CN113195717A - 单细胞全转录组分析中的选择性延伸 - Google Patents

Abstract

本文的公开内容包括用于选择性地扩增和/或延伸样品中的核酸靶分子的方法和组合物。该方法和组合物可以例如减少样品中不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，和/或允许选择性去除样品中不期望的核酸种类。

Description

单细胞全转录组分析中的选择性延伸

相关申请

本申请根据35 U.S.C.§119(e)，要求2018年12月13日提交的美国临时专利申请序列第62/779,374号的权益，该相关申请的内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。

背景

领域

本公开内容总体上涉及分子生物学领域，例如分子条形码化(molecularbarcoding)。

对现有技术的描述

生物样品中不同基因的表达水平可能有显著差异。例如，基因表达的一些大类有：1)“高表达者”，包括5-10个基因，占细胞mRNA的～20％；2)“中等(intermediate)表达者”，包括50-200个基因，占细胞mRNA的40％-60％；和3)“温和(moderate)表达者”，包括10,000-20,000个基因，占细胞mRNA分数的其余部分。分子生物学和分子遗传学中的一个挑战是高效和准确地捕获这种高度动态的基因表达谱，以便区分样品中的不同细胞类型和表型。

下一代测序(NGS)为评估基因表达谱提供了一种高通量的方法。在为NGS准备文库的过程中，通过PCR扩增具有异质cDNA种类的样品，以获得足够的样品量并连接NGS相容的衔接子。测序过程从PCR扩增的文库样品捕获每个基因的读段数量，以解释基因表达水平。然而，由于不同的基因在很大水平范围内表达，PCR扩增会扭曲天然基因的表达。例如，含有一个分子cDNA的基因将需要40个循环的PCR才能获得与含有1000个分子cDNA的基因在30个循环中获得的相同的代表量。在异质的cDNA样品中，PCR通常以过量的循环进行，以充分扩增低表达者；在这些情况下，天然基因表达谱通常被主要的高表达者PCR产物所扭曲。纠正PCR产物中这种偏差的一种方法是分子索引(Molecular Indexing)；然而，高表达者诸如核糖体蛋白mRNA、线粒体mRNA或看家基因通常在测序运行中占主导地位，对实验解释的贡献很小。对选择性地延伸和/或扩增感兴趣的序列存在需求。

概述

本文的公开内容包括一种选择性延伸的方法。在一些实施方案中，该方法包括获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的样品；将封闭寡核苷酸与样品接触，其中封闭寡核苷酸特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种；将多于一种寡核苷酸探针与样品接触，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和能够与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的靶结合区；以及延伸与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸探针，以产生多于一种延伸产物；由此一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的延伸被封闭寡核苷酸减少。

封闭寡核苷酸可以在多于一种寡核苷酸探针与样品接触之前或之后与样品接触。

在一些实施方案中，该方法包括获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的第二样品，其中使封闭寡核苷酸与样品接触包括使封闭寡核苷酸与第二样品接触，并且其中使多于一种寡核苷酸探针与样品接触包括使多于一种寡核苷酸探针与第二样品接触，该方法包括在使多于一种寡核苷酸探针与样品接触之后，并且在延伸与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸之前：汇集样品和第二样品。在一些实施方案中，该方法包括汇集样品和第二样品，包括在将封闭寡核苷酸与样品和第二样品接触之前汇集样品和第二样品。封闭寡核苷酸可以在多于一种寡核苷酸探针与样品接触时与样品接触。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含封闭寡核苷酸。

封闭寡核苷酸可以例如包含(i)特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，和(ii)靶结合区的序列或子序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针都不包含封闭寡核苷酸。在一些实施方案中，方法包括扩增多于一种延伸产物以产生多于一种扩增子。在一些实施方案中，扩增包括多于一种延伸产物的PCR扩增。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增被封闭寡核苷酸减少。封闭寡核苷酸的类型可以变化。例如，封闭寡核苷酸可以是锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、DNA、LNA/PNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体。在一些实施方案中，该方法包括提供特异性地结合样品中两种或更多种不期望的核酸种类的封闭寡核苷酸。在一些实施方案中，该方法包括提供特异性地结合样品中至少10种不期望的核酸种类的封闭寡核苷酸。在一些实施方案中，该方法包括提供特异性地结合样品中至少100种不期望的核酸种类的封闭寡核苷酸。封闭寡核苷酸的T_m可以变化，例如，T_m可以为至少50℃、至少65℃、或至少70℃。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。

封闭寡核苷酸可以例如包含(i)特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，(ii)靶结合区的序列或子序列，和(iii)不与一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种杂交的序列。封闭寡核苷酸可以包含3’非退火区，其被配置为不与一种或更多种不期望的核酸种类退火。3’非退火区和不期望的核酸种类中被封闭寡核苷酸特异性地结合的序列的5’相邻区域之间的非互补性可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或者可以是约100％。3’非退火区可以是1nt至100nt长，1nt至50nt长，1nt至21nt长，1nt至10nt长，或者可以是约5nt长。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸不包含非天然核苷酸。

通过本文公开的方法减少不期望的核酸种类的扩增或延伸的程度可以变化。例如，不期望的核酸种类的扩增或延伸可以减少至少10％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少25％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少50％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少80％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少90％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少95％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少99％。

封闭寡核苷酸的长度可以变化。例如，封闭寡核苷酸可以是8nt至100nt长，10nt至50nt长(例如，12nt至21nt长)，或20nt至30nt长。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是约25nt长。

不期望的核酸种类可以以不同的量存在于样品中，和/或可以以不同的核酸含量在样品中。例如，一种或更多种不期望的核酸种类可占样品核酸含量的约50％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占样品核酸含量的约60％、约70％或约80％。

不期望的核酸种类的类型可以变化。例如，不期望的核酸种类可以是核糖体蛋白mRNA、线粒体mRNA、基因组DNA、内含子序列、高丰度序列或它们的任何组合。封闭寡核苷酸可以特异性地结合不期望的核酸种类的不同位置，以减少不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类的3’末端的100nt内(例如，50nt内)。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类的3’末端的25nt内。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类的5’末端的100nt内。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中点的100nt内。

寡核苷酸探针可以具有一个或更多个序列组分。例如，寡核苷酸探针可以包含分子标记序列和/或靶结合区域。在一些实施方案中，寡核苷酸探针(例如，多于一种寡核苷酸探针中的每一种)可以包含细胞标记序列、样品标记序列、位置标记序列、通用引物的结合位点或其组合。

多于一种寡核苷酸探针中的一些、大多数或所有可以具有不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针包含至少100种不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针包含至少1000种不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针包含至少10000种不同的分子标记序列。多于一种寡核苷酸探针中的一些、大多数或所有可以包含相同的细胞标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的每一种可以包含相同的细胞标记序列。

在本文公开的方法中可以接触各种样品。例如，样品可以包括单细胞、单细胞的裂解物、多于一种细胞、多于一种细胞的裂解物、组织样品、组织样品的裂解物或其任何组合。

在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针与颗粒关联。例如，寡核苷酸探针被固定在颗粒上、部分固定在颗粒上、包埋在颗粒中、部分包埋在颗粒中，或它们的组合。在一些实施方案中，颗粒是或包括珠。在一些实施方案中，颗粒(例如，珠)包含以下材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，或它们的组合。在一些实施方案中，颗粒(例如珠)是水凝胶珠或磁珠。颗粒(例如珠)可以是可破裂的。

多于一种核酸靶分子和/或一种或更多种不期望的核酸种类可以包括不同的核酸种类，例如，RNA分子、DNA分子或其组合。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子和/或一种或更多种不期望的核酸种类包括mRNA分子。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子和/或一种或更多种不期望的核酸种类包括DNA分子。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类是mRNA分子，并且封闭寡核苷酸特异性地结合到一种或更多种不期望的核酸种类的3’多(A)尾的10nt内。

在一些实施方案中，靶结合区包含多dT序列。在一些实施方案中，多于一种扩增子包含cDNA文库。在一些实施方案中，该方法还包括对多于一种扩增子测序。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占多于一种扩增子的少于40％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占多于一种扩增子的少于20％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占多于一种扩增子的少于10％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占多于一种扩增子的少于5％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的40％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的20％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的10％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的5％。

本文的公开内容还包括用于选择性扩增样品中的核酸分子的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含：多于一种寡核苷酸探针，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和包含多dT序列的靶结合区；和特异性地结合样品中多于一种不期望的mRNA种类的多于一种封闭寡核苷酸，其中多于一种封闭寡核苷酸结合多于一种不期望的mRNA种类的非多(A)区域，并且其中每种封闭寡核苷酸探针不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。

在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含多于一种封闭寡核苷酸中的一种。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列和(ii)多dT序列。在一些实施方案中，寡核苷酸探针的多dT序列比封闭寡核苷酸的多dT序列长。在一些实施方案中，寡核苷酸探针的多dT序列和封闭寡核苷酸的多dT序列具有相同的长度。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针都不包含封闭寡核苷酸。封闭寡核苷酸可以例如包含(i)特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，(ii)靶结合区的序列或子序列，和(iii)不与一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种杂交的序列。例如，封闭寡核苷酸可以包含3’非退火区，其被配置为不与一种或更多种不期望的核酸种类退火。3’非退火区和不期望的核酸种类中被封闭寡核苷酸特异性地结合的序列的5’相邻区域之间的非互补性可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％，或者可以是约100％。3’非退火区可以是1nt至100nt长，1nt至50nt长，1nt至21nt长，1nt至10nt长，或者可以是约5nt长。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸不包含非天然核苷酸。封闭寡核苷酸的类型可以变化，例如，锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、DNA、LNA/PNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体。封闭寡核苷酸可以结合(例如，特异性地结合)一种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸特异性地结合两种或多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸特异性地结合至少10种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸特异性地结合至少100种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是8nt至100nt长。在一些实施方案中，多于一种不期望的mRNA种类包括核糖体mRNA、线粒体mRNA或其组合。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸特异性地结合不期望的核酸种类的3’末端的100nt内。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针被固定在基底上。基底是颗粒，例如珠。在一些实施方案中，试剂盒还包含酶。试剂盒中可以存在各种酶，例如，酶可以是逆转录酶、聚合酶、连接酶、核酸酶或其组合。封闭寡核苷酸的T_m可以变化，例如，封闭寡核苷酸(例如，每种封闭寡核苷酸探针)可以具有至少50℃的T_m。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针包括至少100种不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针包含至少1,000种不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针包含相同的细胞标记序列。

附图简述

图1图示了非限制性示例性条形码。

图2示出了条形码化和数字计数的非限制性示例性工作流程。

图3是示出了用于从多于一种靶产生在3’-末端条形码化的靶的索引化文库(indexed library)的非限制性示例性方法的示意性图示。

图4A-图4B显示在单细胞全转录组分析中核糖体和线粒体含量的测量结果。

图5显示从感兴趣的mRNA和看家mRNA非限制性示例性产生cDNA。

图6A-图6E显示在封闭寡核苷酸的存在下选择性产生cDNA以防止不期望的mRNA的cDNA合成的非限制性示例性实施方案。

详述

定义

除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语具有与本公开内容所属技术领域的普通技术人员所通常理解的相同的含义。如本说明书和所附权利要求书中使用的，除非上下文另有清楚指示，否则单数形式“a(一)”、“an(一)”和“该(the)”包括复数的提示物。除非另外说明，否则在本文中对“或”的任何提及意在涵盖“和/或”。

如本文使用的，术语“关联”或“与......关联”可以意指两个或更多个种类(species)可以被鉴定为在某个时间点处共定位。关联可意指两个或更多个种类在或曾经在相似的容器内。关联可以是信息学关联，其中例如，关于两个或更多个种类的数字信息被存储并且可以用于确定所述种类中的一个或更多个在某个时间点处共定位。关联也可以是物理关联。在一些情形中，两个或更多个关联的种类彼此之间或与共同的固体或半固体表面是“连接的”、“附接的”或“固定的”。关联可以指用于将标记附接到固体或半固体支持物(诸如珠)上的共价或非共价方式。关联可以包括靶与标记之间的杂交。

如本文使用的，术语“互补”可以指两个核苷酸之间精确配对的能力。例如，如果核酸的在给定位置的核苷酸能够与另一个核酸的核苷酸以氢键键合，则两个核酸被认为在该位置处是彼此互补的。两个单链核酸分子之间的互补性可以是“部分的”，其中所述核苷酸中仅一些核苷酸结合，或者当所述单链分子之间存在完全互补性时，这种互补性可以是完全的。如果第一核苷酸序列与第二核苷酸序列互补，则可以称第一核苷酸序列是第二序列的“互补体”。如果第一核苷酸序列与和第二序列相反的序列(即，核苷酸顺序相反)互补，则可以称第一核苷酸序列是第二序列的“反向互补体”。如本文使用的，术语“互补体”、“互补”和“反向互补体”可以互换使用。从本公开内容可以理解，如果一个分子可以与另一个分子杂交，则其可以是其所杂交的分子的互补体。

如本文使用的，术语“数字计数”可以指用于估计样品中靶分子的数量的方法。数字计数可以包括确定已经与样品中的靶关联的独特标记的数量的步骤。这种随机的方法将对分子进行计数的问题从相同分子的定位和鉴定中的一种转化为有关检测一组预定义标记的一系列是/否数字问题。

如本文使用的，术语(一种或更多种)“标记”可以指与样品中的靶关联的核酸编码。标记可以是例如核酸标记。标记可以是完全或部分可扩增的标记。标记可以是完全或部分可测序的标记。标记可以是可鉴定为有区别的天然核酸的一部分。标记可以是已知的序列。标记可以包括核酸序列的连接区，例如天然序列和非天然序列的连接区。如本文使用的，术语“标记”可以与术语“索引”、“标签”或“标记-标签”互换使用。标记可以传达信息。例如，在各种实施方案中，可以使用标记来确定样品的身份、样品的来源、细胞的身份，和/或靶。

如本文使用的，“核酸”通常可以指多核苷酸序列或其片段。核酸可以包括核苷酸。核酸对于细胞可以是外源的或内源的。核酸可以存在于无细胞环境中。核酸可以是基因或其片段。核酸可以是DNA。核酸可以是RNA。核酸可以包括一种或更多种类似物(例如改变的骨架、糖或核碱基)。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异源核酸(xenonucleic acid)、吗啉代核酸(morpholinos)、锁核酸、二醇核酸、苏糖核酸、二脱氧核苷酸、虫草菌素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，罗丹明或与糖连接的荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、辫苷(queuosine)以及怀俄苷(wyosine)。“核酸”、“多核苷酸”、“靶多核苷酸”和“靶核酸”可以互换使用。

核酸可以包含一种或更多种修饰(例如，碱基修饰、骨架修饰)，以向核酸提供新的或增强的特征(例如，改进的稳定性)。核酸可以包含核酸亲和标签。核苷可以是碱基-糖组合。核苷的碱基部分可以是杂环碱基。这样的杂环碱基的两个最常见的类别是嘌呤和嘧啶。核苷酸可以是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包括呋喃戊糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到糖的2’、3’或5’羟基部分。在形成核酸中，磷酸基团可以将相邻的核苷彼此共价连接以形成线性聚合化合物。继而此线性聚合化合物的各自末端可以进一步接合以形成环状化合物；然而，线性化合物通常是合适的。此外，线性化合物可以具有内部核苷酸碱基互补性，并且因此可以按产生完全或部分双链化合物的方式折叠。在核酸中，磷酸基团通常可以被称为形成核酸的核苷间骨架。核酸的连接或骨架可以是3’至5’磷酸二酯连接。

核酸可以包含修饰的骨架和/或修饰的核苷间连接。修饰的骨架可以包括那些在骨架中保留磷原子的骨架和那些在骨架中不具有磷原子的骨架。其中含有磷原子的合适的修饰的核酸骨架可以包括，例如，硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨基烷基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯，诸如3’-亚烷基磷酸酯、5’-亚烷基磷酸酯、手性磷酸酯、亚磷酸酯，包括3’-氨基磷酰胺和氨基烷基磷酰胺的磷酰胺，磷酰二胺、硫代磷酰胺、硫代烷基磷酸酯、硫代烷基磷酸三酯、硒代磷酸酯和具有正常的3'-5'连接的硼酸磷酸酯(boranophosphates)、2'-5’连接的类似物，以及具有反转极性的那些，其中一个或更多个核苷酸间连接为3'至3'、5'至5’或2'至2’连接。

核酸可以包含由以下形成的多核苷酸骨架：短链烷基或环烷基核苷间连接、混合杂原子，和烷基或环烷基核苷间连接，或者一个或更多个短链杂原子的或杂环的核苷间连接。这些可以包括具有以下的那些：吗啉代连接(部分地从核苷的糖部分形成)；硅氧烷骨架；硫化物、亚砜和砜骨架；甲乙酰基(formacetyl)和硫代甲乙酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲乙酰基和硫代甲乙酰基骨架；核糖乙酰基(riboacetyl)骨架；含有烯烃的骨架；氨基磺酸盐骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸盐和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和具有混合的N、O、S和CH₂组成部分的其他物质。

核酸可以包括核酸模拟物。术语“模拟物”可意在包括其中仅呋喃糖环或呋喃糖环和核苷酸间连接二者被非呋喃糖基团代替的多核苷酸，仅呋喃糖环的代替也可称为糖替代物。杂环碱基部分或修饰的杂环碱基部分可被保持以与适当的靶核酸杂交。一种这样的核酸可以是肽核酸(PNA)。在PNA中，多核苷酸的糖骨架可以被含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架代替。核苷酸可以被保留，并直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。PNA化合物中的骨架可以包含两个或更多个连接的氨基乙基甘氨酸单元，这为PNA提供含酰胺的骨架。杂环碱基部分可以直接或间接结合到骨架的酰胺部分的氮杂氮原子。

核酸可以包含吗啉代骨架结构。例如，核酸可以包含代替核糖环的6元吗啉代环。在这些实施方案中的一些中，磷酰二胺或其他非磷酸二酯核苷间连接可以代替磷酸二酯连接。

核酸可以包含具有附接到吗啉代环上的杂环碱基的连接的吗啉代单元(即，吗啉代核酸)。连接基团可以连接吗啉代核酸中的吗啉代单体单元。非离子的基于吗啉代的寡聚化合物可与细胞蛋白质具有较少的不期望的相互作用。基于吗啉代的多核苷酸可以是核酸的非离子模拟物。吗啉代类别中的各种化合物可以使用不同的连接基团连接。另一类多核苷酸模拟物可以称为环己烯基核酸(CeNA)。核酸分子中通常存在的呋喃糖环可以被环己烯基环取代。使用亚磷酰胺化学可以制备CeNA DMT保护的亚磷酰胺单体并用于寡聚化合物合成。将CeNA单体掺入核酸链中可以增加DNA/RNA杂交体的稳定性。CeNA寡腺苷酸可以与核酸互补体形成稳定性与天然复合物相似的复合物。另外的修饰可以包括锁核酸(LNA)，其中2’-羟基基团连接到糖环的4’碳原子，从而形成2′-C,4′-C-氧亚甲基连接，从而形成双环糖部分。连接可以是亚甲基(-CH2-)，桥接2’氧原子和4’碳原子的基团，其中n是1或2。LNA和LNA类似物可以显示出与互补核酸的非常高的双链体热稳定性(Tm＝+3℃至+10℃)、对3’-核酸外切酶降解的稳定性和良好的溶解度特性。

核酸还可以包括核碱基(通常简称为“碱基”)修饰或取代。如本文使用的，“未修饰的”或“天然的”核碱基可以包括嘌呤碱基(例如腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G))，以及嘧啶碱基(例如胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U))。经修饰的核碱基可以包括其他合成以及天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、5-羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基衍生物和其他烷基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基衍生物和其他烷基衍生物、2-硫代尿嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶、5-卤素尿嘧啶(5-halouracil)和胞嘧啶、5-丙炔基(-C═C-CH3)尿嘧啶和胞嘧啶，和嘧啶碱基的其他炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4-硫代尿嘧啶，8-卤素、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤素特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤、2-F-腺嘌呤、2-氨基腺嘌呤、8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱氮腺嘌呤和3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤。修饰的核碱基可以包括三环嘧啶，诸如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、吩噻嗪胞苷(1H-嘧啶并(5,4-b)(1,4)苯并噻嗪-2(3H)-酮)、G-夹类(G-clamps)，诸如取代的吩噁嗪胞苷(例如9-(2-氨基乙氧基)-H-嘧啶并(5,4-(b)(1,4)苯并噁嗪-2(3H)-酮)、咔唑胞苷(2H-嘧啶并(4,5-b)吲哚-2-酮)、吡啶并吲哚胞苷(H-吡啶并(3′,′:4,5)吡咯并[2,3-d]嘧啶-2-酮)。

如本文使用的，术语“样品”可以指包含靶的组合物。用于通过本文公开的方法、装置和***进行分析的合适样品包括细胞、单细胞、组织、器官或生物体。

如本文使用的，术语“采样装置”或“装置”可以指可以取一部分样品和/或将所述部分放置在基底上的装置。采样装置可以指例如荧光激活细胞分选(FACS)机、细胞分选机、活组织检查针、活组织检查装置、组织切片装置、微流体装置、叶栅和/或超薄切片机。

如本文使用的，术语“固体支持物”可以指可以附接多于一种随机条形码的离散固体或半固体表面。固体支持物可以包括任何类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他类似形状，由塑料、陶瓷、金属或聚合材料(例如，水凝胶)构成，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。固体支持物可以包括可以是球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状诸如立方体、长方体、锥体、圆柱体、圆锥体、椭圆形或圆盘形等。以阵列间隔开的多于一个固体支持物可以不包括基底。固体支持物可以与术语“珠”互换使用。如本文使用的，“固体支持物”和“基底”可以互换使用。

如本文使用的，术语“随机条形码”指包含本公开内容的标记的多核苷酸序列。随机条形码可以是可用于随机条形码化的多核苷酸序列。随机条形码可用于对样品中的靶进行定量。随机条形码可用于控制标记与靶关联后可能发生的错误。例如，随机条形码可用于评估扩增或测序错误。与靶关联的随机条形码可以称为随机条形码-靶或随机条形码-标签-靶。

如本文使用的，术语“随机条形码化”指核酸的随机标记(例如，条形码化)。随机条形码化可以利用递归泊松策略来关联并对与靶关联的标记进行定量。如本文使用的，术语“随机条形码化”可以与“随机进行标记”互换使用。

如本文使用的，术语“靶”可以指可与随机条形码关联的组合物。用于通过本文公开的方法、装置和***进行分析的示例性合适的靶包括寡核苷酸、DNA、RNA、mRNA、微RNA、tRNA等。靶可以是单链的或双链的。在一些实施方案中，靶可以是蛋白质、多肽或肽。在一些实施方案中，靶是脂质。如本文使用的，“靶”可以与“种类”互换使用。

术语“逆转录酶”可以指具有逆转录酶活性(即，催化从RNA模板合成DNA)的一组酶。通常，这样的酶包括但不限于逆转录病毒逆转录酶、逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶(retron reverse transcriptase)、细菌逆转录酶、II型内含子衍生的逆转录酶(group II intron-derived reverse transcriptase)，以及它们的突变体、变体或衍生物。非逆转录病毒逆转录酶包括非LTR逆转录转座子逆转录酶、逆转录质粒逆转录酶、逆转录子逆转录酶和II型内含子逆转录酶。II型内含子逆转录酶的实例包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)Ll.LtrB内含子逆转录酶、细长嗜热聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)TeI4c内含子逆转录酶或嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)GsI-IIC内含子逆转录酶。其他类别的逆转录酶可以包括许多类型的非逆转录病毒逆转录酶(即，逆转录子、II型内含子，以及多样性产生型逆转录元件，等等)。

条形码

条形码化，诸如随机条形码化，已描述于例如US 2015/0299784，WO 2015/031691，以及Fu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2011May 31；108(22):9026-31中，这些出版物的内容以其整体在此并入本文。在一些实施方案中，本文公开的条形码可以是随机条形码，所述随机条形码可以是可用于对靶进行随机标记(例如，条形码，标签)的多核苷酸序列。如果随机条形码中的不同条形码序列的数量与待标记的任何靶的出现次数(number ofoccurrence)的比率可以是以下，或是约以下，则条形码可以称为随机条形码：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA种类。如果随机条形码中的不同条形码序列的数量与待标记的任何靶的出现次数的比率是至少以下，或至多以下，则条形码可以称为随机条形码：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。随机条形码的条形码序列可以称为分子标记。

条形码，例如随机条形码，可以包含一种或更多种标记。示例性标记可以包括通用标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、样品标记、板标记、空间标记和/或前空间标记(pre-spatial label)。图1图示了具有空间标记的示例性条形码104。条形码104可以包含可将条形码与固体支持物108连接的5’胺。条形码可以包含通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记中的一种或更多种。条形码中不同标记(包括但不限于通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和分子标记)的顺序可以改变。例如，如图1中示出的，通用标记可以是最5’侧的标记(5’-most lable)，且分子标记可以是最3’侧的标记(3’-mostlable)。空间标记、维度标记和细胞标记可以处于任何顺序。在一些实施方案中，通用标记、空间标记、维度标记、细胞标记和分子标记是处于任何顺序的。条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶(例如，靶核酸、RNA、mRNA、DNA)相互作用。例如，靶结合区可以包括可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡聚(dT)序列。在一些情况下，条形码的标记(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列)可以由1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸隔开。

标记，例如，细胞标记，可以包括一组独特的定义长度的核酸子序列，例如各自有七个核苷酸(相当于一些汉明纠错码(Hamming error correction codes)中使用的数量)，其可以设计为提供纠错能力。可以设计包含七个核苷酸序列的纠错子序列组，使得所述组中的序列的任何成对组合展现出定义的“遗传距离”(或错配碱基数)，例如一组纠错子序列能被设计为展现三个核苷酸的遗传距离。在这种情况下，对于经标记的靶核酸分子的序列数据组中的纠错序列的审查(在下文更全面地描述)能允许检测或纠正扩增或测序错误。在一些实施方案中，用于产生纠错码的核酸子序列的长度可以变化，例如，它们的长度可以是以下，或是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、30个、31个、40个、50个，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。在一些实施方案中，其他长度的核酸子序列可以用来产生纠错码。

条形码可以包含靶结合区。靶结合区可以与样品中的靶相互作用。靶可以是，或包括核糖核酸(RNA)、信使RNA(mRNA)、微RNA、小干扰RNA(siRNA)、RNA降解产物、各自含有多(A)尾的RNA或它们的任何组合。在一些实施方案中，多于一种靶可以包括脱氧核糖核酸(DNA)。

在一些实施方案中，靶结合区可以包含可以与mRNA的多(A)尾相互作用的寡聚(dT)序列。条形码的标记中的一种或更多种(例如，通用标记、维度标记、空间标记、细胞标记和条形码序列(例如，分子标记))可以通过间隔序列(spacer)与条形码的剩余标记中的另一个或两个隔开。间隔序列可以是例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，条形码的标记中没有标记被间隔序列隔开。

通用标记

条形码可以包含一种或更多种通用标记。在一些实施方案中，对于条形码组中的所有条形码(附接到给定的固体支持物上的)，一种或更多种通用标记可以是相同的。在一些实施方案中，对于附接到多于一个珠上的所有条形码，一种或更多种通用标记可以是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物杂交的核酸序列。测序引物可以用于对包含通用标记的条形码进行测序。测序引物(例如，通用测序引物)可以包括与高通量测序平台有关的测序引物。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与PCR引物杂交的核酸序列。在一些实施方案中，通用标记可以包括能够与测序引物和PCR引物杂交的核酸序列。能够与测序或PCR引物杂交的通用标记的核酸序列可以被称为引物结合位点。通用标记可以包括可用于起始条形码转录的序列。通用标记可以包括可用于使条形码或条形码内的区域延伸的序列。通用标记的长度可以是以下，或约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。例如，通用标记可以包括至少约10个核苷酸。通用标记的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。在一些实施方案中，可裂解接头或修饰的核苷酸可以是通用标记序列的一部分，以使条形码能够从支持物上被裂解下来。

维度标记

条形码可以包含一种或更多种维度标记。在一些实施方案中，维度标记可以包括提供关于发生标记(例如，随机标记)的维度的信息的核酸序列。例如，维度标记可以提供关于对靶进行条形码化的时间的信息。维度标记可以与样品中条形码化(例如，随机条形码化)的时间关联。维度标记可以在标记的时间被激活。不同的维度标记可以在不同的时间被激活。维度标记提供关于靶、靶的组和/或样品被条形码化的顺序的信息。例如，在细胞周期的G0期可以对细胞群体进行条形码化。在细胞周期的G1期，可以用条形码(例如，随机条形码)再次对细胞进行脉冲处理。在细胞周期的S期，可以用条形码再次对细胞进行脉冲处理，等等。每次脉冲(例如，细胞周期的每个期)时的条形码可以包含不同的维度标记。以这种方式，维度标记提供关于哪些靶在细胞周期的哪个期被标记的信息。维度标记可以询问许多不同的生物学时间。示例性的生物学时间可以包括但不限于细胞周期、转录(例如，转录起始)和转录物降解。在另一个实例中，样品(例如，细胞、细胞群体)可以在用药物和/或疗法治疗之前和/或之后进行标记。不同靶的拷贝数的变化可以指示样品对药物和/或疗法的反应。

维度标记可以是可激活的。可以在特定时间点激活可激活的维度标记。可激活的标记可以被例如组成性地激活(例如，不关闭)。所述可激活的维度标记可以被例如可逆地激活(例如，所述可激活的维度标记可以打开和关闭)。维度标记可以被例如可逆地激活至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。维度标记可以被可逆地激活例如至少1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。在一些实施方案中，可以用荧光、光、化学事件(例如，裂解，另一种分子的连接，修饰的添加(例如，聚乙二醇化、sumo化(sumoylate)、乙酰化、甲基化、去乙酰化、去甲基化)、光化学事件(例如，光锁定(photocaging))以及引入非天然的核苷酸将所述维度标记激活。

在一些实施方案中，维度标记对于附接到给定的固体支持物(例如，珠)上的所有条形码(例如，随机条形码)可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的维度标记。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的维度标记。

多于一个固体支持物(例如，珠)可以表现多达10⁶种或更多种独特维度标记序列。维度标记的长度可以是以下，或约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。维度标记的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。维度标记可以包括约5个至约200个之间的核苷酸。维度标记可以包括约10个至约150个之间的核苷酸。维度标记可以包括长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

空间标记

条形码可以包含一种或更多种空间标记。在一些实施方案中，空间标记可以包括提供与条形码关联的靶分子的空间定向的信息的核酸序列。空间标记可以与样品中的坐标关联。所述坐标可以是固定的坐标。例如，可以参考基底将坐标固定。空间标记可以参考二维或三维网格。可以参考界标(landmark)将坐标固定。在空间中界标是可被鉴定的。界标可以是可被成像的结构。界标可以是生物学结构，例如解剖学界标。界标可以是细胞界标，例如细胞器。界标可以是非天然界标，诸如具有可鉴定标识(诸如颜色编码、条形码、磁性、荧光、放射性或独特尺寸或形状)的结构。空间标记可以与物理分区(例如，孔、容器或液滴)关联。在一些实施方案中，将多于一种空间标记一起用于编码空间中的一个或更多个位置。

空间标记对于附接到给定的固体支持物(例如，颗粒或珠)上的所有条形码可以是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，颗粒或珠)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是以下，或约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，相同固体支持物上包含相同空间标记的条形码的百分比可以是至少以下，或至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的空间标记，例如，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的空间标记。

多于一个固体支持物(例如，珠)可以表现多达10⁶种或更多种独特空间标记序列。空间标记的长度可以是以下，或约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。空间标记的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。空间标记可以包含约5个至约200个之间的核苷酸。空间标记可以包含约10个至约150个之间的核苷酸，例如约20个至约125个的核苷酸。

细胞标记

条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种细胞标记。在一些实施方案中，细胞标记可以包括提供用于确定哪种靶核酸来自哪个细胞的信息的核酸序列。在一些实施方案中，细胞标记对于附接到给定的固体支持物(例如，珠)上的所有条形码是相同的，但对于不同的固体支持物(例如，珠)是不同的。在一些实施方案中，相同固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下，或约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，相同固体支持物上包含相同细胞标记的条形码的百分比可以是以下，或约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。例如，相同固体支持物上的至少60％的条形码可以包含相同的细胞标记。作为另一个实例，相同固体支持物上的至少95％的条形码可以包含相同的细胞标记。

多于一个固体支持物(例如，珠)可以表现多达10⁶种或更多种独特细胞标记序列。细胞标记的长度可以是以下，或约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个核苷酸，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。例如，细胞标记可以包括约5个至约200个之间的核苷酸。作为另一个实例，细胞标记可以包括约10个至约150个之间的核苷酸。作为又另一个实例，细胞标记可以包括长度在约20个至约125个之间的核苷酸。

条形码序列

条形码可以包含一种或更多种条形码序列。在一些实施方案中，条形码序列可以包括提供与条形码杂交的特定类型的靶核酸种类的鉴定信息的核酸序列。条形码序列可以包括如下核酸序列，所述核酸序列提供与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸种类的特定出现的计数(例如，提供粗略近似)。

在一些实施方案中，一组不同的条形码序列附接到给定的固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下，或有约以下的独特分子标记序列：10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一种条形码可以包括具有不同序列的约6561种条形码序列。作为另一个实例，多于一种条形码可以包括具有不同序列的约65536种条形码序列。在一些实施方案中，可以有至少以下，或至多以下的独特条形码序列：10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种或10⁹种。独特分子标记序列可以附接到给定的固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，独特分子标记序列被颗粒(例如水凝胶珠)部分或全部包围。

在不同实施方式中，条形码的长度可以是不同的。例如，条形码的长度可以是以下，或约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。作为另一个实例，条形码的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。

分子标记

条形码(例如，随机条形码)可以包含一种或更多种分子标记。分子标记可以包括条形码序列。在一些实施方案中，分子标记可以包括提供与条形码杂交的特定类型的靶核酸种类的鉴定信息的核酸序列。分子标记可以包括如下核酸序列，所述核酸序列提供与条形码(例如，靶结合区)杂交的靶核酸种类的特定出现的计数。

在一些实施方案中，一组不同的分子标记附接到给定的固体支持物(例如，珠)。在一些实施方案中，可以有以下，或有约以下的独特分子标记序列：10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。例如，多于一种条形码可以包括具有不同序列的约6561种分子标记。作为另一个实例，多于一种条形码可以包括具有不同序列的约65536种分子标记。在一些实施方案中，可以有至少以下，或至多以下的独特分子标记序列：10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种或10⁹种。具有独特分子标记序列的条形码可以附接到给定的固体支持物(例如，珠)。

对于使用多于一种随机条形码进行的条形码化(例如，随机条形码化)，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比率可以是以下，或约以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。靶可以是包括具有相同或几乎相同序列的mRNA分子的mRNA种类。在一些实施方案中，不同分子标记序列的数量与任何靶的出现次数的比率是至少以下，或至多以下：1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1或100:1。

分子标记的长度可以是以下，或是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。分子标记的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个、100个、200个或300个核苷酸。

靶结合区

条形码可以包含一种或更多种靶结合区，诸如捕获探针。在一些实施方案中，靶结合区可以与感兴趣的靶杂交。在一些实施方案中，靶结合区可以包括与靶(例如，靶核酸、靶分子，例如待分析的细胞核酸)，例如，与特定基因序列，进行特异性杂交的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包括可附接(例如，杂交)至特定靶核酸的特定位置的核酸序列。在一些实施方案中，靶结合区可以包括能够与限制性酶位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)进行特异性杂交的核酸序列。然后条形码可以连接到包括与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。

在一些实施方案中，靶结合区可以包括非特异性靶核酸序列。非特异性靶核酸序列可以指不依赖靶核酸的特定序列可与多种靶核酸结合的序列。例如，靶结合区可以包括与mRNA分子上的多(A)尾杂交的随机多聚体序列或寡聚(dT)序列。随机多聚体序列可以是例如随机二聚体、三聚体、四聚体、五聚体、六聚体、七聚体、八聚体、九聚体、十聚体或任何长度的更高多聚体序列。在一些实施方案中，附接到给定珠的所有条形码的靶结合区是相同的。在一些实施方案中，附接到给定珠的多于一种条形码的靶结合区可以包括两种或更多种不同的靶结合序列。靶结合区的长度可以是以下，或是约以下：5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。

在一些实施方案中，靶结合区可以包括寡聚(dT)，所述寡聚(dT)可以与包含多腺苷酸化末端的mRNA杂交。靶结合区可以是基因特异性的。例如，可以将靶结合区配置为与靶的特定区域杂交。靶结合区的长度可以是以下，或是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个核苷酸，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。靶结合区的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。靶结合区的长度可以是约5-30个核苷酸。当条形码包含基因特异性靶结合区时，所述条形码在本文中可以被称为基因特异性条形码。

定向特性

随机条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种可用于定向(例如，比对)条形码的定向特性。条形码可以包含用于等电聚焦的部分。不同的条形码可以包括不同的等电聚焦点。当将这些条形码引入样品中时，所述样品可以经历等电聚焦，以便于将条形码定位成已知的方式。以这种方式，定向特性可以用于开发样品中条形码的已知的地图(map)。示例性定向特性可以包括电泳迁移(例如，基于条形码的尺寸)、等电点、自旋、电导和/或自组装。例如，具有自组装的定向特性的条形码在激活后可以自组装成特定定向(例如，核酸纳米结构)。

亲和特性

条形码(例如，随机条形码)可以包括一种或更多种亲和特性。例如，空间标记可以包括亲和特性。亲和特性可以包括可促进条形码与另一种实体(例如，细胞受体)结合的化学和/或生物部分。例如，亲和特性可以包括抗体，例如，对样品上的特定部分(例如，受体)有特异性的抗体。在一些实施方案中，抗体可以将条形码引导至特定细胞类型或分子。在特定细胞类型或分子处的和/或在特定细胞类型或分子附近的靶可以被标记(例如，随机地标记)。在一些实施方案中，因为抗体可以将条形码引导至特定位置，亲和特性可以提供除了空间标记的核苷酸序列之外的空间信息。抗体可以是治疗性抗体，例如单克隆抗体或多克隆抗体。抗体可以是人源化的或嵌合的。抗体可以是裸抗体(naked antibody)或融合抗体。

抗体可以是全长(即，天然存在的或通过正常免疫球蛋白基因片段重组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫活性(即，特异性结合)部分(如抗体片段)。

例如，抗体片段可以是抗体的一部分，诸如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv、sFv等。在一些实施方案中，抗体片段可以与由全长抗体识别的相同抗原结合。抗体片段可以包括由抗体的可变区组成的分离的片段，诸如由重链和轻链的可变区组成的“Fv”片段和其中轻链和重链的可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)。示例性抗体可以包括但不限于癌细胞抗体、病毒抗体、结合至细胞表面受体(CD8、CD34、CD45)的抗体，和治疗性抗体。

通用衔接子引物

条形码可以包含一种或更多种通用衔接子引物。例如，基因特异性条形码，诸如基因特异性随机条形码，可以包含通用衔接子引物。通用衔接子引物可以指跨越所有条形码通用的核苷酸序列。通用衔接子引物可以用于构建基因特异性条形码。通用衔接子引物的长度可以是以下，或是约以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个、30个，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是至少以下，或至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个、20个、21个、22个、23个、24个、25个、26个、27个、28个、29个或30个核苷酸。通用衔接子引物的长度可以是5-30个核苷酸。

接头

当条形码包含多于一种标记类型(例如，多于一种细胞标记或多于一种条形码序列，诸如一种分子标记)时，标记之间可以散布有接头标记序列。接头标记序列的长度可以是至少约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。接头标记序列的长度可以是至多约5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个核苷酸。在某些情况下，接头标记序列长度为12个核苷酸。接头标记序列可用于促进条形码的合成。接头标签可以包括纠错(例如汉明)码。

固体支持物

在一些实施方案中，本文公开的条形码，诸如随机条形码，可以与固体支持物关联。例如，固体支持物可以是合成颗粒。在一些实施方案中，固体支持物上的多于一种条形码(例如，第一多于一种条形码)的一些或所有条形码序列(诸如，随机条形码(例如，第一条形码序列)的分子标记)具有至少一个核苷酸的差异。相同固体支持物上的条形码的细胞标记可以是相同的。不同固体支持物上的条形码的细胞标记可以具有至少一个核苷酸的差异。例如，第一固体支持物上的第一多于一种条形码的第一细胞标记可以具有相同的序列，且第二固体支持物上的第二多于一种条形码的第二细胞标记可以具有相同的序列。第一固体支持物上的第一多于一种条形码的第一细胞标记和第二固体支持物上的第二多于一种条形码的第二细胞标记可以具有至少一个核苷酸的差异。细胞标记可以是例如约5-20个核苷酸长。条形码序列可以是例如约5-20个核苷酸长。合成颗粒可以例如是珠。

珠可以例如是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、交联葡聚糖/琼脂糖凝胶珠、珠状纤维素、聚苯乙烯珠或它们的任何组合。珠可以包括诸如以下的材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮或它们的任何组合。

在一些实施方案中，珠可以是用条形码或随机条形码官能化的聚合珠，例如可变形的珠或凝胶珠(诸如来自10X Genomics(San Francisco,CA)的凝胶珠)。在一些实施方式中，凝胶珠可以包括基于聚合物的凝胶。例如，凝胶珠可以通过将一种或更多种聚合物前体包封进液滴中来产生。在将聚合物前体暴露于促进剂(例如，四甲基乙二胺(TEMED))后，可以产生凝胶珠。

在一些实施方案中，颗粒可以是可破裂的(例如，可溶解或可降解的)。例如，聚合珠可以例如在所期望的条件下溶解、熔化或降解。所期望的条件可以包括环境条件。所期望的条件可导致聚合珠以受控方式溶解、熔化或降解。由于化学刺激物、物理刺激物、生物刺激物、热刺激物、磁刺激物、电刺激物、光刺激物或它们的任何组合，凝胶珠可以溶解、熔化或降解。

分析物和/或试剂(诸如寡核苷酸条形码)例如可以偶联/固定到凝胶珠的内表面(例如，经由寡核苷酸条形码和/或用于产生寡核苷酸条形码的材料的扩散而可及的内部)，和/或凝胶珠或本文描述的任何其他微囊的外表面。偶联/固定可以经由任何形式的化学键合(例如，共价键、离子键)或物理现象(例如，范德华力、偶极-偶极相互作用等)。在一些实施方案中，试剂与凝胶珠或本文描述的任何其他微囊的偶联/固定可以是可逆的，诸如，例如经由不稳定部分(例如，经由化学交联剂，包括本文描述的化学交联剂)。在施加刺激物后，不稳定部分可以被裂解并释放固定化的试剂。在一些实施方案中，不稳定部分是二硫键。例如，在经由二硫键将寡核苷酸条形码固定到凝胶珠的情况下，将二硫键暴露于还原剂可以将二硫键裂解并从珠释放寡核苷酸条形码。不稳定部分可以作为凝胶珠或微囊的一部分、作为将试剂或分析物与凝胶珠或微囊连接的化学接头的一部分，和/或作为试剂或分析物的一部分包括在内。在一些实施方案中，多于一种条形码中的至少一种条形码可固定在颗粒上、部分固定在颗粒上、包封在颗粒中、部分包封在颗粒中或它们的任何组合。

在一些实施方案中，凝胶珠可以包括广泛多种不同的聚合物，包括但不限于：聚合物、热敏聚合物、光敏聚合物、磁性聚合物、pH敏感聚合物、盐敏感聚合物、化学敏感聚合物、聚电解质、多糖、肽、蛋白质和/或塑料。聚合物可包括但不限于以下材料：诸如聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAAm)、聚(苯乙烯磺酸酯)(PSS)、聚(烯丙基胺)(PAAm)、聚(丙烯酸)(PAA)、聚(乙烯亚胺)(PEI)、聚(二烯丙基二甲基-氯化铵)(PDADMAC)、聚(吡咯)(PPy)、聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVPON)、聚(乙烯基吡啶)(PVP)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMAA)、聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)、聚苯乙烯(PS)、聚(四氢呋喃)(PTHF)、聚(邻苯二甲醛)(PPA)、聚(己基紫精)(PHV)、聚(L-赖氨酸)(PLL)、聚(L-精氨酸)(PARG)、聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)。

许多化学刺激物可用于触发珠的破坏、溶解或降解。这些化学改变的实例包括但不限于pH介导的珠壁改变、经由交联键的化学裂解使珠壁崩解、珠壁的触发解聚，和珠壁转换反应(bead wall switching reactions)。容量改变(bulk changes)也可用于触发珠的破坏。

通过各种刺激物对微囊的容量或物理变化在设计囊以释放试剂方面也提供了许多优点。在宏观尺度上发生容量或物理变化，其中珠破裂是由刺激物引起的机械-物理力的结果。这些过程可包括但不限于压力引起的破裂、珠壁熔化，或珠壁的孔隙率的改变。

生物刺激物也可用于触发珠的破坏、溶解或降解。通常，生物触发物类似于化学触发物，但是许多实例使用生物分子或生命***中常见的分子，诸如酶、肽、糖、脂肪酸、核酸等。例如，珠可包括具有肽交联的聚合物，所述肽交联对特定蛋白酶的裂解敏感。更具体地，一个实例可包括含有GFLGK肽交联的微囊。在添加生物触发物(诸如蛋白酶组织蛋白酶B)后，壳壁的肽交联被裂解且珠的内容物被释放。在其他情况下，蛋白酶可以是热激活的。在另一个实例中，珠包括含有纤维素的壳壁。水解酶壳聚糖的添加用作用于纤维素键的裂解、壳壁的解聚和其内部内容物的释放的生物触发物。

还可以在施加热刺激物后诱导珠释放其内容物。温度的变化可导致珠的各种变化。热量的变化可能导致珠的熔化，使得珠壁崩解。在其他情况下，热量可能增加珠的内部组分的内部压力，使得珠破裂或***。在仍然其他情况下，热量可以使珠转变成收缩的脱水状态。热量还可以作用于珠壁内的热敏聚合物，从而引起珠的破坏。

将磁性纳米颗粒包括在微囊的珠壁中可以允许珠的触发破裂以及在阵列中引导珠。本公开内容的装置可以包括用于任一目的的磁珠。在一个实例中，将Fe₃O₄纳米颗粒掺入含聚电解质的珠中在振荡磁场刺激物的存在下触发破裂。

珠也可能由于电刺激而破坏、溶解或降解。与先前部分中描述的磁性颗粒相似，电敏珠可以允许珠的触发破裂以及其他功能，诸如电场中的对准、电导或氧化还原反应。在一个实例中，含有电敏材料的珠在电场中对准，从而可以控制内部试剂的释放。在一些实例中，电场可以在珠壁本身内引起氧化还原反应，这可以增加孔隙率。

也可用光刺激物使珠破坏。许多光触发物是可能的，并可以包括使用各种分子(诸如能够吸收特定波长范围的光子的纳米颗粒和发色团)的***。例如，金属氧化物涂层可用作囊触发物。涂覆有SiO₂的聚电解质囊的UV照射可导致珠壁的崩解。在又另一个实例中，可以将可光转换的材料，诸如偶氮苯基团，掺入珠壁中。在施加UV或可见光后，诸如这些的化学物质在吸收光子后经历可逆的顺式-至-反式异构化。在此方面，包括光转换导致珠壁在施加光触发物后可崩解或变得更为多孔。

例如，在图2中图示的条形码化(例如，随机条形码化)的非限制性实例中，在框208处将细胞(诸如单细胞)引入微孔阵列的多于一个微孔之后，在框212处可以将珠引入微孔阵列的多于一个微孔。每个微孔可包含一个珠。珠可以包含多于一种条形码(例如，本文公开的多于一种寡核苷酸探针)。条形码可以包含附接到珠的5’胺区域。条形码可以包含通用标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶结合区或它们的任何组合。

本文公开的条形码(例如，本文公开的多于一种寡核苷酸探针)可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。与固体支持物关联的条形码可以各自包含选自包括以下的组的条形码序列：具有独特序列的至少100种或1000种条形码序列。在一些实施方案中，与固体支持物关联的不同条形码可以包括具有不同序列的条形码。在一些实施方案中，一定百分比的与固体支持物关联的条形码包含相同的细胞标记。例如，所述百分比可以是以下，或是约以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％、100％，或在这些值中的任何两个值之间的数字或范围。作为另一个实例，所述百分比可以是至少以下，或至多以下：60％、70％、80％、85％、90％、95％、97％、99％或100％。在一些实施方案中，与固体支持物关联的条形码可以具有相同的细胞标记。与不同固体支持物关联的条形码可以具有选自包括以下的组的不同的细胞标记：具有独特序列的至少100种或1000种细胞标记。

本文公开的条形码可以与固体支持物(例如，珠)关联(例如，附接)。在一些实施方案中，可以用包括与多于一种条形码关联的多于一个合成的颗粒的固体支持物对样品中的多于一种靶进行条形码化。在一些实施方案中，固体支持物可包括与多于一种条形码关联的多于一个合成的颗粒。不同固体支持物上的多于一种条形码的空间标记可以具有至少一个核苷酸的差异。固体支持物可以例如包括处于二维或三维的多于一种条形码。合成的颗粒可以是珠。珠可以是硅胶珠、可控孔径玻璃珠、磁珠、Dynabead、交联葡聚糖/琼脂糖凝胶珠、珠状纤维素、聚苯乙烯珠或它们的任何组合。固体支持物可包括聚合物、基质、水凝胶、针阵列装置、抗体或它们的任何组合。在一些实施方案中，固体支持物可以自由浮动。在一些实施方案中，固体支持物可嵌入半固体或固体阵列中。条形码可以不与固体支持物关联。条形码可以是单独的核苷酸。条形码可与基底关联。

如本文使用的，术语“拴系”、“附接”和“固定”可以互换使用，并且可以指用于将条形码附接至固体支持物的共价或非共价手段(means)。可以将各种不同的固体支持物中的任何一种用作固体支持物，以用于附接预先合成的条形码或用于条形码的原位固相合成。

在一些实施方案中，固体支持物是珠。珠可以包括一种或更多种类型的实心的、多孔的或空心的球体、球、承座、圆柱体或其他相似形状，其上可以固定核酸(例如，共价地或非共价地)。珠可以例如由塑料、陶瓷、金属、聚合物材料或它们的任何组合构成。珠可以是，或包括，球形的(例如，微球)或具有非球形或不规则形状的离散颗粒，所述形状是诸如立方体、长方体、锥体、圆柱体、圆锥体、椭圆形或圆盘形等。在一些实施方案中，珠的形状可以是非球形的。

珠可以包括各种材料，包括但不限于顺磁性材料(例如，镁、钼、锂和钽)、超顺磁性材料(例如，铁氧体(Fe₃O₄；磁铁矿)纳米颗粒)、铁磁材料(例如，铁、镍、钴，它们的一些合金，以及一些稀土金属化合物)、陶瓷、塑料、玻璃、聚苯乙烯、二氧化硅、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、胶乳、交联琼脂糖、琼脂糖、水凝胶、聚合物、纤维素、尼龙或它们的任何组合。

在一些实施方案中，珠(例如，标记所附接的珠)是水凝胶珠。在一些实施方案中，珠包括水凝胶。

本文公开的一些实施方案包括一个或更多个颗粒(例如，珠)。颗粒中的每一个可以包括多于一种寡核苷酸(例如，条形码)。多于一种寡核苷酸中的每一种可以包括条形码序列(例如，分子标记序列)、细胞标记和靶结合区(例如，寡聚(dT)序列、基因特异性序列、随机多聚体，或它们的组合)。多于一种寡核苷酸中的每一种的细胞标记序列可以是相同的。不同颗粒上的寡核苷酸的细胞标记序列可以是不同的，使得可以鉴定不同颗粒上的寡核苷酸。在不同实施方式中，不同细胞标记序列的数量可以是不同的。在一些实施方案中，细胞标记序列的数量可以是以下，或是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹，在这些值中的任何两个值之间的数字或范围，或更多。在一些实施方案中，细胞标记序列的数量可以是至少以下，或至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹。在一些实施方案中，多于一个颗粒中不超过1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种或更多种包括具有相同细胞序列的寡核苷酸。在一些实施方案中，包括具有相同细胞序列的寡核苷酸的多于一个颗粒可以是至多0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％或更多。在一些实施方案中，多于一个颗粒中没有一个具有相同的细胞标记序列。

每个颗粒上的多于一种寡核苷酸可以包含不同的条形码序列(例如，分子标记)。在一些实施方案中，条形码序列的数量可以是以下，或是约以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，条形码序列的数量可以是至少以下，或至多以下：10、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000、20000、30000、40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、10⁶、10⁷、10⁸或10⁹。例如，多于一种寡核苷酸中的至少100种包含不同的条形码序列。作为另一个实例，在单个颗粒中，多于一种寡核苷酸中的至少100种、500种、1000种、5000种、10000种、15000种、20000种、50000种，这些值的任何两个之间的数字或范围，或更多种包含不同的条形码序列。一些实施方案提供了包含条形码的多于一个颗粒。在一些实施方案中，待标记的靶和不同条形码序列的出现(或拷贝或数量)的比率可以是至少1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14、1:15、1:16、1:17、1:18、1:19、1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70、1:80、1:90或更多。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸中的每一种还包含样品标记、通用标记，或两者。颗粒可以是例如纳米颗粒或微颗粒。

珠的尺寸可以变化。例如，珠的直径的范围可以是0.1微米至50微米。在一些实施方案中，珠的直径可以是以下，或是约以下：0.1微米、0.5微米、1微米、2微米、3微米、4微米、5微米、6微米、7微米、8微米、9微米、10微米、20微米、30微米、40微米、50微米，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。

珠的直径可以与基底的孔的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围，或比孔的直径长或短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。珠的直径可以与细胞(例如，被基质的孔截留的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比孔的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。珠的直径可以与细胞(例如，被基质的孔截留的单细胞)的直径相关。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围，或比细胞的直径长或短约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％、300％或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。在一些实施方案中，珠的直径可以比细胞的直径长或短至少或至多10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、150％、200％、250％或300％。

珠可以附接到和/或嵌入到基底中。珠可以附接到和/或嵌入到凝胶、水凝胶、聚合物和/或基质中。珠在基底(例如，凝胶、基质、支架或聚合物)中的空间位置可以使用珠上的条形码上存在的可以用作位置地址的空间标签来鉴定。

珠的实例包括但不限于链霉抗生物素蛋白珠、琼脂糖珠、磁珠、

微珠、抗体缀合珠(例如，抗免疫球蛋白微珠)、蛋白A缀合珠、蛋白G缀合珠、蛋白A/G缀合珠、蛋白L缀合珠、寡聚(dT)缀合珠、二氧化硅珠、二氧化硅样珠、抗生物素微珠、抗荧光染料微珠和BcMag^TM羧基封端磁珠。

珠可以与量子点或荧光染料关联(例如，用量子点或荧光染料浸渍)，以使其在一个荧光光学通道或多个光学通道中发荧光。珠可以与氧化铁或氧化铬关联，以使其为顺磁性或铁磁性。珠是可鉴定的。例如，可以使用照相机对珠进行成像。珠可以具有与珠关联的可检测编码。例如，珠可包含条形码。例如，由于在有机或无机溶液中的膨胀，珠可以改变尺寸。珠可以是疏水的。珠可以是亲水的。珠可以是生物相容的。

固体支持物(例如珠)可以被可视化。固体支持物可以包含可视化标签(例如，荧光染料)。固体支持物(例如珠)可以用标识符(例如数字)蚀刻。标识符可以通过对珠进行成像而可视化。

固体支持物可以包含可溶性、半溶性或不溶性物质。当固体支持物包括与其连接的接头、支架、构建单元(building block)或其他反应性部分时，固体支持物可以被称为“官能化的”，而当固体支持物缺少这样的与其连接的反应性部分时，固体支持物可以被称为“非官能化的”。固体支持物可以在溶液中自由使用，诸如在微量滴定孔形式中；在流通形式中，诸如在列中；或者在浸量尺(dipstick)中。

固体支持物可以包括膜、纸、塑料、涂层表面、平坦表面、玻璃、载玻片、芯片或它们的任何组合。固体支持物可以采取树脂、凝胶、微球或其他几何形状的形式。固体支持物可以包括二氧化硅芯片、微粒、纳米颗粒、板、阵列、毛细管、平坦支持物诸如玻璃纤维过滤器、玻璃表面、金属表面(钢、金、银、铝、硅和铜)、玻璃支持物、塑料支持物、硅支持物、芯片、过滤器、膜、微孔板、载玻片、塑料材料，包括多孔板或膜(例如由聚乙烯、聚丙烯、聚酰胺、聚偏二氟乙烯形成的)，和/或晶片(wafers)、梳、针(pins)或针头(needles)(例如适于组合合成或分析的针阵列)，或平坦表面诸如晶片(例如硅晶片)的凹点(pit)或纳升孔的阵列中的珠，具有带有或不带有过滤器底的凹点的晶片。

固体支持物可以包含聚合物基质(例如，凝胶、水凝胶)。聚合物基质可能能够渗透细胞内空间(例如，细胞器周围)。聚合物基质可能能够被泵送到整个循环***。

基底和微孔阵列

如本文使用的，基底可以指一种类型的固体支持物。基底可以指可包含本公开内容的条形码或随机条形码的固体支持物。例如，基底可以包括多于一个微孔。例如，基底可以是包括两个或更多个微孔的孔阵列。在一些实施方案中，微孔可以包括限定体积的小反应室。在一些实施方案中，微孔可以截留一个或更多个细胞。在一些实施方案中，微孔仅能截留一个细胞。在一些实施方案中，微孔可以截留一种或更多种固体支持物。在一些实施方案中，微孔仅能截留一种固体支持物。在一些实施方案中，微孔截留单细胞和单个固体支持物(例如珠)。微孔可以包含本公开内容的条形码试剂。

条形码化的方法

本公开内容提供了用于估计身体样品(例如，组织、器官、肿瘤、细胞)中的不同位置处的不同靶的数量的方法。所述方法可以包括将条形码(例如，随机条形码)靠近样品放置，裂解样品，将不同靶与条形码关联，对靶进行扩增和/或对靶进行数字计数。所述方法还可以包括对从条形码上的空间标记获得的信息进行分析和/或可视化。在一些实施方案中，所述方法包括使样品中的多于一种靶可视化。将多于一种靶映射到样品的地图上可以包括生成样品的二维地图或三维地图。可以在对样品中的多于一种靶进行条形码化(例如，随机条形码化)之前或之后生成二维地图和三维地图。使样品中的多于一种靶可视化可以包括将多于一种靶映射到样品的地图上。将多于一种靶映射到样品的地图上可以包括生成样品的二维地图或三维地图。可以在对样品中的多于一种靶进行条形码化之前或之后生成二维地图和三维地图。在一些实施方案中，可以在裂解样品之前或之后生成二维地图和三维地图。在生成二维地图或三维地图之前或之后裂解样品可以包括加热样品、使样品与去污剂接触、改变样品的pH或它们的任何组合。

在一些实施方案中，对多于一种靶进行条形码化包括使多于一种条形码与多于一种靶杂交以产生条形码化靶(例如，随机条形码化靶)。对多于一种靶进行条形码化可以包括生成条形码化靶的索引文库。生成条形码化靶的索引文库可以用包含多于一种条形码(例如，随机条形码)的固体支持物进行。

使样品和条形码接触

本公开内容提供了用于使样品(例如，细胞)与本公开内容的基底接触的方法。例如，样品可以包括器官、组织、组织薄片、单细胞、单细胞的裂解物、多于一种细胞、多于一种细胞的裂解物、组织样品、组织样品的裂解物或其组合。在一些实施方案中，样品是单细胞，或单细胞的裂解物或衍生物。在一些实施方案中，样品包含单细胞的核酸内容物。在一些实施方案中，样品可以接触条形码(例如，随机条形码)。例如，通过重力流可以接触所述细胞，其中可以使所述细胞沉淀并且产生单层。样品可以是组织薄切片。可以将薄切片置于基底上。样品可以是一维的(例如，形成平坦表面)。样品(例如，细胞)可以散布于基底上，例如，通过在基底上生长/培养所述细胞。

当条形码靠近靶时，靶可以与条形码杂交。条形码可以按不可耗尽的比率接触，使得每种不同的靶可以与本公开内容的不同条形码关联。为了确保靶与条形码之间的有效关联，可以将靶与条形码交联。

细胞裂解

在细胞和条形码的分布之后，可以裂解细胞以释放靶分子。细胞裂解可以通过各种手段中的任何一种来完成，例如通过化学或生物化学手段，通过渗透冲击，或通过热裂解、机械裂解或光学裂解的手段。可以通过添加包含去污剂(例如，SDS、十二烷基硫酸锂、TritonX-100、吐温-20或NP-40)的细胞裂解缓冲液、有机溶剂(例如甲醇或丙酮)或消化酶(例如蛋白酶K、胃蛋白酶或胰蛋白酶)或它们的任何组合来裂解细胞。为了增加靶和条形码的关联，可通过例如降低裂解物的温度和/或增加裂解物的粘度来改变靶分子的扩散速率。

在一些实施方案中，样品可以使用滤纸裂解。滤纸可以用滤纸之上的裂解缓冲液浸泡。滤纸可以用压力施加到样品上，该压力可以促进样品的裂解和样品的靶与基底的杂交。

在一些实施方案中，裂解可以通过机械裂解、热裂解、光学裂解和/或化学裂解进行。化学裂解可以包括使用消化酶，诸如蛋白酶K、胃蛋白酶和胰蛋白酶。裂解可以通过将裂解缓冲液添加到基底来进行。裂解缓冲液可以包含Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至少约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含至多约0.01M、0.05M、0.1M、0.5M或1M或更多的Tris HCl。裂解缓冲液可以包含约0.1M Tris HCl。裂解缓冲液的pH可以是至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。裂解缓冲液的pH可以是至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液的pH为约7.5。裂解缓冲液可以包含盐(例如LiCl)。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至少约0.1、0.5或1M或更高。裂解缓冲液中的盐浓度可以是至多约0.1、0.5或1M或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中的盐浓度为约0.5M。裂解缓冲液可以包含去污剂(例如SDS、十二烷基硫酸锂、tritonX、吐温、NP-40)。裂解缓冲液中去污剂的浓度可以是至少约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更多。裂解缓冲液中去污剂的浓度可以是至多约0.0001％、0.0005％、0.001％、0.005％、0.01％、0.05％、0.1％、0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％或7％或更多。在一些实施方案中，裂解缓冲液中去污剂的浓度为约1％的十二烷基硫酸锂。裂解方法中使用的时间可以取决于使用的去污剂的量。在一些实施方案中，使用的去污剂越多，裂解所需的时间越少。裂解缓冲液可以包含螯合剂(例如，EDTA、EGTA)。裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。裂解缓冲液中螯合剂的浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM或30mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中螯合剂的浓度是约10mM。裂解缓冲液可以包含还原剂(例如，β-巯基乙醇、DTT)。裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至少约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。裂解缓冲液中还原剂的浓度可以是至多约1mM、5mM、10mM、15mM或20mM或更高。在一些实施方案中，裂解缓冲液中还原试剂的浓度是约5mM。在一些实施方案中，裂解缓冲液可以包含约0.1M TrisHCl，约pH 7.5、约0.5M LiCl、约1％十二烷基硫酸锂、约10mM EDTA和约5mM DTT。

裂解可以在约4℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的温度进行。裂解可以进行约1分钟、5分钟、10分钟、15分钟或20分钟或更长时间。裂解的细胞可以包括至少约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。裂解的细胞可以包括至多约100000个、200000个、300000个、400000个、500000个、600000个或700000个或更多个靶核酸分子。

将条形码附接至靶核酸分子

在细胞裂解和核酸分子从细胞释放之后，核酸分子可以随机地与共定位的固体支持物的条形码关联。关联可以包括使条形码的靶识别区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，条形码的寡聚(dT)可以与靶的多(A)尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定杂交体。在一些实施方案中，从裂解的细胞释放的核酸分子可以与基底上的多于一个探针关联(例如，与基底上的探针杂交)。当探针包括寡聚(dT)时，mRNA分子可以与探针杂交，并且进行逆转录。寡核苷酸的寡聚(dT)部分可以充当用于cDNA分子的第一链合成的引物。例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框216处，mRNA分子可以与珠上的条形码杂交。例如，单链的核苷酸片段可以与条形码的靶结合区杂交。

附接还可以包括将条形码的靶识别区与靶核酸分子的一部分连接。例如，靶结合区可以包括可能能够与限制性位点突出端(例如，EcoRI粘性末端突出端)进行特异性杂交的核酸序列。测定程序还可以包括用限制性酶(例如，EcoRI)处理靶核酸以产生限制性位点突出端。然后条形码可以连接到包括与限制性位点突出端互补的序列的任何核酸分子。连接酶(例如，T4DNA连接酶)可以用于连接两个片段。

例如，在图2中图示的条形码化的非限制性实例中，在框220处，来自多于一个细胞(或多于一个样品)的经标记的靶(例如，靶-条形码分子)可以随后被汇集，例如汇集至管中。经标记的靶可以通过例如将条形码和/或附接靶-条形码分子的珠取回(retrieving)来汇集。

附接的靶-条形码分子的基于固体支持物的集合的取回可以通过使用磁珠和外部施加的磁场来实施。在所述靶-条形码分子已经汇集后，所有进一步的处理可以在单个反应容器中进行。进一步的处理可以包括例如逆转录反应、扩增反应、裂解反应、解离反应和/或核酸延伸反应。进一步的处理反应可以在微孔内进行，即，不首先汇集来自多于一个细胞的经标记的靶核酸分子。

逆转录

本公开内容提供了使用逆转录来产生靶-条形码缀合物的方法(在图2的框224处)。靶-条形码缀合物可以包括条形码以及靶核酸(即，条形码化cDNA分子，诸如随机条形码化cDNA分子)的全部或一部分的互补序列。关联的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物连同逆转录酶一起而发生。逆转录引物可以是寡聚(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。寡聚(dT)引物的长度可以是12-18个核苷酸，或可以是约12-18个核苷酸，并与哺乳动物mRNA的3’末端处的内源性多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在多个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。

在一些实施方案中，标记的RNA分子的逆转录可以通过添加逆转录引物而发生。在一些实施方案中，所述逆转录引物是寡聚(dT)引物、随机六核苷酸引物或靶特异性寡核苷酸引物。通常，寡聚(dT)引物的长度为12-18个核苷酸，并与哺乳动物mRNA的3’末端处的内源性多(A)尾结合。随机六核苷酸引物可以在多个互补位点处与mRNA结合。靶特异性寡核苷酸引物通常选择性地引发感兴趣的mRNA。

逆转录可以重复地发生以产生多个经标记的cDNA分子。本文公开的方法可以包括进行至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个逆转录反应。该方法可以包括进行至少约25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个逆转录反应。

扩增

可以进行一个或更多个核酸扩增反应(例如，在图2的框228处)以产生经标记的靶核酸分子的多个拷贝。扩增可以以多重方式(in a multiplexed manner)进行，其中多种靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可用于将测序衔接子添加至核酸分子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶核酸，或它们的组合的至少一部分。扩增反应可以包括扩增多于一个核酸的0.5％、1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、100％，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围。所述方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或条形码序列(例如，分子标记)的靶-条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。

在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，PCR可以指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR可以包括所述反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和组装PCR。

经标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增(circle-to-circle amplification)。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性核酸内切酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些实施方案中，扩增不产生环化转录物。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对经标记的核酸(例如，经标记的RNA、经标记的DNA、经标记的cDNA)进行聚合酶链式反应以产生经标记的扩增子(例如，经随机标记的扩增子)。所述经标记的扩增子可以是双链分子。双链分子可以包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或条形码序列(例如，分子标记)。所述经标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或它们的组合。单链分子可以包括DNA、RNA或它们的组合。扩增可以包括使用一个或更多个非天然核苷酸。

扩增可以包括使用一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括例如，1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一个或更多个引物可以包括至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。一种或更多种引物可以包括少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的靶(例如，随机标记的靶)的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的靶的3’末端和/或5’末端。一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的靶的内部区域。内部区域可以与多于一种经标记的靶的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。

一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、条形码序列(例如，分子标记)、靶或它们的任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计用于扩增一种或更多种靶。靶可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。靶可以包括一个或更多个样品中总的经标记的靶的子集。一种或更多种引物可以包括至少96种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少960种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少9600种或更多种定制引物。一种或更多种定制引物可以退火至两种或更多种不同的经标记的核酸。两种或更多种不同的经标记的核酸可以对应于一个或更多个基因。

可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一个方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增附接至珠的分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物，和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物转变为Illumina测序文库。使用150bp x 2测序进行测序可以揭示读段(read)1上的细胞标记和条形码序列(例如，分子标记)、读段2上的基因，以及索引1读段上的样品索引。

在一些实施方案中，核酸可以使用化学裂解从基底去除。例如，存在于核酸中的化学基团或经修饰的碱基可以用于促进将其从固体支持物去除。例如，酶可以用于将核酸从基底去除。例如，核酸可以通过限制性核酸内切酶消化从基底去除。例如，使用尿嘧啶-d-糖基化酶(UDG)处理含有dUTP或ddUTP的核酸可以将核酸从基底去除。例如，核酸可以使用进行核苷酸切除的酶(诸如，碱基切除修复酶，诸如无嘌呤/无嘧啶(AP)核酸内切酶)将核酸从基底去除。在一些实施方案中，核酸可以使用可光裂解(photocleavable)基团以及光从基底去除。在一些实施方案中，可以使用可裂解接头将核酸从基底去除。例如，可裂解接头可以包括以下中的至少一种：生物素/亲和素、生物素/链霉抗生物素蛋白、生物素/中性链亲和素(neutravidin)、Ig蛋白A、光不稳定性接头、酸或碱不稳定性接头基团，或适体。

当探针是基因特异性时，可以使分子与探针杂交，并且进行逆转录和/或扩增。在一些实施方案中，在核酸已经合成(例如，逆转录)之后，可以将其扩增。扩增可以以多重方式进行，其中多种靶核酸序列同时进行扩增。扩增可以将测序衔接子添加至核酸。

在一些实施方案中，可以例如用桥式扩增在基底上进行扩增。可以对cDNA加同聚物尾，以便产生相容末端，用于使用基底上的寡聚(dT)探针进行桥式扩增。在桥式扩增中，与模板核酸的3’末端互补的引物可以是共价附接到固体颗粒的每对引物的第一引物。当含有模板核酸的样品与颗粒接触并进行单个热循环时，可以使模板分子退火至第一引物，并且第一引物通过添加核苷酸而在正向方向上延伸以形成双链体分子，所述双链体分子由模板分子和与模板互补的新形成的DNA链组成。在下一循环的加热步骤中，可以使双链体分子变性，从颗粒释放模板分子，并通过第一引物将互补DNA链附接到颗粒。在随后的退火和延伸步骤的退火阶段中，互补链可以与第二引物杂交，所述第二引物在从第一引物去除的位置处与互补链的区段(segment)互补。这种杂交可以导致互补链在第一引物和第二引物之间形成桥，所述桥通过共价键固定到第一引物并通过杂交固定到第二引物。在延伸阶段，通过在相同的反应混合物中添加核苷酸，第二引物可以在反向方向上延伸，从而将桥转化为双链桥。然后开始下一个循环，并且可以使双链桥变性以产生两个单链核酸分子，每个单链核酸分子的一个末端分别经第一引物和第二引物附接到颗粒表面，其中每个单链核酸分子的另一个末端是未附接的。在该第二个循环的退火和延伸步骤中，每条链可以在相同的颗粒上与先前未使用的另外的互补引物杂交，以形成新的单链桥。使现在杂交的两个先前未使用的引物延伸，以将两个新桥转换成双链桥。

扩增反应可包括扩增多于一种核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。

对经标记的核酸的扩增可以包括基于PCR的方法或非基于PCR的方法。对经标记的核酸的扩增可以包括对经标记的核酸的指数式扩增。对经标记的核酸的扩增可以包括对经标记的核酸的线性扩增。扩增可以通过聚合酶链式反应(PCR)进行。PCR可以指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。PCR可涵盖所述反应的派生形式，包括但不限于，RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR、阻抑PCR、半阻抑PCR和组装PCR。

在一些实施方案中，对经标记的核酸的扩增包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)、Qβ复制酶(Qβ)、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性核酸内切酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体在延伸反应和扩增之前裂解的扩增方法、使用缺乏5’核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和/或分支延伸扩增(RAM)。

在一些实施方案中，本文公开的方法还包括对扩增的扩增子(例如，靶)进行巢式聚合酶链式反应。扩增子可以是双链分子。双链分子可以包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标签或分子标识符标记。可替代地，扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或它们的组合。本发明的核酸可以包括合成的或改变的核酸。

在一些实施方案中，所述方法包括反复扩增经标记的核酸以产生多种扩增子。本文公开的方法可以包括进行至少约1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个、15个、16个、17个、18个、19个或20个扩增反应。可替代地，所述方法包括进行至少约25个、30个、35个、40个、45个、50个、55个、60个、65个、70个、75个、80个、85个、90个、95个或100个扩增反应。

扩增还可以包括将一个或更多个对照核酸添加至一个或更多个包括多于一个核酸的样品中。扩增还可以包括将一个或更多个对照核酸添加至多于一个核酸中。对照核酸可以包括对照标记。

扩增可以包括使用一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定和/或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。一种或更多种引物可以包括一种或更多种寡核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包括至少约7-9个核苷酸。一种或更多种寡核苷酸可以包括少于12-15个核苷酸。一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的核酸的至少一部分。一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的核酸的3’末端和/或5’末端。一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的核酸的内部区域。内部区域可以与多于一种经标记的核酸的3’末端距离至少约50个、100个、150个、200个、220个、230个、240个、250个、260个、270个、280个、290个、300个、310个、320个、330个、340个、350个、360个、370个、380个、390个、400个、410个、420个、430个、440个、450个、460个、470个、480个、490个、500个、510个、520个、530个、540个、550个、560个、570个、580个、590个、600个、650个、700个、750个、800个、850个、900个或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种看家基因引物。一种或更多种引物可以包括通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标签、第二样品标签、分子标识符标记、核酸或它们的产物。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。定制引物可以被设计成扩增一种或更多种靶核酸。靶核酸可以包括一个或更多个样品中总核酸的子集。在一些实施方案中，引物是附接到本公开内容的阵列的探针。

在一些实施方案中，使样品中的多于一种靶条形码化(例如，随机条形码化)还包括生成条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库或所述靶的条形码化片段的索引文库。不同条形码的条形码序列(例如，不同的随机条形码的分子标记)可以彼此不同。生成条形码化靶的索引文库包括从样品中的多于一种靶生成多于一种索引多核苷酸。例如，对于包括第一索引靶和第二索引靶的条形码化靶的索引文库，第一索引多核苷酸的标记区与第二索引多核苷酸的标记区可以具有以下，具有约以下，具有至少以下，或具有至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个核苷酸的差异，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸的差异。在一些实施方案中，生成条形码化靶的索引文库包括使多于一种靶(例如mRNA分子)与包括多(T)区和标记区的多于一种寡核苷酸接触；以及使用逆转录酶进行第一链合成以产生各自包含cDNA区和标记区的单链标记的cDNA分子，其中多于一种靶包括不同序列的至少两种mRNA分子，且多于一种寡核苷酸包括不同序列的至少两种寡核苷酸。生成条形码化靶的索引文库还可以包括扩增单链标记的cDNA分子以产生双链标记的cDNA分子；以及对双链标记的cDNA分子进行巢式PCR以产生标记的扩增子。在一些实施方案中，所述方法可以包括产生衔接子标记的扩增子。

条形码化(例如，随机条形码化)可以包括使用核酸条形码或标签以对单种核酸(例如，DNA或RNA)分子进行标记。在一些实施方案中，其涉及将DNA条形码或标签添加至cDNA分子，因为cDNA分子是从mRNA产生的。可以进行巢式PCR以使PCR扩增偏倚最小化。可以使用例如下一代测序(NGS)添加衔接子，用于测序。例如在图2的框232处，可以使用测序结果以确定靶的一个或更多个拷贝的细胞标记、分子标记，和核苷酸片段的序列。

图3是示出了生成条形码化靶(例如，随机条形码化靶)的索引文库，诸如条形码化mRNA或其片段的索引文库的非限制性示例性方法的示意图。如步骤1中示出的，逆转录过程可以编码具有独特的分子标记序列、细胞标记序列和通用PCR位点的每个mRNA分子。特别地，通过使一组条形码(例如，随机条形码)310与RNA分子302的多(A)尾区308杂交(例如，随机杂交)，可以将RNA分子302逆转录以产生经标记的cDNA分子304(包括cDNA区306)。条形码310中的每一种可以包含靶结合区，例如多(dT)区312、标记区314(例如，条形码序列或分子)和通用PCR区316。

在一些实施方案中，细胞标记序列可以包括3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，分子标记序列可以包括3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，多于一种随机条形码中的每种还包含通用标记和细胞标记中的一种或更多种，其中固体支持物上的多于一种随机条形码的通用标记是相同的，并且固体支持物上的多于一种随机条形码的细胞标记是相同的。在一些实施方案中，通用标记可以包括3个至20个核苷酸。在一些实施方案中，细胞标记包括3个至20个核苷酸。

在一些实施方案中，标记区314可以包括条形码序列或分子标记318和细胞标记320。在一些实施方案中，标记区314可以包括通用标记、维度标记和细胞标记中的一种或更多种。条形码序列或分子标记318的长度可以是以下，可以是约以下，可以是至少以下，或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。细胞标记320的长度可以是以下，可以是约以下，可以是至少以下，或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。通用标记的长度可以是以下，可以是约以下，可以是至少以下，或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。固体支持物上的多于一种随机条形码的通用标记可以是相同的，并且固体支持物上的多于一种随机条形码的细胞标记是相同的。维度标记的长度可以是以下，可以是约以下，可以是至少以下，或可以是至多以下：1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、20个、30个、40个、50个、60个、70个、80个、90个、100个，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。

在一些实施方案中，标记区314可以包括以下，包括约以下，包括至少以下，或包括至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同标记，诸如条形码序列或分子标记318和细胞标记320。每种标记的长度可以是以下，可以是约以下，可以是至少以下，或可以是至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的核苷酸。一组条形码或随机条形码310可以含有以下，含有约以下，含有至少以下，或可以是至多以下：10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10²⁰种，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的条形码或随机条形码310。并且一组条形码或随机条形码310可以例如，各自含有独特标记区314。经标记的cDNA分子304可以进行纯化以去除过量条形码或随机条形码310。纯化可以包括Ampure珠纯化。

如步骤2中示出的，来自步骤1中的逆转录过程的产物可以汇集至1支管中，并且用第1PCR引物池和第1通用PCR引物进行PCR扩增。由于独特标记区314，汇集是可能的。特别地，可以将经标记的cDNA分子304扩增以产生巢式PCR标记的扩增子322。扩增可以包括多重PCR扩增。扩增可以包括在单一反应体积中用96种多重引物进行的多重PCR扩增。在一些实施方案中，在单一反应体积中，多重PCR扩增可以利用以下，利用约以下，利用至少以下，或利用至多以下：10种、20种、40种、50种、70种、80种、90种、10²种、10³种、10⁴种、10⁵种、10⁶种、10⁷种、10⁸种、10⁹种、10¹⁰种、10¹¹种、10¹²种、10¹³种、10¹⁴种、10¹⁵种、10²⁰种，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的多重引物。扩增可以包括使用包括靶向特异性基因的定制引物326A-C的第1PCR引物池324和通用引物328。定制引物326可以与经标记的cDNA分子304的cDNA部分306’内的区域杂交。通用引物328可以与经标记的cDNA分子304的通用PCR区域316杂交。

如图3的步骤3中示出的，来自步骤2中的PCR扩增的产物可以用巢式PCR引物池和第2通用PCR引物进行扩增。巢式PCR可以使PCR扩增偏倚最小化。例如，巢式PCR标记的扩增子322可以通过巢式PCR进行进一步扩增。巢式PCR可以包括在单个反应体积中用巢式PCR引物332a-c的巢式PCR引物池330和第2通用PCR引物328’进行的多重PCR。巢式PCR引物池330可以含有以下，含有约以下，含有至少以下，或含有至多以下：1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种、20种、30种、40种、50种、60种、70种、80种、90种、100种、200种、300种、400种、500种、600种、700种、800种、900种、1000种，或这些值中的任何两个值之间的数字或范围的不同巢式PCR引物332。巢式PCR引物332可以含有衔接子334，并与经标记的扩增子322的cDNA部分306”内的区域杂交。通用引物328’可以含有衔接子336，并与经标记的扩增子322的通用PCR区316杂交。因此，步骤3产生衔接子标记的扩增子338。在一些实施方案中，巢式PCR引物332和第2通用PCR引物328’可以不含有衔接子334和336。相反，衔接子334和336可以连接到巢式PCR的产物以产生衔接子标记的扩增子338。

如步骤4中示出的，来自步骤3的PCR产物可以使用文库扩增引物进行PCR扩增用于测序。特别地，衔接子334和336可以用于对衔接子标记的扩增子338进行一个或更多个另外的测定。衔接子334和336可以与引物340和342杂交。一种或更多种引物340和342可以是PCR扩增引物。一种或更多种引物340和342可以是测序引物。一种或更多种衔接子334和336可以用于衔接子标记的扩增子338的进一步扩增。一种或更多种衔接子334和336可以用于对衔接子标记的扩增子338进行测序。引物342可以含有板索引344，使得使用同一组条形码或随机条形码310产生的扩增子可以在一轮测序反应中使用下一代测序(NGS)进行测序。

用于选择性扩增和/或延伸的方法和组合物

感兴趣的靶或靶种类(诸如感兴趣的寡核苷酸或寡核苷酸种类)的单细胞实验可能受到不感兴趣的靶或靶种类(诸如不感兴趣的寡核苷酸或寡核苷酸种类，在本文中也称为不期望的或不希望的寡核苷酸或寡核苷酸种类)的存在或高丰度的阻碍。例如，单细胞分析，诸如单细胞全转录组分析(WTA)，可能会受到不感兴趣的基因(在本文中也称为不期望或不希望的基因)诸如看家基因(例如核糖体蛋白的mRNA和线粒体mRNA)的存在或高丰度的阻碍。在外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)的全转录组分析中，高达40％的测序读段可以是这些基因的读段(参见图4A-图4B)。

图5显示从感兴趣的mRNA和看家mRNA非限制性示例性产生cDNA。如图5所示，细胞捕获珠500与多于一种寡核苷酸探针508相关联，并与包含核酸靶分子或mRNA 504和不期望的分子或mRNA种类512的样品或细胞接触。寡核苷酸探针508的多(T)序列与靶分子504的多(A)尾和不期望的分子512的多(A)尾杂交，以允许逆转录。如果不期望的分子512在样品或细胞中具有高丰度，则为样品获得的测序读段可以具有高丰度的不期望的分子512。

作为另一个实例，在使用寡核苷酸相关或缀合的细胞结合试剂(例如，寡核苷酸缀合的抗体(本文中称为“AbO”)或蛋白质结合试剂)来获得组学信息(例如，基因组学、染色质可及性(chromatin accessibility)、甲基组学、转录组学和蛋白质组学信息)的单细胞实验中，例如，在样品制备、测序文库制备和/或测序数据中这种寡核苷酸(例如，样品索引寡核苷酸)的高丰度可能阻碍组学分析。样品的细胞可以用与样品索引寡核苷酸缀合的抗体来标记，所述样品索引寡核苷酸具有相同样品索引序列。在测序数据中，这样的样品索引序列与细胞的关联可用于鉴定来自样品的细胞。这种样品鉴定或追踪可以是定性的，因此可能不期望测序数据中与细胞相关的样品索引序列的高丰度。在US2018/0088112和2018/0346970中描述了使用寡核苷酸相关的细胞结合试剂进行蛋白质组分析以及样品鉴定和追踪的分析；每个出版物的内容通过引用以其整体并入本文。

本文公开了减少或最小化不感兴趣的这些寡核苷酸(例如，不期望的基因)的存在或丰度的***、方法、组合物和试剂盒。在一些实施方案中，在文库制备步骤中，测序文库中不感兴趣的基因被减少、最小化或耗尽。例如，在RNA捕获和全转录组PCR后，测序数据中编码核糖体蛋白的mRNA的读段或线粒体mRNA可以减少。在一些实施方案中，在单细胞样品制备的开始步骤中不感兴趣的基因的捕获被减少、最小化或耗尽，使得酶和/或引物可以用于感兴趣的靶的单细胞分析。在一些实施方案中，寡核苷酸夹可用于阻止看家基因的cDNA合成。

本文公开的一些实施方案提供了选择性扩增和/或延伸样品中多于一种核酸靶分子的方法和组合物。该方法和组合物可以例如减少样品中不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，允许选择性去除样品中不期望的核酸种类，或者二者。在一些实施方案中，选择性扩增和/或延伸的方法可以包括获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的样品；将封闭寡核苷酸与样品接触，其中封闭寡核苷酸特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种；将多于一种寡核苷酸探针与样品接触，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和能够与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的靶结合区；以及延伸与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸探针，以产生多于一种延伸产物；由此一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的延伸被封闭寡核苷酸减少。

在一些实施方案中，该方法可以包括扩增多于一种延伸产物以产生多于一种扩增子，例如多于一种延伸产物的PCR扩增。

例如，样品可以包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类。一种或更多种不期望的核酸种类可以以不同的量存在于样品中。例如，一种或更多种不期望的核酸种类可占样品中核酸含量的约以下或至少约以下：5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多、或100％、或这些值中的两个之间的范围。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占样品核酸含量的至少约40％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占样品核酸含量的至少约50％。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类占样品核酸含量的至少约80％。不期望的核酸种类可以是或可以包括各种类型的核酸分子。例如，一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种可以是核糖体蛋白mRNA、线粒体mRNA、基因组DNA、内含子序列、高丰度序列或其组合。在一些实施方案中，不期望的核酸种类是或包含mRNA种类。mRNA种类可以是，例如，看家基因的mRNA种类、核糖体基因的mRNA种类、线粒体基因的mRNA种类、高丰度基因的mRNA种类中的一种或更多种或其任何组合。在一些实施方案中，不期望的核酸种类是或包括DNA种类。DNA种类可以是例如看家基因的DNA种类、核糖体基因的DNA种类、线粒体基因的DNA种类、高丰度基因的DNA种类中的一种或更多种或其任何组合。在一些实施方案中，不期望的核酸种类是或包括DNA种类和RNA种类。

封闭寡核苷酸可以在多于一种寡核苷酸探针与样品接触之前、同时或之后与样品接触。在一些实施方案中，与样品中的多于一种核酸靶分子相比，该方法可以显著减少一种或更多种不期望的核酸种类(例如，看家基因、样品索引寡核苷酸等)的扩增、延伸或二者。在一些实施方案中，获得样品包括获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的第二样品，并且其中使封闭寡核苷酸与样品接触包括使封闭寡核苷酸与第二样品接触，并且其中使多于一种寡核苷酸探针与样品接触包括使多于一种寡核苷酸探针与第二样品接触。在一些实施方案中，该方法包括在使多于一种寡核苷酸探针与样品接触之后并且在延伸与多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸之前，汇集样品和第二样品。汇集样品和第二样品可以在使封闭寡核苷酸与样品和第二样品接触之前、同时或之后。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸在多于一种寡核苷酸探针与样品接触时与样品接触。

封闭寡核苷酸可以本身以离散的实体存在，或者是多于一种寡核苷酸探针之一的一部分。例如，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种可以包含封闭寡核苷酸。多于一种寡核苷酸探针中的一些、大多数或所有可以包含一种或更多种封闭寡核苷酸。例如，多于一种寡核苷酸探针中至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多、或100％，或这些值中的任何两个值之间的范围，可以包含一种或更多种封闭寡核苷酸。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多、或100％，或这些值中的任何两个值之间的范围，不包含任何封闭寡核苷酸。

一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸可以被封闭寡核苷酸不同程度地减少，例如，基于需要。例如，与样品中至少一种核酸靶分子的扩增和/或延伸相比，或与样品中一种或更多种核酸靶分子的平均扩增和/或延伸相比，或与不存在封闭寡核苷酸时一种或更多种不期望的核酸种类中至少一种的扩增和/或延伸相比，一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸可以减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少55％、至少50％、至少65％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或更多，或在这些值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，与核酸靶分子相比，本文公开的方法可以显著减少一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，而不会显著影响样品中核酸靶分子的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少10％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少50％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少80％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的扩增或延伸减少了至少90％。

如本文所用，“核酸种类”是指序列相同或基本相同，或彼此互补，或能够彼此杂交，或为来自相同遗传基因座的转录物，或编码相同蛋白质或其片段的多核苷酸(例如，单链多核苷酸)。在一些实施方案中，核酸种类的成员彼此或与其互补体至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或100％同源。在一些实施方案中，种类的成员可以在高严格杂交条件下彼此杂交。在一些实施方案中，种类的成员可以在中度严格杂交条件下彼此杂交。在一些实施方案中，种类的成员可以在低严格杂交条件下彼此杂交。在一些实施方案中，种类的成员是来自相同遗传基因座的转录物，并且转录物可以具有相同或不同的长度。在一些实施方案中，种类是基因组DNA、核糖体RNA(rRNA)、核糖体蛋白mRNA、线粒体DNA(mtDNA)、cDNA、mRNA或其组合。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以减少样品中一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。例如，本文公开的方法和组合物可以减少样品中至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少20个、至少50个、至少100个、至少200个、至少500个、至少1000个或更多个不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将样品中一种或更多种不期望的核酸种类的每一种的扩增和/或延伸减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物消除了样品中一种或更多种不期望的核酸种类的每一种的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的扩增和/或延伸减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％或100％。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物消除了一种或更多种不期望的核酸种类中至少一种的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物减少了不期望的核酸种类的全部的扩增和/或延伸。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以减少一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，而不会显著减少同一样品中核酸靶分子的扩增和/或延伸。例如，在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将一种或更多种不期望的核酸种类中的每一种的扩增和/或延伸减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％，而不会显著减少核酸靶分子的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将不期望的核酸种类的全部减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％，而不会显著减少核酸靶分子的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以减少一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，同时保持每种核酸靶分子的扩增和/或延伸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以减少一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，同时保持至少一种核酸靶分子的扩增和/或延伸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以减少一种或更多种不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，同时保持核酸靶分子的全部的扩增和/或延伸的至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。

图6A-图6E显示在封闭寡核苷酸的存在下选择性产生cDNA以防止不期望的mRNA的cDNA合成的各种非限制性实施方案。如图6A-图6E所示，细胞捕获珠600与多于一种寡核苷酸探针608和/或620(例如条形码，诸如随机条形码)相关联，并与包含核酸靶分子或mRNA604和不期望的寡核苷酸种类(例如不期望的mRNA种类612或样品索引寡核苷酸)的样品接触。寡核苷酸探针608的多(T)序列与靶分子mRNA 604的多(A)尾杂交以允许逆转录，或与样品标记寡核苷酸的多(A)尾杂交以允许延伸。在另一方面，在封闭寡核苷酸616和/或624和/或630的存在下，不期望的mRNA种类612的逆转录、从而cDNA合成，或者不期望的寡核苷酸种类的引物延伸、从而合成，被减少或抑制。封闭寡核苷酸616和/或624和/或630可能无法被逆转录酶或DNA聚合酶延伸。例如，封闭寡核苷酸616和/或624和/或630可以在3’末端具有2’,3’双脱氧核苷酸或3’脱氧核苷酸。

在图6A中，寡核苷酸探针608的多(T)序列与不期望的mRNA 612的多(A)尾杂交；然而，不期望的mRNA 612的逆转录(或不感兴趣的寡核苷酸种类的引物延伸)被封闭寡核苷酸616减少或抑制，该封闭寡核苷酸616特异性地结合不期望的mRNA 612中其多(A)尾的5’相邻区域。在图6A中，封闭寡核苷酸616不包含多(T)序列，并且不是寡核苷酸探针608的一部分。在图6B中，寡核苷酸探针620的多(T)序列与不期望的mRNA 612的多(A)尾杂交；然而，不期望的mRNA 612的逆转录(或不感兴趣的寡核苷酸种类的引物延伸)被封闭寡核苷酸616减少或抑制，该封闭寡核苷酸616特异性地结合不期望的mRNA 612中其多(A)尾的5’相邻区域。在图6B中，与细胞捕获珠600相关联的寡核苷酸探针620包含封闭寡核苷酸616。在图6C中，封闭寡核苷酸624包含能够与不期望的mRNA 612的多(A)尾杂交的多(T)序列，以及与不期望的mRNA 612中其多(A)尾的5’相邻区域特异性地结合的区域。不期望的mRNA 612的逆转录(或不感兴趣的寡核苷酸种类的引物延伸)被特异性结合其多(A)尾和邻近区域的封闭寡核苷酸624减少或抑制。在图6C中，封闭寡核苷酸624不是与细胞捕获珠600相关联的任何寡核苷酸探针的一部分。在图6D中，封闭寡核苷酸630包含能够与不期望的mRNA 612的多(A)尾杂交的多(T)序列，与不期望的mRNA 612中其多(A)尾的5’相邻区域特异性结合的区域，和不结合不期望的mRNA中特异性结合的区域的5’相邻区域的3’非退火区640。3’非退火区640可以包含一种或更多种不与不期望的mRNA 612杂交的核苷酸。由于3’非退火区640与不期望的mRNA 612没有杂交，封闭寡核苷酸630可能无法被逆转录酶或DNA聚合酶延伸。不期望的mRNA 612的逆转录(或不感兴趣的寡核苷酸种类的引物延伸)可以被封闭寡核苷酸630减少或抑制，所述封闭寡核苷酸630特异性地结合不期望的mRNA 612(或不感兴趣的寡核苷酸种类)的多(A)尾和邻近区域，并还包含不与其退火的3’非退火区640。在图6D中，封闭寡核苷酸630不是与细胞捕获珠600相关的任何寡核苷酸探针的一部分。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸630不包含非天然核苷酸。在图6E中，寡核苷酸探针620的多(T)序列与不期望的mRNA 612的多(A)尾杂交；然而，不期望的mRNA 612的逆转录(或不感兴趣的寡核苷酸种类的引物延伸)被封闭寡核苷酸616减少或抑制，该封闭寡核苷酸616特异性地结合不期望的mRNA 612中其多(A)尾的5’相邻区域，并还包括不退火至不期望的mRNA中特异性结合的区域的5’相邻区域的3’非退火区640。由于3’非退火区640与不期望的mRNA 612没有杂交，寡核苷酸探针620可能无法被逆转录酶或DNA聚合酶延伸。在图6E中，与细胞捕获珠600相关的寡核苷酸探针620包含封闭寡核苷酸616。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸616不包含非天然核苷酸。

核酸靶分子

在一些实施方案中，本文公开的方法包括提供包含多于一种核酸靶分子的样品。在一些实施方案中，样品可以包含一种或更多种不期望的核酸种类。本领域技术人员应理解，多于一种核酸分子和/或不期望的核酸种类可以包括各种核酸靶分子。例如，核酸靶分子和/或不期望的核酸种类可以包括DNA分子、RNA分子、基因组DNA分子、cDNA分子、mRNA分子、rRNA分子、mtDNA、siRNA分子或其任何组合。核酸靶分子可以是单链或双链的。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子可以包含多A RNA分子。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子包括至少100种、至少1,000种、至少10,000种、至少20,000种、至少30,000种、至少40,000种、至少50,000种、至少100,000种、至少1,000,000种或更多种核酸种类。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子可以来自样品，诸如单细胞、组织或多于一个细胞。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子可以从多于一个样品汇集，诸如从多于一个单细胞或来自不同受试者(例如，患者)的样品汇集。

在一些实施方案中，样品可以包含一种或更多种不期望的核酸种类。如本文使用的，“不期望的核酸种类”是指在样品中例如以高量存在的核酸种类，例如占样品中核酸含量的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或更多，或在这些值中的任何两个值之间的范围的核酸种类。在一些实施方案中，样品可以包含至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少10种、至少20种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，所有不期望的核酸种类的总和代表样品中核酸含量的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％或更多。在一些实施方案中，不期望的核酸种类可以包括编码一种或更多种核糖体蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，不期望的核酸种类包含rRNA。在一些实施方案中，不期望的核酸种类可以包括编码一种或更多种线粒体蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，不期望的核酸种类包括mtDNA。在一些实施方案中，不期望的核酸种类可以包括编码一种或更多种看家蛋白的多核苷酸。在一些实施方案中，不期望的核酸种类可以包括mRNA、rRNA、mtRNA、基因组DNA、内含子序列、高丰度序列及其任何组合。

在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子包括未标准化的核酸文库、部分标准化的核酸文库或通过其他方法标准化的核酸文库，诸如cDNA文库、基因组DNA文库等。在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子可以包含汇集的未标准化核酸文库，诸如从各自代表单细胞的多于一个未标准化核酸文库构建的汇集的未标准化核酸文库。在一些实施方案中，未标准化的核酸文库是cDNA文库。在一些实施方案中，未标准化的核酸文库是基因组文库。在一些实施方案中，未标准化的核酸文库是单细胞核酸文库。

封闭寡核苷酸

在一些实施方案中，本文公开的方法包括提供特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的封闭寡核苷酸。封闭寡核苷酸可以在本文公开的方法中的任何点提供，使得它们可以减少不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。例如，可以在延伸步骤之前、期间或之后，在在扩增步骤之前或期间，提供多于一种寡核苷酸步骤之前、期间或之后，在将多于一种寡核苷酸探针与多于一种核酸靶分子接触以进行杂交之前、期间或之后，或其任何组合来提供封闭寡核苷酸。本文所用的“封闭寡核苷酸”是指能够特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种，由此封闭寡核苷酸和一种或更多种不期望的核酸种类之间的特异性结合能够减少一种或更多种不期望的核酸种类的扩增或延伸(例如，逆转录)的核酸分子。例如，封闭寡核苷酸可以包含能够与一种或更多种不期望的核酸种类杂交的核酸序列。在一些实施方案中，可以提供多于一种封闭寡核苷酸。多于一种封闭寡核苷酸可以特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类的至少1种、至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种或更多种，或在这些值中的任何两个值之间的范围。封闭寡核苷酸与不期望的核酸种类特异性地结合的位置可以变化。例如，封闭寡核苷酸可以特异性地结合靠近不期望的核酸种类的5’末端的序列。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合到一种或更多种不期望的核酸种类中至少一种的5’末端的1nt、3nt、5nt、8nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、50nt、75nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt或1000nt内，或在这些值中的任何两个值之间的范围内。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合靠近不期望的核酸种类的3’末端的序列。例如，封闭寡核苷酸可以特异性地结合到一种或更多种不期望的核酸种类中至少一种的3’末端的1nt、3nt、5nt、10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、75nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt或1000nt或更多，或在这些值中的任何两个值之间的范围内。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合不期望的核酸种类中间部分的序列。例如，封闭寡核苷酸可以特异性地结合到距离一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的中点1nt、3nt、5nt、10nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、75nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt或1000nt或更大，或在这些值中的任何两个值之间的范围内。在一些实施方案中，不期望的核酸种类是mRNA种类。封闭寡核苷酸可以结合或不结合mRNA种类的多(A)尾。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸特异性地结合到与mRNA种类的多(A)尾相邻的区域。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸特异性地结合mRNA种类的多(A)尾和邻近多(A)尾的区域。在一些实施方案中，一种或更多种不期望的核酸种类是mRNA分子，并且封闭寡核苷酸特异性结合一种或更多种不期望的核酸种类的3’多(A)尾的1nt、3nt、5nt、8nt、10nt或在这些值中的任何两个值之间的范围内。

封闭寡核苷酸可以包含各种序列组分。例如，封闭寡核苷酸可以包含(i)特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，和(ii)靶结合区的序列或子序列。

封闭寡核苷酸可以本身以离散的实体存在，或者可以是多于一种寡核苷酸探针之一的一部分。例如，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种可以包含封闭寡核苷酸。多于一种寡核苷酸探针中的一些、大多数或所有可以包含一种或更多种封闭寡核苷酸。例如，多于一种寡核苷酸探针中至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多、或100％，或这些值中的任何两个值之间的范围，可以包含一种或更多种封闭寡核苷酸。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中至少或至多5％、10％、20％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或更多、或100％，或这些值中的任何两个值之间的范围，不包含任何封闭寡核苷酸。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针都不包含封闭寡核苷酸。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸和不期望的核酸种类之间的特异性结合可以将不期望的核酸种类的扩增和/或延伸减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％或更多。

预期，封闭寡核苷酸可以通过例如与不期望的核酸种类形成具有高解链温度(T_m)的杂交复合物来减少不期望的核酸种类的扩增和/或延伸，通过其不能用作逆转录酶、聚合酶或其组合的引物。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以具有的T_m为以下，为约以下，为至少以下：40℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或这些值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，通过与扩增和/或延伸引物竞争与不期望的核酸种类杂交，封闭寡核苷酸可以减少不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸不能用作逆转录酶或聚合酶或二者的引物。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以包含一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以是例如光不稳定的核苷酸或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是嵌合寡核苷酸，诸如LNA/PNA/DNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体、PNA/DNA嵌合体、GNA/DNA嵌合体、TNA/DNA嵌合体或其任何组合。

封闭寡核苷酸的长度可以变化。例如，在一些实施方案中，可以通过调节封闭寡核苷酸的长度来改变封闭寡核苷酸的解链温度(T_m)。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以具有的长度为以下，为约以下，小于以下，大于以下：4nt、6nt、8nt、10nt、12nt、15nt、20nt、21nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt，或上述值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是或是约8nt至100nt长。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是或是约10nt至50nt长。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是或是约12nt至21nt长。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是或是约20nt至30nt长，例如25nt长。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸的T_m通过包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸中的DNA残基的数量调节。例如，包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸可以具有的DNA残基百分比为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以被设计成不能用作扩增和/或延伸反应的引物或探针。例如，封闭寡核苷酸可能不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。例如，包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸可以被设计成具有一定百分比的LNA或PNA残基，或者在某些位置上具有LNA或PNA残基，诸如在接近或在寡核苷酸的3’末端、5’末端或中间部分的位置。在一些实施方案中，包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸可以具有的LNA或PNA残基的百分比为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合至少一种或更多种不期望的核酸种类，并且由于其3’末端与一种或更多种不期望的核酸种类缺乏杂交，因此不能用作扩增和/或延伸反应的引物或探针。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以包含3’非退火区。3’非退火区可以位于封闭寡核苷酸的最3’末端。3’非退火区可以包含一个或更多个核苷酸，该核苷酸与由封闭寡核苷酸的5’区特异性结合的不期望的核酸种类非互补。由于3’非退火区与不期望的核酸种类没有杂交，封闭寡核苷酸可能无法被逆转录酶或DNA聚合酶延伸。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸包含能特异性地结合至少一种或更多种不期望的核酸种类的5’区域和3’非退火区。在一些这样的实施方案中，5’区域特异性地结合至少一种或更多种不期望的核酸种类的3’末端。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸包含结合不期望的核酸种类(例如，看家mRNA)的5’多(dT)区、不结合不期望的核酸种类的3’非退火区和特异性地结合不期望的核酸种类的间插区域。在一些实施方案中，相对于封闭寡核苷酸的总长度，3’非退火区的长度为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。3’非退火区的序列可以在靶向不同的不期望的核酸种类的不同封闭寡核苷酸之间共享。在一些这样的实施方案中，3’非退火区包含被配置为不与一些或所有不期望的核酸种类杂交的序列。在其他实施方案中，3’非退火区的序列被配置为防止与特定的不期望的核酸种类杂交。

封闭寡核苷酸的3’非退火区的GC含量可以根据实施方案而变化。在一些实施方案中，较高的GC含量防止3’非退火区与不期望的核酸种类的非特异性结合。在一些实施方案中，3’非退火区域的GC含量为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。3’非退火区可以包含二级结构(例如发夹)，其可以防止封闭寡核苷酸的延伸。在一些实施方案中，3’非退火区被配置为防止分子内杂交、与其他封闭寡核苷酸的分子间杂交和/或二级结构形成。3’非退火区可以仅包含天然核苷酸。可选地，3’非退火区可以包含一个或更多个非天然核苷酸。

3’非退火区的长度可以变化。在一些实施方案中，3’非退火区可以具有的长度为以下，为约以下，小于以下，大于以下：4nt、6nt、8nt、10nt、12nt、15nt、20nt、21nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt，或上述值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至100nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至50nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至21nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至10nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约5nt长。

封闭寡核苷酸的3’非退火区和不期望的核酸种类之间的非互补程度可以变化。在一些实施方案中，3’非退火区与与被封闭寡核苷酸特异性地结合的序列相邻的不期望的核酸种类的序列具有完全的非互补性。在一些实施方案中，3’非退火区和不期望的核酸种类中被封闭寡核苷酸特异性地结合的序列的5’相邻区域之间的非互补性为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或上述值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括除去封闭寡核苷酸和不期望的核酸种类之间形成的杂交复合体。例如，封闭寡核苷酸可以包含亲和部分。亲和部分可以是选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉亲和素、肝素、适体、点击化学部分、地高辛、伯胺、羧基、羟基、醛、酮及其任何组合。在一些实施方案中，亲和部分是生物素。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以通过亲和部分固定到具有亲和部分结合配偶体的固体支持物。在一些实施方案中，亲和配偶体是链霉亲和素。

封闭寡核苷酸可以结合，例如特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以结合两种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，本文公开的方法包括提供特异性地结合样品中两种或更多种不期望的核酸种类的封闭寡核苷酸。例如，该方法可以包括封闭寡核苷酸，该封闭寡核苷酸特异性地结合样品中至少5个、10个、15个、20个、30个、50个、60个、70个、80个、90个、100个、150个、200个、250个、300个、350个、400个、500个或更多个，或这些值中的任何两个值之间的范围的不期望的核酸种类。

寡核苷酸探针

本文公开的方法可以包括提供多于一种寡核苷酸探针。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的一种或更多种(例如，多于一种寡核苷酸探针中的每一种)可以包含分子标记序列和结合区域。在一些实施方案中，本文公开的方法包括使多于一种寡核苷酸探针与多于一种核酸靶分子接触以进行杂交。例如，结合区域可以与多于一种核酸靶分子中的一种或更多种以及一种或更多种不期望的核酸种类杂交。在一些实施方案中，结合区域是靶特异性的。例如，结合区域被配置为结合特定序列。在一些实施方案中，结合区域不是靶非特异性的。在一些实施方案中，结合区域包含多dT序列或由多dT序列组成。在一些实施方案中，寡核苷酸探针可以包含随机条形码。在一些实施方案中，寡核苷酸探针包含分子标记序列、细胞标记序列、样品标记序列、位置标记序列、通用引物的结合位点或其组合。多于一种寡核苷酸探针中的一种或更多种可以包含不同的分子标记序列。例如，多于一种寡核苷酸探针中的一些或每一种可以包含不同的分子标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的约以下或至少以下包含不同的分子标记序列：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％或这些值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的约以下或至少以下包含不同的分子标记序列：5个、10个、50个、100个、250个、500个、750个、1000个、1500个、2000个、2500个、5000个、7500个、10000个、25000个、50000个或更多个或这些值中的任何两个值之间的范围。多于一种寡核苷酸探针中的一种或更多种可以包含相同的细胞标记序列。例如，多于一种寡核苷酸探针中的一些或全部可以包含相同的细胞标记序列。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的约以下或至少以下包含相同的细胞标记序列：30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％或这些值中的任何两个值之间的范围。

预期，本文公开的方法和组合物可以与分子标记序列结合使用，例如，与包含分子标记序列的寡核苷酸探针结合使用。因此，在一些实施方案中，本文公开的核酸分子种类可以在多于一种核酸分子中包括以下多核苷酸，它们是相同的或彼此互补的，或者能够彼此杂交，或者是来自相同遗传基因座的转录物，或者编码相同的蛋白质或其片段，等等，但是与不同的分子标记序列相关联。应当理解，分子标记序列可用于鉴定核酸种类的出现。

分子标记序列可以包含为特定核酸提供识别信息的核酸序列。分子标记序列可以包括如下核酸序列，所述核酸序列提供靶核酸的特定出现的计数。分子标记序列的长度可以是例如以下：1个、2个、3个、4个、5个、10个、15个、20个、25个、30个、35个、40个、45个、50个或更多个，或在这些值中的任何两个值之间的范围的核苷酸。分子标记序列的长度可以是例如至多约300个、200个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个、15个、12个、10个、9个、8个、7个、6个、5个、4个或更少的核苷酸。

应当理解，在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以减少不期望的核酸种类的扩增，而不显著减少与其他核酸靶分子相关联的不同分子标记序列的数量。例如，本文公开的方法和组合物可以减少不期望的核酸种类的扩增，同时保留与其他核酸靶分子相关的不同分子标记序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以将不期望的核酸种类的扩增减少至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％，同时保留与其他核酸靶分子相关的不同分子标记序列的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或100％。在一些实施方案中，减少不期望的核酸种类的扩增不会显著减少与其他核酸靶分子相关的不同分子标记序列的数量。

延伸

可以使用寡核苷酸探针进行一个或更多个延伸反应，所述寡核苷酸探针与多于一种核酸靶分子杂交以产生多于一种延伸产物。在一些实施方案中，寡核苷酸探针用作延伸反应，诸如逆转录的引物。延伸反应可以在封闭寡核苷酸的存在或不存在下进行。在延伸反应中存在封闭寡核苷酸的实施方案中，封闭寡核苷酸可以减少封闭寡核苷酸特异性地结合的一种或更多种不期望的核酸种类的延伸。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸不会显著减少核酸靶分子的延伸。

在一些实施方案中，多于一种核酸靶分子可以随机地与寡核苷酸探针关联。关联可以例如包括使寡核苷酸探针的结合区与靶核酸分子的互补部分杂交(例如，随机条形码的寡聚dT序列可以与靶核酸分子的多A尾相互作用)。可以选择用于杂交的测定条件(例如，缓冲液pH、离子强度、温度等)以促进形成特定的稳定杂交体。

本公开内容提供了使用逆转录使分子标记与靶核酸关联的方法。

扩增

在一些实施方案中，本文公开的方法可以包括扩增样品，其中该样品包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类，或者扩增多于一种延伸产物以产生多于一种扩增子。在一些实施方案中，可以进行一个或更多个核酸扩增反应以产生靶核酸分子或延伸产物的多于一个拷贝。在一些实施方案中，可以添加引物用于扩增反应，诸如PCR。扩增反应可以在封闭寡核苷酸的存在或不存在下进行。在扩增反应中存在封闭寡核苷酸的实施方案中，封闭寡核苷酸可以减少封闭寡核苷酸特异性地结合的一种或更多种不期望的核酸种类的扩增。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸不会显著降低核酸靶分子的扩增。

在一些实施方案中，扩增可以以多重方式进行，其中多于一种靶核酸序列同时进行扩增。扩增反应可用于例如将测序衔接子添加至核酸分子。扩增反应可以包括扩增样品标记(如果存在)的至少一部分。扩增反应可以包括扩增细胞标记和/或分子标记的至少一部分。扩增反应可以包括扩增样品标签、细胞标记、空间标记、分子标记、靶核酸或它们的组合的至少一部分。扩增反应可以例如包括扩增多于一种靶核酸的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％或100％。所述方法还可以包括进行一个或更多个cDNA合成反应以产生包含样品标记、细胞标记、空间标记和/或分子标记的靶-条形码分子的一个或更多个cDNA拷贝。

在一些实施方案中，可以使用聚合酶链式反应(PCR)进行扩增。如本文使用的，“PCR”指用于通过DNA的互补链的同时引物延伸使特定DNA序列体外扩增的反应。如本文使用的，PCR包括所述反应的派生形式，包括但不限于RT-PCR、实时PCR、巢式PCR、定量PCR、多重PCR、数字PCR和组装PCR。

经标记的核酸的扩增可以包括非基于PCR的方法。非基于PCR的方法的实例包括但不限于多重置换扩增(MDA)、转录介导的扩增(TMA)、全转录物组扩增(WTA)、全基因座扩增(WGA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、实时SDA、滚环扩增或环到环扩增。其他非基于PCR的扩增方法包括DNA依赖性RNA聚合酶驱动的RNA转录扩增或RNA指导的DNA合成和转录的多个循环以扩增DNA或RNA靶、连接酶链式反应(LCR)和Qβ复制酶(Qβ)方法、回文探针的使用、链置换扩增、使用限制性核酸内切酶的寡核苷酸驱动的扩增、使引物与核酸序列杂交并且将所得双链体裂解然后进行延伸反应和扩增的扩增方法、使用缺乏5’核酸外切酶活性的核酸聚合酶的链置换扩增、滚环扩增和分支延伸扩增(RAM)。在一些情形中，扩增可以不产生环化转录物。

在一些情形中，本文公开的方法还包括对经标记的核酸(例如，经标记的RNA、经标记的DNA、经标记的cDNA)进行聚合酶链式反应以产生经标记的扩增子。经标记的扩增子可以例如是双链分子。双链分子可以包括双链RNA分子、双链DNA分子或者与DNA分子杂交的RNA分子。双链分子的一条或两条链可以包含样品标记、空间标记、细胞标记和/或分子标记。经标记的扩增子可以是单链分子。单链分子可以包括DNA、RNA或它们的组合。本公开内容的核酸包含合成的或改变的核酸。

扩增可以例如包括使用一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定的核苷酸或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。可以将非天然核苷酸添加至扩增反应的一个或更多个循环中。添加非天然核苷酸可以例如用于鉴定扩增反应中特定循环或时间点的产物。

如本文描述的，进行一个或更多个扩增反应可以包括使用一种或更多种引物。引物可以例如包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。在一些实施方案中，引物包含至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、11个、12个、13个、14个或15个或更多个核苷酸。例如，引物可以包含12至15个核苷酸。一种或更多种引物可以例如退火至多于一种经标记的靶核酸分子和寡核苷酸的至少一部分。例如，一种或更多种引物可以退火至多于一种经标记的靶核酸分子和寡核苷酸的3’末端或5’末端。在一些实施方案中，一个或更多个引物可以退火至多于一种经标记的靶核酸分子和寡核苷酸的内部区域。寡核苷酸或靶核酸分子的内部区域可以例如距离该寡核苷酸或靶核酸分子的3’末端和/或5’末端至少约50、100、150、200、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390、400、410、420、430、440、450、460、470、480、490、500、510、520、530、540、550、560、570、580、590、600、650、700、750、800、850、900或1000个核苷酸。一种或更多种引物可以包括一组固定的引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种定制引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种对照引物。一种或更多种引物可以包括至少一种或更多种基因特异性引物。

一种或更多种引物可以包括本公开内容的任何通用引物。通用引物可以退火至通用引物结合位点。在一些实施方案中，一种或更多种定制引物可以退火至第一样品标记、第二样品标记、空间标记、细胞标记、分子标记、靶或它们的任何组合。一种或更多种引物可以包括通用引物和定制引物。

可以在本公开内容的方法中使用任何扩增方案。例如，在一个方案中，第一轮PCR可以使用基因特异性引物和针对通用Illumina测序引物1序列的引物来扩增(例如附接至珠的)分子。第二轮PCR可以使用侧翼为Illumina测序引物2序列的巢式基因特异性引物，和针对通用Illumina测序引物1序列的引物扩增第一PCR产物。第三轮PCR添加P5和P7以及样品索引，以使PCR产物转变为Illumina测序文库。使用150bp x 2测序进行测序可以揭示读段(read)1上的细胞标记和分子索引、读段2上的基因，以及索引1读段上的样品索引。

扩增可以以一轮或多轮进行。在一些情况下，有多轮扩增。扩增可以包括两轮或多轮扩增。第一次扩增可以是远离X’的延伸以产生基因特异性区域。当样品核酸与新产生的链杂交时，可以发生第二次扩增。

在一些实施方案中，杂交不需要发生在核酸分子的末端。在一些实施方案中，较长核酸的完整链中的靶核酸被杂交和扩增。例如，基因组DNA或mRNA较长部分中的靶。靶可以距离多核苷酸的一个末端(例如5’末端或3’末端)多于50nt、多于100nt或多于1000nt。

测序

在一些实施方案中，本文公开的延伸产物和/或扩增产物可用于测序。可以使用本领域已知的任何合适的测序方法，优选地高通量方法。例如，也可以利用使用平台诸如Roche 454、Illumina Solexa、ABI-SOLiD、ION Torrent、Complete Genomics、PacificBioscience、Helicos或Polonator平台的循环阵列测序。测序可以包括MiSeq测序和/或HiSeq测序。在一些实施方案中，本文公开的选择性延伸和/或扩增方法可以通过减少不期望的核酸种类的测序读段的数量来提高测序的效率。

在一些实施方案中，在使用本文所述的选择性延伸和/或扩增方法后，不期望的核酸种类的测序读段是总测序读段的少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％或更少。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的40％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的30％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的20％。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段少于总测序读段的10％。在一些实施方案中，在使用本文所述的选择性延伸和/或扩增方法后，不期望的核酸种类的测序读段减少到不使用本文所述的选择性延伸和/或扩增方法时不期望的核酸的测序读段的少于60％、少于50％、少于40％、少于30％、少于20％、少于10％、少于5％。在一些实施方案中，在使用本文所述的选择性延伸和/或扩增方法后，不期望的核酸种类的测序读段减少到不使用本文所述的选择性延伸和/或扩增方法时不期望的核酸的测序读段的以下或约以下：60％、50％、40％、30％、20％、10％、5％、2％、1％、0.5％或这些值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，本文公开的方法和组合物可以通过降低不期望的核酸种类的测序读段:分子标记比率和/或增加核酸靶分子的测序读段:分子标记比率来提高测序效率。例如，不期望的核酸种类的测序读段与分子标记的比率可以是小于20、小于15、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、小于5、小于4、小于3、小于2或小于1。在一些实施方案中，不期望的核酸种类的测序读段与分子标记的比率是20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或这些值中的任何两个值之间的范围。

试剂盒

本文的公开内容包括用于选择性扩增和/或延伸样品中的核酸分子的试剂盒。例如，样品可以包含多于一种靶核酸种类和一种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，试剂盒包含多于一种寡核苷酸探针，其中多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和包含多dT序列的靶结合区；和特异性地结合样品中多于一种不期望的mRNA种类的多于一种封闭寡核苷酸，其中多于一种封闭寡核苷酸结合多于一种不期望的mRNA种类的非多(A)区域，并且其中每种封闭寡核苷酸探针不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。

封闭寡核苷酸可以是寡核苷酸探针的一部分，或者是与寡核苷酸探针分开的实体。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含多于一种封闭寡核苷酸中的一种。例如，多于一种封闭寡核苷酸中的一些或所有是寡核苷酸探针的一部分。在一些实施方案中，试剂盒中多于一种封闭寡核苷酸的约以下或至少以下是寡核苷酸探针的一部分：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、100％或这些值中任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列和(ii)多dT序列。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的每一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列和(ii)多dT序列。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，(ii)多dT序列和(iii)3’非退火区。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的每一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，(ii)多dT序列和(iii)3’非退火区。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列和(ii)3’非退火区。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸中的每一种包含(i)特异性地结合多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，和(ii)3’非退火区。寡核苷酸探针的多dT序列可以比封闭寡核苷酸的多dT序列长。在一些实施方案中，寡核苷酸探针的多dT序列和封闭寡核苷酸的多dT序列具有相同的长度。在一些实施方案中，多于一种寡核苷酸探针都不包含封闭寡核苷酸。

封闭寡核苷酸可以包含3’非退火区。3’非退火区可以位于封闭寡核苷酸的最3’末端。3’非退火区可以包含一个或更多个核苷酸，该核苷酸与由封闭寡核苷酸的5’区特异性结合的不期望的核酸种类非互补。封闭寡核苷酸的3’非退火区和不期望的核酸种类之间的非互补程度可以变化。在一些实施方案中，3’非退火区与与被封闭寡核苷酸特异性地结合的序列相邻的不期望的核酸种类的序列具有完全的非互补性。在一些实施方案中，3’非退火区和不期望的核酸种类中被封闭寡核苷酸特异性地结合的序列的5’相邻区域之间的非互补性为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、100％，或上述值中的任何两个值之间的范围。

封闭寡核苷酸可包含能特异性地结合至少一种或更多种不期望的核酸种类的5’区域和3’非退火区。在一些这样的实施方案中，5’区域特异性地结合至少一种或更多种不期望的核酸种类的3’末端。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸包含结合不期望的核酸种类(例如，看家mRNA)的5’多(dT)区、不结合不期望的核酸种类的3’非退火区和特异性地结合不期望的核酸种类的间插区域。在一些实施方案中，相对于封闭寡核苷酸的总长度，3’非退火区的长度为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。3’非退火区的序列可以在靶向不同的不期望的核酸种类的不同封闭寡核苷酸之间共享。在一些这样的实施方案中，3’非退火区包含被配置为不与一些或所有不期望的核酸种类杂交的序列。在其他实施方案中，3’非退火区的序列被配置为防止与特定的不期望的核酸种类杂交。

封闭寡核苷酸的3’非退火区的GC含量可以根据实施方案而变化。在一些实施方案中，较高的GC含量防止3’非退火区与不期望的核酸种类的非特异性结合。在一些实施方案中，3’非退火区域的GC含量为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。3’非退火区可以包含二级结构(例如发夹)，其可以防止封闭寡核苷酸的延伸。在一些实施方案中，3’非退火区被配置为防止分子内杂交、与其他封闭寡核苷酸的分子间杂交和/或二级结构形成。3’非退火区可以仅包含天然核苷酸。可选地，3’非退火区可以包含一个或更多个非天然核苷酸。3’非退火区的长度可以变化。在一些实施方案中，3’非退火区可以具有的长度为以下，为约以下，小于以下，大于以下：4nt、6nt、8nt、10nt、12nt、15nt、20nt、21nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、150nt、200nt，或上述值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至100nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至50nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至21nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约1nt至10nt长。在一些实施方案中，3’非退火区是或是约5nt长。

多于一种封闭寡核苷酸可以例如特异性地结合样品中至少1种、至少2种、至少5种、至少10种、至少50种、至少100种、至少200种、至少500种、至少1000种或更多种不期望的核酸种类。在一些实施方案中，多于一种封闭寡核苷酸特异性地结合样品中1种、2种、5种、10种、20种、50种、100种、200种、500种、1000种、1500种、2000种或更多种，或这些值中的任何两个值之间的范围的不期望的核酸种类。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类的5’末端的10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt、1000nt内。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合一种或更多种不期望的核酸种类的3’末端的10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt、1000nt内。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以特异性地结合在一种或更多种不期望的核酸种类的中点周围10nt、20nt、30nt、40nt、50nt、100nt、200nt、300nt、400nt、500nt、1000nt内。

不限于任何特定的理论，设想封闭寡核苷酸可以通过与不期望的核酸种类形成具有高解链温度(T_m)的杂交复合物、通过不能用作逆转录酶或聚合酶的引物、它们的组合等来减少不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以具有为以下、约以下、至少以下的T_m：50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃，或上述值中的任何两个值之间的范围。在一些实施方案中，通过与扩增和/或延伸引物竞争与不期望的核酸种类杂交，封闭寡核苷酸可以减少不期望的核酸种类的扩增和/或延伸。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以包含一个或更多个非天然核苷酸。非天然核苷酸可以包括光不稳定的核苷酸或可触发的核苷酸。非天然核苷酸的实例可以包括但不限于肽核酸(PNA)、吗啉代核酸和锁核酸(LNA)，以及二醇核酸(GNA)与苏糖核酸(TNA)。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸是嵌合寡核苷酸，诸如LNA/PNA/DNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体、PNA/DNA嵌合体、GNA/DNA嵌合体、TNA/DNA嵌合体及其组合。

封闭寡核苷酸的长度可以变化。例如，可以通过调节封闭寡核苷酸的长度来修改封闭寡核苷酸的T_m。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以具有的长度为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10nt、15nt、20nt、25nt、30nt、35nt、40nt、45nt、50nt、60nt、70nt、80nt、90nt、100nt、200nt，或上述值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸的T_m可以通过调整包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸中的DNA残基的数量调节。例如，包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸可以具有的DNA残基百分比为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以被设计成不能用作延伸或扩增的引物。例如，封闭寡核苷酸可能不能用作逆转录酶、聚合酶或二者的引物。例如，包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸可被设计成具有某一百分比的LNA或PNA残基或在封闭寡核苷酸的某些位置(诸如3’末端、5’末端、内部区域或其组合)具有LNA或PNA残基。在一些实施方案中，包含LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体的封闭寡核苷酸可以具有的LNA或PNA残基的百分比为以下，为约以下，小于以下，大于以下：10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％，或上述值中的任何两个值之间的范围。

在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以包含亲和部分。亲和部分可以是选自由以下组成的组的官能团：生物素、链霉亲和素、肝素、适体、点击化学部分、地高辛、伯胺、羧基、羟基、醛、酮及其任何组合。在一些实施方案中，封闭寡核苷酸可以通过亲和部分固定到具有亲和部分结合配偶体的固体支持物。

在一些实施方案中，每种寡核苷酸探针可以包含分子标记、细胞标记、样品标记或它们的任何组合。在一些实施方案中，每种寡核苷酸可以包含接头。在一些实施方案中，每种寡核苷酸探针可以包含用于寡核苷酸探针的结合位点，诸如多A尾。例如，多A尾可以是，例如oligodA₁₈(不锚定到固体支持物)或oligoA₁₈V(锚定到固体支持物)。寡核苷酸探针可以包含DNA残基、RNA残基或二者。

多于一种寡核苷酸探针可以固定在如本文所述的基底上。在一些实施方案中，基底是颗粒。在一些实施方案中，基底是珠。

在一些实施方案中，试剂盒可以还包含酶，例如逆转录酶、聚合酶、连接酶、核酸酶或其组合。

尽管本文已经公开了各种方面和实施方案，但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不意在限制由以下权利要求所指出的实际范围和精神。

本领域技术人员将理解，对于本文公开的这个和其他过程和方法，在过程和方法中执行的功能可以以不同的顺序实现。此外，概述的步骤和操作仅作为实例提供，并且一些步骤和操作可以是任选的，组合成更少的步骤和操作，或者扩展到附加的步骤和操作，而不偏离所公开的实施方案的本质。

关于本文中使用基本上任何复数和/或单数术语，在对于背景和/或应用适当的情况下，本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起见，可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。

本领域技术人员将理解，一般来说，本文使用的术语，并且尤其是所附权利要求(例如，所附权利要求的主体)中的术语，通常意在作为“开放式”术语(例如，术语“包括(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”，术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”，术语“包括(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”，等等)。本领域技术人员将进一步理解，如果所引入的权利要求陈述的特定数目是所预期，这样的预期将明确地陈述于权利要求中，并且在不存在这样的陈述的情况下，不存在这样的预期。例如，作为对理解的帮助，以下所附权利要求可以包含前置短语“至少一个/至少一种(at least one)”和“一个或更多个/一种或更多种(one or more)”的使用，以引入权利要求陈述。然而，这样的短语的使用不应理解为暗含通过不定冠词“一个”或“一种”(“a”or“an”)引入权利要求陈述会将包含这样的引入的权利要求陈述的任何具体权利要求限制到包含仅一个这样的陈述的实施方案中，甚至在相同的权利要求包括前置词“一个或更多个/一种或更多种”或“至少一个/至少一种”以及不定冠词诸如“一个”或“一种”时也是如此(例如，“一个”和/或“一种”应解释为意指“至少一个/至少一种”或“一个或更多个/一种或更多种”)；这对于使用定冠词来引入权利要求陈述同样适用。此外，即使明确地陈述了所引入的权利要求陈述的特定数目，本领域技术人员将认识到，这样的陈述应解释为意指至少所陈述的数目(例如，仅陈述“两个陈述”而没有其他修饰词意指至少两个陈述，或两个或更多个陈述)。此外，在使用类似于“A、B和C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这样的句法结构以本领域技术人员将理解该惯例的意义被预期(例如，“具有A、B和C中的至少一个的***”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的***)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一个”的惯例的那些情况下，通常这样的句法结构以本领域技术人员将理解该惯例的意义被预期(例如，“具有A、B或C中的至少一个的***”将包括但不限于仅具有A，仅具有B，仅具有C，A和B一起，A和C一起，B和C一起，和/或A、B和C一起等的***)。本领域技术人员将进一步理解，实际上，无论在说明书、权利要求书还是在附图中，呈现两个或更多个替代术语的任何转折性(disjunctive)词语和/或短语应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可能性。例如，短语“A或B”将被理解为包括“A”或“B”或者“A和B”的可能性。

此外，当本公开内容的特征或方面以马库什群组(Markushgroup)描述时，本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什群组的任何单独的成员或成员子组描述。

如本领域技术人员将理解的，出于任何和所有目的，诸如在提供书面描述方面，本文公开的所有范围还包括任何和所有可能的它的子范围和子范围组合。任何列出的范围都可以很容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半，三分之一，四分之一，五分之一，十分之一等。作为非限制性实例，本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一，中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的，所有语言，诸如“多达”、“至少”等包括所陈述的数字，并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后，如本领域技术人员将理解的，范围包括每个单独的成员。因此，例如，具有1-3个细胞的组是指具有1个、2个或3个细胞的组。类似地，具有1-5个细胞的组是指具有1个、2个、3个、4个或5个细胞的组，等等。

从以上所述，将会理解，为了说明的目的，本文已经描述了本公开内容的各种实施例，并且在不脱离本公开的范围和精神的情况下，可以进行各种修改。因此，本文公开的各种实施方案并不意在限制由以下权利要求所指出的实际范围和精神。

Claims (61)

1.一种选择性延伸的方法，包括：

获得包含多于一种核酸靶分子和一种或更多种不期望的核酸种类的样品；

将封闭寡核苷酸与所述样品接触，其中所述封闭寡核苷酸特异性地结合所述一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种；

将多于一种寡核苷酸探针与所述样品接触，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和能够与所述多于一种核酸靶分子和所述一种或更多种不期望的核酸种类杂交的靶结合区；以及

延伸与所述多于一种核酸靶分子和所述一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸探针，以产生多于一种延伸产物；

由此所述一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的延伸被所述封闭寡核苷酸减少。

2.根据权利要求1所述的方法，其中在将所述多于一种寡核苷酸探针与所述样品接触之前，将所述封闭寡核苷酸与所述样品接触。

3.根据权利要求1所述的方法，其中在所述多于一种寡核苷酸探针与所述样品接触之后，将所述封闭寡核苷酸与所述样品接触。

4.根据权利要求3所述的方法，其中：

获得所述样品包括获得包含所述多于一种核酸靶分子和所述一种或更多种不期望的核酸种类的第二样品，

使所述封闭寡核苷酸与所述样品接触包括使所述封闭寡核苷酸与所述第二样品接触，和/或

使所述多于一种寡核苷酸探针与所述样品接触包括使所述多于一种寡核苷酸探针与所述第二样品接触，以及

该方法包括在使所述多于一种寡核苷酸探针与所述样品接触之后和延伸与所述多于一种核酸靶分子和所述一种或更多种不期望的核酸种类杂交的寡核苷酸之前，汇集所述样品和所述第二样品。

5.根据权利要求4所述的方法，其中汇集所述样品和所述第二样品包括在所述封闭寡核苷酸与所述样品和所述第二样品接触之前汇集所述样品和所述第二样品。

6.根据权利要求1所述的方法，其中当所述多于一种寡核苷酸探针与所述样品接触时，使所述封闭寡核苷酸与所述样品接触。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含所述封闭寡核苷酸。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸包含：(i)特异性地结合所述一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，和(ii)所述靶结合区的序列或子序列。

9.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸包含(i)特异性地结合所述一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，(ii)所述靶结合区的序列或子序列，以及(iii)不与所述一种或更多种不期望的核酸种类中的至少一种杂交的序列。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码都不包含所述封闭寡核苷酸。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，所述方法包括扩增所述多于一种延伸产物以产生多于一种扩增子，任选地，其中所述多于一种扩增子包含cDNA文库。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述扩增包括所述多于一种延伸产物的PCR扩增。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其中所述不期望的核酸种类的扩增被所述封闭寡核苷酸减少。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸包含3’非退火区，所述3’非退火区被配置为不与所述一种或更多种不期望的核酸种类退火；并且任选地，所述3’非退火区和所述不期望的核酸种类中被所述封闭寡核苷酸特异性地结合的序列的5’相邻区域之间的非互补性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或约100％。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述3’非退火区为1nt至100nt长，1nt至50nt长，1nt至21nt长，1nt至10nt长，或约5nt长。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸是锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、DNA、LNA/PNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸不包含非天然核苷酸。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，所述方法包括提供特异性地结合所述样品中两种或更多种不期望的核酸种类，任选地至少10种或至少100种不期望的核酸种类的封闭寡核苷酸。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸具有的T_m为至少50℃、至少60℃或至少70℃。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。

21.根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸种类的扩增或延伸减少至少10％、至少25％、至少50％、至少80％、至少90％、至少95％或至少99％。

22.根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸为8nt至100nt长、10nt至50nt长、12nt至21nt长、20nt至30nt长或约25nt长。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸种类占所述样品核酸含量的约50％、约60％、约70％或约80％。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸种类选自由以下组成的组：核糖体RNA、线粒体RNA、基因组DNA、内含子序列、高丰度序列及其组合。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸特异性地结合至所述一种或更多种不期望的核酸种类的3’末端的100nt内、50nt内或25nt内。

26.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述封闭寡核苷酸特异性地结合至所述一种或更多种不期望的核酸种类的5’末端的100nt内，或者所述封闭寡核苷酸特异性地结合至所述一种或更多种不期望的核酸种类的中点的100nt内。

27.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含细胞标记序列、样品标记序列、位置标记序列、通用引物的结合位点或其组合。

28.根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针包含至少100种、至少1000种或至少10000种不同的分子标记序列。

29.根据权利要求27-28中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸条形码包含相同的细胞标记序列。

30.根据权利要求1-29中任一项所述的方法，其中所述样品包含单细胞、单细胞的裂解物、多于一种细胞、多于一种细胞的裂解物、组织样品、组织样品的裂解物或其组合；并且任选地，所述样品是单细胞或单细胞的裂解物。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述多于一种寡核苷酸探针与颗粒关联，并且任选地，所述寡核苷酸探针被固定在所述颗粒上、部分地固定在所述颗粒上、包埋在所述颗粒中、部分地包埋在所述颗粒中或其组合。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述颗粒是珠，并且任选地所述珠包含以下材料：聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚苯乙烯、玻璃、聚丙烯、琼脂糖、明胶、水凝胶、顺磁物质、陶瓷、塑料、玻璃、甲基苯乙烯、丙烯酸聚合物、钛、乳胶、琼脂糖凝胶、纤维素、尼龙、硅酮，或它们的组合。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述珠是水凝胶珠或磁珠。

34.根据权利要求32-33中任一项所述的方法，其中所述珠是可破裂的。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述多于一种核酸靶分子和/或所述不期望的核酸种类包括mRNA分子和/或DNA分子。

36.根据权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述一种或更多种不期望的核酸种类是mRNA分子，并且所述封闭寡核苷酸特异性结合到所述一种或更多种不期望的核酸种类的3’多(A)尾的10nt内。

37.根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述靶结合区包含多dT序列。

38.根据权利要求11-37中任一项所述的方法，所述方法还包括对所述多于一种扩增子测序。

39.根据权利要求11-38中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸种类占所述多于一种扩增子的少于40％、少于20％、少于10％或少于5％。

40.根据权利要求11-39中任一项所述的方法，其中所述不期望的核酸种类的测序读段是总测序读段的少于40％、少于20％、少于10％或少于5％。

41.一种试剂盒，所述试剂盒用于选择性扩增样品中的核酸分子，所述试剂盒包含：

多于一种寡核苷酸探针，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的每一种包含分子标记序列和靶结合区，所述靶结合区包含多dT序列；和

多于一种封闭寡核苷酸，所述多于一种封闭寡核苷酸特异性地结合所述样品中的多于一种不期望的mRNA种类，其中所述多于一种封闭寡核苷酸结合所述多于一种不期望的mRNA种类的非多(A)区域，并且其中每种封闭寡核苷酸探针不能用作逆转录酶或聚合酶的引物。

42.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸探针中的至少一种包含所述多于一种封闭寡核苷酸中的一种。

43.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述多于一种封闭寡核苷酸中的一种包含(i)特异性地结合所述多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列和(ii)多dT序列。

44.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述多于一种封闭寡核苷酸中的一种包含(i)特异性地结合所述多于一种不期望的核酸种类中的至少一种的序列，(ii)多dT序列，和(iii)不与所述多于一种不期望的核酸种类中的至少一种杂交的序列。

45.根据权利要求43-44中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针的多dT序列比所述封闭寡核苷酸的多dT序列长。

46.根据权利要求43-44中任一项所述的试剂盒，其中所述寡核苷酸探针的多dT序列和所述封闭寡核苷酸的多dT序列具有相同的长度。

47.根据权利要求41所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸探针都不包含所述封闭寡核苷酸。

48.根据权利要求41-47中任一项所述的试剂盒，其中所述封闭寡核苷酸包含3’非退火区，所述3’非退火区被配置为不与所述一种或更多种不期望的核酸种类退火。

49.根据权利要求48所述的试剂盒，其中所述3’非退火区和所述不期望的核酸种类中被所述封闭寡核苷酸特异性地结合的序列的5’相邻区域之间的非互补性为至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或约100％。

50.根据权利要求48-49中任一项所述的试剂盒，其中所述3’非退火区为1nt至100nt长、1nt至50nt长、1nt至21nt长、1nt至10nt长或约5nt长。

51.根据权利要求41-50中任一项所述的试剂盒，其中所述封闭寡核苷酸是锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、DNA、LNA/PNA嵌合体、LNA/DNA嵌合体或PNA/DNA嵌合体。

52.根据权利要求41-50中任一项所述的试剂盒，其中所述封闭寡核苷酸不包含非天然核苷酸。

53.根据权利要求41-52中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种封闭寡核苷酸特异性地结合两种或更多种，和任选地至少10种或至少100种不期望的核酸种类。

54.根据权利要求41-53中任一项所述的试剂盒，其中所述封闭寡核苷酸为8nt至100nt长。

55.根据权利要求41-54中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种不期望的mRNA种类包括核糖体mRNA、线粒体mRNA或其组合。

56.根据权利要求41-55中任一项所述的试剂盒，其中所述封闭寡核苷酸特异性地结合至所述不期望的核酸种类的3’末端的100nt内。

57.根据权利要求41-56中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸探针被固定在基底上，并且任选地，所述基底是颗粒，并且任选地，所述基底是珠。

58.根据权利要求41-57中任一项所述的试剂盒，所述试剂盒还包含酶，任选地其中所述酶选自由以下组成的组：逆转录酶、聚合酶、连接酶、核酸酶及其组合。

59.根据权利要求41-58中任一项所述的试剂盒，其中每种封闭寡核苷酸探针具有的T_m为至少60℃。

60.根据权利要求41-59中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸探针包含至少100种不同的分子标记序列或至少100种不同的分子标记序列。

61.根据权利要求41-60中任一项所述的试剂盒，其中所述多于一种寡核苷酸探针包含相同的细胞标记序列。

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