CN115980249A - 一种虎耳草药材质量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种虎耳草药材质量检测方法，包括采用薄层色谱法鉴别虎耳草药材，包括以下步骤：A、取虎耳草药材，加30％乙醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加热水混悬，并用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，制得供试品溶液；B、取虎耳草对照药材，加30％乙醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加热水混悬，并用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，制得对照药材溶液；C、取供试品溶液和对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:1的甲苯‑乙酸乙酯‑甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，检视。本发明具有提取率高、鉴别准确的特点。

Description

一种虎耳草药材质量检测方法

技术领域

本发明涉及一种中药分析检测，特别是一种虎耳草药材质量检测方法。

背景技术

虎耳草为虎耳草科植物虎耳草的干燥全草。虎耳草属植物全世界约有370种，我国约有200种，全国各地广泛分布，但不同种类的分布具有明显的地域性特点，部分种类在植物分类上尚有争议。据文献记载该属植物约有36种(含种下等级)在不同地区、不同民族药用的种类、临床应用也有较大地差异。其中，以在低海拔地区分布广泛的虎耳草药用最为广泛，具有消炎、解毒的功效，用于急性中耳炎、风热咳嗽，外用于大泡性鼓膜炎、风疹瘙痒等。藏医药用的该属植物主要为分布于高海拔的种类，如小伞虎耳草(S.umbellulataHook.f.et Thoms.)、篦齿虎耳草(S.umbellullata Hook.f.et Thoms.var.pectinata(Marquand etAiry-Shaw)J.T.Pan)、唐古特虎耳草(S.tangutica Engl.)等，主要用于治疗肝胆类疾病。经研究，低海拔地区分布的虎耳草S.stolonifera等品种主要含有以岩白菜素为特征性成分的酚酸类成分，高海拔地区分布的种类大多不含有岩白菜素，而含有特征性的二苯庚烷类、三萜类等成分，这种成分的差异与其临床应用功效密切相关。

以“虎耳草”之名收载的原标准有《中华人民共和国药典》(1977年版)及各地方标准《上海市中药材标准》(1994年版)、湖北省中药材标准(2009年版)、《贵州中药材、民族药材质量标准》(2003年版)和《湖南省中药材标准》(2009年版)。各标准中规定有【性状】、【鉴别】(叶表面观，岩白菜素或槲皮素为对照的薄层鉴别)、【检查】(水分、总灰分、酸不溶性灰分)、【含测】(规定岩白菜素限量不得少于0.08％)等项。目前标准中只有对虎耳草的岩白菜素或者槲皮素为对照的薄层鉴别，并没有对虎耳草对照药材的薄层鉴别，使得虎耳草的真伪容易混淆，整体质量无法很好地进行控制。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种虎耳草药材质量检测方法。本发明具有提取率高、鉴别准确的特点。

本发明的技术方案：一种虎耳草药材的质量检测方法，包括采用薄层色谱法鉴别虎耳草药材，包括以下步骤：

A、取虎耳草药材，根据料液比为1:40～50加30％乙醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加热水混悬，并用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，制得供试品溶液；

B、取虎耳草对照药材，根据料液比为1:40～50加30％乙醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加热水混悬，并用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，制得对照药材溶液；

C、取供试品溶液和对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，包括以下步骤：

A、取虎耳草药材0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml热水混悬，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制得供试品溶液；

B、取虎耳草对照药材粉末0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml热水混悬，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制得对照药材溶液；

C、取供试品溶液和对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，步骤C中，供试品溶液的色谱中，在与对照药材溶液的色谱相应的位置上，两者显相同颜色的斑点。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，步骤C中，供试品溶液和对照药材溶液的取量均为10～15μl。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，步骤C中，紫外光灯的波长选择为254nm波长。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，所述检测方法还包括采用液相色谱法测定虎耳草药材中岩白菜素的含量，包括以下步骤：

(1)取岩白菜素对照品，加30％乙醇制成对照品溶液；

(2)取虎耳草药材，根据料液比为1:40～50加入30％乙醇，称定重量，超声处理75分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测得虎耳草药材中岩白菜素的含量。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，所述检测方法还包括采用液相色谱法测定虎耳草药材中岩白菜素的含量，包括以下步骤：

(1)取岩白菜素对照品，加30％乙醇制成每1ml含岩白菜素110μg的溶液，为对照品溶液；

(2)取虎耳草药材0.50g，加入30％乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理75分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)分别取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测虎耳草药材中岩白菜素的含量。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，所述液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为16:84的乙腈-0.4％甲酸溶液为流动相等度洗脱；柱温为25℃；检测波长为270nm；流速1.0ml·min^-1。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，步骤(2)中，超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

前述的一种虎耳草药材的质量检测方法中，步骤(3)中，对照品溶液与供试品溶液各取5μl注入液相色谱仪进行测定。

与现有技术相比，本发明提供了一种虎耳草药材的质量检测方法，该质量检测方法包括虎耳草药材的薄层鉴别方法和虎耳草药材中岩白菜素的含量测定方法。所述的虎耳草药材的薄层鉴别方法具有灵敏度高、专属性强以及分离效果好等特点，简便可行，重现性强，从而能够对药材的真伪进行准确的鉴别，有效地将虎耳草药材与其伪品、混淆品区分开来。所述的虎耳草药材中岩白菜素的含量测定方法能够准确、快速地测定出虎耳草药材中岩白菜素的含量，采用30％乙醇为提取溶剂，提取率高，为虎耳草药材提供有效的定性定量分析手段，从而有利于对虎耳草药材的质量进行控制。采用本发明提供的虎耳草药材的质量检测方法能有效的控制虎耳草药材的整体质量、保证虎耳草药材临床用药的安全有效性。

本发明提供的虎耳草药材的质量检测方法，有助于弥补《中华人民共和国药典》(1977年版)及各地方标准《上海市中药材标准》(1994年版)、湖北省中药材标准(2009年版)、《贵州中药材、民族药材质量标准》(2003年版)和《湖南省中药材标准》(2009年版)中质量检测方法的不足，实用性强。本发明方法对于虎耳草药材的进一步质量控制具有重要的意义，可为虎耳草药材质量表混的制定提供科学依据。

附图说明

图1是展开剂溶剂选择考察薄层色谱图；

图2是展开剂溶剂比例考察薄层色谱图；

图3是供试品溶液制备方法考察薄层色谱图；

图4是点样量考察薄层色谱图；

图5是不同波长紫外灯下检视薄层色谱图；

图6是虎耳草对照药材的薄层色谱图；

图7是岩白菜素紫外扫描图；

图8是流动相为甲醇-纯水(30:70)的液相色谱图；

图9是流动相为甲醇-0.4％甲酸水(25:75)的液相色谱图；

图10是流动相为乙腈-0.4％甲酸水(16:84)的液相色谱图；

图11是流动相为乙腈-0.4％甲酸水(12:88)的液相色谱图；

图12是流动相为乙腈-0.4％甲酸水(16:84)的液相色谱图；

图13是流动相为乙腈-0.4％甲酸水(20:80)的液相色谱图；

图14是不同流速的液相色谱图；

图15是不同浓度甲醇提取液色谱图；

图16是不同浓度乙醇提取液色谱图；

图17是水提取液色谱图；

图18是不同提取溶剂用量考察色谱图1；

图19是不同提取溶剂用量考察色谱图2；

图20是不同超声提取时间考察色谱图1；

图21是不同超声提取时间考察色谱图2；

图22是岩白菜素标准曲线图；

图23是精密度实验结果图；

图24是重复性试验色谱图；

图25是样品回收率实验色谱图1；

图26是样品回收率实验色谱图2；

图27是样品回收率实验色谱图3。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不作为对本发明限制的依据。

实施例：

仪器：

瑞士CAMAG薄层点样仪(Auto sampler 4)和成像仪(Visualize 4)；岛津LC-20AT型液相色谱仪；色谱柱：Waters sunfire(5μm，4.6mm×250mm)；AUW220D型电子天平：万分之一，美国奥豪斯公司；KQ250DB型数控超声波清洗器：巩义市予华仪器有限责任公司；KQ5200型水浴锅：昆山市超声仪器有限公司；DHG－9140A电热恒温鼓风干燥箱：巩义市予华仪器有限责任公司；三用紫外线分析仪：上海顾村电光仪器厂。

试剂与试药

1.对照品

岩白菜素和没食子酸购自中国食品药品检定研究院(岩白菜素批号：110709-200304，纯度94.4％；没食子酸批号：1102542-201452)。

2.试剂

薄层色谱用硅胶GF₂₅₄(默克化工技术有限公司，批号：HC30492153)；甲醇(分析纯，西陇科学股份有限公司，批号：161004)；甲苯(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20151102)；乙腈(色谱纯，美国，批号：810901/810905)；三氯甲烷(分析纯，国药集团化学试剂有限公司，批号：20141206)；乙酸乙酯(分析纯，西陇化工股份有限公司，批号：20140103)；无水乙醇(分析纯，天津市恒兴化学制剂制造有限公司，批号：20161125)；甲酸(分析纯，西陇化工股份有限公司，批号：20130143)；丙酮(分析纯，西陇科学股份有限公司，批号：20142520)；水为密理博纯水仪产超纯水；其余试剂均为分析纯。

药材

虎耳草药材共计38批次，包括由贵州百灵制药厂提供19批(1～19号)、采自贵州、江西、安徽、湖北、重庆、湖南、广西、浙江的19批自采样品，具体见表1所示。

表1虎耳草药材批次

关于薄层鉴别，对主要分布于低海拔地区的虎耳草Saxifraga stolonifera及分布于高海拔地区藏医药用的3种虎耳草属植物[篦齿虎耳草S.umbellulata Hook.f.erThoms.var.pectinata(Marquand et Airy-Shaw)J.T.Pan、小伞虎耳草S.umbellulataHook.f.er Thoms.、唐古特虎耳草S.tangutica Engl.]进行了成分比较研究，结果表明，4种虎耳草属植物在成分类型及其组成上有较大差异，黄酮类成分为4种虎耳草属植物共有成分，岩白菜素和没食子酸是虎耳草S.stolonifera与其他同属植物相比较具有代表性的成分，且岩白菜素为该种的特征性成分，故进行了以对照药材、岩白菜素和没食子酸为对照的薄层鉴别研究，建立了各薄层鉴别方法。

一种虎耳草药材质量检测方法，包括采用薄层色谱法鉴别虎耳草药材，包括以下步骤：

A、取虎耳草药材0.5g，加浓度为30％的乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml热水(70～80℃)混悬，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制得供试品溶液；

B、取虎耳草对照药材粉末0.5g，加浓度为30％的乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml热水混悬，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制得对照药材溶液；

C、照薄层色谱法(通则0502)，取供试品溶液和对照药材溶液各10～15μl，分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，以体积比为5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置254nm波长的紫外光灯下检视。

供试品溶液的色谱中，在与对照药材溶液的色谱相应的位置上，两者显相同颜色的斑点。

采用薄层鉴别岩白菜素和没食子酸，包括以下步骤：

(1)取岩白菜素和没食子酸对照品适量，加甲醇分别制成每1ml含岩白菜素110μg的对照品溶液以及每1ml含没食子酸10μg的对照品溶液；

(2)取虎耳草药材粉末0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，加入10ml热水混悬，用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，即得供试品溶液；

(3)照薄层色谱法(通则0502)试验，吸取供试品溶液和对照品溶液各5～10μl,分别点于同一硅胶GF₂₅₄薄层板上，置紫外光灯(254nm)下检视；或喷硫酸乙醇试液显色，在日光下检视。一、薄层鉴别方法选择：

1.1展开剂溶剂选择

分别选择氯仿-乙酸乙酯-甲酸(体积比为10:7:1)、氯仿-丙酮-甲酸(体积比为7:5:1)、甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5:5:1)、乙酸乙酯-甲醇-甲酸(体积比为40:1:0.05)为展开剂，点样量：5μl，展开，取出，晾干，置紫外光灯(254nm)下检视；或喷硫酸乙醇试液显色，在日光下检视，见过见图1。

结果表明以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5:5:1)为展开剂的展开效果为佳，以紫外光灯下检视为好。因此选择甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比为5:5:1)为展开剂，在紫外光灯下检视。

1.2展开剂溶剂***中溶剂比例选择

在确定为甲苯-乙酸乙酯-甲酸展开剂***后，进一步对溶剂之间的比例进行了优化。分别选择体积比为5:9:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸以及体积比为5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂，进行测定，测定结果如图2所示。结果表明以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(5:5:1)展开效果为好。因此选择5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸作为展开剂。

1.3供试品溶液制备方法选择

供试品溶液制备方法1：取虎耳草药材粉末0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，加甲醇1ml溶解，即得。

供试品溶液制备方法2：取虎耳草药材粉末0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30min，滤过，滤液旋干，加入10ml热水混悬，分别用10ml乙酸乙酯萃取3次，分离乙酸乙酯萃取液，合并滤液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，即得。

分别吸取上述供试品溶液及对照品溶液5μl，点样，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(体积比5:5:1)展开，置紫外光灯(254nm)下检视。

检视结果见图3，结果显示供试品溶液制备方法2的样品斑点更为清晰，因此选择制备方法2作为供试品溶液的制备方法。

1.4点样量考察

取虎耳草药材粉末，按供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按上述薄层色谱条件，分别点样15μl、10μl、5μl展开，每个点样量重复3次，展开结果见图4。结果显示点样量10～15μl较为适宜。

1.5检视波长选择

取虎耳草商品药材(1～19号样品)粉末制备供试品溶液，点样，展开，分别置于254nm和366nm紫外光灯下检视。检视结果见图5。结果表明，在254nm紫外灯下检视斑点清晰。

1.6对照药材的薄层鉴别

分别取虎耳草对照药材(表1：第20号，HRC-201607-7，采自贵州铜仁市梵净山，经江西中医药大学钟国跃研究员鉴定为虎耳草Saxifraga stolonifera Meerb.，样品及蜡叶标本存江西中医药大学中药资源与民族药研究中心)、虎耳草商品药材(1～6号)、自采对口药材(21～28号)及藏医药用的产自高原的3种虎耳草属植物样品，制备供试品溶液，分别吸取各供试品溶液、对照品溶液，点样，展开。测试结果见图6。

结果表明，虎耳草商品药材、对口药材的薄层色谱与对照药材和对照品薄层色谱一致；产自高原的3种虎耳草属植物的薄层色谱与对照药材和对照品薄层色谱明显不同。因此，本薄层鉴别方法可行。

虎耳草资源丰富，分布广泛，据调查市售虎耳草药材中也未见混入高原产虎耳草的情况，规定岩白菜素和没食子酸对照的薄层鉴别意义不大；岩白菜素作为虎耳草中的活性成分之一，且含量较高，适宜作为含测指标成分；虎耳草对照药材的薄层鉴别在虎耳草的真伪鉴别中更有意义；黄酮类为虎耳草属植物的共有成分，原贵州标准中槲皮素为对照的薄层鉴别的特征性不强。故最终确定标准中仅增加对照药材的薄层鉴别，取消原标准中岩白菜素、槲皮素为对照的薄层鉴别。

原贵州和湖北省标中规定有岩白菜素的限量，为不得少于0.08％。发明人对虎耳草Saxifraga stolonifera及其同属3种虎耳草的成分比较研究表明，岩白菜素为与其他3种相比的特征性成分；同时已有大量研究报道，岩白菜素具有镇咳、抗炎作用，与虎耳草功能主治一致，因此以岩白菜素作为含测项指标成分是合理的。实验中，对岩白菜素含量的HPLC测定方法进行了考察，优化了原测定方法；对19批虎耳草药材的岩白菜素含量进行了测定，根据测定结果，将岩白菜素含量限量修订为不得少于0.3％。该限量明显高于原标准的限量(0.08％)，系因为原标准中供试品溶液制备使用甲醇为溶剂，其提取率较低，本方案中修订为使用30％乙醇为溶剂，提取效率明显更高。

一种虎耳草药材质量检测方法，还包括采用液相色谱法测定虎耳草药材中岩白菜素的含量，照高效液相色谱法(《中国药典》2020版第四部通则0512)测定，包括以下步骤：

(1)取岩白菜素对照品，精密称定，加30％乙醇制成每1ml含岩白菜素110μg的溶液，为对照品溶液；

(2)取虎耳草药材粉末(过四号筛)0.50g，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇20ml，密塞，称定重量，以功率为250W，频率为40kHz的超声处理75分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)分别取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测虎耳草药材中岩白菜素的含量。

液相色谱处理时，以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为16:84的乙腈-0.4％甲酸溶液为流动相等度洗脱；柱温为25℃；检测波长为270nm；流速1.0ml·min^-1。理论板数按岩白菜素峰计算应不低于3000。

根据标准本品含按干燥品计算，含岩白菜素(C₁₄H₁₆O₉)不得少于0.30％。

二、岩白菜素的含量测定方法选择：

2.1检测波长的选择

岩白菜素紫外吸收特征如图7所述。综合现有资料，最终确定检测波长为270nm。

2.2流动相***中流动相溶剂选择

以甲醇或者乙腈为有机相，纯水或0.4％甲酸为水相，测试在不同色谱条件下虎耳草药材样品的岩白菜素峰形，虎耳草药材样品色谱图测试结果见图8～图10。结果显示乙腈和甲酸水溶液作为有机相，样品色谱图基线漂移小，岩白菜素色谱峰峰形更好，据此选择乙腈和甲酸水溶液作为流动相溶剂。

2.3流动相溶剂比例选择

分别以乙腈-0.4％甲酸水不同比例为流动相试验，比较色谱图中的岩白菜素峰形，试验结果见图11～图13。结果表明以乙腈-0.4％甲酸水(16:84)的样品色谱图基线漂移小，岩白菜素色谱峰峰形更好，故确定流动相溶剂比例为乙腈-0.4％甲酸水(16:84)。

2.4流速选择

以乙腈-0.4％甲酸水(16:84)为流动相，以不同流速试验，比较不同流速下的岩白菜素峰形图，试验结果见图14。结果表明流速为1.0ml·min^-1时，样品色谱图基线漂移小，岩白菜素色谱峰峰形更好，出峰时间短，故选择流速为1.0ml·min^-1。

2.5供试品溶液制备方法选择

分别考察不同提取溶剂(不同浓度甲醇、乙醇)、溶剂用量、提取时间。

2.5.1提取溶剂考察

取同一批次虎耳草药材粉末9份，每份0.5g，精密称定，分别精密加入25ml不同浓度乙醇、甲醇和水，密塞，称定重量，超声提取1小时，放冷，再称定重量，用对应浓度乙醇、甲醇和水补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取上述9种供试液各5μl，注入液相色谱仪，测定，测定结果见表2、图15～17。计算比峰面积的大小(峰面积与进样量的比值作为实验考察指标，比值越大说明该成分提取越完全)。

结果表明相同条件下，以100％甲醇作为提取溶剂的岩白菜素提取率最低；纯水、30％乙醇和30％甲醇对药材中岩白菜素的提取率相当，且相比其他极性溶剂，提取率更高，说明大极性溶剂对药材中岩白菜素的提取更为完全。但考虑到纯水提取溶液的大极性杂质更多，且不易过滤，30％甲醇提取溶液在实验过程中也发现过滤困难，故最终选择以30％乙醇作为供试品溶液制备的提取溶剂。

表2不同提取溶剂的提取结果

2.5.2提取溶剂用量考察

取同一批次虎耳草药材粉末7份，每份0.5g，置具塞锥形瓶中，每份分别精密加入30％乙醇5ml、10ml、15ml、20ml、25ml、30ml、40ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)30分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液过0.45μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取上述供试液各5μl，注入液相色谱仪，测定。计算比峰面积的大小(峰面积与进样量的比值作为实验考察指标，比值越大说明该成分提取越完全)。测定结果见表3，图18、19。从中可以看出，当料液比为1:40时，提取率最高，因此选择料液比为1:40，即当虎耳草取0.50g时，乙醇加入量为20ml。

表3提取溶剂用量考察

2.6.3超声时间考察

取同一批次虎耳草药材粉末7份，每份0.5g，置具塞锥形瓶中，精密加入20ml 30％乙醇，密塞，称定重量，分别超声处理(功率250W，频率40kHz)15分钟、30分钟、45分钟、60分钟、75分钟、90分钟、105分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。分别精密吸取上述供试液各5μl，注入液相色谱仪，测定。计算比峰面积的大小(峰面积与取样量的比值作为实验考察指标，比值越大说明该成分提取越完全)。测定结果见表4，图20、21。

结果显示超声提取75分钟后岩白菜素成分含量不再显著增加，趋于稳定。故选择超声提取时间为75分钟。

表4不同超声提取时间考察结果

根据上述试验结果，最终确定供试品溶液的制备方法为：取本品粉末(过四号筛)0.50g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入30％乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理(功率250W，频率40kHz)75分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

三、方法学验证

3.1标准曲线制备

取岩白菜素10mg，精密称定，置于10ml容量瓶中，用30％乙醇定容至刻度，得岩白菜素对照品溶液。在上述色谱条件下，分别进样2、4、6、8、10、12μl(n＝3)，测定岩白菜素峰面积，结果见表5。以峰面积积分值为纵坐标，对照品的量(μg)为横坐标，绘制标准曲线(见图22)，并计算得岩白菜素线性回归方程为y＝1218741.65x-7055.93(r＝1)，在0.2077μg-1.2461μg范围内，线性关系良好。

表5标准曲线的制备

3.2精密度试验

取同一岩白菜素对照品溶液，注入液相色谱仪，重复进样5次，每次进样5μl，测定，结果见表6、图23。结果表明RSD值小于3％，仪器精密度良好。

表6精密度试验结果

3.3重复性试验

取虎耳草粉末6份，每份0.5g，精密称定，照供试品溶液的制备方法制备，分别注入液相色谱仪，进样量5μl，测定岩白菜素峰面积，代入标准曲线方程，计算岩白菜素含量。结果见表7、图24。结果显示样品平均含量为0.34％，RSD值为0.8％，表明方法重现性良好。

表7重复性试验结果

3.4稳定性试验

取同一供试品溶液，每隔2小时进样1次，测定。结果见表8。

结果显示在24h内检测样品稳定，稳定性良好。

表8稳定性考察

3.5加样回收率试验

取同一批次已知岩白菜素含量的虎耳草粉末6份，分别为1-6号样品，每份约0.25g，按与药材中岩白菜素含量比为1:1的比例，加入岩白菜素对照品，按照供试品溶液制备方法制备供试品溶液。分别进样，测定，按下式计算回收率：

结果显示平均加样回收率为97.42，RSD值为1.65％，表明方法准确度良好。每个样品分别重复进样3次，取平均值，结果见表9、图25～27。

表9加样回收试验结果表(n＝3)

3.6样品含量测定及含量限定：

分别取38批虎耳草样品(商品药材与对口药材各19批)，制备供试品溶液，在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μl，注入液相色谱仪，测定。结果见表10。

表10 38批虎耳草样品岩白菜素含量测定结果

结果表明，38批虎耳草样品中岩白菜素含量在0.15％～0.65％之间，平均含量为0.43％。取均值下浮20％值为0.34％，38批样品中有10批不合格(合格率71％)。据此确定岩白菜素含量不得低于0.30％(38批样品合格率为86％)。

Claims (10)

1.一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：包括采用薄层色谱法鉴别虎耳草药材，包括以下步骤：

A、取虎耳草药材，根据料液比为1:40～50加30％乙醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加热水混悬，并用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，制得供试品溶液；

B、取虎耳草对照药材，根据料液比为1:40～50加30％乙醇，超声处理，滤过，滤液蒸干，残渣加热水混悬，并用乙酸乙酯萃取多次，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，制得对照药材溶液；

C、取供试品溶液和对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，检视。

2.根据权利要求1所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：包括以下步骤：

A、取虎耳草药材0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml热水混悬，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制得供试品溶液；

B、取虎耳草对照药材粉末0.5g，加30％乙醇20ml，超声处理30分钟，滤过，滤液蒸干，残渣加10ml热水混悬，并用乙酸乙酯萃取3次，每次10ml，合并乙酸乙酯萃取液，蒸干，残渣加1ml甲醇溶解，制得对照药材溶液；

C、取供试品溶液和对照药材溶液，分别点于同一硅胶薄层板上，以体积比为5:5:1的甲苯-乙酸乙酯-甲酸为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。

3.根据权利要求1或2所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：步骤C中，供试品溶液的色谱中，在与对照药材溶液的色谱相应的位置上，两者显相同颜色的斑点。

4.根据权利要求1或2所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：步骤C中，供试品溶液和对照药材溶液的取量均为10～15μl。

5.根据权利要求1或2所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：步骤C中，紫外光灯的波长选择为254nm波长。

6.根据权利要求1所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括采用液相色谱法测定虎耳草药材中岩白菜素的含量，包括以下步骤：

(1)取岩白菜素对照品，加30％乙醇制成对照品溶液；

(2)取虎耳草药材，根据料液比为1:40～50加入30％乙醇，称定重量，超声处理，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)分别吸取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测得虎耳草药材中岩白菜素的含量。

7.根据权利要求6所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：所述检测方法还包括采用液相色谱法测定虎耳草药材中岩白菜素的含量，包括以下步骤：

(1)取岩白菜素对照品，加30％乙醇制成每1ml含岩白菜素110μg的溶液，为对照品溶液；

(2)取虎耳草药材0.50g，加入30％乙醇20ml，密塞，称定重量，超声处理75分钟，放冷，再称定重量，用30％乙醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液用0.45μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液；

(3)分别取对照品溶液与供试品溶液，注入液相色谱仪，测虎耳草药材中岩白菜素的含量。

8.根据权利要求6或7所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：所述液相色谱法的色谱条件为：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以体积比为16:84的乙腈-0.4％甲酸溶液为流动相等度洗脱；柱温为25℃；检测波长为270nm；流速1.0ml·min^-1。

9.根据权利要求6或7所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：步骤(2)中，超声处理的功率为250W，频率为40kHz。

10.根据权利要求6或7所述的一种虎耳草药材质量检测方法，其特征在于：步骤(3)中，对照品溶液与供试品溶液各取5μl注入液相色谱仪进行测定。

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