试剂盒的提取方法如实施例1；使用海狸生物公司的病毒DNA/RNA提取试剂盒提取，样本量(与实验组所用样本一致)200μl，按试剂盒说明书进行提取，洗脱体积50μl。

二、实验结果

实验结果如表9及图4所示。

表9：

由实验结果可知,本发明试剂提取不同浓度新冠假病毒的效果均比对照试剂好，提取效果比对照试剂好5～6倍(1个CT值≈3.33倍，CT值越小，浓度越高)。搭配达安基因的新型冠状病毒核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法)进行检测，最低检测限可达10copies(5×10¹copies/ml新冠假病毒，加入量200μl)，因而更适用于微量病毒样本的核酸提取。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种基于磁珠法提取病毒样本的核酸提取试剂盒，其特征在于，含有磁珠、裂解液、洗涤液I、洗涤液II和洗脱液；其中所述磁珠为浓度为25mg/mL的硅羟基磁珠组合物，以质量计，所述硅羟基磁珠组合物含50％直径为50～200nm的硅羟基磁珠，40％直径为300～500nm的硅羟基磁珠，10％直径为500～900nm的硅羟基磁珠；

所述裂解液含有：4mol/L异硫氰酸胍、0.5mol/L碘化钠、0.02mol/L Tris-HCl、1％(v/v)Tween20、0.5mol/L尿素、2mg/mL糖原、0.02mol/L金属离子络合剂；裂解液pH为6；

所述洗涤液I含有：3％(v/v)的吐温20、0.5mol/L氯化钠、2mol/L盐酸胍0.1mol/LTris-HCl、30％(v/v)异丙醇；

所述洗涤液II为80％(v/v)乙醇；

所述洗脱液为无核酸酶水或6～10 mol/L的Tris-HCl-无核酸酶水。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述洗脱液为无核酸酶水。

3.一种病毒核酸提取的方法，其特征在于，使用权利要求1～2任一所述的核酸提取试剂盒。