CN108220284A - 一种磁珠法细菌基因组dna提取试剂盒及应用 - Google Patents

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Abstract

一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒及应用，属于分子生物学技术领域。该试剂盒包括以下六种组分：磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E和洗脱液。该试剂盒提取方法包括以下四个步骤：细菌裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱。本发明试剂盒采用单分散、超顺磁性硅羟基纳米磁珠，配合独特的缓冲液***，提取出来的细菌基因组DNA浓度大、纯度高、完整性好。

Description

一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒及应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及一种DNA提取试剂盒。
背景技术
基因组DNA的提取是分了生物学研究的一个重要环节，是进行几乎所有核酸检测的基础。传统的细菌基因组DNA提取方法有酚—氯仿抽提法、盐析法和离心柱法等。这些方法均存在一些缺点，例如：酚—氯仿抽提法要使用到酚和氯仿等有毒物质，对人体有害，且容易造成环境污染；盐析法提取的DNA纯度低。硅胶膜吸附柱法提取的DNA浓度低。
传统细菌基因组DNA提取方法同时提取过程需要反复换管、离心、分液，步骤繁琐，提取工作效率低下，并且会造成样本的丢失与污染。此外。传统的方法实现自动化困难、单位时间通量低、既费时又繁琐，远远不适用于核酸自动化检测。近年来，基于纳米材料的基因组DNA分离技术得到了快速发展，而纳米磁珠由于具有分散性好、易于功能化、易于自动化的优点使之成为非常合适的基因组DNA制备载体。应用表面修饰了功能基团的纳米磁珠和合适的缓冲液***，能够快速、高效地从细菌中提取基因组DNA。具有自动化升级的潜力，使得核酸提取的大规模集成化，均一化成为可能。
由于细菌中存在大量的蛋白质和RNA，现有的磁珠法提取的细菌基因组DNA由于没有去除蛋白质和RNA等杂质的步骤，提取到的基因组DNA得率低、纯度低。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明提供了一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒，利用该试剂盒提取的细菌基因组DNA片段完整，纯度高，无蛋白质和RNA污染，并且得率高。
为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案。
本发明所述的一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒，包括磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E、洗脱液六种组分。
所述磁珠悬液A中使用的磁珠为单分散、超顺磁性硅羟基纳米磁珠，磁珠粒径300-500nm，浓度100mg/mL，磁珠悬浮在20%的乙醇中。
所述缓冲液B终浓度组成为：2-5mol/L盐酸胍、1-2%月桂酰肌氨酸钠、200-500µg/mL核糖核酸酶A（RNase A）、0.05-0.1mol/L柠檬酸钠，溶剂为无菌去离子水，缓冲液B pH为6.5-8.0。核糖核酸酶A可以快速有效的降解体系中的RNA，去除RNA污染，同时增加磁珠对DNA的吸附量。
所述缓冲液C终浓度组成为：1-2mol/L异硫氰酸胍、60-80%异丙醇、1-5%聚乙二醇、0.02-0.05mol/L柠檬酸钠，溶剂为无菌去离子水，缓冲液C pH为5.5-7.5。缓冲液C为清洗液，其中的异硫氰酸胍能够使体系中的蛋白质迅速变性而与DNA分离，达到清除蛋白质的目的。
所述缓冲液D终浓度组成为：1-2mol/L醋酸钠、5-8%聚乙二醇，溶剂为无菌去离子水，缓冲液D pH为5.0-6.0。
所述缓冲液E终浓度组成为：0.05-0.1mol/L氯化钠、60-80%乙醇、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，溶剂为无菌去离子水，缓冲液D pH为7.0-7.5。
所述洗脱液为：无菌去离子水或10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，洗脱液pH为7.0-8.0。
本发明所述的试剂盒提取细菌基因组DNA包括细菌裂解、磁珠吸附、洗涤、洗脱步骤，具体如下。
步骤一，向离心管中加入100-500μL细菌培养液，然后加入初始菌液相同体积的缓冲液B，混匀，裂解15分钟。
步骤二，向离心管中加入10μL 磁珠悬液A和2倍初始菌液体积的缓冲液C，混匀，室温放置3分钟。
步骤三，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至孔壁上之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
步骤四，加入500μL 缓冲液D，混匀，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。
步骤五，加入500μL 缓冲液E，混匀，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。
步骤六，重复步骤五1次。
步骤七，将离心管置于55℃恒温箱中干燥5-7 分钟至离心管内无液体残留。
步骤八，加入50-100μL洗脱液，充分悬浮磁珠5分钟。
步骤九，取出离心管并置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，小心吸取上清至新的离心管，即获得DNA产物。
本发明所述的磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E，为便于区分表述不同步骤所用缓冲液不同而命名，字母A、B、C、D、E本身没有含义。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明提供的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒，是一种有效的、高质量的核酸提取试剂盒。试剂盒中的单分散纳米磁珠，配以独特的缓冲***，使得本发明试剂盒提取出来的细菌基因组DNA片段完整、纯度高、得率高，满足后续实验要求，大大提高了DNA的质量。
附图说明
图1是本发明试剂盒提取的大肠杆菌DH10B和金黄色葡萄球菌基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DNA分子量DL15000，泳道1：本试剂盒提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA，泳道2：本试剂盒提取的金黄色葡萄球菌基因组DNA。
图2是三种不同方法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA的琼脂糖凝胶电泳图，泳道M：DNA分子量DL15000，泳道1：本发明试剂盒提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA，泳道2：酚—氯仿抽提法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA，离心柱法提取的大肠杆菌DH10B基因组DNA。
具体实施方式
本发明将通过以下实施例作进一步说明。
实施例1。
磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒的制备。按照以下组分浓度配置相应的缓冲液：
磁珠悬液A：100mg/mL纳米磁珠、20%乙醇。
缓冲液B：3mol/L盐酸胍、2%月桂酰肌氨酸钠、400µg/mL RNase A、0.05mol/L柠檬酸钠，pH为7.5。
缓冲液C：1.5mol/L异硫氰酸胍、70%异丙醇、5%聚乙二醇、0.02mol/L柠檬酸钠， pH为5.5。
缓冲液D：1.5mol/L醋酸钠、5%聚乙二醇，pH为5.5。
缓冲液E：0.05mol/L氯化钠、75%乙醇、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，pH为7.0。
洗脱液：无菌去离子水，pH为7.2
实施例2。
用上述实施例1制备的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒分别提取大肠杆菌DH10B和金黄色葡萄球菌基因组DNA，步骤如下：
步骤一，向离心管中加入200μL大肠杆菌DH10B或金黄色葡萄球菌过夜培养液，然后加入200μL缓冲液B，混匀，裂解15分钟。
步骤二，向离心管中加入10μL磁珠悬液A和400μL缓冲液C，混匀，室温放置3分钟。
步骤三，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至孔壁上之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管。
步骤四，加入500μL 缓冲液D，混匀，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。
步骤五，加入500μL 缓冲液E，混匀，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管。
步骤六，重复步骤五1次。
步骤七，将离心管置于55℃恒温箱中干燥5-7分钟至离心管内无液体残留。
步骤八，加入100μL洗脱液，充分悬浮磁珠5分钟。
步骤九，取出离心管并置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，小心吸取上清至新的离心管，即获得DNA产物。
提取的基因组DNA经NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测浓度和纯度，结果如表1所示。可以看出，本试剂盒提取得到的基因组DNA纯度高，能够满足实验要求，且基因组DNA提取效率较高，可从200μL菌液获得大于80μg DNA。取5μL的基因组DNA，于质量浓度1%的琼脂糖凝胶上，在100v电压下电泳30min，用紫外凝胶成像***进行照相，可见基因组DNA完整性好，且没有RNA污染(图1所示)。
表1 本试剂盒细菌基因组DNA提取结果
细菌类型 DNA浓度（ng/μL） OD260/280 OD230/260
大肠杆菌DH10B 450.6 1.88 1.92
金黄色葡萄球菌 401.2 1.86 1.93
对比例1。
分别用酚—氯仿抽提法和离心柱法提取细菌基因组DNA，步骤分别按照各自的说明书进行，提取的基因组DNA经NanoDrop 2000C超微量分光光度计检测浓度和纯度，结果如表2所示。可以看出，本发明试剂盒提取得到的基因组DNA与其他两种方法相比，纯度高、浓度大，没有盐离子污染，基因组完整性好（图2所示）。
表2 三种方法对DH10B基因组DNA提取结果
方 法 DNA浓度（ng/μL） OD260/280 OD230/260
本发明试剂盒 443.3 1.87 1.91
酚—氯仿抽提法 215.4 1.78 1.92
离心柱法 358.9 1.66 1.93

Claims (2)

1.一种磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒，其特征是包括磁珠悬液A、缓冲液B、缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E、洗脱液六种组分；
所述磁珠悬液A中使用的磁珠为单分散、超顺磁性硅羟基纳米磁珠，磁珠粒径300-500nm，浓度100mg/mL，磁珠悬浮在20%的乙醇中；
所述缓冲液B终浓度组成为：2-5mol/L盐酸胍、1-2%月桂酰肌氨酸钠、200-500µg/mL核糖核酸酶A、0.05-0.1mol/L柠檬酸钠，溶剂为无菌去离子水，缓冲液B pH为6.5-8.0；
所述缓冲液C终浓度组成为：1-2mol/L异硫氰酸胍、60-80%异丙醇、1-5%聚乙二醇、0.02-0.05mol/L柠檬酸钠，溶剂为无菌去离子水，缓冲液C pH为5.5-7.5；
所述缓冲液D终浓度组成为：1-2mol/L醋酸钠、5-8%聚乙二醇，溶剂为无菌去离子水，缓冲液D pH为5.0-6.0；
所述缓冲液E终浓度组成为：0.05-0.1mol/L氯化钠、60-80%乙醇、10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，溶剂为无菌去离子水，缓冲液D pH为7.0-7.5；
所述洗脱液为：无菌去离子水或10mmol/L三羟甲基氨基甲烷，洗脱液pH为7.0-8.0。
2.权利要求1所述的磁珠法细菌基因组DNA提取试剂盒的应用，其特征是按如下步骤：
步骤一，向离心管中加入100-500μL细菌培养液，然后加入初始菌液相同体积的缓冲液B，混匀，裂解15分钟；
步骤二，向离心管中加入10μL 磁珠悬液A和2倍初始菌液体积的缓冲液C，混匀，室温放置3分钟；
步骤三，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至孔壁上之后，吸弃上清，从磁力架上取出离心管；
步骤四，加入500μL 缓冲液D，混匀，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管；
步骤五，加入500μL 缓冲液E，混匀，将离心管置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，吸弃上清，然后从磁力架上取出离心管；
步骤六，重复步骤五1次；
步骤七，将离心管置于55℃恒温箱中干燥5-7 分钟至离心管内无液体残留；
步骤八，加入50-100μL洗脱液，充分悬浮磁珠5分钟；
步骤九，取出离心管并置于磁力架上15秒，待磁珠完全吸至管壁上后，小心吸取上清至新的离心管，即获得DNA产物。
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