CN115032308B - 一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的特征图谱构建方法和鉴别方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开了一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的特征图谱构建方法。本申请还提供通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的鉴别方法。本申请提供的构建方法，能反映通草药材的质量，还能反映通草饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量，能同时用于通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量检测。
Description
技术领域
本申请涉及中药技术领域，特别是涉及一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的特征图谱构建方法和鉴别方法。
背景技术
通草最早记载于《神农本草经》，列为中品。《中国药典》2020年版一部记载，通草为五加科植物通脱木Tetrapanax papyrifer(Hook)K.Koch的干燥茎髓，具有清热利尿、通气下乳的功效，用于湿热淋证、水肿尿少、乳汁不下等症。
小通草也收载于《中国药典》中，是指旌节花科植物喜马山旌节花StachyurushimalaicusHook.f.etThoms、中国旌节花StachyuruschinensisFranch.或山茱萸科植物青荚叶Helwingiajaponica(Thunb.)Dietr.的干燥茎髓。
通草的产量小，所以市场上常用产量较大的小通草当作通草使用，另外还有用与通草形态相似的合萌、刺通草等伪品或掺杂其他物质混用。现代研究对通草的质量标准研究较少，亟须建立健全其质量标准。
目前已有对通草提取工艺及薄层鉴别进行的研究，也有对通草及其伪品的性状、显微鉴别等不同点进行分析，对其鉴别点进行阐述。但薄层鉴别、显微鉴别的方法只能用于药材、饮片的鉴别，对于现代设备生产的冻干粉、中药配方颗粒等已失去固有形态的物质，上述方法不能直接辨别其真伪与质量。
因此，如何提供一种通草特征图谱及其检测方法，不仅能够检测通草药材，还适用于通草中药饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的检测，对通草现代制剂的质量检测至关重要。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的第一个目的为提供一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的特征图谱构建方法；本发明的第二个目的为提供一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的鉴别方法。本申请提供的构建方法，不仅能够反映通草药材的质量，而且还能反映通草饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量，能同时用于通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量检测。
本发明提供的技术方案如下：
一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的特征图谱构建方法，包括以下步骤：
制备对照药材参照物溶液：使用通草对照药材制备参照物溶液；
制备药材供试品溶液：使用通草药材制备通草药材供试品溶液；
制备饮片供试品溶液：使用通草饮片制备通草饮片供试品溶液；
制备标准汤剂供试品溶液：使用通草标准汤剂制备通草标准汤剂供试品溶液；
制备干膏粉供试品溶液：使用通草干膏粉制备通草干膏粉供试品溶液；
制备中药配方颗粒供试品溶液：使用通草中药配方颗粒制备通草中药配方颗粒供试品溶液；
采用高效液相色谱法对对照药材参照物溶液和各供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，将所述对照图谱和所述检测图谱进行相似度分析，制定特征图谱；
其中，所述高效液相色谱法中流动相条件为：流动相A为体积分数为0.01-0.05％的乙酸水溶液，流动相B为乙腈；所述高效液相色谱的条件包括：采用梯度洗脱；
梯度洗脱：0～5min，保持流动相A体积分数为98％，流动相B体积分数为2％；
5～30min，流动相A体积分数98％降至40％，流动相B体积分数为2％升至60％；
30～35min，保持流动相A体积分数为40％，流动相B体积分数为60％；
35～35.1min，流动相A体积分数40％升至98％，流动相B体积分数为60％降至2％；
35.1～45min，保持流动相A体积分数为98％，流动相B体积分数为2％。
优选地，所述高效液相色谱的条件还包括：
固定相：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；色谱柱的规格为：柱长250mm，内径4.6mm，粒径5-6μm。
优选地，所述特征图谱包含4个峰，以峰2为参照峰，计算峰1、峰3、峰4的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％之内；
峰1的相对保留时间规定值为0.92；峰3的相对保留时间规定值为1.16；峰4的相对保留时间规定值为1.20。
优选地，通草对照药材参照物溶液制备方法如下：通草对照药材先加水加热提取，滤过，收集滤液，蒸干，然后在以下方法中任选一项继续处理：
加水超声处理30min，水的用量为每克药材60-70mL水；或，
加水，在60-100℃水浴回流2h，水的用量为每克药材60-70mL水；或，
加乙醇超声处理30min，乙醇的用量为每克药材60-70mL乙醇；或，
加乙醇，在60-100℃水浴回流2h，乙醇的用量为每克药材60-70mL乙醇；或，
加盐酸超声处理30min；盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10molHCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加盐酸，在60-100℃水浴回流2h，盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加乙醇和盐酸，超声处理30min；其中，乙醇的用量为每克药材加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L；或，
加乙醇和盐酸，在60-100℃水浴回流2h；其中，乙醇的用量为每克药材加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L。
优选地，通草药材供试品溶液制备方法如下：通草药材先加水加热提取，滤过，收集滤液，蒸干，然后在以下方法中任选一项继续处理：
加水超声处理30min，水的用量为每克药材60-70mL水；或，
加水，在60-100℃水浴回流2h，水的用量为每克药材60-70mL水；或，
加乙醇超声处理30min，乙醇的用量为每克药材60-70mL乙醇；或，
加乙醇，在60-100℃水浴回流2h，乙醇的用量为每克药材60-70mL乙醇；或，
加盐酸超声处理30min；盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10molHCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加盐酸，在60-100℃水浴回流2h，盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加乙醇和盐酸，超声处理30min；其中，乙醇的用量为每克药材加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L；或，
加乙醇和盐酸，在60-100℃水浴回流2h；其中，乙醇的用量为每克药材加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克药材加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L。
优选地，通草饮片供试品溶液制备方法如下：通草饮片先加水加热提取，滤过，收集滤液，蒸干，然后在以下方法中任选一项继续处理：
加水超声处理30min，水的用量为每克饮片60-70mL水；或，
加水，在60-100℃水浴回流2h，水的用量为每克饮片60-70mL水；或，
加乙醇超声处理30min，乙醇的用量为每克饮片60-70mL乙醇；或，
加乙醇，在60-100℃水浴回流2h，乙醇的用量为每克饮片60-70mL乙醇；或，
加盐酸超声处理30min；盐酸溶液中HCl的用量为每克饮片加入0.08-0.10molHCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加盐酸，在60-100℃水浴回流2h，盐酸溶液中HCl的用量为每克饮片加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加乙醇和盐酸，超声处理30min；其中，乙醇的用量为每克饮片加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克饮片加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L；或，
加乙醇和盐酸，在60-100℃水浴回流2h；其中，乙醇的用量为每克饮片加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克饮片加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L。
优选地，通草标准汤剂供试品溶液制备方法如下：通草标准汤剂先研细，得到通草标准汤剂粉，然后在以下方法中任选一项继续处理：
加水超声处理30min，水的用量为每克标准汤剂600-650mL水；或，
加水，在60-100℃水浴回流2h，水的用量为每克标准汤剂600-650mL水；或，
加乙醇超声处理30min，乙醇的用量为每克标准汤剂600-650mL乙醇；或，
加乙醇，在60-100℃水浴回流2h，乙醇的用量为每克标准汤剂600-650mL乙醇；或，
加盐酸超声处理30min；盐酸溶液中HCl的用量为每克标准汤剂加入0.8-1.0molHCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加盐酸，在60-100℃水浴回流2h，盐酸溶液中HCl的用量为每克标准汤剂加入0.8-1.0mol HCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加乙醇和盐酸，超声处理30min；其中，乙醇的用量为每克标准汤剂加入400-450mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克标准汤剂加入0.8-1.0mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L；或，
加乙醇和盐酸，在60-100℃水浴回流2h；其中，乙醇的用量为每克标准汤剂加入400-450mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克标准汤剂加入0.8-1.0mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L。
优选地，通草中药配方颗粒供试品溶液制备方法如下：通草中药配方颗粒先研细，然后在以下方法中任选一项继续处理：
加水超声处理30min，水的用量为每克中药配方颗粒60-70mL水；或，
加水，在60-100℃水浴回流2h，水的用量为每克中药配方颗粒60-70mL水；或，
加乙醇超声处理30min，乙醇的用量为每克中药配方颗粒60-70mL乙醇；或，
加乙醇，在60-100℃水浴回流2h，乙醇的用量为每克中药配方颗粒60-70mL乙醇；或，
加盐酸超声处理30min；盐酸溶液中HCl的用量为每克中药配方颗粒加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加盐酸，在60-100℃水浴回流2h，盐酸溶液中HCl的用量为每克中药配方颗粒加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；或，
加乙醇和盐酸，超声处理30min；其中，乙醇的用量为每克中药配方颗粒加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克中药配方颗粒加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L；或，
加乙醇和盐酸，在60-100℃水浴回流2h；其中，乙醇的用量为每克中药配方颗粒加入40-50mL乙醇，盐酸溶液中HCl的用量为每克中药配方颗粒加入0.08-0.10mol HCl，且盐酸溶液的浓度为3-4mol/L。
一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的鉴别方法，包括以下步骤：
取待鉴定的通草药材或饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒，并制备样品溶液；
采用高效液相色谱法对样品溶液进行检测，得到待鉴定的特征色谱；
将待鉴定的特征色谱与上述任一项所述的构建方法构建的特征图谱进行比对，若待鉴定的特征色谱与构建的特征图谱一致，则鉴别为质量合格。
本发明选择同时适用于通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的超高效液相色谱条件，以通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒为供试品进行检测，从而构建特征图谱，该特征图谱包含4个特征峰，不仅能够反映通草药材的质量，而且还能通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量，能同时用于通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量检测，为通草及其现代制剂的质量检测提供了有效的方法，也为通草及其现代制剂的质量综合评价的研究提供科学的实验依据。
采用该特征图谱对通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒进行检测，简单高效，结果客观，精密可靠，专属性强，灵敏度高，稳定性和耐受性好。
本发明弥补了通草药材及现代制剂质量检测的空白，从内在质量上实现了通草从药材到饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量把控及专属性鉴别，既能解决因原材料外观的缺失而造成通草标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒鉴别困难的问题，也能从源头至终端产品上削减混伪品给中药市场带来的不良影响，从而确保通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量，有利于保障临床用药的有效性。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请中记载的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中色谱条件1下通草饮片、标准标汤、中药配方颗粒特征图谱对比图；S1：通草标准汤剂供试品溶液；S2：通草中药配方颗粒供试品溶液；S3：通草饮片供试品溶液；
图2为本发明实施例1中色谱条件2下通草饮片、标准标汤、中药配方颗粒特征图谱对比图；S1：通草标准汤剂供试品溶液；S2：通草中药配方颗粒供试品溶液；S3：通草饮片供试品溶液；
图3为本发明实施例1中色谱条件3下通草饮片、标准标汤、中药配方颗粒特征图谱对比图；S1：通草标准汤剂供试品溶液；S2：通草中药配方颗粒供试品溶液；S3：通草饮片供试品溶液；
图4为本发明实施例2中12种提取方式下通草干膏粉特征图谱对比图；S1：提取方式1；S2：提取方式2；S3：提取方式3；S4：提取方式4；S5：提取方式5；S6：提取方式6；S7：提取方式7；S8：提取方式8；S9：提取方式9；S10：提取方式10；S11：提取方式11；S12：提取方式12；
图5为本发明实施例3中1批通草对照药材叠加特征图谱；R：通草对照图谱；S2：通草对照药材；
图6为本发明实施例3中2批通草中药饮片叠加特征图谱；S1：通草对照图谱；S2：210904批饮片；S3：210910批饮片；
图7为本发明实施例3中15批通草中药饮片标准汤剂叠加特征图谱；R：通草对照图谱；S2：210904批通草标汤；S3：210905批通草标汤；S4：210906批通草标汤；S5：210907批通草标汤；S6：210908批通草标汤；S7：210909批通草标汤；S8：210910批通草标汤；S9：210911批通草标汤；S10：210912批通草标汤；S11：210913批通草标汤；S12：210914批通草标汤；S13：210915批通草标汤；S14：P210901批通草标汤；S15：P210902批通草标汤；S16：P210903批通草标汤；
图8为本发明实施例3中3批通草干膏粉叠加特征图谱；R：通草对照图谱；S2：090211101批通草干膏粉；S3：090211102批通草干膏粉；S4：090211103批通草干膏粉；
图9为本发明实施例3中3批通草中药配方颗粒叠加特征图谱；R：通草对照图谱；S2：090211101批通草中药配方颗粒；S3：090211102批通草中药配方颗粒；S4：090211103批通草中药配方粒；
图10为通草对照特征图谱；
图11为中间精密度实验特征图谱；S1：211101批通草中药配方颗粒；S2：210910批通草饮片；S3：对照药材；R：通草对照图谱；
图12为重复性实验特征图谱；S1：211101批中药配方颗粒重复性溶液1；S2：211101批中药配方颗粒重复性溶液2；S3：211101批中药配方颗粒重复性溶液3；S4：211101批中药配方颗粒重复性溶液4；S5：211101批中药配方颗粒重复性溶液5；S6：211101批中药配方颗粒重复性溶液6；R：通草对照图谱；
图13为溶液稳定性实验和进样精密度实验特征图谱；S1：211101批中药配方颗粒(0-4h)1；S2：211101批中药配方颗粒(0-4h)2；S3：211101批中药配方颗粒(0-4h)3；S4：211101批中药配方颗粒(0-4h)4；S5：211101批中药配方颗粒(0-4h)5；S6：211101批中药配方颗粒(0-4h)6；S7：211101批中药配方颗粒(9h)；S8：211101批中药配方颗粒(14h)；S9：211101批中药配方颗粒(20h)；S10：211101批中药配方颗粒(24h)；R：通草对照图谱；
图14为稳定性实验特征图谱；S1：211101批长期3月；S2：211102批长期3月；S3：211103批长期3月；S4：211101批加速3月；S5：211102批加速3月；S6：211103批加速3月；R：通草对照图谱。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
实施例所涉及的仪器、试剂、试药如下：
1、仪器
见表1
表1
| 仪器名称 | 厂家 | 型号 |
| 液相色谱仪 | Waters | ACQUITY ARC-2489UV |
| 液相色谱仪 | 岛津 | Nexera XR LC-20AD |
| 电子天平 | 赛多利斯 | SECURA225D-1CN |
| 电子天平 | 上海天美天平仪器有限公司 | FA2204C |
| 数控超声波清洗器 | 昆山市超声仪器有限公司 | KQ-500DE |
| 电热恒温水浴锅 | 上海一恒科学仪器有限公司 | HWS-28型 |
| 药品稳定性试验箱 | 北京兰贝石恒温技术有限公司 | 1000LGS |
2、试剂
见表2
表2
| 名称 | 来源 | 级别 |
| 乙腈 | Sigma | HPLC |
| 水 | HHitech纯水机自制 | 超纯水 |
| 乙醇 | 西陇科学 | HPLC |
| 盐酸 | 湖南汇虹试剂有限公司 | AR |
| 冰乙酸 | 阿拉丁 | HPLC |
| 乙酸铵 | 广东光华科技股份有限公司 | AR |
| 磷酸二氢钾 | 阿拉丁 | AR |
| 磷酸氢二钾 | 阿拉丁 | AR |
| 磷酸 | 阿拉丁 | HPLC |
| 甲醇 | Sigma | HPLC |
3、试药
见表3
表3
实施例1色谱条件的确定
本次实验考察不同色谱条件对通草特征图谱的影响，选取以下三种色谱条件。对不同色谱条件的样品溶液特征图谱进行测定，确定最佳色谱条件。
1.1色谱条件
色谱条件1：
色谱柱：十八烷基键合硅胶柱C18，4.6mm*250mm*5mm
检测波长：220nm
柱温：35℃
进样体积：20mL
流动相A：体积分数0.01％乙酸水溶液
流动相B：乙腈
流速：1.0mL/min
洗脱梯度：见表4
表4色谱条件1梯度洗脱表
| 时间/min | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 95 | 5 |
| 30 | 30 | 70 |
| 50 | 30 | 70 |
| 51 | 95 | 5 |
| 60 | 95 | 5 |
色谱条件2
色谱柱：CERI L-column 2ODS，250*4.6mm*5mm
检测波长：220nm
柱温：35℃
进样体积：50μl
流动相A：体积分数0.01％乙酸水溶液
流动相B：乙腈
流速：1.0mL/min
洗脱梯度：见表5
表5色谱条件2梯度洗脱表
| 时间/min | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0 | 95 | 5 |
| 5 | 95 | 5 |
| 50 | 0 | 100 |
| 60 | 0 | 100 |
| 61 | 95 | 5 |
| 70 | 95 | 5 |
色谱条件3
色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18，250*4.6mm*5mm
检测波长：220nm
柱温：35℃
进样体积：20μL
流动相A：体积分数0.01％乙酸水溶液
流动相B：乙腈
流速：1.0mL/min
洗脱梯度：见表6
表6色谱条件3梯度洗脱表
| 时间/min | 流动相A％ | 流动相B％ |
| 0 | 98 | 2 |
| 5 | 98 | 2 |
| 30 | 40 | 60 |
| 35 | 40 | 60 |
| 35.1 | 98 | 2 |
| 45 | 98 | 2 |
1.2供试品溶液制备
通草饮片供试品溶液：取通草饮片1.0g，置烧瓶中，加水150ml，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40ml和4mol/L的盐酸溶液20ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
通草标准汤剂供试品溶液：取通草标准汤剂供试品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40ml和4mol/L的盐酸溶液20ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
通草中药配方颗粒供试品溶液：取通草中药配方颗粒供试品适量，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40ml和4mol/L的盐酸溶液20ml，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
通过比较以上3种色谱条件的特征图谱(图1至图3)，发现通过优化流动相洗脱梯度，色谱条件3将洗脱时间从70分钟缩减至45分钟，基线平稳，并且在分离时各峰的峰型好，各峰之间的分离度良好，拖尾因子、理论塔板数均符合分析要求，分析总时间短，相对保留时间稳定,重现性好。流动相配制方面，使用乙酸水溶液-乙腈体系进行洗脱，无需使用缓冲盐，配制方式简单且方便色谱***维护。进样量设置为20微升，在不影响特征峰检出的情况下使得峰形更好。
综上所述，通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒特征图谱的最佳色谱条件与***适应性试验确定为：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂(柱长为250mm，内径为4.6mm，粒径为5μm)；以体积分数0.01％乙酸水溶液为流动相A，以乙腈为流动相B；按表7中的梯度进行洗脱；检测波长为220nm，流速1.0mL/min，柱温35℃。
表7色谱条件梯度洗脱表。
实施例2对照品和供试品溶液制备工艺考察
本次实验考察不同提取方式对通草药材特征图谱的影响，选取以下12种提取方式。对不同提取方式的样品溶液特征图谱进行测定(使用实施例1确定的最佳色谱条件)，确定最佳提取方式。
供试品的制备：
提取方式1：干膏粉水超声：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加水60mL，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式2：干膏粉盐酸超声：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加0.1mol/L盐酸60mL，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式3：干膏粉乙醇超声：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加乙醇60mL，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式4：干膏粉乙醇+盐酸超声：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加乙醇40mL，4mol/L盐酸20mL，超声处理30min，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式5：干膏粉60℃水回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加水60mL，60℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式6：干膏粉60℃盐酸回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加0.1mol/L盐酸60mL，60℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式7：干膏粉60℃乙醇回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加乙醇60mL，60℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式8：干膏粉60℃乙醇+盐酸回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加乙醇40mL，4mol/L盐酸20mL，60℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式9：干膏粉100℃水回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加水60mL，100℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式10：干膏粉100℃盐酸回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加0.1mol/L盐酸60mL，100℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式11：干膏粉100℃乙醇回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加乙醇60mL，100℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
提取方式12：干膏粉100℃乙醇+盐酸回流提取：称取090211101批通草干膏粉约0.4g，精密称定，加乙醇40mL，4mol/L盐酸20mL，100℃水浴回流2h，放冷，滤过，取续滤液，即得；
以上12种提取方式的特征图谱请见图4，从图4可以直观看出，同一色谱条件下，S12(即提取方式12)的谱图的特征峰峰型良好，色谱峰较均匀的分布在10min～30min范围内。超声提取与回流提取比较，回流提取将样品提取更加完全，样品谱图中色谱峰较多，将回流温度从60℃升至100℃，样品谱图中峰面积有所提高，有利于实验结果重现。提取溶剂方面，使用乙醇提取，几乎无特征峰产生，使用水、0.1mol/L盐酸提取时，特征峰面积普遍较小，使用乙醇-4mol/L盐酸＝2：1溶液回流提取，产生特征峰个数较多，峰面积较大，能保证提取完全。且溶剂中加入乙醇，有利于样品保存。保留时间20min左右有明显色谱峰可作为S峰，
综上所述，通草干膏粉的制备方法确定为：取通草干膏粉供试品适量，研细，取约0.4g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
按照以上制备方法，确定参照物溶液、通草药材、饮片、标准汤剂、中药配方颗粒供试品溶液制备方法如下：
通草对照药材参照物溶液的制备：取通草对照药材1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通草药材供试品溶液的制备：取药材供试品1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通草中药饮片供试品溶液的制备：取中药饮片供试品1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通草标准汤剂供试品溶液的制备：取标准汤剂供试品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
通草中药配方颗粒供试品溶液的制备：取中药配方颗粒供试品适量，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
实施例3参照峰和共有峰的选择
测定1批通草对照药材所得色谱图，确定了4个共有峰，见图5，图5为1批通草对照药材叠加特征图谱。
测定2批通草中药饮片所得色谱图，确定了4个共有峰，见图6，图6为2批通草中药饮片叠加特征图谱。
测定15批通草中药饮片标准汤剂所得色谱图，确定了4个共有峰，见图7，图7为15批通草中药饮片标准汤剂叠加特征图谱。
测定3批通草干膏粉所得色谱图，确定了4个共有峰，见图8，图8为8批通草干膏粉叠加特征图谱。
测定3批通草中药配方颗粒所得色谱图，确定了4个共有峰，见图9，图9为3批草中药配方颗粒叠加特征图谱。
实验结果表明，从通草中药饮片到通草标准汤剂再到通草干膏粉最后到通草中药配方颗粒中，4个特征峰均能稳定转移，且与对照药材参照物溶液谱图中特征峰相对应。即通草对照药材特征图谱与通草中药饮片、通草中药饮片标准汤剂、通草干膏粉、通草中药配方颗粒特征图谱中的4个特征峰相对应，因此，选择通草对照药材特征图谱中的4个特征峰为通草药材的共有峰，并以峰2为参照峰进行标准研究，详情参见图5至图9。
实施例4对照特征图谱的建立和相似度评价
将1批通草对照药材、2批通草中药饮片、15批通草中药饮片标准汤剂、3批通草干膏粉、3批通草中药配方颗粒色谱图各导入中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2012.1版本)，采用中位数法生成各自的叠加特征图谱(见图5至图9)。
(1)相似度
使用《中药色谱指纹图谱相似度评价***》(2012.1版本)，计算1批通草对照药材、2批通草中药饮片、12批通草中药饮片标准汤剂、3批通草干膏粉、3批通草中药配方颗粒特征图谱的相似度，其结果见表8：
表8通草对照药材、中药饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒相似度分析结果
/>
其中，S1表示对照药材，S2表示210904批饮片，S3表示210910批饮片，S4表示210904批标汤剂，S5表示210905批标汤剂，S6表示210906批标汤剂，S7表示210907批标汤剂，S8表示210908批标汤剂，S9表示210909批标汤剂，S10表示210910批标汤剂，S11表示210911批标汤剂，S12表示210912批标汤剂，S13表示210913批标汤剂，S14表示210914批标汤剂，S15表示210915批标汤剂，S16表示090211101批干膏粉，S17表示090211102批干膏粉，S18表示090211103批干膏粉，S19表示090211101批中药配方颗粒，S20表示090211102批中药配方颗粒，S21表示090211103批中药配方颗粒。
结果显示：通草对照药材、通草中药饮片、通草中药饮片标准汤剂、通草干膏粉、通草中药配方颗粒的特征图谱相似度均大于0.90。
这说明以通草对照药材为供试品构建的特征图谱不仅能反映通草药材的质量从而可用于药材的检测，同样也反映通草饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的质量从而可用于通草饮片、标准汤剂、干膏粉和中药配方颗粒的检测，反之亦然。
(2)相对保留时间
对1批通草对照药材、2批通草中药饮片、15批通草中药饮片标准汤剂、3批通草干膏粉、3批通草中药配方颗粒特征图谱进行分析，以色谱峰峰2为参照峰，计算4个色谱峰的相对保留时间，实验结果见表9。
表9通草对照药材、中药饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒保留时间与相对保留时间
/>
结果显示，通草对照药材4个特征峰较为稳定，与通草中药饮片、通草中药饮片标准汤剂、通草干膏粉、通草中药配方颗粒共有峰一致。
以峰2为参照峰，通草对照药材特征图谱的其余3个特征峰相对保留时间分别为0.92，1.16，1.20，RSD％值分别为0.22，0.44，0.32。
为严格控制通草药材的质量，为通草中药饮片、通草中药饮片标准汤剂、通草干膏粉、通草中药配方颗粒的制备提供质优且稳定的原料药材，对通草药材指纹图谱的特征峰相对峰面积设定限量标准，是非常必要的。暂定通草药材特征图谱的标准为：供试品色谱中应呈现4个特征峰，并应与通草药材对照特征图谱中的4个特征峰保留时间相对应；
(3)特征图谱的拟定
将1批通草对照药材、2批通草中药饮片、15批通草中药饮片标准汤剂、3批通草干膏粉、3批通草中药配方颗粒特征图谱使用《中药色谱指纹图谱相似度评价软件***》匹配，各自的叠加特征图谱(见图5至图9)，建立通草对照特征图谱，如图10。
暂定通草药材特征图谱标准为：供试品色谱中应呈现4个特征峰，并应与对照药材参照物色谱图中的4个特征峰的保留时间相对应，其中峰2作为S峰，计算峰1、3、4与S峰的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10％范围之内。规定值为：0.92(峰1)、1.16(峰3)、1.20(峰4)。
实施例5中间精密度试验
通草中药配方颗粒供试品溶液：取211101批通草中药配方颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，加乙醇40mL，4mol/L盐酸20mL，密塞，称定重量，水浴回流2h，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；
通草对照药材(饮片)供试品溶液：取通草对照药材(饮片)约1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
使用岛津Nexera XR LC-20AD型液相色谱仪检测。
按实施例1确定的最佳色谱条件进行进样分析，见图11，并计算特征峰1、峰3、峰4与S峰的相对保留时间，计算结果见表10：
表10中间精密度试验保留时间与相对保留时间
实验结果显示，通草饮片、通草中药配方颗粒各特征峰的相对保留时间RSD值均小于0.55％，表明各色谱峰相对保留时间中间精密度较好。
实施例6重复性、溶液稳定性及进样精密度试验
通草中药配方颗粒重复性供试品溶液：取211101批通草中药配方颗粒适量，研细，取约1g，精密称定，加乙醇40mL，4mol/L盐酸20mL，密塞，称定重量，水浴回流2h，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸(4mol/L)＝2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得；平行配制6份。
考察进样精密度，溶液稳定性(0h，4h，9h，14h，20h，24h)，重复性。
按实施例1确定的最佳色谱条件进行进样分析。见图12、13，并计算特征峰1、峰3、峰4与S峰的相对保留时间及RSD值，计算结果见表11：
表11重复性、溶液稳定性及进样精密度试验保留时间与相对保留时间
实验结果显示，通草中药配方颗粒各色谱峰相对保留时间RSD值均为0.00％，表明该特征图谱分析方法重复性、溶液稳定性及进样精密度好。
实施例7稳定性试验
(1)加速试验
取模拟包装的各批次通草中药配方颗粒样品各200袋，置药品稳定性试验箱中贮存。
试验条件：温度40℃±2℃，相对湿度75％±5％
取样时间：加速3月
(2)长期试验
取模拟包装的各批次通草中药配方颗粒样品760袋，置稳定性考察室中贮存。
试验条件：温度30℃±2℃,相对湿度65％±5％
取样时间：长期3月
按实施例1确定的最佳色谱条件进行进样分析。见图14，并计算特征峰1、峰3、峰4与S峰的相对保留时间，计算结果见表12：
表12稳定性试验保留时间与相对保留时间
稳定性试验结果显示，通草中药配方颗粒各色谱峰相对保留时间RSD值均小于0.26％表明该特征图谱分析方法稳定性良好。
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (7)
1.一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的特征图谱构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备对照药材参照物溶液：使用通草对照药材制备参照物溶液；
制备药材供试品溶液：使用通草药材制备通草药材供试品溶液；
制备饮片供试品溶液：使用通草饮片制备通草饮片供试品溶液；
制备标准汤剂供试品溶液：使用通草标准汤剂制备通草标准汤剂供试品溶液；
制备干膏粉供试品溶液：使用通草干膏粉制备通草干膏粉供试品溶液；
制备中药配方颗粒供试品溶液：使用通草中药配方颗粒制备通草中药配方颗粒供试品溶液；
采用高效液相色谱法对对照药材参照物溶液和各供试品溶液进行检测，相应获得对照图谱和检测图谱，将所述对照图谱和所述检测图谱进行相似度分析，制定特征图谱；
其中，所述高效液相色谱法中流动相条件为：色谱柱：Agilent ZORBAX SB C18，250*4.6 mm*5 mm，检测波长220nm，柱温35℃，进样体积20μL，流动相A为体积分数为0.01的乙酸水溶液，流动相B为乙腈，流速1.0ml/min；所述高效液相色谱的条件包括：采用梯度洗脱；
梯度洗脱：0~5min，保持流动相A体积分数为98%，流动相B体积分数为2%；
5~30min，流动相A体积分数98%降至40%，流动相B体积分数为2%升至60%；
30~35min，保持流动相A体积分数为40%，流动相B体积分数为60%；
35~35.1min，流动相A体积分数40%升至98%，流动相B体积分数为60%降至2%；
35.1~45min，保持流动相A体积分数为98%，流动相B体积分数为2%；
所述特征图谱包含4个峰，以峰2为参照峰，计算峰1、峰3、峰4的相对保留时间，其相对保留时间应在规定值的±10%之内；
峰1的相对保留时间规定值为0.92；峰3的相对保留时间规定值为1.16；峰4的相对保留时间规定值为1.20；
所述通草为五加科植物通脱木的干燥茎髓。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通草对照药材参照物溶液制备方法如下：取通草对照药材1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸=2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通草药材供试品溶液制备方法如下：取药材供试品1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸=2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通草饮片供试品溶液制备方法如下：取中药饮片供试品1.0g，置烧瓶中，加水150mL，缓慢加热，微沸30分钟，滤过，用适量水冲洗烧瓶，合并洗液滤液，蒸干，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸=2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通草标准汤剂供试品溶液制备方法如下：取标准汤剂供试品适量，研细，取约0.1g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸=2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，通草中药配方颗粒供试品溶液制备方法如下：取中药配方颗粒供试品适量，研细，取约1.0g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇40mL和4mol/L的盐酸溶液20mL，密塞，称定重量，回流提取2小时，放冷，再称定重量，用乙醇：盐酸=2：1补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
7.一种通草药材及其饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒的鉴别方法，其特征在于，包括以下步骤：
取待鉴定的通草药材或饮片、标准汤剂、干膏粉、中药配方颗粒，并制备样品溶液；
采用高效液相色谱法对样品溶液进行检测，得到待鉴定的特征色谱；
将待鉴定的特征色谱与权利要求1-6中任一项所述的构建方法构建的特征图谱进行比对，若待鉴定的特征色谱与构建的特征图谱一致，则鉴别为质量合格。
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