CN115369096B - 一种浓缩水中猪源性病毒的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于水体中病毒浓缩和检测技术领域，具体涉及一种浓缩水中猪源性病毒的方法。本发明制备了一种有效吸附水中病毒的玻璃棉，以威胁养猪业和公共卫生安全的病原体伪狂犬病病毒和猪流行性腹泻病毒为模型评估了病毒核酸回收率；以沙门菌噬菌体ph2‑2为模型评估了病毒的感染性回收率。通过评估不同pH、不同水质、不同病毒类型等因素对浓缩效率的影响，最终确定了本发明的使用条件和最优操作程序。100L水体积经本发明浓缩后可将病毒浓度提高至1000‑10000倍以上。本发明对于完善养殖场疫病风险评估和公共卫生风险评估具有重要意义。

Description

一种浓缩水中猪源性病毒的方法
技术领域
本发明属于水中猪源性病毒的浓缩技术领域，具体涉及一种浓缩水中猪源性病毒如伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的方法，同时本发明也可浓缩水中其他猪源性病毒。
背景技术
本发明是基于水中病毒，尤其是针对水中猪源性病毒伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒存在状况而提出的。
(1)水中病毒的存在状况：
病毒在自然界中广泛存在，主要是通过消化道、呼吸道、粘膜和密切接触侵入机体，而水是病毒传播的重要途径之一，目前已发现有700多种病毒可以通过水传播，而有140多种病毒是通过人畜粪便排出，然后经下水道、农田施肥、养殖场排污、生活垃圾等途径进入地下水和地表水并稳定存在，再通过交叉管网扩散，污染整个水体；当病毒载量足够高且未充分扩散，则可能会导致区域内人群或动物爆发疾病。
在世界范围内，轮状病毒、诺如病毒、星状病毒、人腺病毒、冠状病毒、甲型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、科萨奇病毒等是感染人类并致病的重要病原体；其中轮状病毒和诺如病毒是导致人类肠道疾病的主要病原体，每年造成上百万人死亡。随着新冠肺炎在全球逐渐扩散，研究人员通过检测城市废水中的新冠病毒评估区域感染动态，并提供了比临床检测更准确的丰度(Karthikeyan,S.,Levy,J.I.,De Hoff,P.et al.Wastewater sequencingreveals early crypticSARS-CoV-2variant transmission.Nature(2022))，病毒介水传播已成为疾病传播的重要方式。
也逐渐成为新的研究热点。
(2)水中猪源性病毒研究现状：
中国每年生猪出栏占到全球的一半，人们一半以上的动物蛋白是由猪肉提供的，因此养猪业在中国国民经济和社会生活中占据重要地位。自中国养猪业进入集约化发展阶段以来，养殖效率不断提升，但疾病一直是猪场发展的首要威胁，虽然各种新型疫苗研发提高易感动物免疫水平，新型检测技术更快识别和剔除传染源，但切换传播途径仍是控制猪群重大疾病的最重要之方式一，对所有疾病的防控均有效。因此深入研究猪源性病毒的传播方式是现代兽医学科的重要任务。相对直接接触、间接接触、自然媒介和空气传播等方式，猪源性病毒介水传播的研究较少，而目前越来越多的猪场发病都指向介水传播，因此加强对猪源性病毒在水中分布和传播的研究对于防控猪病有重要意义，尤其是威胁公共卫生安全和给猪场造成重大损失的猪源性病毒应重点关注。
伪狂犬病毒(PRV)是影响中国养猪业发展的重要病毒之一，表现为母猪流产、新生仔猪死亡、育肥猪呼吸道疾病等症状，据调查2011年至2021年***群中gE野毒抗体总体阳性率达29.87％(Tan L,Yao J,Yang Y,et al.Current Status and Challenge ofPseudorabies Virus Infection in China.Virol Sin.2021；36(4):588-607)。PR的流行不仅给中国养猪业带来持续影响，也给公共卫生安全带来威胁。2018年以来，有研究通过NGS技术检测核酸和ELISA技术检测特异性抗体，陆续发现部分人感染伪狂犬病毒的病例，特别是Liu等人从一名急性脑炎患者中成功分离出一株PRV毒株，为人类感染PRV提供了直接证据(Liu Q,Wang X,Xie C,et al.A Novel Human Acute Encephalitis Caused byPseudorabies Virus Variant Strain.Clin Infect Dis.2021；73(11):e3690-e3700)。虽然人类感染PRV是偶然事件，但一旦感染预后多数不良，这也提示在有PRV分布的工作环境中，需要加强自我防护。因此通过检测特定场所如屠宰场、猪场水中PRV病毒分布，对猪群感染PRV进行溯源分析，对相关场所工作人群进行预警并提高防护意识和加强消毒具有重要意义。
猪流行性腹泻(PED)是严重影响国内养猪业的健康发展的三大病毒性疾病(非洲猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪流行性腹泻)之一。2010年以前，我国养猪场PED以散发性和区域性为主，到2010年10月国内多个省份爆发了以急性腹泻为临床特征的PED疫情，仔猪PED死亡率飙升至80％100％，养猪业遭受毁灭性打击，至今国内仍呈持续流行态势(WangD,Fang L,Xiao S.Porcine epidemic diarrhea in China.Virus Res.2016；226:7-13)。PEDV主要随发病猪粪便排出，而后在场内随人员和工具扩散，未消毒彻底的带毒粪污排出场外后，也会随水体扩散，污染整个大环境，因此研究其在水中的分布和传播情况对于PED的区域防控有重要意义。
(3)现有的水中病毒浓缩方法现状：
水中病毒浓度较低，直接检测容易出现假阴性，即使采用最灵敏的临床检测方法也无法对饮水中病毒进行检测，因此欲开展水中病毒研究，首先要对水环境中病毒进行浓缩。
目前世界各国对水中病毒的控制要求鲜有规定，我国现行《生活饮用水卫生标准》(GB5749—2006)中没有规定病毒的卫生限值或控制要求，由美国公共卫生协会等发布的《水和废水标准检测方法》(第23版)中提供了三种浓缩方法:一是用微孔过滤器吸附样品中的病毒(9510B/C)；二是用氢氧化铝吸附沉淀病毒(9510D)；三是用聚乙二醇富集病毒(9510E)；世界上其他研究人员也尝试多种方法开展水中病毒浓缩研究，如超滤法，超速离心法，活性炭吸附法，中空纤维超滤膜法，阴离子交换树脂吸附法等，高效液相色谱法等，均取得了一定的效果，但是不同试验间结果差异较大，对不同病毒浓缩效果需要进一步验证。
而且由于浓缩前水体积大，第一次浓缩后并不能直接检测病毒，必须进行第二次浓缩，使其最终体积缩小到临床标本体积。第二次浓缩方法有絮凝沉淀、透析、超速离心等，目前主要多采用絮凝沉淀法。絮凝剂种类繁多，理化性质各异，寻找理想的絮凝剂，建立最佳絮凝方法，需要具体问题具体分析，开展细致筛选研究。
(4)水中病毒检测方法
对水中病毒进行浓缩后，需要对病毒进行进一步的检测和分析，目前国内常用的检测方法主要分以下几类，还有一些方法也在不断被发明和改进。
1)细胞培养法
将病毒进行有效浓缩后进行检测，最经典方法之一是细胞培养法，常见细胞系有Hela、Hep-2、Vero、PK-15等。它是20世纪90年代以来使用最广泛的方法，但是该方法相对费时，操作繁琐，对试验室要求高，需要特定的细胞系，也容易污染。
2)分子生物学法
主要是对病毒的核酸进行检测，包括普通PCR、RT-PCTR、巢式PCR、多重PCR、以及qPCR等，可用于难以培养的病毒的快速检测；其中qPCR灵敏度可达普通PCR的几十甚至上百倍，是目前主流分子生物学检测方法。此外分子生物学方法还包括环介导恒温扩增技术(LAMP)、基于核酸序列的扩增技术(NASBA)、基因芯片技术等，这些方法都是基于核酸扩增和杂交技术，可以达到较好的灵敏度。
在细胞培养和分子生物学基础上，衍生出了细胞培养与PCR相结合的方法(ICC-PCR)。该方法是利用PCR快速检测病毒在宿主细胞内产生的mRNA，完成对具有感染性病毒的检测，灵敏度更高。
3)高通量测序技术
2005年基于焦磷酸测序法的超高通量基因组测序***被454Life Sciences公司发明和推出，随着高通量测序技术的发展，目前应用较为广泛的平台是illumina测序技术。有研究将东太湖水源水作为研究对象，应用梯度－串联－循环－切向流超滤技术对水体中病毒进行富集浓缩后采用进行高通量测序，获得了水中微生物大量序列信息(葛英亮，于水利，时文歆.应用Illumina Miseq测序分析饮用水源水中病毒多样性[J].食品科学,2018,39(02):287-292)。
4)免疫学方法
主要是利用抗原-抗体反应的高度特异性，在抗原或抗体上标记荧光基团、胶体金、过氧化物酶等基团，通过读取或观察显色反应进行一定程度的判定。但免疫学方法灵敏度相对较低，不适合用于水中病毒的直接检测。
(5)对水中病毒浓缩方法的要求
由于不同病毒的外膜结构、大小、等电点均不同，不同浓缩方法对病毒的浓缩效率也有较大的差异；同种方法的步骤微调也会导致病毒浓缩效率的显著改变，因此筛选和研发一种高效实用的水中猪源性病毒浓缩方法，需满足以下要求：(1)浓缩时间短；(2)有较高回收率；(3)浓缩后体积小；(4)成本低；(5)可用于较大体积浓缩；(6)重复性好。由于不同检测单位的设备条件、人员操作熟练程度不同，因此病毒的检测需要设备门槛低、易操作、易推广等特点。
发明内容
本发明目的在于提供一种浓缩水中猪源性病毒如伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的方法，本发明也适合浓缩和检测水中的极微量的其他猪源性病毒。
本发明能直接浓缩大多数种类的病毒，并随着样本过滤体积增大，病毒终浓度不断升高。本发明可在多种场景下开展临床水样的采集和过滤工作。如100L水可在1小时内完成，操作简单、迅速，浓缩后病毒浓度比原水中浓度可提高1000-10000倍。
本发明的技术方案如下所述：
一种浓缩水中猪源性病毒如伪狂犬病毒和猪流行性腹泻病毒的方法，包括以下步骤：
(1)制备玻璃棉滤芯
称重适量的玻璃棉，经处理后装入过滤器中并在4℃下密封保存，将过滤器内的玻璃棉填充密实。
(2)临床样本的过滤
通过蠕动泵，利用负压***将临床水样抽取并通过玻璃棉滤芯，将水中病毒浓缩吸附到过滤器中的滤芯上。
(3)洗脱病毒
本发明的洗脱液为pH为9.0-10.0，3％牛肉浸粉(Cat:B8530,北京索莱宝生物科技有限公司产品，主要是牛肉膏在碱性PH中有较强的解离作用，可以达到洗脱病毒的效果。本发明主要对pH有要求的，不用加添加其他成分)配制的洗脱液，对滤芯进行洗脱。即：首先用70ml洗脱液浸泡玻璃棉滤芯，再用80ml洗脱液对滤芯再次冲洗，合并收集两次洗脱液，共计150ml。
(4)洗脱液的初步浓缩
取步骤(3)所得的的洗脱液40ml，将pH调节至5.0，并加入1‰的脱脂奶粉；之后将洗脱液以200-220r/min速率摇晃1-2h，以4500r/m速率离心30min后弃去上清，留取沉淀。
(5)重悬浓缩液
向步骤(4)所得的沉淀中加入1ml的0.1M的PBS(即磷酸盐缓冲液；Cat:BL601A，北京兰杰柯科技有限公司产品)溶液,充分溶解离心管底部的沉淀物，并吹打或涡旋使其均匀。
(6)检测与分析
若脱脂奶粉浓缩后的重悬液检测目的病毒为阳性，可根据需要开展进一步试验。即：取20-40ml牛肉浸粉洗脱液加到超高速离心管中，向离心管底部加入5ml 30％的蔗糖溶液以形成垫层，在30000r/min条件下离心2h以上，再用0.1M的PBS(pH7.2-7.4)进行重悬，重悬液可进行病毒的分离鉴定。
上述方法中，所述步骤(1)中过滤器体积约为120cm3，填充的的湿玻璃棉密度约为0.5g/cm3，可过滤1000L水以上。
上述方法中，所述步骤(2)中蠕动泵过滤速度可为1L-4L/min，过滤速度对吸附效果无显著影响。
上述方法中，所述步骤(3)中滤芯可在4℃条件下保存48h随即送到试验室进行洗脱，洗脱液pH在9.0-10.0之间的处理效果最好；洗脱液浸泡时间最佳为15-20min。
上述方法中，所述步骤(4)中脱脂奶粉浓度为1‰时效果最好并便于观察；在16-25℃的条件下摇晃效果最佳。
上述方法中，步骤(5)中可将多管浓缩后的重悬液混合后再次离心，取沉淀再次用PBS重悬，终浓缩液体积一般为0.5ml-1ml。
上述方法中，步骤(6)中超高速离心可以最大程度地保存浓缩病毒的活性，便于开展病毒的分离、鉴定以及高通量测序工作。
本发明的优点：
本发明利用制备的玻璃棉滤芯对水体中病毒进行吸附、洗脱和浓缩，可过滤大体积前端样本；通过建立模型发现本发明可对水中DNA病毒、RNA病毒等不同种类病毒进行浓缩，如100L的水样品经过滤浓缩后病毒终浓度比原水中提高1000-10000倍。应用玻璃棉滤芯可在多种场景下进行采样和浓缩，对设备和试剂要求简单，在基层实验室均可进行，对完善公共卫生安全风险评估和养殖场生物安全风险评估具有重要意义。
附图说明
图1：PRV-gH-qPCR不同浓度质粒扩增曲线图。
图2：PRV-gH-qPCR不同浓度质粒标准曲线图。
图3：PEDV—RT-qPCR不同浓度质粒扩增曲线图。
图4：PEDV—RT-qPCR标准曲线图。
图5：本发明的主要工艺流程涉及的过滤设备配置示意图。
图6：本发明浓缩工艺步骤示意框图。
具体实施方式
下面通过实施实例进一步描述本发明，本实施例主要是以伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)和沙门菌噬菌体ph2-2为模型进行。但不限于上述猪源性病毒。
1.玻璃棉滤芯的制备
(1)在制作每批过滤器前，用1‰次氯酸钠溶液或5‰的过硫酸氢钾溶液对过滤器、管道、烧杯等进行消毒；然后用5‰的硫代硫酸钠对过滤器浸泡和对工作台面进行擦拭，去除残留的消毒液。
(2)用电子天平称取25g的干玻璃棉，并用蒸馏水浸泡30min后，排出多余的水分。
(3)用0.5M的盐酸浸泡玻璃棉15-20min，排出多余的盐酸，用蒸馏水冲洗玻璃棉3-5次。
(4)用0.5M的氢氧化钠浸泡玻璃棉15-20min，排出多余的氢氧化钠，用蒸馏水冲洗玻璃棉3-5次。
(5)将0.1M PBS(调整pH至6.7-7.0)浸泡玻璃棉，然后装到过滤器中，密封保存，本实施例中过滤器大小约为120cm3；玻璃棉滤芯在4℃保存3个月浓缩效率无明显下降。
2.PRV(猪伪狂犬病病毒)、PEDV(猪流行性腹泻病毒)和Phage(噬菌体)ph2-2三种病毒检测方法的建立
2.1 PRV-qPCR方法的建立
(1)按照商品化核酸提取试剂盒(Cat:RM201-02,南京诺唯赞生物科技股份有限公司)说明书操作步骤，提取PRV的核酸，置-20℃保存。(本试验中使用的PRV均为HB-98疫苗株，购自武汉科前生物股份有限公司，批号20220112)。
(2)参考中华人民共和国国家标准《伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法》，标准号为GB/T35911-2018，设计扩增PRV-gH质粒片段的引物，扩增后的片段大小为313bp，参考2xRapid Taq Master Mix(Cat:P222-01，南京诺唯赞生物科技有限公司)说明书进行扩增。
表1 PRV-gH质粒片段的引物序列
引物名称 序列(5-3)
PRV-gH-plasmid-F CTGCCGCTGGAGGTCATCA
PRV-gH-plasmid-R CCGCCTCGGAGAAGACGA
表2 PRV-gH质粒片段的扩增体系
试剂 加样量(μl)
2x Rapid Taq Master Mix 25
PRV-gH-plasmid-F 2
PRV-gH-plasmid-R 2
dd-H2O 19
模板 2
反应总体积 50
表2反应程序：第一步95℃预变性5min；第二步95℃变性15s，52℃退火15s,72℃延伸15s，共进行35个循环；第三步72℃延伸至5min，获得50μl的反应产物。
(3)取50μl PCR产物按照商品化胶回收试剂盒(REF：D2500-02,美国Omegabio-tek公司)说明书的操作步骤对目的片段进行纯化和回收。
(4)将纯化的目的片段与PMD-19T载体连接，将连接产物转移到大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆并送武汉擎科生物技术有限公司测序，测序结果blast比对表明为阳性重组体。
(5)将大肠杆菌DH5α阳性克隆在TSB培养基(REF：211825，美国BD公司)中扩大培养，按商品化质粒提取试剂盒(Cat:DP103-03,天根生化科技(北京)有限公司)说明书指导，取5ml菌液提取质粒并保存在-20℃中。
(6)用分光光度计读取质粒在260nm处的OD值，换算出质粒浓度为176μg/μl，确定为本试验中的标准品，换算成拷贝数为5.28*1010copies/μl。
(7)将质粒标准品用水依次稀释到每μl拷贝数分别为5.28*1010、5.28*109、5.28*108到5.28*101个。将每个稀释梯度的质粒标准品分别取2μl做qPCR，测定结果建立标准曲线的相关公式。
(8)检测体系和程序参考中华人民共和国国家标准《伪狂犬病病毒荧光PCR检测方法》，标准号为GB/T 35911-2018，具体见表3和表4。
表3 PRV-gH-qPCR引物和探针
表4 PRV-gH-qPCR扩增体系
表4反应程序：第一步为95℃5分钟；第二步为95℃变性15s，60℃延伸30s，第二步为40个循环且在60℃采集荧光信号，根据结果建立PRV-gH-qPCR标准曲线；以ddH2O为阴性对照。
2.3 PEDV-RT-qPCR方法的建立
(1)按照商品化核酸提取试剂盒说明书操作步骤，提取PEDV疫苗毒株的核酸(本试验中使用的PEDV均为AJ1102-R疫苗株，购自武汉科前生物股份有限公司，批号为20220318)；并用按照试剂盒说明书(REF：RR036A，宝生物工程(大连)有限公司)进行反转录，将所得cDNA置-20℃保存。
(2)在PEDV-M基因保守片段上设计PEDV-M质粒片段的质粒片段引物，扩增后的片段大小为614bp。
表5 PEDV-M质粒片段引物
引物名称 序列(5-3)
PEDV-M-plasmid-F TTGGTGGTCTTTCAATCC
PEDV-M-plasmid-R GGTCCTGTTCCGAGGTAG
表6反应程序：第一步95℃预变性5min；第二步95℃变性15s，52℃退火15s,72℃延伸15s，共进行35个循环；第三步72℃延伸至5min，获得50μl的反应产物。
中间步骤同2.1中(3)、(4)和(5)步的方法。
表6 PEDV-M质粒片段扩增体系
试剂 加样量(μl)
2x Rapid Taq Master Mix 25
PEDV-M-plasmid-F 2
PEDV-M-plasmid-R 2
dd-H2O 19
DNA 2
反应总体积 50
(6)用分光光度计读取质粒在260nm处的OD值，换算出质粒浓度为50μg/μl，确定为本试验用的标准品，换算成拷贝数为1.4*1010copies/μl。
(7)将质粒标准品用水依次稀释到每μl拷贝数为1.4*1010、1.4*109、1.4*108到1.4*101个。将每个稀释梯度的质粒标准品分别取2μl做qPCR，测定结果建立标准曲线的相关公式。
(8)反应体系和程序参考本申请人的实验室已有方法(王玄珂.猪流行性腹泻病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立及其初步应用[D].华中农业大学,2013(10-11))，具体见表7和表8。
表7 PEDV-M-RT-qPCR引物和探针
引物/探针名称 序列(5-3)
PEDV-M-Primer-F CGTACAGGTAAGTCAATTAC
PEDV-M-Primer-F GATGAAGCATTGACTGAA
PEDV-M--Probe TTCGTCACAGTCGCCAAGG
表8 PEDV-M-RT-qPCR扩增体系
表8反应程序：第一步为95℃5分钟；第二步为95℃变性15s，60℃延伸30s，第二步为40个循环且在60℃采集荧光信号，根据结果得到PEDV-RT-qPCR标准曲线；以ddH2O为阴性对照。
2.3噬菌体毒价的测定
(1)宿主菌制备：选取沙门菌单菌落接种于5ml TSB培养基中，200r/min、37℃培养16-18h，得到宿主菌悬液，分装后4℃保存。
(2)噬菌体效价的测定：将待测噬菌体ph2-2【(Salmonella paratyphibacteriophage)，专利申请号2021113907587，公布号CN114107222A，公开日2022年03月07日】。用PBS(pH7.2-7.4)分别稀释至10-1，10-2，10-3直到10-7CFU/ml，共计7个梯度。
(3)取300μl宿主菌悬液于无菌10ml EP管中,再向EP管加入已融化的45℃半固体琼脂(2.5gTSA+1.8gTSB+100ml水)培养基至8ml，迅速倒入已准备好的底层为TSA培养基的平皿，倾斜旋转平皿使其分布均匀,待琼脂凝固后,按稀释度分别取10μl噬菌体病毒液点于平皿上，晾干后37℃恒温倒置培养过夜。
(4)各稀释度做三个平行样，同时加无菌水作为空白对照。
(5)观察透明空斑并计数，取三个平行样的平均值。
其中，噬菌体效价(PFU/ml)＝每梯度平均噬菌斑数×稀释倍数×100。
2.4回收率的计算
回收率是浓缩效率最重要的指标之一，它定义为播种到一定体积水中的病毒，经浓缩后得到的病毒占播种病毒的比例，计算公式为：
回收率＝(洗脱液病毒浓度*洗脱液体积)/播种病毒总量
由于病毒在不同溶液中检测的结果有差异，所以播种病毒应加入到洗脱液中稀释后检测，以排除不同溶液溶质对病毒浓度测定干扰。
3.pH对回收率的影响
病毒粒子等电点大多低于7.0，因此病毒在中性水中大多带负电荷，且推测病毒负电荷强度会受pH影响，pH越高负荷电荷越强。本发明对玻璃棉进行处理后，增强玻璃棉表面的正电荷作用，以提高玻璃棉对水中负电荷病毒的吸附能力，为了解不同pH的水对玻璃棉吸附病毒效果的影响，基于绝大多数临床水样pH在6.0-9.0之间，本试验设置了pH6.0、pH7.0、pH8.0、H9.0四个处理组进行比较。为了保持每批次试验中病毒播种总量的一致性，可预先将PRV和PEDV疫苗干粉溶解后混合，再将病毒混合液稀释一定倍数分装到离心管中，置-80℃保存，随用随取。
(1)设置5个处理组，每个处理组配制4L PBS溶液(pH7.2-7.4)，并加入5‰的硫代硫酸钠中和余氯；前面4个处理组将pH分别调整为6.0、7.0、8.0、9.0，最后一个处理组为阴性对照组；每组试验重复3次。
(2)向前面4个不同pH组中分别加入200μl病毒混合液，搅拌均匀后按照前文所述方法进行过滤。
(3)阴性对照组中不加病毒混合液，直接过滤，并将150ml的牛肉浸粉洗脱液保存备用。
(4)将阴性对照组的洗脱液取5ml，并加入200μl的病毒混合液，作为病毒总量组。
(5)将4个pH过滤组、阴性对照组和病毒总量组分别取200μl溶液提取核酸并反转录，按照前文方法检测和计算病毒拷贝数。
(6)阴性对照检测结果为阴性则试验成立；按照已测定的标准曲线，计算病毒拷贝数和回收率，结果见表9；以临床水样中最常见的pH7.0水样浓缩为例，浓缩前后病毒浓度见表10。
表9不同pH对两种病毒浓缩回收率的影响
表10 pH 7.0时两种病毒浓缩前后浓度(病毒浓度单位：copies/μl)
表10说明：回收率＝(浓缩洗脱液病毒浓度*150ml)/(播种病毒总量浓度*5ml)
结果表明，玻璃棉对两种病毒均有浓缩效果，但是在不同pH条件下回收率有一定差异：PRV在从pH6.0到pH9.0间随pH变化并不显著，其最高回收率和最低回收率间仅差10％；PEDV在从pH6.0到pH9.0，随着pH增大，回收率总体上呈下降趋势，但是其最高回收率和最低之间相差不到2倍；因此一般情况下无需进行对水样进行pH调整。
4.水质对回收率的影响
临床水样由于来源不同，所富含的有机物、盐度、微生物种类均不相同，为了评估本方法的适用范围，根据样本可能的来源(污水处理、养殖场周边、主干河流等)特选取了具有代表意义的五种水质进行测定。
(1)设置6个组，分别选取自来水(pH8.0)、城市内陆湖水(pH9.0)、长江水(pH7.9)、郊区河流(湖北省武汉市)(pH7.84)、PBS(pH7.4)5种不同水基质,最后一组为阴性对照组；每组试验重复3次。
(2)向前面5个不同水质组中分别加入已制备分装的200μl病毒混合液，搅拌均匀后按照前文所述方法进行过滤。
(3)阴性对照组中不加病毒混合液，直接过滤，将150ml的牛肉浸粉洗脱液保存备用。
(4)将对照组的洗脱液取5ml，并加入200μl的病毒混合液，作为病毒总量组。
(5)将5个不同水质组、阴性对照组、病毒总量组分别取200μl提取核酸并反转录，并按照前文方法检测和计算病毒浓度。
(6)阴性对照检测结果为阴性则试验成立；按照已测定的标准曲线，计算病毒拷贝数和回收率，结果见表11；以常见的郊区河流为例，浓缩前后病毒浓度见表12。
表11不同水质对两种病毒浓缩回收率的影响
表12武汉市郊区河流水中两种病毒浓缩前后浓度(病毒浓度单位：copies/μl)
表12的说明：回收率＝(洗脱液病毒浓度*150ml)/(病毒总量组浓度*5ml)
结果表明，玻璃棉对不同水质中的两种病毒均有较好浓缩效果，但是水质的差异会导致回收率在一定范围内波动。此试验表明本方法可适用于多种不同的水质，具有较广的适用范围。
5.浓缩方法对其他猪源性病毒的适用性研究
在玻璃棉对PRV和PEDV有较好回收效果基础上，对其他常见猪源病毒猪乙脑病毒、猪呼吸与繁殖综合征病毒、猪细小病毒在水中的回收效果开展初步评估；三种病毒分别参考浙江省地方标准《猪流行性乙型脑炎病毒荧光定量RT－PCR检测方法》，标准号为DB33/T2246-2020；中华人民共和国进出口行业标准《猪细小病毒病检疫技术规范》，标准号为SN/T1919-2016；中华人民共和国国家标准《猪繁殖与呼吸综合征病毒荧光RT-PCR检测方法》，标准号为GB/T 35912-2018；建立qPCR方法进行检测，通过浓缩前后CT值的差异进行初步评估。
(1)设置2个组，配制4L-9L PBS溶液(pH7.2-7.4)，并加入5‰的硫代硫酸钠中和余氯；第1和2次试验为3L，第3次为9L的PBS。
(2)向第1组中分别加入200μl猪乙脑病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒疫苗株混合液(本试验中使用上述三种病毒分别为SA14-14-2株，JXA1-R株和WH-1株，由武汉科前生物股份有限公司馈赠)，搅拌均匀后按照前文所述方法进行过滤。
(3)第2组为阴性对照组，其中不加病毒混合液，直接过滤，并将150ml的牛肉浸粉洗脱液保存备用。
(4)将过滤组、阴性对照组分别取200μl溶液提取核酸并反转录，按照前文方法检测。
(6)阴性对照检测结果为阴性则试验成立；通过浓缩前后的CT值差异初步评估效果。
表13不同病毒在水中浓缩的效果
病毒种类 ΔCT1(3L) ΔCT2(3L) ΔCT3(9L)
PRRSV 1.325 1.365 2.078
PPV 1.220 1.324 2.560
JEV 1.205 0.875 1.715
表13说明：本表中三种病毒未绘制标准曲线进行定量计算，是通过CT值的差异(即ΔCT)来初步评估浓缩效果；根据qPCR反应原理及PRV和PEDV的标准曲线，CT值相差1时病毒浓缩相差约2倍，相差N时浓度相差2N倍。
试验结果表明和猪乙脑病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪细小病毒均能被玻璃棉有效浓缩，浓缩前后病毒浓缩明显提高；且随着体积的增大其终浓度也逐渐提高，表现出和PRV、PEDV相似的浓缩规律；这表明本方法也可有效浓缩水中其他种类病毒。
6.浓缩方法的感染性回收效果
qPCR或者RT-qPCR方法是目前检测水中病毒最常用的方法，但是其只能检测核酸而无法鉴别病毒的感染性，也无法鉴别浓缩方法对病毒活性的影响；但在研究中往往需要对浓缩后的病原进一步分析，对有感染性的活病毒开展分离鉴定工作；因此有必要评估本发明对病毒感染性回收的效果。
由于本发明滤芯材料在开放条件下制备，不具备无菌操作条件；对浓缩液中的病毒进行细胞培养时，需提前用0.22μm滤器过滤，导致病毒含量会有不同程度损耗，回收率统计不准确；因此本方法采用噬菌体作为感染性回收模型，在避免细菌污染基础上，可较为准确的测定感染性回收率。
(1)设置试验组和阴性对照组：将一定量的ph2-2噬菌体病毒液加到4L-20L的PBS(pH7.2-7.4)溶液中作为试验组，按照前述方法进行过滤；另一组为阴性对照组。
(2)阴性对照组中不加噬菌体病毒液，直接过滤，将150ml的牛肉浸粉洗脱液保存备用。
(3)将阴性对照组的洗脱液取5ml，向洗脱液内加入200μl的ph2-2病毒液，作为病毒播种总量。
(4)将试验组、阴性对照组、病毒播种组按照2.3方法测定噬菌体效价，结果见表14。
表14噬菌体ph2-2的感染性回收效果(噬菌体浓度单位：PFU/ml)
表13的说明：回收率＝(洗脱液噬菌体浓度*150ml)/(噬菌体播种总量浓度*5ml)
结果显示，噬菌体病毒液经过滤回收后有约5％-12％的回收率，且浓缩后病毒浓度随样本体积增大而增大。4L水过滤后浓缩液效价提高2倍，16L过滤后提高7倍，20L过滤提高约10倍，则推测100L水经玻璃棉过滤后病毒浓度可提高约40-50倍；说明本方法能够有效回收活病毒和提高浓缩液中活病毒浓度。
7.二级浓缩的比较
无论水样前端体积大小，经玻璃棉过滤后得到的150ml牛肉浸粉洗脱液，其体积仍然较大，需要对其进行二级浓缩。本发明对脱脂奶粉、PEG-Nacl和超高速离心三种方法进行了比较，筛选出适用于不同场景的方法。
取4LPBS(pH7.2-7.4)通过玻璃棉滤芯，用150ml的牛肉浸粉洗脱液浸泡和冲洗，获得洗脱液150ml并保存；取已制备分装的200μl病毒混合液(PRV和PEDV)和200μlph2-2噬菌体加入到150ml洗脱液中，作为二级浓缩前的样品，对病毒进行回收评估，每组重复3次。
在每次试验中，取40ml样本液(加1‰脱脂奶粉，pH调整到5.0)作为脱脂奶粉组；取40ml样本液(加10％PEG-8000,0.2M Nacl,pH调整到6.5-7.5间)作为PEG-Nacl组；取40ml样本液作为超高速离心组(30000r/m离心2h)；按照前文所述方法进行浓缩操作和检测，最终得到0.5ml的PBS重悬液作为二级浓缩液。对二级浓缩方法在核酸和感染性回收两方面进行比较，具体见表15、表16和表17。
表15 PRV二级浓缩方法回收率(病毒浓度单位：copies/μl)
表15的说明：回收率＝(二级浓缩后病毒浓度*0.5ml)/(二级浓缩前病毒浓度*40ml)表16 PEDV二级浓缩方法回收率(病毒浓度单位：copies/μl)
表16的说明：回收率＝(二级浓缩后病毒浓度*0.5ml)/(二级浓缩前病毒浓度*40ml)
表17噬菌体ph2-2二级浓缩方法感染性回收率(浓度单位：PFU/ml)
表17的说明：二级浓缩方法回收率＝(二级浓缩后噬菌体浓度*0.5ml)/(二级浓缩前噬菌体浓度*40ml)
在病毒核酸qPCR检测时，脱脂奶粉法对PRV的浓缩效率显著优于PEG-Nacl法，虽然其对PEDV的浓缩效率比PEG-Nacl法低1倍，考虑操作步骤、设备要求、试剂损耗、结果观察等方面因素，临床上初步检测选用脱脂奶粉法更加简洁和准确。但在对病毒进一步研究时，可以采用超高速离心的方法，获得尽量多具有活性的病毒粒子；若不具备超高速离心条件可使用PEG-Nacl法。
8.回收效果的讨论
由于样本经玻璃棉和二级浓缩后的最终体积为0.5-1ml,当总体回收率为N时，样本的浓缩倍数＝N*样本体积/1ml；以100L(100000ml)样本体积计算，总体回收率为1％时浓度可以提高1000倍，回收率为10％时终浓度可以提高10000倍。本发明验证玻璃棉对两种不同类型猪源性病毒以及一种噬菌体具有较好的浓缩效果，也探索了对其他病毒的浓缩效果，结果表明本发明对大多数水中病毒均会有浓缩作用。具有重要的应用和推广价值。

Claims (1)

1.一种浓缩水中猪源性病毒的方法，所述的猪源性病毒为伪狂犬病毒，包括下列步骤：
(1)制备玻璃棉过滤器，用0.5-1M的盐酸和氢氧化钠分别浸泡；
(2)采样过滤：通过蠕动泵，以1-1.5L/min速度抽取临床水样50-100L或更大体积，将水中病毒吸附到玻璃棉上；
(3)洗脱病毒：将过滤器置于4℃条件下于48h内送到实验室，用pH9.0-10.0，浓度为3％的牛肉浸粉溶液浸泡15min后再冲洗保存，洗脱完成后加入盐酸将pH调整至中性以保持病毒活性；
(4)洗脱液的浓缩：向上一步的洗脱液中加入1‰的脱脂奶粉，并将pH调整至5.0，在室温下以200r/min摇晃2h，离心30min后弃去上清，留取沉淀重悬；
(5)若脱脂奶粉浓缩后的重悬液检测目的病毒核酸为阳性，使用超高速离心法对洗脱液进行浓缩，获得尽可能多的完整病毒粒子。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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水中病毒浓缩方法研究进展;陈莉萍;徐德顺;;中国卫生检验杂志;20150131(第02期);摘要 *
水样中病毒浓缩和回收;杨振兴;;现代预防医学;20111231(第22期);摘要 *

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