CN113588648B - 一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法 - Google Patents

一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于药材检测领域，具体是一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法，包括：(1)取样；(2)性状鉴别；(3)显微鉴别：样本粉末显微观察、样本花柄玻片标本显微观察；(4)理化检测：采用乙酸‑铜离子反应进行环烯醚萜类检识；(5)一般项检查：包括水分检查、灰分检查、浸出物检查和重金属检查；(6)化学成分检测：分别采用薄层色谱法和高效液相色谱法检测进行龙胆苦苷、异荭草苷的定性和定量分析；全部检测结果达到相应的质量指标则符合质量要求。本发明填补了小秦艽花蒙药材质量检测方法的空白，具有全方面、***化进行质量控制的优点，为小秦艽花的开发利用提供了可靠的科学依据。

Description

一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法
技术领域
本发明属于药物质量检测领域，具体是一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法。
背景技术
小秦艽花，蒙药名为呼和朱力根-其木格，为龙胆科龙胆属达乌里龙胆(GentianadahuricaFisch)的干燥花，广泛分布于内蒙古、陕西、甘肃、新疆等地，多生长于田边、路旁、河滩、水沟边、向阳山坡等地，是蒙药的常用药材之一。小秦艽与大叶秦艽(GentianamacrophyllaPall.)、粗茎秦艽(GentianacrassicaulisDuthieexBurk.)、麻花秦艽(GentianastramineaMaxim.)作为中药秦艽的基原植物，收载于2020年版《中国药典》。
小秦艽花收载于《中华人民共和国***药品标准》(蒙药分册)，为蒙医临床常用药，具有清热、解毒、止咳、祛痰的功效，主治肺热咳嗽、咽喉热、咽喉肿痛、毒热、瘟热等症。以龙胆苦苷为代表的环烯醚萜类化合物具有一定的抗炎作用，可视为秦艽类药材抗炎的主要有效成分。但是，目前小秦艽花的相关研究较少，还没有建立质量控制的检测方法。
相关文献对小秦艽花的报道如下：现有技术“HPLC法测定蒙药材小秦艽花中龙胆苦苷的含量”(《中国民族医药》杂志2012年第18卷第2期)只测定了了小秦艽花中龙胆苦苷一种化学成分；现有技术“HPLC法测定小秦艽花中异荭草苷的含量”(《内蒙古医科大学学报》杂志2011年第33卷第4期)只测定了了小秦艽花中异荭草苷一种化学成分；现有技术“HPLC-DAD双波长法同时测定小秦艽花中5个成分的含量”(《药物分析》杂志》2020年第40卷第2期)测定了小秦艽花中5种化学成分，但并未对水分、灰分等一般项检查进行检测；现有技术“小秦艽花质量分析研究”(《亚太传统医药杂志》2019年第15卷第11期)对小秦艽花进行薄层鉴别、异荭草苷的含量测定、水分、灰分、浸出物、重金属的一般项检查，但是并未对小秦艽花的性状鉴别、显微鉴别、理化鉴别进行规范，并且文中药材批次较少，且集中于内蒙古地区，未能体现药材广泛性，不能全面代表药材。
综上，目前小秦艽花的相关研究较少，还没有建立质量控制的检测方法。我们将从性状、显微鉴别，理化鉴别，薄层色谱鉴别、含量测定、一般性检查(水分、总灰分、酸不溶灰分、浸出物、重金属)等多方面对小秦艽花质量进行控制，为小秦艽花的开发利用提供可靠的科学依据。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，提供了一种可提高小秦艽花药品质量标准及安全有效性和质量可控性的小秦艽花质量检测方法。
所述质量检测方法包括性状、显微、理化鉴别小秦艽花，薄层色谱定性鉴别龙胆苦苷、异荭草苷，高效液相色谱法测定龙胆苦苷、异荭草苷含量，水分、总灰分、酸不溶灰分、浸出物、重金属测定。
本发明的技术方案是：一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法，其特征在于，由以下步骤组成：(1)取样；(2)性状鉴别：对选取样本的外观形状、大小、颜色、表面特征、质地、断面特征、气味进行鉴定；性状特征符合以下特征的样本初步确认为是小秦艽花蒙药材：花多皱缩，完整花长3～4cm；花萼钟形，长1.5～2cm，黄绿色或浅褐色，裂片5，长短不等，3～8mm，条形，质薄而脆，多破碎。花冠筒状钟形，长3～4cm，下部浅绿色，向上渐呈蓝色，裂片5，卵形，长约5mm；裂片间有皱褶，三角形；果实包裹于花冠内，成熟者长3～3.5cm，圆柱形，稍扁，内有多数细小种子；气微，味苦；见图1和图2。
(3)显微鉴别。
A.粉末显微鉴别：将步骤(1)所得样本制成50-60目(250-300μm)的粉末，挑取筛下粉末置于载玻片上，滴加甘油醋酸试液或水合氯醛试液，盖上盖玻片，加热透化，在显微镜下观察；符合以下特征的样本是小秦艽花蒙药材：粉末成褐色，茎表皮细胞，长梭形，紧密排列，壁有时连珠状增厚；花粉粒众多，球形或椭圆形，直径32～42μm，具3孔沟；花冠碎片多见，薄壁细胞方形或长方形，细胞中有油滴状物，有时可见螺纹导管，细小成束；尊片上表皮薄层细胞，波状弯曲，相互镶嵌似鳞片；薄壁细胞长方形，壁微连珠状增厚；花粉囊内壁细胞，多段碎，细胞壁呈星状或爪状分支；非腺毛，圆锥形或长卵形，下皮细胞具有乳状突起，乳突上具增厚角质层增厚，细胞内含油滴；花丝表皮细胞，近长方形，具油滴；见图3。
B.花柄横切显微鉴别：将步骤(1)所得样本的花柄放入水中浸泡4～5天，使材料软化，切成2～3mm的小段，浸泡于FAA固定液12h～24h以上，将药材从固定液中取出，用自来水冲洗12～24h，然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片处理。
脱水：从45-55％浓度的乙醇开始进行浸泡1-2h进行级次脱水，即，首次为从45-55％浓度的乙醇中进行浸泡1-2h，之后每次将乙醇的浓度提升8-10度，直至达到无水乙醇，每次时间为1-2h，如不能及时进行各级脱水的，从固定液中取出的花柄小段放在70％乙醇中保存。
透明：先经1重量份二甲苯兑1.8-2.2重量份乙醇的混合液浸渍0.6-0.6h，再依次转入1重量份二甲苯兑1重量份乙醇的混合液1.8-2.2重量份二甲苯兑1重量份乙醇的混合液中浸渍0.4-0.6h，最后转入纯二甲苯中浸渍0.4-0.6h。
浸蜡：把花柄小段放入熔化的石蜡液中浸渍2-3次，每次0.51-1.5h，放置8-15h，浸蜡时温度控制在高于石蜡熔点2-5℃。
包埋、切片、贴片、烤片处理，得干燥的样本切片。
取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡6-10min，脱完蜡后的切片可依次用纯乙醇1重量份与二甲苯0.8-1.2重量份的混合液，纯乙醇，浓度94-96％乙醇溶液、78-82％乙醇溶液、68-72％乙醇溶液分别洗4-6min，之后进行番红染液染色3-5h，水洗2-4s，之后依次用30-40％乙醇、45-55％乙醇、65-75％乙醇、75-85％乙醇、90％以上乙醇洗1.5-3min，固绿染色4-6s，染色后的切片用纯乙醇洗2-3次，每次10-20s，再用纯乙醇1重量份与二甲苯0.8-1.2重量份比例的混合液洗4-6min，纯二甲苯洗8-12min，洗去多余染料。
在洁净盖玻片上滴加1-2mL中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在显微镜下观察，以确定小秦艽花蒙药材的真伪和品质。
花柄横切鉴别，表皮为1列细胞，外壁稍厚，微木栓化，壁皱缩；皮层约为2～3列扁长形细胞或不规则形，排列疏松，有裂隙，内皮层细胞较小，类方形，排列整齐。韧皮部宽广，射线明显。形成层环不明显；木质部导管单个散在或2～3个成群，稍木化；有时导管及管胞排列成“V”形；见图4。
(4)理化检测：采用乙酸-铜离子反应进行环烯醚萜类的检识；取步骤(1)所得样本的粉末少量溶于冰醋酸，加入少量铜离子，立即加热，显蓝色为环烯醚萜类正反应；含有环烯醚萜类，符合质量要求。
(5)一般项检查：以下检查均达标为符合质量要求。
A.水分检查：检测方法参考2020年版《中国药典》，水分检查方法按照2020年版《中国药典》(四部)通则0832水分测定法第二法测定，不得超过9.08％。
B.灰分检查：总灰分和酸不溶灰分检查方法按照2020年版《中国药典》(四部)通则2302测定，总灰分不得超过7.93％，酸不溶灰分含量不得超过0.79％。
C.浸出物检查：浸出物检查方法按照2020年版《中国药典》(四部)通则2201照水溶性浸出物下的热浸法测定，不得低于22.44％。
D.重金属检查：重金属检查方法为按照2020年版《中国药典》(四部)通则2321第一法原子吸收分光光度法和第二法电感耦合等离子体质谱法测定重金属铅、镉、砷、汞、铜含量，铅不得过5mg/kg；镉不得过0.4mg/kg；砷不得过2mg/kg；汞不得过0.2mg/kg；铜不得过20mg/kg。
(6)化学成分检测：包括标志性化学成分龙胆苦苷、异荭草苷的定性分析和定量分析。
其中步骤(2)性状鉴别、步骤(3)显微鉴别中的A.粉末显微鉴别和B.花柄横切显微鉴别均属于药材的基原鉴别；步骤(3)～(6)属于定性检测和定量检测。
本发明填补了小秦艽花蒙药材质量检测方法的空白，具有全方面、***化进行质量控制的优点，为小秦艽花的开发利用提供了可靠的科学依据。
本发明的优选方案如下。
所述步骤(6)化学成分检测中的龙胆苦苷、异荭草苷的定性分析为采用薄层色谱法定性检识龙胆苦苷、异荭草苷两种环烯醚萜类。
将步骤(2)所得样本制成30-40目(420-590μm)的粉末，按比例取样，每0.4-0.6g样本粉末，加入15-30mL甲醇中，超声提取(40W，30℃)50-70min，冷却至常温，用小于350μmbntx孔径筛过滤或静置6h以上取上清液，作为供试品溶液。
取龙胆苦苷、异荭草苷作为对照品，精密称定，加入甲醇分别制成成分质量浓度分别为2.0-2.5mg/mL和0.09-0.1mg/mL的单一成分对照品贮备液。
按照2020年版《中国药典》(四部)TLC法(通则0502)实验操作要求，分别吸取各单一成分对照品贮备液4-6μL和供试品溶液8-12μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，在常温下饱和后展开，其中，龙胆苦苷的展开剂体积比乙酸乙酯：甲醇：水为8-12:1.5-2.5:1，异荭草苷的展开条件体积比乙酸乙酯：甲醇：水为8-12:1.5-2.5:1，取出，晾干，置于紫外灯254nm波长下检视，对供试品与各对照品在相应的位置上所显状态进行比对，确定小秦艽花蒙药材的真伪和品质，显相同颜色的斑点，证明样品含有龙胆苦苷、异荭草苷两种环烯醚萜类，符合质量要求；见图5。
进一步的，所述步骤(6)化学成分检测中的龙胆苦苷、异荭草苷的定量分析为采用高效液相色谱法检测化学成分对进行龙胆苦苷、异荭草苷的定量分析，记录色谱图见图6；测定峰面积时的色谱条件为：检测波长为265-275nm，柱温为28-32℃，样体积4-6μL，流动相：以乙腈(A)-(0.05～0.15％)甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～8min，15％→20％A；8～11min，20％→25％A)，流速为0.8～1mL/min。
以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算得龙胆苦苷、异荭草苷2种成分的线性回归方程、线性范围、相关系数；再测定小秦艽花的色谱峰面积，以回归方程计算出小秦艽花中龙胆苦苷、异荭草苷的含量；符合以上含量测定特征为符合质量要求。
本发明的主要创新点在于以下方面。
1、现有技术“小秦艽花质量分析研究”(《亚太传统医药杂志》2019年第15卷第11期)中薄层展开条件为甲醇：水：冰醋酸为6:1:1，该方法仅对异荭草苷进行了薄层鉴别，未对龙胆苦苷进行薄层鉴别。本发明的方法不需要用到酸类试剂，保证了分离度及Rf值的大小在合适范围内，同时斑点分离度良好，斑点清晰，未见拖尾。
2、现有技术“HPLC法测定小秦艽花中异荭草苷的含量”(《内蒙古医科大学学报》杂志2011年第33卷第4期)只测定了了小秦艽花中异荭草苷一种化学成分，色谱条件为检测波长为254nm，柱温为35℃，进样体积10μL，流动相：以MeOH–H2O-HAc(35:65:1)，流速为1mL/min；现有技术“HPLC法测定蒙药材小秦艽花中龙胆苦苷的含量”(《中国民族医药》杂志2012年第18卷第2期)只测定了了小秦艽花中龙胆苦苷一种化学成分，色谱条件为检测波长为270nm，流动相：以甲醇(A)-水(B)(25:75)，流速为1mL/min。
以上两种现有技术一次均只能测定一种成分，流动相复杂，等度洗脱，且峰型较差。本发明的方法能在更短的时间内分离出两种成分，且两个化学成分峰型良好，分离度良好。
附图说明
图1为小秦艽花原植物图。
图2为小秦艽花性状图。
图3为小秦艽花粉末显微图。
图4为小秦艽花花柄横切显微图。
图5为小秦艽花和对照品TLC图(1～10.供试品11.对照品)。
图6为对照品(A)、小秦艽花样品(B)、阴性溶液(C)的HPLC图(1.龙胆苦苷2.异荭草苷)。
具体实施方式
按照本发明提供的方法和标准对不同来源的某一批次小秦艽花原料进行蒙药材的质量检测。
一、使用仪器：数码生物显微镜、型薄层数码成像仪、G型硅胶板、展开槽、HPLC仪、超声波清洗器、十万分之一电子分析天平。
二、使用试药：龙胆苦苷对照品、异荭草苷对照品(上海源叶生物科技有限公司，批号分别为Y30J9Q66926、P17M10F88275，纯度均大于98％)，乙腈、甲醇(美国Fisher公司，色谱纯)，甲酸、甲醇(天津市富宇精细化工有限公司，分析纯)，超纯水。
表1小秦艽花蒙药材来源
三、检测步骤如下。
(1)取样。
(2)性状鉴别：对选取样本的外观形状、大小、颜色、表面特征、质地、断面特征、气味进行鉴定；性状特征符合以下特征的样本初步确认为是小秦艽花蒙药材：花多皱缩，完整花长3～4cm；花萼钟形，长1.5～2cm，黄绿色或浅褐色，裂片5，长短不等，3～8mm，条形，质薄而脆，多破碎。花冠筒状钟形，长3～4cm，下部浅绿色，向上渐呈蓝色，裂片5，卵形，长约5mm；裂片间有皱褶，三角形；果实包裹于花冠内，成熟者长3～3.5cm，圆柱形，稍扁，内有多数细小种子；气微，味苦；见图1和图2。
(3)显微鉴别。
A.粉末显微鉴别：将步骤(1)所得样本制成粉末，经四号筛(65目，即230μm)筛分，挑取筛下粉末置于载玻片上，滴加甘油醋酸试液或水合氯醛试液，盖上盖玻片，加热透化，在显微镜下观察；符合以下特征的样本是小秦艽花蒙药材：粉末成褐色，茎表皮细胞，长梭形，紧密排列，壁有时连珠状增厚；花粉粒众多，球形或椭圆形，直径32～42μm，具3孔沟；花冠碎片多见，薄壁细胞方形或长方形，细胞中有油滴状物，有时可见螺纹导管，细小成束；尊片上表皮薄层细胞，波状弯曲，相互镶嵌似鳞片；薄壁细胞长方形，壁微连珠状增厚；花粉囊内壁细胞，多段碎，细胞壁呈星状或爪状分支；非腺毛，圆锥形或长卵形，下皮细胞具有乳状突起，乳突上具增厚角质层增厚，细胞内含油滴；花丝表皮细胞，近长方形，具油滴；见图3。
B.花柄横切显微鉴别：将步骤(1)所得样本的花柄放入水中浸泡4～5天，使材料软化，切成2～3mm的小段，浸泡于FAA固定液12h～24h以上，将药材从固定液中取出，用自来水冲洗24h，然后从50％乙醇开始进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片处理，取已经干燥的切片，进行脱蜡、染色，然后迅速擦去材料周围多余液体，在切片滴加1～2滴中性树胶，封片后即制成永久性玻片标本，在显微镜下观察，符合以下显微特征确认为小秦艽花蒙药材。
花柄横切鉴别，表皮为1列细胞，外壁稍厚，微木栓化，壁皱缩；皮层约为2～3列扁长形细胞或不规则形，排列疏松，有裂隙，内皮层细胞较小，类方形，排列整齐。韧皮部宽广，射线明显。形成层环不明显；木质部导管单个散在或2～3个成群，稍木化；有时导管及管胞排列成“V”形，见图4。
(4)理化检测：取步骤(1)所得样本的粉末少量溶于冰醋酸中，加入少量铜离子，立即加热，显蓝色为环烯醚萜类正反应；显蓝色说明含有环烯醚萜类，符合质量要求。
表2小秦艽花理化检识结果。
(5)一般项检查：以下检查均达标为符合质量要求。
A.水分检查：检测方法依照2020年版《中国药典》(四部)通则0832水分测定法第二法测定，不得超过9.08％；每批样品平行测定3次，取平均值，结果，本实施例中样品水分含量为6.94％～8.66％，平均值为7.57％，详见表3。
B.灰分检查：总灰分和酸不溶灰分检查方法按照2020年版《中国药典》(四部)通则2302测定，总灰分不得超过7.93％，酸不溶灰分含量不得超过0.79％；每批样品平行测定3次，本实施例中样品总灰分含量为4.89％～8.59％，平均值为6.61％；酸不溶灰分含量为0.24％～1.75％，平均值为0.66％，详见表3。
C.浸出物检查：浸出物检查方法按照2020年版《中国药典》(四部)通则2201照水溶性浸出物下的热浸法测定，不得低于22.44％；每批样品平行测定3次，取平均值，本实施例中样品水溶性浸出物含量为22.55％～39.59％，平均值为28.05％，详见表3。
表3小秦艽花中水分、总灰分、酸不溶灰分和浸出物含量测定结果(n＝3，％)
D.重金属检查：重金属检查方法为按照2020年版《中国药典》(四部)通则2321第一法原子吸收分光光度法和第二法电感耦合等离子体质谱法测定重金属铅、镉、砷、汞、铜含量，铅不得过5mg/kg；镉不得过0.4mg/kg；砷不得过2mg/kg；汞不得过0.2mg/kg；铜不得过20mg/kg；
a.原子荧光分光光度计工作条件工作参数为：负高压：300V；总电流：30mA；载气流量：400mL/min；屏蔽气流量：1000mL/min；原子化气高度：10mm；读数时间：10S；延迟时间：1S。
b.ICP-MS工作条件用调谐液调整仪器灵敏度、氧化物、双电荷、分辨率等各项指标。优化后的ICP-MS工作参数为：射频功率：1300W；等离子体流速：15L/min；辅助气流速：0.70L/min；载气流速：0.86L/min；雾室温度：2℃；采样深度：10mm；采样锥孔径：1.0mm；截取锥孔径：0.45mm。
c.微波消解条件经优化调整的微波消解程序见表4。
表4微波消解程序
d.标准溶液的配制分别精密吸取铅、砷、镉、汞、铜单元素标准溶液，用10％硝酸溶液逐级稀释制成混合标准溶液。同时，加入金标准溶液(1μg/mL)，使金终浓度为4ng/mL。该标液临用时配制。
e.供试品溶液的制备取供试品，粉碎成粗粉，取约0.25g，精密称定，置微波消解罐中，加20mL纯化硝酸，电热板200℃，消煮1h，不够继续加酸。待样品完全溶解后，加入2mL过氧化氢预消解，置微波消解仪内消解，消解程序见表7。消解结束后，用水稀释定容至25mL，摇匀，即得。同法制备试剂空白溶液。过滤时得过滤到玻璃管中，先用原子荧光光度计测定汞，随后用ICP-MS测定其他元素。
f.内标溶液的制备取锗、铑混合标准溶液用水稀释，制成0.5μg/mL的混合内标溶液，即得。
g.测定法用调谐液调整仪器，各项指标达到测定要求后，引入在线内标、标准系列及供试品溶液。测定时选取的同位素为Cu、As以Ge作为内标，Pb以Rh作为内标，仪器的内标进样管在仪器分析过程中始终***内标溶液，依次将仪器的样品管***各个浓度的标准品溶液和样品溶液进行测定，测量值取3次读数的平均值，并扣除试剂空白。
h.线性关系考察取标准系列混合溶液，依法测定，以各元素与内标计数值的比值(Y)为纵坐标，各元素质量浓度(X)为横坐标，绘制标准曲线，结果见表8，各元素的线性关系良好。
表5线性关系考察结果
i.结果分析
按照2020年版《中国药典》(四部)通则2321，对哈日-沙布嘎、乌日格斯图-阿日查、紫花地丁、呼和-朱力根-其木格、巴勒古纳、麻黄、查黑勒达格因-乌热7味药材重金属含量测定结果如表6所示，暂定所有药材铅不得过5mg/kg；镉不得过0.4mg/kg；砷不得过2mg/kg；汞不得过0.2mg/kg；铜不得过20mg/kg。
表6小秦艽花中铅、砷、镉、汞、铜的含量(mg/kg，n＝3)。
(6)化学成分检测。
首先采用薄层色谱法定性鉴别龙胆苦苷、异荭草苷两种环烯醚萜类。
a.取步骤(1)所得样本的粉末，过30目(即550μm)筛，称量0.5g筛下粉末，加入20mL甲醇，超声提取(40W，30℃)60min，放冷至室温，过滤，作为供试品溶液。
b.取龙胆苦苷、异荭草苷对照品适量，精密称定，加入甲醇制成2个成分质量浓度分别为2.314、0.0945mg/mL的单一成分对照品贮备液。
c.按照2020年版《中国药典》(四部)TLC法(通则0502)实验操作要求，分别吸取各单一成分对照品贮备液5μL和供试品溶液10μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，在常温下饱和后展开，取出，晾干，置于紫外灯254nm波长下检视。其中，龙胆苦苷和异荭草苷的展开剂组成均为乙酸乙酯：甲醇：水按体积比10:2:1配置；供试品与各对照品在相应的位置上，显相同颜色的斑点，证明含有龙胆苦苷、异荭草苷两种环烯醚萜类，符合质量要求；见图5。
然后采用高效液相色谱法检测化学成分对进行龙胆苦苷、异荭草苷的定量分析，测定峰面积时的色谱条件为：检测波长为270nm，柱温为30℃，进样体积5μL，流动相：以乙腈(A)-0.1％甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～8min，15％→20％A；8～11min，20％→25％A)，流速为1mL/min。以浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算得龙胆苦苷、异荭草苷2种成分的线性回归方程、线性范围、相关系数；再测定小秦艽花的色谱峰面积，以回归方程计算出小秦艽花中龙胆苦苷、异荭草苷的含量；符合以上含量测定特征为符合质量要求。具体步骤如下。
A.溶液制备。
a.对照品溶液制备分别取龙胆苦苷、异荭草苷对照品各适量，精密称定，加入甲醇制成上述2个成分质量浓度分别为2.314、0.0945mg/mL的单一成分对照品贮备液。分别取龙胆苦苷对照品贮备液0.86mL，异荭草苷对照品贮备液各0.078mL，置于同一5mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，混匀，制备成混合对照品溶液。并逐步稀释成6个系列浓度混合对照品，备用。
b.供试品溶液制备取过30目(550μm)筛呼和-朱力根-其木格样品0.5g，精密称定，置于100mL锥形瓶中，加甲醇20mL，称质量，超声(功率300W，频率40kHz)处理1h，取出，放冷至室温，再次称质量，用甲醇补足减失的质量，先后以滤纸、0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。
c.阴性对照品溶液制备取甲醇20mL，置于100mL锥形瓶中，按供试品制备方法制备阴性对照溶液。
B.色谱条件采用ACEC18PFP(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱，流动相:以乙腈(A)－0.1％甲酸水溶液(B)为流动相，梯度洗脱(0～8min，15％→20％A；8～11min，20％→25％A)，流速为1mL/min，检测波长为270nm，柱温为30℃，进样体积5μL。
C.***适用性试验取混合对照品溶液、供试品溶液、阴性对照溶液各5μL，按上述色谱条件进样测定，记录色谱图见图6。结果表明，在该色谱条件下，理论塔板数按龙胆苦苷计算不低于8000，各峰与相邻峰的分离度均大于1.5，各成分测定不受其他组分的干扰。
D.线性关系考察取系列浓度的混合对照品溶液，依照上述色谱条件分别进样5μL，测定2种成分峰面积。浓度(X)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，绘制标准曲线，计算得2种成分的线性回归方程、线性范围、相关系数，结果见表7。
表7小秦艽花中2种成分线性关系考察结果
E.精密度试验精密吸取混合对照品溶液5μL，按上述色谱条件进样5μL进行测定，连续进样6次，测定2个成分的峰面积。结果龙胆苦苷、异荭草苷峰面积的RSD(n＝6)分别为0.359％、1.43％，表明仪器精密度良好。
F.重复性试验分别称取同一批样品(编号S1)6份，每份0.5g，精密称定，置100mL锥形瓶中，按上述供试品制备方法制备6份供试品溶液，按上述色谱条件进样5μL进行测定，记录5个待测成分的峰面积，计算平均含量及RSD。结果样品中龙胆苦苷、异荭草苷的平均含量分别为7.547、0.5035mg/g，RSD(n＝6)分别为1.86％、2.63％。表明本方法重复性良好。
G.稳定性试验取同一份供试品溶液(编号S2)，分别在0、2、4、8、12、24h按上述色谱条件进样5μL进行测定，记录2个待测成分的峰面积，计算龙胆苦苷、异荭草苷峰面积的RSD(n＝6)分别为0.976％、1.23％。表明供试品溶液室温下放置24h内稳定。
H.加样回收率试验称取已知含量的样品(编号S4)6份，精密称定，按上述供试品制备方法，精密加入混合对照品溶液适量，制备6份供试品溶液，再按上述供试品条件进样5μL进行测定，计算加样回收率和RSD，结果见表8，表明本方法准确度良好。
表8小秦艽花中2种成分加样回收率试验结果，n＝6
I.样品含量测定取各批次样品适量，按照供试品制备方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样5μL进行测定，每个样品平均测定3次，计算2个成分的平均含量，结果见表9。
表9小秦艽花样品含量测定结果(n＝3，mg/g)
通过采用本发明的小秦艽花蒙药材质量检测方法，填补了小秦艽花蒙药材质量检测方法的空白，对药材实现了全方面、***化进行质量控制，为小秦艽花的开发利用提供了可靠的科学依据。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种小秦艽花蒙药材的质量检测方法，包含取样、性状鉴别、显微鉴别、理化检测、一般项检查和化学成分检测，其特征在于，
所述的显微鉴别包含下列步骤：
A.粉末显微鉴别：将取样样本制成50-60目的粉末，将粉末置于载玻片上，滴加甘油醋酸试液或水合氯醛试液，盖上盖玻片，加热透化，在显微镜下观察样本性状；
B.花柄横切显微鉴别：将取样所得样本的花柄放入水中浸泡4~5天，使材料软化，切成2~3mm的花柄小段，浸泡于FAA固定液12h~24h，将花柄小段从固定液中取出，用自来水冲洗12-24h，然后进行脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、贴片、烤片处理，
脱水：从45-55%浓度的乙醇开始进行浸泡1-2h进行级次脱水，即，首次为从45-55%浓度的乙醇中进行浸泡1-2h，之后每次将乙醇的浓度提升8-10度，直至达到无水乙醇，每次时间为1-2h，
如不能及时进行各级脱水的，从固定液中取出的花柄小段放在70%乙醇中保存；
透明：先经1重量份二甲苯兑1.8-2.2重量份乙醇的混合液浸渍0.6-0.6h，再依次转入1重量份二甲苯兑1重量份乙醇的混合液1.8-2.2重量份二甲苯兑1重量份乙醇的混合液中浸渍0.4-0.6h，最后转入纯二甲苯中浸渍0.4-0.6h；
浸蜡：把花柄小段放入熔化的石蜡液中浸渍2-3次，每次0.51-1.5h，放置8-15h，浸蜡时温度控制在高于石蜡熔点2-5℃；
包埋、切片、贴片、烤片处理，得干燥的样本切片；
取已经干燥的切片，放于盛有二甲苯的染缸内脱蜡6-10min，脱完蜡后的切片可依次用纯乙醇1重量份与二甲苯0.8-1.2重量份的混合液，纯乙醇，浓度94-96%乙醇溶液、78-82%乙醇溶液、68-72%乙醇溶液分别洗4-6 min，之后进行番红染液染色3-5h，水洗2-4s，之后依次用30-40%乙醇、45-55%乙醇、65-75%乙醇、75-85%乙醇、90%以上乙醇洗1.5-3min，固绿染色4-6s，染色后的切片用纯乙醇洗2-3次，每次10-20s，再用纯乙醇1重量份与二甲苯0.8-1.2重量份比例的混合液洗4-6min，纯二甲苯洗8-12min，洗去多余染料；
在洁净盖玻片上滴加1-2mL中性树胶，再将洁净盖玻片倾斜放下，以免出现气泡，封片后即制成永久性玻片标本，在显微镜下观察，以确定小秦艽花蒙药材的真伪和品质；
所述一般项检查为：
A.水分检查：检测方法参考2020年版《中国药典》，水分检查方法按照2020年版《中国药典》第四部通则0832水分测定法第二法测定，不得超过9.08%；
B.灰分检查：总灰分和酸不溶灰分检查方法按照2020年版《中国药典》第四部通则2302测定，总灰分不得超过7.93%，酸不溶灰分含量不得超过0.79%；
C.浸出物检查：浸出物检查方法按照2020年版《中国药典》第四部通则2201照水溶性浸出物下的热浸法测定，不得低于22.44%；
D.重金属检查：重金属检查方法为按照2020年版《中国药典》第四部通则2321第一法原子吸收分光光度法和第二法电感耦合等离子体质谱法测定重金属铅、镉、砷、汞、铜含量，铅不得过5mg/kg；镉不得过0.4mg/kg；砷不得过2mg/kg；汞不得过0.2mg/kg；铜不得过20mg/kg。
2.根据权利要求1所述的小秦艽花蒙药材的质量检测方法，其特征在于：所述的化学成分检测为采用薄层色谱法定性鉴别龙胆苦苷、异荭草苷两种环烯醚萜类：
将所得样本制成30-40目的粉末，按比例取样，每0.4-0.6g样本粉末，加入15-30mL甲醇中，超声提取50-70min，冷却至常温，用小于350μmbntx孔径筛过滤或静置6h以上取上清液，作为供试品溶液；
取龙胆苦苷、异荭草苷作为对照品，精密称定，加入甲醇分别制成成分质量浓度分别为2.0-2.5mg/mL和0.09-0.1mg/mL的单一成分对照品贮备液，
按照2020年版《中国药典》第四部TLC法通则0502实验操作要求，分别吸取各单一成分对照品贮备液4-6μL和供试品溶液8-12μL，点于同一硅胶GF254薄层板上，在常温下饱和后展开，其中，龙胆苦苷的展开剂体积比乙酸乙酯：甲醇：水为8-12:1.5-2.5:1，异荭草苷的展开条件体积比乙酸乙酯：甲醇：水为8-12:1.5-2.5:1，取出，晾干，置于紫外灯254nm波长下检视，对供试品与各对照品在相应的位置上所显状态进行比对，确定小秦艽花蒙药材的真伪和品质。
3.根据权利要求1所述的小秦艽花蒙药材的质量检测方法，其特征在于：所述的化学成分检测为：采用高效液相色谱法检测化学成分对进行龙胆苦苷、异荭草苷的定量分析，测定峰面积时的色谱条件为：
检测波长为265-275nm，柱温为28-32℃，进样体积4-6μL，流动相：以乙腈作为A相，浓度0.05～0.15%的甲酸水溶液作为B相为流动相，梯度洗脱：流动相A相从15%→20%，0~8min，流动相A相从20%→25%，8~11min，流速为0.8~1mL/min；
以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，计算得龙胆苦苷、异荭草苷2种成分的线性回归方程、线性范围、相关系数；再测定小秦艽花的色谱峰面积，以回归方程计算出小秦艽花中龙胆苦苷、异荭草苷的含量；符合以上含量测定特征为符合质量要求。
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