KR100882711B1 - 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도 - Google Patents

사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR100882711B1
KR100882711B1 KR1020070023976A KR20070023976A KR100882711B1 KR 100882711 B1 KR100882711 B1 KR 100882711B1 KR 1020070023976 A KR1020070023976 A KR 1020070023976A KR 20070023976 A KR20070023976 A KR 20070023976A KR 100882711 B1 KR100882711 B1 KR 100882711B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
udg
uracil
dna
pcr
present
Prior art date
Application number
KR1020070023976A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20080083428A (ko
Inventor
권석태
이미선
김건아
이정현
Original Assignee
성균관대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 성균관대학교산학협력단 filed Critical 성균관대학교산학협력단
Priority to KR1020070023976A priority Critical patent/KR100882711B1/ko
Priority to US11/823,123 priority patent/US7723093B2/en
Publication of KR20080083428A publication Critical patent/KR20080083428A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR100882711B1 publication Critical patent/KR100882711B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/02—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2) hydrolysing N-glycosyl compounds (3.2.2)
    • C12Y302/02027—Uracil-DNA glycosylase (3.2.2.27)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2497—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing N- glycosyl compounds (3.2.2)

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본 발명은 사이크로박터 스피시스 HJ147 균주 유래의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 저온성 세균인 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147) 유래의 우라실-DNA 글리코실라제 (uracil- DNA glycosylase)의 유전자 및 그로부터 유추되는 아미노산 서열, Psp HJ147 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자의 대장균 (Escherichia coli) 내에서 발현 및 정제, 이를 통해서 생산된 UDG의 특성 및 중합효소 연쇄반응 (PCR)에의 이용에 관한 것이다.
본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 우라실을 포함하고 있는 DNA 기질 내에서 우라실 염기를 특이적으로 분해하는 활성이 있고 저온에서 쉽게 변성하는 특징이 있어 dUTP를 이용한 중합효소 연쇄반응 (PCR) 과정 중에서 발생하는 교차 오염을 쉽게 제거 할 수 있다. 따라서 본 발명의 Psp HJ147 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 PCR 반응의 정확도, 순도 및 증폭 효율을 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

사이크로박터 스피시스 ＨＪ147 균주 유래의 우라실-ＤＮＡ 글리코실라제 및 이의 용도 {Uracil-DNA glycosylase of Psychrobacter sp. HJ147 and use thereof}
도 1은 대장균 (Escherichia coli ; E. coli), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae ; Hin), 슈도모나스 데니트리피칸스 (Pseudomonas denitrificans; Pde), 비브리오 파라해몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus; Vpa) 및 해양성 저온균주인 BMTU3346의 아미노산 서열에서 공통적으로 보존된 부분에 해당하는 아미노산 서열을 나타낸 것이다.
도 2는 저온성 균주의 게놈 DNA를 주형으로 하고 고안된 프라이머를 이용하여 수행한 PCR 반응 산물을 아가로스(agarose) 겔에 전기영동하여 나타낸 결과이다(M; 1 kb ladder 마커 DNA, P; Psp HJ147 균주를 주형으로 한 PCR 결과이다).
도 3은 본 발명의 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147; Psp HJ147) 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 전체 유전자의 아미노산 서열을 사이크로박터 크리오할로렌티스 K5 (Psychrobacter cryohalolentis K5; Pcr K5), 아시네토박터 스피시스 ADP1 (Acinetobacter sp. ADP1; Asp ADP1), 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5 (Pseudomonas fluorescens Pf-5; Pfl Pf-5) 및 대장균 (Escherichia coli; E. coli) 균주의 UDG 아미노산 서열과 비교한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 사이크로박터 스피시스 HJ147 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자 의 발현을 위한 재조합 플라스미드 pTPSUDG의 구축 과정을 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 재조합 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 대장균에서 발현시켜 친화성을 이용하여 정제한 것을 전기영동으로 나타낸 것이다 (M: 마커 단백질, 1: 발현을 유도하지 않은 전체 세포질 분획, 2: 발현을 유도한 전체 세포질 분획, 3: IMPACT-CN 시스템을 통해 정제한 분획을 나타낸 것이다).
도 6은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 pH에 따른 효소 활성을 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 7은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 효소의 온도에 따른 효소 활성을 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 8은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 40℃ (●) 및 50℃ (○) 의 온도에서 시간에 따른 상대적인 효소 활성을 나타낸 그래프이다.
도 9은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 NaCl (●) 및 KCl (○) 농도에 따른 효소 활성을 상대적으로 나타낸 그래프이다.
도 10은 본 발명의 UDG (A) 및 대장균의 UDG (B)를 PCR방법으로 증폭시킨 1kb DNA를 25℃에서 시간별로 반응시킨 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 11은 본 발명의 UDG (A) 및 대장균의 UDG (B)를 PCR방법으로 dUTP를 이용하여 증폭시킨 0.5 kb 우라실 함유 DNA (uracil-DNA)를 25℃에서 시간별로 반응시킨 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 12는 본 발명의 UDG (A) 및 대장균의 UDG (B)를 PCR방법으로 dUTP를 이용 하여 증폭시킨 우라실 함유 DNA (0.5kb)를 50℃에서 시간별로 반응시킨 후, 아가로스 겔 전기영동을 통해 확인한 결과이다.
도 13은 1 kb DNA와 0.5 kb 우라실 함유 DNA (uracil-DNA)를 인위적으로 오염시킨 주형 (template)을 본 발명의 UDG 및 대장균의 UDG를 첨가하여 25℃에서 5분간 반응시킨 후 PCR한 것 (A)과 또 25℃에서 반응시키지 않고 바로 PCR한 것 (B)을 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석한 결과이다 (M: 1 kb 마커 DNA, C: 대조군에 UDG를 첨가하지 않은 것, 1: 본 발명의 UDG를 첨가한 것, 2: 대장균 UDG를 첨가한 것임).
본 발명은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제 (uracil-DNA glycosylase)의 효소 특성 및 이의 용도에 관한 것이다.
우라실-DNA 글리코실라제 (uracil-DNA glycosylase; 이하 "UDG" 라고 함)는 손상된 DNA를 회복시키는 효소로써 DNA의 손상부위를 인식하여 DNA 내의 우라실 염기와 데옥시리보오스 당 사이의 N-글리코시드 결합을 가수분해하여 DNA 내에서 손상된 염기를 제거하는 것으로 알려져 있다. 우라실-DNA 글리코실라제는 대장균에서 처음으로 분리되었고, 이 후 바실러스를 포함한 다수의 세균에서 분리 되었으며, 분자량은 약 25내지 35 kDa에 달하고 기질에 대한 특이성, 즉 DNA 내의 염기 중에서 우라실 염기만을 특이적으로 선택하여 제거하는 것으로 알려져 있다[참조: Lindahl, T., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3649-3653, 1974; Cone, R. et al., Biochemistry 16, 3194-3201, 1977].
우라실은 RNA의 염기로서 때때로 DNA 내에서 발견되기도 하는데 이는 사이토신이 자연적으로 탈아미노화 되어 생긴 우라실이 DNA 내로 삽입되거나 DNA 복제 과정 중 dTTP 대신 dUTP가 DNA 내로 잘못 삽입되어 변이가 발생한다. 그러나 우라실-DNA 글리코실라제는 RNA 내의 우라실은 제거하지 않고 DNA내의 우라실 염기만을 특이적으로 제거하여 염기가 제거된 AP (apyrimidinic site) 부위를 만들게 됨으로써 이 부위에 DNA를 수복하는 여러 가지 효소들, 즉 AP 엔도뉴클레이즈, DNA 폴리머레이즈 및 DNA 리가제 등의 작용을 촉진시켜 손상된 또는 변이된 DNA를 복구하는 과정이 진행된다[참조, Chen, R. et al., J Gen Virol. 83, 2339-2345, 2002; Lanes, O. et al., Extremophiles 6, 73-86, 2002].
한편, 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction: PCR)은 내열성 세균 유래의 DNA 합성효소를 이용하여 시험관 내에서 특정 핵산 부위를 대량으로 증폭하여 유용 유전자를 분리하거나 확인하는 기술이다[참조: Erlich, H. A., J Clin Immunol 9, 437-447, 1989; Shin, H. J. et al., J Microbiol Biotechnol 15, 1359-136, 2005]. 이러한 PCR 반응 기술은 핵산의 검출에 필요한 검출한계를 크게 낮추는데 기여하였고, 현재에는 바이러스의 진단, 병원성 세균의 진단 등 질환을 확인하고 판단하는데 매우 유용하게 사용되고 있다. 그러나 여전히 핵산의 농도가 매우 낮은 경우에는 검출하기 어려운 문제점이 있으며 반응 효율이 반응기마다 다르게 나타나는 단점이 있다. 특히 임상 진단 시 시료의 오염은 PCR 후 잘못된 판 정을 가성 양성(false positive)으로 내릴 수 있기 때문에 가장 심각한 문제 중의 하나이다. 이러한 오염으로 인해 시료의 선별, 핵산의 분리 과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 반응과정, 시료의 보관 및 전기영동 후 시료의 회수 과정 등에서 교차 오염 (cross contamination)이 발생하기도 한다. PCR 반응 과정에서의 오염 원인은 시료들 간의 교차 오염, 실험실에서의 DNA 오염 및 증폭 생산물들과 이전 PCR들의 프라이머 (primer)에 의한 동반배출 오염(carryover contamination)이 있는데[참조: Sobek, H. et al., FEBS Lett 388, 1996], 이 중 이러한 교차 오염은 극히 미량 일지라도 목적의 시료와 함께 증폭된다면 기존의 PCR 방법으로는 시료의 오염여부를 구별할 수가 없는 문제점이 발생하게 된다.
따라서, 최근 들어 PCR 과정 중에서 발생하는 교차 오염을 방지하기 위한 방법들이 다수 개발되고 있는데 이러한 방법으로는 dTTP 대신 dUTP를 넣어서 PCR을 수행하는 방법이 Longo 등에 의해 개시된 바 있다[참조, Longo, M. C. et al., Gene 93, 125-128, 1990]. 또한, PCR 개시 전에 시료 내에 주형 DNA와 함께 극소량으로 오염된 우라실 함유 DNA (uracil-DNA)를 제거시키기 위해 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 처리하고, 가열에 의해 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 불활성화 시킨 후, 다시 dTTP 대신 dUTP를 첨가하여 PCR을 수행하는 방법들이 보고된 바 있다[참조: Udaykumar., et al., Nucleic Acids Res. 21, 3917-3918, 1993; Taggart et al., J. Virol. Methods 105, 57-65, 2002]. 그러므로 최근에는 PCR 반응 과정에 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 처리하거나, 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 포함하는 PCR 제품들이 판매되고 있는 추세이다.
대장균을 비롯한 중온성 우라실-DNA 글리코실라제는 60℃ 이상의 고온에서 쉽게 실활되지 않고 활성을 일부 유지하므로 dUTP를 첨가한 PCR 반응에서 증폭된 우라실 염기를 포함하는 DNA 산물이 절단되어 산물이 줄어드는 문제점이 있다. 예로서 역전사 효소 (reverse transcriptase)를 이용한 PCR 반응 (RT-PCR) 첫 단계에서 RNA의 2차 구조를 풀기위해 역전사 효소의 반응 한계 온도 보통 55℃ 내지 60℃ 부근의 온도에서 반응을 수행하기 때문에 변성되지 않고 남아있는 중온성 우라실-DNA 글리코실라제에 의해 dUTP를 첨가한 반응 산물의 양이 현저하게 감소하는 단점이 있다. 따라서 오염된 dUMP를 포함한 DNA를 제거하기 위해 UDG 처리 후에는 반드시 가열하여 UDG를 실활시키는 단계를 거친 후 다시 dUTP를 이용하여 PCR을 수행하여야 하는 번거로움이 있다.
최근에 와서 UDG 처리 후 가열에 의한 UDG를 실활 시키는 별도의 단계를 거치지 않고 바로 PCR, 또는 RT-PCR를 수행 할 수 있도록 열에 불안정한 저온성 UDG 발굴에 관심이 대두되고 있다. 그러나 현재까지 보고된 바로는 열에 쉽게 실활되는 저온성 UDG는 해양성 저온균주 BMTU3346으로부터 분리된 효소 밖에 없다[참조: Jaeger, S. et al., Extremophiles 4, 115-122, 2000].
이에 본 발명자들은 새로운 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 찾으려고 연구를 거듭하던 중, 저온성 세균인 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)로부터 신규한 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 분리하였고, 상기 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)가 25℃에서 안정한 효소활성을 가지고 있으며 50℃에서 쉽게 불활성화 되는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 종래 중온성 우라실-DNA 글리코실라제의 사용으로 인한 문제점을 해결하고, UDG 처리 후 가열에 의한 UDG를 실활 시키는 별도의 단계를 거치지 않고 바로 PCR, 또는 RT-PCR를 수행 할 수 있도록 열에 불안정한 저온성 우라실-DNA 글리코실라제를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 저온성 우라실-DNA 글리코실라제 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 저온성 우라실-DNA 글리코실라제를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공하기 위한 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 PCR 반응용 조성물을 이용한 PCR 반응산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 사이크로박터 스피시스 HJ147 균주 유래의 신규한 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 암호화하는 폴리뉴클리오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환 된 세균을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공한다.
나아가, 본 발명은 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명자들은 새로운 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자를 탐색하기 위하여 저온성 세균을 이용하였다. 이는 상기 저온성 세균이 생산하는 효소는 보통 중온성 세균들이 생산하는 효소와 동일한 기능을 가지고 있으면서 낮은 온도에서 안정하게 효소반응을 수행한다고 알려져 있기 때문이다. 따라서 본 발명자들은 먼저 종래에 알려진 UDG 유전자들의 공통적으로 보존된 부위에 결합하는 프라이머를 제조하고 한국 해양 연구원으로부터 분양받은 저온성 세균 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)의 게놈 DNA를 이용하여 PCR을 수행함으로써 약 324 bp에 해당하는 DNA 산물을 얻었다. 이후, 상기 증폭된 DNA의 염기서열을 분석한 결과, 기존에 보고된 다른 종의 UDG 유전자의 염기서열과 높은 서열 상동성을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 상기 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)로부터 증폭된 DNA로부터 UDG의 완전한 유전자를 얻기 위하여 인버스 (inverse) PCR 방법을 수행하였고 증폭된 PCR 산물의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)로부터 분리된 UDG의 전체 유전자는 총 735 bp의 염기서열로 이루어져 있었고, 총 244 개의 아미노산으로 이루어져 있었으며 단백질 분자량이 약 27.1 kDa임을 추정할 수 있었다. 또한, 도 3에서와 같이 다른 종과의 염기서열 상동성을 비교한 결과, 사이크로박터 크리오할로렌티스 K5 (Psychrobacter cryohalolentis K5)와 89.3%의 상동성을 보였고, 아시네토박터 스피시스 ADP1 (Acinetobacter sp. ADP1)와는 60.6%의 상동성을 보였으며, 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5 (Pseudomonas fluorescens Pf-5)와는 51.2%의 상동성을 보였고 대장균 (Escherichia coli)과의 상동성은 45.4%였다. D (Asp), N (Asn), H (His) 세 가지 아미노산은 UDG의 활성에 관여하는 중요한 아미노산으로 알려져 있는데 도 3에서 보는 바와 같이 세가지 아미노산이 잘 보존되어 있다 [참조: Sartori, A. A. et al., EMBO J 21, 3182-3191, 2002]. 특히 잘 보존된 D (ASP) 85번째와 H (His) 206 번째를 포함한 모티프(motif) A와 모티프 B 영역을 확인 하였다 (도 3 참조).
이에 본 발명자들은 상기의 방법으로 획득한 UDG 유전자로부터 발현된 UDG 효소의 기능을 규명하기 위하여 먼저 UDG 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터에 클로닝 한 후, 상기 발현벡터 (pTPSUDG)를 이용하여 발현용 세균에 형질전환 하였다. 이후, 상기 형질전환 된 세균에서 발현된 본 발명의 UDG 효소를 IMPACT-CN 시스템을 이용하여 정제하였다.
한편, UDG 효소는 DNA 내에서 우리실 염기를 제거하는 효소 활성이 있다고 알려져 있다. 따라서 본 발명의 UDG 효소가 상기와 같은 효소 활성을 가지고 있는지 확인하기 위하여, 우라실이 포함된 DNA 기질을 이용하여 UDG 효소 활성을 측정하였고, 그 결과 본 발명의 UDG 효소가 DNA 기질내의 우라실 염기를 분해하는 것을 확인함으로써 UDG 효소 활성을 가지고 있음을 확인하였다.
또한, 본 발명의 UDG 효소의 최적 활성 pH 및 최적 온도를 확인한 결과, pH 7.0에서 효소 활성이 가장 높게 나타났으며 (도 6 참조), UDG 효소의 최적온도는 25℃인 것을 확인하였다 (도 7 참조). 반면, 30℃ 이후부터는 효소 활성이 급격히 감소하여 거의 활성을 잃는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 현재까지 가장 많이 사용되고 있는 대장균의 UDG 효소 및 기존에 알려진 다른 UDG 효소들이 60℃ 이상의 고온에서도 활성을 가지고 있는 것에 비해서 본 발명의 UDG 효소는 50℃ 이하에서도 쉽게 불활성화 되는 특징이 있다 (도 8 참조).
또한, 본 발명의 UDG 효소의 열에 대한 안정성을 조사한 결과, 50℃에서 단백질의 열 안정성이 급격히 감소하여 5분 이내에 완전히 활성을 잃어버리는 것으로 나타났다 (도 7 참조). 이러한 결과는 상기 최적 온도를 확인한 결과와 동일한 결과를 보임으로써 본 발명의 UDG 효소가 50℃에서 쉽게 불활성화 됨을 다시 한번 확인하였다.
또한, 본 발명의 UDG 효소의 NaCl와 KCl에 대한 조사한 결과 50~75 mM에서 활성이 높게 나타나는 것을 확인할 수 있었다 (도 9 참조).
나아가 본 발명자들은 본 발명의 UDG 효소를 PCR 반응에 응용할 수 있는지 확인하기 위하여 기질특이성 및 열안정성을 확인하였다. 먼저, 본 발명의 UDG 효소의 기질특이성은 dUTP 및 dTTP를 포함하는 기질을 이용하여 확인하였는데 그 결과, 본 발명의 UDG 효소는 기존에 알려진 대장균의 UDG 및 해양성 저온균주인 BMTU의 UDG 효소와 동일하게 dUTP를 포함하는 기질에만 작용 (도 11, 12 참조)하여 분해하 는 것을 확인하였고, 반면 dTTP를 포함하는 기질은 분해되지 않는 것으로 확인하였다 (도 10 참조). 따라서 본 발명의 UDG 효소도 우라실을 포함하는 DNA 기질에만 특이적으로 반응하는 기질특이성을 가지고 있음을 알 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 본 발명의 UDG 효소를 PCR 반응에 응용하였다. 0.5 kb 우라실 DNA (오염 DNA) 주형과 1 kb DNA (정상 DNA) 주형을 임의의 농도로 혼합하여 오염된 DNA를 제조한 후, 여기에 UDG 효소와 dUTP를 포함하는 PCR 혼합물을 모두 한꺼번에 첨가하여 효소 반응 및 PCR 반응을 수행한 결과, 0.5 kb 우라실 DNA (오염 DNA)는 PCR 반응산물이 증폭되지 않았고, 반면에 1 kb DNA (정상 DNA)만 PCR 반응산물이 증폭된 것을 확인할 수 있었다 (도 13 참조). 따라서 본 발명의 사이크로박터 스피시스 HJ147 유래의 UDG 효소는 DNA 기질내에서 우라실 염기만을 특이적으로 선택하여 제거시키는 반응을 하는 것을 알 수 있었다.
따라서 본 발명은 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 제공한다.
상기 우라실-DNA 글라이코실라제(UDG)는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드의 기능적 동등물을 포함한다. 상기 "기능적 동등물"이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 아미노산 서열과 적어도 80%, 보다 바람직하게는 90% 이상이 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 UDG 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, "실질적으로 동질의 생리활성"이란 DNA 내에서 우라실 염기를 특이적으로 분해하는 활성을 의미한다.
또한, 본 발명은 상기 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 암호화하는 폴리뉴클 레오티드를 제공한다. 바람직하게 상기 폴리뉴클레오티드는 염기서열을 가지는 DNA 또는 RNA 일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 자연에서 분리되거나 또는 화학적 합성법에 의해 제조될 수 있다. 그러나 바람직하게는 저온성 세균으로부터 분리될 수 있으며, 더욱 바람직하게는 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)로부터 분리될 수 있다.
상기 본 발명에 따른 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 적합한 발현 벡터내로 삽입되어 숙주세포를 형질전환 할 수 있다. "발현 벡터"라는 용어는 UDG 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열이 삽입 또는 도입될 수 있는 플라스미드, 바이러스 또는 기타 매개체를 의미한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드 서열은 발현 조절 서열에 작동 가능하게 연결될 수 있으며, 상기 작동 가능하게 연결된 유전자 서열과 발현 조절 서열은 선택 마커 및 복제 개시점 (replication origin)을 같이 포함하고 있는 하나의 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. “작동 가능하게 연결 (operably linked)”된다는 것은 적절한 분자가 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 발현 조절 서열일 수 있다. 상기 “발현 조절 서열(expression control sequence)”이란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오티드 서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 상기 플라스미드의 예로는 대장균 유래 플라스미드 (pBR322, pBR325, pUC118 및 pUC119, pET-22b(+)), 바실러스 서브틸러스 유래 플라스미드(pUB110 및 pTP5) 및 효모 유래 플라스미드 (YEp13, YEp24 및 YCp50) 등이 있으며 상기 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스 또는 백시니아 바이러스와 같은 동물 바이러스, 배큘로바이러스와 같은 곤충 바이러스가 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드를 숙주세포에 도입시키는데 적합한 벡터를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 단백질 발현 유도 및 발현된 단백질의 분리가 용이하도록 디자인된 벡터를 사용할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시에서는, 발현벡터 pTYB1 벡터 (New England Biolabs, 미국)에 삽입하여 사이크로박터 스피시스 HJ147의 UDG 효소를 위한 재조합 플라스미드 (pTPSUDG)를 제작하였다. 상기와 같이 구축된 pTPSUDG를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시킨 균주 (Escherichia coli BL21(DE3) / pTPSUDG)를 서울시 서대문구 소재의 한국 미생물 보존센터에 2007년 1월 23일자로 기탁번호 KCCM10838P로서 기탁하였다.
본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 숙주 세포에 도입할 수 있다. 상기 본 발명에 따른 재조합 벡터를 숙주 세포에 도입하는 방법으로는, 이에 한정되지는 않으나, 염화칼슘 (CaCl2) 및 열쇼크 (heat shock) 방법, 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스터 (Silicon carbide whiskers), 초음파 처리 (sonication), 전기천공법 (electroporation) 및 PEG (polyethylenglycol)에 의한 침전법 등을 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 본 발명의 재조합 벡터로 형질 전환된 숙주 세포를 제공한다. 상기 숙주 세포로는 세균 (bacteria)이 바람직하며, 그 예로는 대장균이 있다.
또한, 본 발명은 상기 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 생산하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 상기 형질전환된 숙주 세포내에서 본 발명의 UDG를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 발현되도록 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하는 것을 포함한다. 상기 형질전환된 세포를 배양하여 재조합 단백질을 발현시키는 방법은 당업계에 공지되어 있으며 예를 들면, 형질전환된 세포가 성장할 수 있는 적합한 배지에 접종하여 종배양한 다음, 이를 본 배양용 배지에 접종하고 적합한 조건에서 배양함으로써 단백질의 발현을 유도할 수 있다. 이후, 상기 형질전환된 세포에서 발현이 유도된 본 발명의 UDG 단백질의 분리 및 정제는 당업계에 공지된 다양한 분리 및 정제 방법을 통해 수행할 수 있으며, 예를 들어, 상기 세포를 용해 후, 용해물을 원심분리하여, 염석 (황산암모늄 침전 및 인산나트륨 침전), 용매 침전 (아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 역상 컬럼 크로마토그래피 및 친화성 크로마토그래피 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 UDG 단백질을 생산할 수 있다[참조: Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, cold Spring Habor, N.Y.(1982); Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989); Deutscher, M., Guide to Protein Purification Methods Enzymology, vol. 182. Academic Press. Inc., San Diego, CA(1990)].
또한 본 발명은 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 제공한다.
상기 PCR 반응용 조성물은 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)을 0.5~10 유닛(units)의 농도로 첨가할 수 있으며, 통상적으로 시험관 내에서 특정 핵산 부위를 대량으로 증폭하는 과정에 사용되는 시약, 예를 들면 각 종의 중합효소, 서로 다른 뉴클레오티드 트리포스페이드(dNTP), 특정 핵산 부위와 결합하여 이를 증폭할 수 있는 프라이머 및 적절한 완충액 등을 포함 할 수 있다. 상기 중합효소는 각 종에서 분리된 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제 또는 역전사 효소일 수 있고, 상기 증폭할 수 있는 프라이머란 적절한 완충액 중의 적절한 조건 및 적당한 온도 하에서 주형-지시 DNA 합성의 시작점으로서 작용할 수 있는 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 말한다.
상기 PCR 반응은 당업계에 공지된 모든 PCR 반응의 종류일 수 있으며, 효소와 기질 및 PCR 조성물을 한꺼번에 첨가하여 효소반응을 시킨 후 PCR 반응을 수행하는 직접 PCR (direct PCR) 및 역전사 효소를 사용하는 역전사 효소 PCR 반응 (reverse transcriptase-PCR)을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 우라실 염기를 포함하는 DNA 기질 및 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물을 25~50℃에서 1 ~ 5 분간 반응하는 단계를 포함하는 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법을 제공한다. 상기 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)는 DNA 기질내의 우라실 염기만을 특이적으로 분해하는 활성이 있어 PCR 반응 과정 중에 발생하는 교차오염을 제거하는 특징이 있다. 상기 교차오염은 PCR 반응을 위한 시료의 선별, 핵산의 분리 과정, 시료를 옮기는 과정, 시료의 PCR 반응 과정, 시료의 보관 및 전기영동 후 시료의 회수과정 등에서 발생하는 오염을 말하는 것으로, 바람직하게는 DNA 기질에 외부적으로 첨가된 우라실 염기, 시토신이 자연적으로 탈아미노화 되어 DNA 내로 삽입된 우라실 염기 또는 상기 우라실 염기가 삽입되어 복제된 DNA 내에 존재하는 우라실 염기일 수 있다.
따라서 본 발명에 따른 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법은 우라실 염기가 포함된 기질 및 본 발명의 UDG 단백질을 포함하는 PCR 반응용 조성물을 본 발명의 UDG 단백질이 효소활성을 나타내는 25~50℃에서 1 ~ 5 분간 반응한 후, 당업계에 공지된 방법으로 PCR 반응을 수행함으로써 PCR 반응 산물내의 교차오염을 제거할 수 있다. 또한, 본 발명의 UDG 단백질은 효소 반응 후 , 보통 50℃~60℃의 온도 범위에서 반응하는 대부분의 PCR 반응 과정에서 활성을 잃기 때문에 PCR 반응 산물을 분해하거나 반응 산물의 양이 줄어드는 일을 방지할 수 있다.
본 발명의 일실시예에서는 상기 우라실 염기가 포함된 기질 및 본 발명의 UDG 단백질을 포함하는 PCR 반응용 조성물을 25℃에서 5분간 반응시킨 후 PCR 반응을 수행함으로써 또 심지어는 25℃에서 5분간 반응시키지 않고도 바로 PCR 반응을 수행하여도 본 발명의 UDG 단백질이 PCR 반응과정 중에 발생하는 교차오염은 줄이고 PCR 반응에는 아무런 영향을 미치지 않는 것을 확인하였다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 유전자의 클로닝
본 발명자들은 저온에서도 활성을 가지는 새로운 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자를 탐색하기 위하여 한국 해양연구원에서 후진항 해면에서 분리한 저온성 균주 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)의 게놈 DNA를 분양받았다. 이 균주는 16S rRNA를 이용한 계통분류학상 γ-프로토박테리아에 속하며 사이크로박터 우라티보란스 (Psychrobacter urativorans, GenBank No. AJ609555)의 16S rRNA 염기서열과 99% 상동성을 나타내고 있다. 상기 분양 받은 사이크로박터 스피시스 HJ147 게놈 DNA를 주형으로 하고 기존에 보고된 대장균 (Escherichia coli; E. coli), 해모필루스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae; Hin), 슈도모나스 데니트리피칸스 (Pseudomonas denitrificans: Pde), 비브리오 파라해몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus; Vpa ) 및 해양성 저온균주인 BMTU3346의 UDG 유전자 중에서 잘 보존 된 부위의 아미노산을 참조하여 서열번호 3 및 4의 프라이머를 제작하여 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 3분간 반응 후, 94℃에서 1분, 53℃에서 1분 및 68℃에서 1분간 반응 과정을 5회 반응 후 94℃에서 1분, 57℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 반응 과정을 25회 반복 수행하였고, 72℃에서 10분간 연장반응 후 반응 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 약 324 bp의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다. 또한, QIAquick Gel Extraction 키트(QIAGEN)를 사용하여 상기 1.5% 아가로스 젤에서 이 PCR 반응 산물들을 정제하였고, 이를 pGEM-T Easy 벡터 시스템 I(Promega)을 이용하여 상기 제조업체의 실험방법에 따라 벡터에 클로닝하였다. 상기 클로닝된 DNA를 (주) 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 결정한 후 기존에 알려진 다른 종의 UDG 염기서열과 유사성을 비교한 결과 높은 상동성을 보임을 확인하였다. 따라서 클로닝된 324 bp의 DNA 단편이 사이크로박터 스피시스 HJ147의 UDG 유전자의 일부분임을 확인할 수 있었다.
서열번호 3 프라이머 (P1-1) : 5'-GGNCARGAYCCNTAYCAYGG-3'
서열번호 4 프라이머 (P1-2) : 5'-TTYTTYTGNGCRTGNGMNCCCCA-3'
(상기에서 N은 G, A, T 또는 C 염기일 수 있고, R은 A 또는 G염기일 수 있으며, Y는 C 또는 T 염기일 수 있으며, M은 A또는 C의 염기일 수 있다) (도 1 참조)
실시예 2: 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 전체 유전자의 클로닝
상기 실시예 1에서 이미 확보된 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147) UDG 유전자의 324 bp의 DNA 염기서열을 이용하여 사이크로박터 스피시스 HJ147의 전체 UDG 유전자 클로닝을 아래와 같이 시도하였다. 전체 UDG 유전자를 클로닝하기 위한 방법으로는 인버스 (inverse) PCR 방법을 이용하였다[참조: Ogasawara, N., et al., DNA Res, 1, 1-14, 1994]. 인버스 PCR은 이미 알려진 염기서열을 이용하여 그곳에 연속되어 있으면서 알지 못한 염기서열을 증폭하여 염기서열을 증폭시켜 알 수 있게 하는 방법이다.
먼저, 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147) 균주의 게놈 DNA를 제한 효소 HindIII로 완전히 절단하여 페놀처리하여 정제한 DNA 단편 약 1 ㎍을 취하여 T4 DNA 연결효소 (T4 DNA ligase) 및 반응완충액을 첨가하여 전체 부피 20 ㎕로 하여 16℃에서 밤새도록 자가결찰(self-ligation)시켰다. 이후 상기 연결된 DNA 산물을 주형으로 인버스 PCR을 수행하기 위하여 상기 실시예 1의 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147) 균주로부터 확인된 약 324 bp에 해당되는 UDG의 보존된 유전자의 염기서열을 기본으로 2개의 인터널 프라이머 (internal primer)를 제작하였다(서열번호 5 및 6). 이 2개의 인터널 프라이머와 상기 연결된 DNA 산물을 주형으로 인버스 PCR을 수행하였다. 상기 PCR의 조건은 95℃에서 3분간 반응 후, 94℃에서 50초, 60℃에서 1분 및 72℃에서 3분간 반응 과정을 30회 반복 수행하였고, 72℃에서 10분간 연장반응 후 반응 산물을 0.8% 아가로스 겔에 전기 영동하여 약 828bp의 DNA 단편이 증폭되었음을 확인하였다. 상기 PCR 반응 산물을 (주) 마크로젠사에 의뢰하여 염기서열을 결정하였다. DNASTAR 프로그램을 이용하여 DNA 염기서열을 분석하여 전체 UDG 유전자의 염기서열을 밝혔으며, 또 NCBI 프로그램 (NCBI BLAST program)을 이용하여 사이크로박터 크리오할로렌티스 K5 (Psychrobacter cryohalolentis K5), 아시네토박터 스피시스ADP1 (Acinetobacter sp. ADP1), 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5 (Pseudomonas fluorescens Pf-5) 및 대장균 균주의 UDG 유전자의 염기서열과 유사성을 비교하였다.
인터널 프라이머 서열
서열번호 5 프라이머 (P2-1): 5'-CCCATTGCCTGCCCTGGTC-3'
서열번호 6 프라이머 (P2-2): 5'-GATGTGGTTAATGAACAAACAGAA-3'
그 결과, 상기 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147) 균주로부터 분리된 UDG 유전자의 전체 염기서열은 개시코돈 (ATG)에서 정지코돈 (TAG)을 포함하여 총 735 bp로 이루어져 있었으며 (서열번호 1참조), 총 아미노산은 244개로 이루어져 있었다 (서열번호 2참조). 상기 아미노산의 서열로 본 발명의 UDG 효소의 분자량이 약 27.1 kDa인 것을 추정할 수 있었다.
또한, 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147; Psp HJ147) 균주로부터 분리된 본 발명의 UDG 유전자의 염기서열과 UDG 유전자의 염기서열을 비교한 결과, 사이크로박터 크리오할로렌티스 K5 (Psychrobacter cryohalolentis K5; Pcr K5)의 UDG와 89.3%의 서열상동성을 보였고, 아시네토박터 스피시스 ADP1 (Acinetobacter sp. ADP1; Asp ADP1)의 UDG와 60.6%의 상동성을 보였고, 슈도모나스 플루오레센스 Pf-5 (Pseudomonas fluorescens Pf-5; Pf1 Pf-5)의 UDG와 51.2%의 상동성을 보였고, 대장균 (E. coli)의 UDG 와는 45.4%의 서열 상동성을 보이는 것을 확인할 수 있었다 (도 3 참조). 또한, D (Asp), N (Asn), H (His) 세 가지 아미노산은 UDG의 활성에 관여하는 중요한 아미노산으로 알려져 있는데 도 3에서 보는 바와 같이 세 가지 아미노산이 잘 보존되어 있다 [참조: Sartori, A. A. et al., EMBO J 21, 3182-3191, 2002]. 특히 잘 보존된 D (ASP) 85번째와 H (His) 206 번째를 포함한 모티프 A와 모티프 B 영역을 확인 하였다.
실시예 3: 재조합 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 발현
사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147) 게놈 DNA를 NdeI과 XhoI이 인위적으로 삽입된 서열번호 7 및 8 프라이머를 사용하여 PCR 방법으로 증폭한 UDG 유전자 산물을 NdeI과 XhoI으로 절단한 후, 1.2% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 732 bp 단편 (정지코돈 제외)의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자를 분리하였다. 이렇게 분리한 DNA 단편을 동일한 NdeI과 XhoI 제한효소들로 절단하여 정제하였다. 또한, T7 프로모터를 가지는 발현 벡터 pTYB1의 복수 클로닝부위(multiple cloning site; MCS)을 NdeI과 XhoI으로 절단하여 정제하였다. NdeI과 XhoI으로 절단된 pTYB1 벡터와 NdeI과 XhoI으로 절단된 732 bp의 UDG 유전자를 적당량씩 혼합한 후 T4 DNA 연결효소를 이용하여 16℃에서 하룻밤 동안 연결반응을 시켜 발현 벡터 pTPSUDG를 구축하였다(도 4 참조). 참고로 pTYB1 벡터 (New England Biolabs, 미국)는 7,477 bp로 T7 프로모터(promoter) 다음에 복수 클로닝사이트 (MCS), Sce VMA 인테인(intein), CBD (chhitin binding domain) 순서로 배열되어 있다. 따라서 pTYB1 벡터에 UDG 유전자가 삽입되어 발현되면 Sce VMA 인테인 및 CBD가 함께 융합된 거대분자로 만들어진다. 상기 연결반응을 시켜 구축한 pTPSUDG가 들어 있는 반응액을 이용하여 대장균 BL21 (DE3)에 Hanahan 방법으로 형질전환 시켰다[참조: Hanahan, D. et al., Gene 10, 63-67, 1983]. 이후 형질전환된 균주를 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에 도말하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 암피실린이 첨가된 LB 플레이트에서 생육한 형질전환체들을 다시 소량 배양하여 플라스미드 pTPSUDG를 분리하여 제한효소 NdeI과 XhoI으로 절단한 후 1.2% 아가로즈 겔에 전기 영동하여 732 bp 단편의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 유전자를 확인하므로서 정상적인 발현벡터 pTPSUDG가 구축됨을 확인하였다. 상기와 같이 구축된 pTPSUDG를 대장균 BL21 (DE3)에 형질전환시킨 균주 (Escherichia coli BL21 (DE3) / pTPSUDG)를 서울시 서대문구 소재의 한국 미생물 보존센터에 2007년 1월 23일자로 기탁번호 KCCM10838P로서 기탁하였다.
서열번호 7 프라이머 (P3-1) : 5'-ACATCATATGGAATTATTCGATGAACAAACGC-3'
NdeI
서열번호 8 프라이머 (P3-2): 5'-TTGACTCGAGTTGCGGTAATTGCCAATCGATAG-3'
XhoI
실시예 4: 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 효소의 정제
상기 실시예 3의 방법에 의해 대장균에 형질전환시킨 재조합 균주 (Escherichia coli BL21 (DE3) / pTPSUDG)로부터 본 발명의 UDG 효소를 융합단백질로 발현시키고 발현된 융합단백질로부터 본 발명의 UDG 만을 절단하여 정제하기 위하여 아래와 같이 실시하였다. 상기 실시예 3에서 재조합 플라스미드를 가지고 있는 대장균 BL21 (DE3)를 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 LB 브로스 배지에 접종하여 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 다음, 8 ㎖를 같은 배지 800 ㎖에 접종하여 37℃에서 배양하였다. 600 nm에서의 흡광도가 0.6정도가 되었을 때, IPTG를 최종 농도가 0.1 mM이 되도록 첨가한 이후 하룻밤 동안 배양하였다. 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 균체를 회수한 다음 1 mM PMSF가 포함된 25 ㎖의 초음파처리 완충액(sonication buffer) (20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 0.5 mM NaCl)에 현탁하여 초음파로 파쇄한 후 18,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 대장균 세포 파편(cell debris) 을 제거하였다. 이후 모든 과정은 발현된 재조합 융합단백질로부터 UDG효소를 절단하고 동시에 UDG 만을 정제하기 위하여 4℃에서 아래와 같이 실시하였다. 침전물을 제거하고 상층만을 취한 세포 파쇄액을 친화성 컬럼(affinity column)인 IMPACT (Intein Mediated Purification with an Affinity Chitin-binding Tag, BioLabs)에 로딩(loading)하여 IMPACT 컬럼에 용합 단백질(fusion protein)만을 결합시킨 후 컬럼 세척 완충액(column washing buffer) [20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl, 0.1 mM EDTA]로 컬럼의 10 배로 세척한 후 인테인에 의한 융합 단백질의 절단을 위해 분할 완충액(cleavage buffer) (30 mM DTT가 첨가된 컬럼 세척 완충액)를 컬럼에 채우고 하룻밤 동안 방치 시킨 후 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 500 mM NaCl 및 0.1 mM EDTA가 첨가된 용리 완충액(elution buffer)으로 세척함으로써 본 발명의 UDG 효소만 분리하였다. 본 발명의 UDG 활성을 나타내는 분획물을 모은 후 다시 20 mM Tris-HCl (pH 8.0)와 50 mM KCl이 첨가된 완충액으로 투석시켰다.
그 결과 재조합 플라스미드 pTPSUDG에서 사이크로박터 스피시스 HJ147 UDG를 정제하였다 (도 5 참조). 도 5의 레인(lane) M은 저분자량 마커 (low-molecular-mass markers), 레인 1은 발현 유도시키지 않은 형질전환 재조합균주이다. 도 5의 레인 2에서 융합단백질의 분자량은 약 85,000 Da으로 발현되었으며, 레인 3에서는 IMPACT-CN 시스템을 거치면서 인테인 절단에 의한 키틴 결합 단백질(chitin binding protein) 부분이 제거된 약 27,000 Da의 분자량으로 나타났으며 이는 본 발명 UDG의 DNA 서열을 환산한 분자량 27,173 Da과 거의 일치하였다. 정제된 효소의 특이적 활성도(specific activity)는 2,768 U/mg 이다.
실시예 5: 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 활성 측정 및 정제수율
본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 효소활성 측정은 Lanes 등의 방법[참조: Secades, P., et al., FEMS Microbiol. Lett. 226, 273-279, 2003]을 이용하여 PCR 기술에 의한 인위적인 [3H]-UMP DNA 기질을 제조하고 이를 이용하여 측정하였다.
<5-1> PCR에 의한 기질 제조
상기 실시예 4에서 정제된 본 발명의 재조합 UDG 효소의 활성을 측정하기 위하여 약 1.8 kb DNA 단편 (Staphylothermus marinus DNA ligase gene)을 주형(template)과 프라이머들을 (서열번호 9, 서열번호 10) 이용하여[참조: Seo, M. et al., J. Biotech. 128, 519-530, 2007], PCR 기술에 의한 우라실 함유 DNA (uracil-DNA) 기질을 제조하였다. PCR (100 ㎕) 혼합물 조성은 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 최종농도 0.15 mM씩 각각 첨가하였고, dUTP내에는 약 2.0 uM의 데옥시[5-3H] 우리딘-5-트리포스페이트 ([3H]-dUTP) (5-30 Ci/mmol, GE Healthcare, code No. TRK351)가 포함되었으며, 700 pg 주형 DNA, 10 pmol PCR 프라이머 , 5U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제 ((주)렉스진바이오텍)와 10x 수퍼 텍 완충액 II를 사용하였다. PCR 반응은 94℃에서 50초, 60℃에서 1분, 72℃에서 3분 30초로 30회 실시하였다. 증폭된 [3H]-dUTP DNA 기질을 NAP-5 컬럼 (Amersham Bioscience)을 이용하여 미반응 [3H]-dUTP를 제거하였다. 기질의 DNA 량은 약 65 pg/㎕이고 특이적 활성도는 약 8,020 cpm/㎕이다.
서열번호 9 프라이머(P4-1):5'-AGGATTACATATGGCTGCACAGCAGAGCGAA-3'
서열번호 10 프라이머(P4-2):5'-ATAACTCGAGTTCAGATAATTTCTTTAGTTGTCTTTT-3'
<5-2> 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)의 활성측정
본 발명에 따른 UDG의 기본적인 활성 측정방법으로 50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 2 ug/㎖ BSA, 1 mM DTT, [3H]-dUTP DNA 기질 7 ㎕ (약 455 pg, 56,140 cpm), UDG 효소 1 ㎕를 사용하였고 최종 20 ㎕ 용액으로 하였다. 반응 혼합액을 25℃ 10분간 반응시킨 후, 얼음 속에서 얼음-냉각 단일가닥 송아지-흉선(ice-cold single-stranded calf-thymus) DNA (1 mg/㎖) 20 ㎕와 200 ㎕의 25% (w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid, TCA)을 첨가하였다. 얼음 속에서 15분간 방치한 후 13,000 rpm에서 20분간 원심분리한 후, 산-용융성(acid-soluble) [3H]-우라실을 함유하는 상층 120 ㎕를 회수하여 Beckman LS 6800 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 측정하였다. UDG의 1 유닛은 25℃에서 1분간 기질로부터 1 pmol [3H]-우라실 유리하는 효소량으로 정하였다.
본 발명에서 800 ㎖의 LB 브로스에서 배양한 재조합균주를 회수하여 균체를 파쇄한 후 친화성 컬럼인 IMPACT를 이용하여 절단, 정제한 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 총 활성은 4,125 U/mg이며 특이적 활성도는 2,768 U/mg 이다.
<5-3> 최적활성 pH의 결정
본 발명의 UDG 효소의 최적 활성 pH를 결정하기 위하여 pH 5.5 내지 10.0의 범위에서 0.5의 간격으로 pH를 달리하면서 상기 <5-2>에서 수행한 방법과 동일한 방법으로 UDG 효소의 활성을 측정하였다. 이때, pH 5.5 내지 6.5의 범위에서는 50 mM 매스-수산화나트륨 (MES-NaOH) 완충용액을 사용하였으며, pH 6.5 내지 7.5의 범위에서는 50 mM 몹스-수산화나트륨 (Mops-NaOH) 완충용액을 사용하였고, pH 7.5 내지 9.0의 범위에서는 50 mM Tris-HCl 완충용액을 사용하였다.
그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 활성도는 pH 7.0 내지 7.5에서 높게 나타나고 있음을 확인함으로써 상기 pH 7.0 내지 7.5의 범위가 본 발명에 따른 효소의 최적 pH 범위임을 알 수 있었다. 특히, 몹스-수산화나트륨 (Mops-NaOH) 완충용액을 사용한 pH 7.0및 Tris-HCl 완충용액을 사용한 pH 7.5에서 효소의 활성이 가장 높게 나타났다. 반면 pH 6.5 이하와 pH 8.0 이상에서 본 발명의 UDG 효소의 활성도가 급격히 감소하는 것으로 나타났다.
<5-4> 최적 온도의 결정
본 발명에 따른 UDG 효소의 최적 온도를 측정하기 위해 10℃ 내지 80℃까지의 온도범위에서 5℃ 내지 10℃간격으로 반응 온도를 다양하게 하면서 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 효소의 활성측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 최적 반응 온도는 25℃인 것으로 나타났으며, 특히, 30℃ 이후부터는 효소의 활성이 급격히 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
<5-5> 열 안정성 측정
본 발명에 따른 UDG 효소의 열 안전성을 측정하기 위해 상기 <5-2>의 반응 혼합액을 25℃, 40℃ 및 50℃에서 반응시키면서 각 시간별 (0, 1, 1.5, 2, 2.5, 3, 4, 5 및 10분, 6시간, 12시간, 24시간)로 시료를 채취하여 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 효소의 효소 활성 측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.
그 결과, 본 발명에 따른 UDG 효소를 40℃ (●) 및 50℃ (○)에서 5~10분간 반응시켰을 때 40℃에서 2분에 50% 정도 활성을 유지하는 것을 알 수 있었으며, 25℃는 24시간 동안 활성이 유지된 것을 알 수 있었다(미도시). 그러나 50℃에서는 효소의 열 안전성이 급격히 감소하여 2분 30초 이내에 활성이 거의 0에 가깝게 나타나는 것을 확인하였다(도 8 참조). 따라서 본 발명의 UDG 효소는 기존에 알려진 대장균의 UDG 효소가 60℃ 이상에서도 활성을 가지고 있는 것에 비해 낮은 온도에서도 쉽게 활성을 잃어버린다는 것을 알 수 있었다.
<5-6> 최적 NaCl과 KCl 결정
본 발명에 따른 UDG 효소의 최적 NaCl (●)과 KCl (○)을 측정하기 위해 0 내지 200 mM 까지의 범위에서 25 mM 간격으로 농도를 다양하게 하면서 상기 <5-2>에서 수행한 UDG 효소의 활성측정 방법과 동일한 방법으로 효소반응의 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 UDG 효소의 최적 NaCl과 KCl은 50 내지 75 mM인 것을 확인할 수 있었다.
실시예 6: 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG) 효소의 기질특이성 및 50℃ 실활 확인
<6-1> PCR 에 의한 0.5 kb 우라실 -DNA와 1 kb DNA 기질 제조
본 발명 UDG 효소를 PCR에 응용하기 위해서는 우라실-DNA만 분해시키는 기질특이성과 가열에 의해 쉽게 실활 되는 특성을 갖는 것이 필요하다.
먼저 PCR를 이용하여 Lambda DNA를 주형으로 0.5 kb 우라실-DNA (오염 DNA) 기질 및 1 kb DNA (정상 DNA) 기질 2종류 기질을 제조하였다. 0.5 kb 우라실-DNA 기질과 1 kb DNA 기질의 증폭을 위하여 프라이머 서열번호 11, 12, 13와 14의 프라이머들을 각각 합성하였다. 먼저 0.5 kb 우라실-DNA 기질 합성을 위한 PCR 조건은 다음과 같다. 100 ㎕의 PCR 혼합물로 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP를 최종농도가 0.25 mM씩 되도록 각각 첨가하였고, 100 ng의 lambda DNA, 서열번호 11와 12로 각각 표시되는 프라이머 각각 10 pmole, 2.5 U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제 및 10x 수퍼 텍 완충액 II를 첨가하였다. PCR 반응은 94℃에서 50초, 58℃ 1분, 72℃ 2분 30초를 30회 반복 실시하였다. 1 kb DNA 기질 합성을 위한 PCR 조건은 dUTP를 첨가하는 대신에 dTTP를 첨가하고 서열번호 13과 서열번호 14의 프라이머를 각각 첨가 한다는 조건 외에는 상기의 0.5 kb 우라실-DNA 기질 합성 방법과 동일하다. 2 종류의 기질을 PCR를 이용하여 제조한 후 PCR 정제 키트를 사용하여 PCR 반응 산물을 순수 분리하여 각각의 기질로 사용하였다.
① 0.5 kb 프라이머
서열번호 11 프라이머 (P5-1): 5'-AATAACGTCGGCAACTTTGG-3'
(람다 게놈 서열(lambda genome sequence) NO. 14074-14093)
서열번호 12 프라이머 (P5-2): 5'-GTTACGCCACCAGTCATCCT-3'
(람다 게놈 서열(lambda genome sequence) NO. 14556-14575)
② 1 kb 프라이머
서열번호 13 프라이머 (P6-1): 5'-CAAAGGCGGTTAAGGTGGTA-3'
(람다 게놈 서열(lambda genome sequence) NO. 20791-20810)
서열번호 14 프라이머 (P6-2): 5'-GGCTGTACCGGACAATGAGT-3'
(람다 게놈 서열(lambda genome sequence) NO. 21768-21787)
<6-2> 1 kb DNA 기질의 UDG 처리 효과
정제된 본 발명 UDG 효소 0.5 U와 반응완충용액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 2 ug/㎖ BSA, 1 mM DTT)에 1 kb DNA 기질 1 ug을 혼합하여 최종 20 ㎕ 용액으로 한 후, 25℃에서 1 내지 5분간 효소 반응을 시킨 후 95℃에서 5분간 열처리하여 효소의 활성을 불활성시킨 후 1 % 아가로스 겔 전기연동으로 확인하였다 (도 10의 A). 도 10의 B는 대장균의 UDG를 같은 방법으로 처리하여 동일한 방법으로 확인하였다. 도 10의 A에서 레인 M은 1 kb ladder, 레인 C는 UDG를 처리하지 않은 컨트롤 1 kb DNA이다. 레인 0-5는 UDG 첨가 후 반응시간이다. PCR 방법으로 증폭한 1 kb DNA (lambda DNA를 주형) 기질에 본 발명의 UDG 및 대장균의 UDG를 각각 첨가하여 25℃에서 시간에 따라 각각 처리해보았다. 두 UDG 모두에 의해 DNA 기질이 전혀 분해되지 않음을 확인하였다.
<6-3> 0.5 kb 우라실 DNA (uracil-DNA) 기질의 UDG 처리 효과
정제된 본 발명 UDG 효소 0.5 U와 반응완충용액 (50 mM Tris-HCl (pH 8.5), 50 mM KCl, 1 mM EDTA, 2 ug/㎖ BSA, 1 mM DTT)에 0.5 kb 우라실 DNA 기질 1 ug을 혼합하여 최종 20 ㎕ 용액으로 한 후, 25℃에서 1 내지 5분간 효소 반응을 시킨 후 95℃에서 5분간 열처리하여 효소의 활성을 불활성시킨 후 1 % 아가로스 겔 전기영동에서 확인하였다 (도 11의 A). 도 11의 B는 대장균의 UDG를 같은 방법으로 처리하여 동일한 방법으로 확인하였다. 도 11의 A에서 레인 M은 1kb ladder, 레인 C는 UDG를 처리하지 않은 컨트롤 0.5 kb DNA이다. 레인 0-5는 UDG 첨가 후 반응시간이다. PCR 방법으로 증폭한 0.5 kb 우라실 DNA 기질에 본 발명의 UDG 및 대장균의 UDG를 각각 첨가하여 25℃에서 시간에 따라 각각 처리해보았다. 두 UDG 모두에 의해 우라실 DNA 기질이 완전히 분해됨을 확인하였다. 따라서 본 발명의 UDG는 우라실 DNA 기질만을 선택적으로 분해하는 것을 알 수 있었다.
<6-4> 0.5 kb 우라실 DNA (uracil-DNA) 기질의 50℃에서 UDG 처리 효과
본 연구에서는 우라실-DNA 글리코시라제의 PCR에 쉽게 이용하기 위해서는 열에 불안정한 UDG를 확보하는데 있다. 실제로 PCR 방법으로 증폭한 0.5 kb 우라실-DNA 기질에 본 발명의 UDG (도 12의 A) 및 대장균의 UDG (도 12의 B) 효소를 각각 첨가하여 50℃에서 시간에 따라 각각 처리해보았다 (도 12). 도 12에서 본 발명 UDG의 경우 50℃에서 2분까지는 기질을 분해하지만 3분 후 부터는 실활하여 기질을 분해하지 못함을 알 수 있다 (도 12의 A). 이러한 결과는 이미 도 8에서 관찰한 본 발명의 UDG의 내열성 연구에서 본 발명의 UDG의 효소활성이 2분 30초 내에 100% 실활 된 연구 결과와 일치하였다. 반면에 대장균의 UDG의 경우 50℃에서 안정하여 0.5 kb 우라실-DNA를 전부 분해하였다 (도 12의 B). 이러한 연구결과는 본 발명의 UDG가 대장균의 UDG 보다 저온에서 쉽게 불활성화 된다는 것을 알 수 있었으며, 이를 이용한 한 단계(one step) PCR 및 RT-PCR에 이용가능하다는 것을 의미한다.
실시예 7: 본 발명의 우라실-DNA 글리코실라제 (UDG)의 PCR 응용
본 발명의 UDG을 이용하여 실시예 7에서 제조한 0.5 kb 우라실-DNA (오염 DNA)와 1 kb DNA (정상 DNA)를 이용하여 인위적으로 우라실-DNA를 오염시킨 2가지 혼합기질을 만든 후 목적의 1 kb DNA만을 선택적으로 증폭가능한지를 확인하였다.
먼저 간접 PCR은 PCR 용액내에 0.5 U의 UDG를 첨가하여 PCR 혼합용액내에 들어 있는 오염된 우라실-DNA를 제거하기 위해 25℃에서 5분간 인큐베이션한 후 PCR을 수행한 것이고, 직접 PCR은 25℃에서 인큐베이션 없이 바로 PCR를 수행한 것이다. PCR 혼합용액은 상기와 같은 방법으로 제조된 0.5 kb 우라실-DNA 기질과 1 kb DNA 기질을 각각 1:1로 인위적으로 혼합시킨 각각 100 ng 기질, 0.5 U의 UDG, 1 U 수퍼 텍 DNA 폴리머라제, 0.25 mM의 dATP, dCTP, dGTP 및 dUTP, 프라이머 5 pmole 및 10x 수퍼 텍 완충액 II이다. 이들 PCR 혼합용액을 간접 PCR 또는 직접 PCR를 수행하였다. 상기 PCR 반응은 94℃에서 50초, 58℃에서 1분 및 72℃에서 1분 30초를 20회 반복 수행하였고, PCR 반응 산물은 1% 아가로스 겔에 전기영동하여 확인하였다.
그 결과, 본 발명의 UDG와 대장균의 UDG를 각각 0.5 U 첨가한 후 간접 PCR (25℃에서 5분간 인큐베이션시킨 후 PCR 반응)을 수행한 후, 1% 아가로즈 겔에 전기영동한 결과 오염된 0.5 kb 우라실-DNA 밴드(band)만 사라지고 정상적인 1 kb DNA 밴드는 증폭되었다 (도 13의 A). 이는 저온에서도 UDG가 작용하여 오염된 우 라실-DNA를 확실히 제거한다는 것을 알 수 있다. 그러나 정상적인 1 kb DNA PCR 증폭 효율에서는 본 발명의 UDG가 대장균 UDG보다 훨씬 높다는 것을 알 수 있다 (도 13의 A). 실제 전기영동한 아가로스 겔을 Labwork 4.6 (densitometer)으로 측정한 결과 본 발명의 UDG가 대장균의 UDG 보다 약 5배 정도 증폭이 잘 되는 것을 확인하였다.
또한 이 우라실-DNA가 오염된 DNA를 주형으로 직접 PCR (25℃에서 인큐베이션없이 바로 PCR) 반응물을 전기영동한 결과 1 kb DNA 밴드만 나타나고 오염된 0.5 kb 우라실-DNA 밴드가 전혀 나타나지 않았다 (도 13의 B). 이는 4℃ 얼음 내에서 PCR 반응물들을 혼합하는 동안에도 UDG 효소가 작용하여 분해한다는 것을 의미한다. 정상적인 1 kb DNA PCR 증폭 효율에서는 본 발명의 UDG가 대장균의 UDG 보다 훨씬 높다는 것을 알 수 있다 (도 13의 B). 이러한 결과는 상기의 간접 PCR과 같은 결과를 보였다.
이러한 현상은 대장균의 UDG가 본발명의 UDG 보다 내열성을 갖기 때문에 초기 PCR 과정에서 우라실 함유 PCR 산물들을 분해하기 때문에 PCR 사이클(cycle) 수가 증가하면 증가할수록 PCR 산물의 차이가 나타나는 것으로 고려된다.
따라서 dTTP 대신에 dUTP를 이용한 PCR 과정에서 본 발명의 UDG를 함께 사용한다면 우라실-DNA의 교차오염 없이 정확한 결과를 얻을 수 있기 때문에 임상진단에 적합한 효소라고 사료된다.
이상에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규한 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)는 저온성 세균인 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)로부터 분리된 효소로써 우라실을 포함하고 있는 DNA 기질 내에서 우라실 염기를 분해하는 활성이 있고 저온에서 쉽게 변성하는 특징이 있어 PCR 반응 과정 중에서 발생하는 교차 오염을 제거함으로써 유전공학 및 분자생물학 실험, 바이러스 유전자 및 암 유전자의조기 판단, 유전병 판단 및 법의학에 이르는 광범위한 분야에서 널리 사용되고 있는 dUTP를 이용한 PCR 반응에 응용함으로써 PCR 반응의 정확도 (허위 양성 제거), 순도 및 증폭 효율을 증가시키는데 효과적으로 사용될 수 있다.
<110> SUNGKYUNKWAN UNIVERSITY Foundation for Corporate Collaboration <120> Uracil-DNA glycosylase of Psychrobacter sp. HJ147 and use thereof <130> IPM-33005 <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 735 <212> DNA <213> Uracil-DNA glycosylase from Psychrobacter sp. HJ147 <400> 1 atggaattat tcgatgaaca aacgccaaaa acgccagcgc aaaaacaagc aattttagac 60 aatgtgcgct tgccagaaga ttggaaaacg gcgttagcag acgagttaac ttctaacaat 120 atggacgact tgcgtgcgtt tttaaaagaa gcctatcaat cagaaaacag tatctatccg 180 ccagcacctt taatatttaa tgcgttaaac ctgacccctt tatcacaaat taaagtcgtg 240 atactagggc aggatccgta tcatggacca gggcaggcaa tgggcttatc gttttcagtg 300 cccaaagtca ttccaaagcc accctcactc aataatttgt taaaagagat ggcaagtgac 360 gttggtatcg caccctcaaa acatggcgac ctgacttact gggcgcagca aggagttttg 420 ctattaaata gctctctgac cgtgcgagaa agtgagccaa atagccatca aaataaaggt 480 tgggagcagt ttaccgatgc ggtgattgat gtggttaatg aacaaacaga acataccgta 540 tttatattgt ggggctctca tgcacaaaaa agcaaatata tcaatactga taagcatctt 600 attctcaccg ctgtacaccc atcaccacta gctgccaatc gtggtggatt ctttggttcc 660 aagccgtttt ctaagaccaa tgattatctg gtacagtatg ggcaaacgcc tatcgattgg 720 caattaccgc aatag 735 <210> 2 <211> 244 <212> PRT <213> Uracil-DNA glycosylase from Psychrobacter sp. HJ147 <400> 2 Met Glu Leu Phe Asp Glu Gln Thr Pro Lys Thr Pro Ala Gln Lys Gln 1 5 10 15 Ala Ile Leu Asp Asn Val Arg Leu Pro Glu Asp Trp Lys Thr Ala Leu 20 25 30 Ala Asp Glu Leu Thr Ser Asn Asn Met Asp Asp Leu Arg Ala Phe Leu 35 40 45 Lys Glu Ala Tyr Gln Ser Glu Asn Ser Ile Tyr Pro Pro Ala Pro Leu 50 55 60 Ile Phe Asn Ala Leu Asn Leu Thr Pro Leu Ser Gln Ile Lys Val Val 65 70 75 80 Ile Leu Gly Gln Asp Pro Tyr His Gly Pro Gly Gln Ala Met Gly Leu 85 90 95 Ser Phe Ser Val Pro Lys Val Ile Pro Lys Pro Pro Ser Leu Asn Asn 100 105 110 Leu Leu Lys Glu Met Ala Ser Asp Val Gly Ile Ala Pro Ser Lys His 115 120 125 Gly Asp Leu Thr Tyr Trp Ala Gln Gln Gly Val Leu Leu Leu Asn Ser 130 135 140 Ser Leu Thr Val Arg Glu Ser Glu Pro Asn Ser His Gln Asn Lys Gly 145 150 155 160 Trp Glu Gln Phe Thr Asp Ala Val Ile Asp Val Val Asn Glu Gln Thr 165 170 175 Glu His Thr Val Phe Ile Leu Trp Gly Ser His Ala Gln Lys Ser Lys 180 185 190 Tyr Ile Asn Thr Asp Lys His Leu Ile Leu Thr Ala Val His Pro Ser 195 200 205 Pro Leu Ala Ala Asn Arg Gly Gly Phe Phe Gly Ser Lys Pro Phe Ser 210 215 220 Lys Thr Asn Asp Tyr Leu Val Gln Tyr Gly Gln Thr Pro Ile Asp Trp 225 230 235 240 Gln Leu Pro Gln <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer, P1-1 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> A or G <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> C or T <400> 3 ggncargayc cntaycaygg 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer, P1-2 <220> <221> misc_feature <222> (3) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (6) <223> C or T <220> <221> misc_feature <222> (9) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (12) <223> A or G <220> <221> misc_feature <222> (15) <223> G, A, T or C <220> <221> misc_feature <222> (17) <223> A or C <220> <221> misc_feature <222> (18) <223> G, A, T or C <400> 4 ttyttytgng crtgngmncc cca 23 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal primer: P2-1 <400> 5 cccattgcct gccctggtc 19 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Internal primer: P2-2 <400> 6 gatgtggtta atgaacaaac agaa 24 <210> 7 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P3-1 <400> 7 acatcatatg gaattattcg atgaacaaac gc 32 <210> 8 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P3-2 <400> 8 ttgactcgag ttgcggtaat tgccaatcga tag 33 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P4-1 <400> 9 aggattacat atggctgcac agcagagcga a 31 <210> 10 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P4-2 <400> 10 ataactcgag ttcagataat ttctttagtt gtctttt 37 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P5-1 <400> 11 aataacgtcg gcaactttgg 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P5-2 <400> 12 gttacgccac cagtcatcct 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P6-1 <400> 13 caaaggcggt taaggtggta 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer: P6-2 <400> 14 ggctgtaccg gacaatgagt 20

Claims (11)

  1. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 사이크로박터 스피시스 HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG).
  2. 제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 암호화하는, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드.
  3. 제2항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 갖는 우라실-DNA 글리코실라제(UDG) 폴리뉴클레오티드.
  4. 제3항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 사이크로박터 스피시스HJ147 (Psychrobacter sp. HJ147)로부터 분리된 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터 pTPSUDG (KCCM10838P).
  6. 제5항의 벡터로 형질전환된 세균.
  7. 제6항의 형질전환된 세균을 배양하는 단계를 포함하는 제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 생산하는 방법.
  8. 제1항의 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)를 포함하는 PCR 반응용 조성물.
  9. 제 8항에 있어서, 우라실-DNA 글리코실라제(UDG)가 0.5 내지 10 유닛의 농도이고, 중합효소, 서로 다른 뉴클레오티드 트리포스페이트, 특정 핵산 부위와 결합하여 증폭할 수 있는 프라이머, 및 완충액을 추가로 포함하는 PCR 반응용 조성물.
  10. 제8항의 PCR 반응용 조성물을 50℃ 이하에서 PCR 반응 산물과 PCR 반응 이전에 반응시키거나, PCR 반응과 함께 반응시켜서 우라실 염기를 포함하는 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 단계가 25 내지 50℃에서 1 내지 5분간 수행됨을 특징으로 하는 PCR 반응 산물의 교차오염을 제거하는 방법.
KR1020070023976A 2007-03-12 2007-03-12 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도 KR100882711B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070023976A KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2007-03-12 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
US11/823,123 US7723093B2 (en) 2007-03-12 2007-06-26 Uracil-DNA glycosylase of Psychrobacter sp. HJ147 and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020070023976A KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2007-03-12 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20080083428A KR20080083428A (ko) 2008-09-18
KR100882711B1 true KR100882711B1 (ko) 2009-02-06

Family

ID=40024104

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020070023976A KR100882711B1 (ko) 2007-03-12 2007-03-12 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도

Country Status (2)

Country Link
US (1) US7723093B2 (ko)
KR (1) KR100882711B1 (ko)

Families Citing this family (49)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102009029194A1 (de) * 2009-09-04 2011-04-07 Kimberly-Clark Worldwide, Inc., Neenah Abtrennung gefärbter Stoffe aus wasserhaltigen Flüssigkeiten
US9315857B2 (en) 2009-12-15 2016-04-19 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse label-tags
US8835358B2 (en) 2009-12-15 2014-09-16 Cellular Research, Inc. Digital counting of individual molecules by stochastic attachment of diverse labels
BR122020001802B1 (pt) 2010-10-22 2021-05-18 T2 Biosystems, Inc métodos para detectar a presença de um patógeno em uma amostra de sangue total e para detectar um analito em uma amostra
US8563298B2 (en) 2010-10-22 2013-10-22 T2 Biosystems, Inc. NMR systems and methods for the rapid detection of analytes
ES2663234T3 (es) 2012-02-27 2018-04-11 Cellular Research, Inc Composiciones y kits para recuento molecular
US11177020B2 (en) 2012-02-27 2021-11-16 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods and uses for molecular tags
US9220646B2 (en) 2012-03-30 2015-12-29 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Absorbent articles with improved stain decolorization
AU2014279672A1 (en) * 2013-06-13 2015-12-10 Vela Operations Singapore Pte. Ltd. Improved NGS workflow
AU2014312208B2 (en) 2013-08-28 2019-07-25 Becton, Dickinson And Company Massively parallel single cell analysis
US9237975B2 (en) 2013-09-27 2016-01-19 Kimberly-Clark Worldwide, Inc. Absorbent article with side barriers and decolorizing agents
EP3055676A1 (en) 2013-10-07 2016-08-17 Cellular Research, Inc. Methods and systems for digitally counting features on arrays
GB2527115A (en) * 2014-06-12 2015-12-16 Vela Operations Pte Ltd Improved NGS workflow
EP3204520B1 (en) * 2014-10-08 2020-02-12 Cornell University Method for identification and quantification of nucleic acid expression, splice variant, translocation, copy number, or methylation changes
ES2824700T3 (es) 2015-02-19 2021-05-13 Becton Dickinson Co Análisis unicelular de alto rendimiento que combina información proteómica y genómica
US9727810B2 (en) 2015-02-27 2017-08-08 Cellular Research, Inc. Spatially addressable molecular barcoding
CN107406888A (zh) 2015-03-30 2017-11-28 赛卢拉研究公司 用于组合条形编码的方法和组合物
CN107580632B (zh) 2015-04-23 2021-12-28 贝克顿迪金森公司 用于全转录组扩增的方法和组合物
US11124823B2 (en) 2015-06-01 2021-09-21 Becton, Dickinson And Company Methods for RNA quantification
JP6940484B2 (ja) 2015-09-11 2021-09-29 セルラー リサーチ， インコーポレイテッド ライブラリー正規化のための方法および組成物
ES2956757T3 (es) 2016-05-02 2023-12-27 Becton Dickinson Co Codificación con códigos de barras moleculares precisa
US10301677B2 (en) 2016-05-25 2019-05-28 Cellular Research, Inc. Normalization of nucleic acid libraries
EP3465502B1 (en) 2016-05-26 2024-04-10 Becton, Dickinson and Company Molecular label counting adjustment methods
US10640763B2 (en) 2016-05-31 2020-05-05 Cellular Research, Inc. Molecular indexing of internal sequences
US10202641B2 (en) 2016-05-31 2019-02-12 Cellular Research, Inc. Error correction in amplification of samples
KR102522023B1 (ko) 2016-09-26 2023-04-17 셀룰러 리서치, 인크. 바코딩된 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 시약을 이용한 단백질 발현의 측정
JP7232180B2 (ja) 2016-11-08 2023-03-02 ベクトン・ディキンソン・アンド・カンパニー 発現プロファイル分類の方法
WO2018089377A1 (en) 2016-11-08 2018-05-17 Cellular Research, Inc. Methods for cell label classification
CN106754823A (zh) * 2016-12-28 2017-05-31 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 一种尿嘧啶dna糖苷酶的制备方法及其应用
ES2961580T3 (es) 2017-01-13 2024-03-12 Cellular Res Inc Revestimiento hidrófilo de canales de fluidos
US11319583B2 (en) 2017-02-01 2022-05-03 Becton, Dickinson And Company Selective amplification using blocking oligonucleotides
WO2018226293A1 (en) 2017-06-05 2018-12-13 Becton, Dickinson And Company Sample indexing for single cells
US11946095B2 (en) 2017-12-19 2024-04-02 Becton, Dickinson And Company Particles associated with oligonucleotides
EP3788170A1 (en) 2018-05-03 2021-03-10 Becton, Dickinson and Company Molecular barcoding on opposite transcript ends
CN112272710A (zh) 2018-05-03 2021-01-26 贝克顿迪金森公司 高通量多组学样品分析
CN112805389A (zh) 2018-10-01 2021-05-14 贝克顿迪金森公司 确定5’转录物序列
CN112969789A (zh) 2018-11-08 2021-06-15 贝克顿迪金森公司 使用随机引发的单细胞全转录组分析
WO2020123384A1 (en) 2018-12-13 2020-06-18 Cellular Research, Inc. Selective extension in single cell whole transcriptome analysis
US11371076B2 (en) 2019-01-16 2022-06-28 Becton, Dickinson And Company Polymerase chain reaction normalization through primer titration
CN113574178A (zh) 2019-01-23 2021-10-29 贝克顿迪金森公司 与抗体关联的寡核苷酸
US11965208B2 (en) 2019-04-19 2024-04-23 Becton, Dickinson And Company Methods of associating phenotypical data and single cell sequencing data
CN114051534A (zh) 2019-07-22 2022-02-15 贝克顿迪金森公司 单细胞染色质免疫沉淀测序测定
EP4055160B1 (en) 2019-11-08 2024-04-10 Becton Dickinson and Company Using random priming to obtain full-length v(d)j information for immune repertoire sequencing
EP4090763A1 (en) 2020-01-13 2022-11-23 Becton Dickinson and Company Methods and compositions for quantitation of proteins and rna
CN115605614A (zh) 2020-05-14 2023-01-13 贝克顿迪金森公司（Us） 用于免疫组库谱分析的引物
US11932901B2 (en) 2020-07-13 2024-03-19 Becton, Dickinson And Company Target enrichment using nucleic acid probes for scRNAseq
EP4008779A4 (en) * 2020-10-22 2023-07-19 Enzynomics Co. Ltd. UDG MUTANTE FEATURING ENHANCED THERMAL SENSITIVITY
WO2022109343A1 (en) 2020-11-20 2022-05-27 Becton, Dickinson And Company Profiling of highly expressed and lowly expressed proteins
WO2023132543A1 (ko) * 2022-01-04 2023-07-13 주식회사 씨젠 포토박테리움 레이오그나티 유래의 우라실-ｄｎａ 글리코실라제를 사용하여 핵산 증폭 반응에서의 캐리오버 오염을 제거하는 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6187575B1 (en) 1995-12-05 2001-02-13 Roche Diagnostics Gmbh Thermolabile uracil-DNA-glycosylas, process for its preparation and use for removing uracil from DNA
US6287823B1 (en) 1989-06-01 2001-09-11 Invitrogen Corporation Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
KR100787995B1 (ko) 2006-08-30 2007-12-24 주식회사 렉스진바이오텍 신규한 우라실-ｄｎａ 글리코실라제(ｕｄｇ) 및 이의 용도

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7273730B2 (en) * 2002-05-24 2007-09-25 Invitrogen Corporation Nested PCR employing degradable primers

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6287823B1 (en) 1989-06-01 2001-09-11 Invitrogen Corporation Process for controlling contamination of nucleic acid amplification reactions
US6187575B1 (en) 1995-12-05 2001-02-13 Roche Diagnostics Gmbh Thermolabile uracil-DNA-glycosylas, process for its preparation and use for removing uracil from DNA
KR100787995B1 (ko) 2006-08-30 2007-12-24 주식회사 렉스진바이오텍 신규한 우라실-ｄｎａ 글리코실라제(ｕｄｇ) 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
US7723093B2 (en) 2010-05-25
US20080299609A1 (en) 2008-12-04
KR20080083428A (ko) 2008-09-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR100882711B1 (ko) 사이크로박터 스피시스 ｈｊ147 균주 유래의 우라실-ｄｎａ글리코실라제 및 이의 용도
US9650618B2 (en) Endonucleases
JP2003510052A (ja) 改良されたポリヌクレオチド合成のための方法と組成物
CA2624324A1 (en) Thermostable viral polymerases and methods of use
WO2006030455A1 (en) Dna polymerases having strand displacement activity
JP7363063B2 (ja) 変異型ｄｎａポリメラーゼ
US8183023B2 (en) Thermus egertssonii DNA polymerases
JP7014256B2 (ja) 核酸増幅試薬
KR100787995B1 (ko) 신규한 우라실-ｄｎａ 글리코실라제(ｕｄｇ) 및 이의 용도
US8986968B2 (en) Thermostable DNA polymerase
KR100963014B1 (ko) 바실러스 스피시스 нｊ171 균주 유래의 신규한 저온성우라실-ｄｎａ 글리코실라제의 제조방법 및 중합효소연쇄반응에서의 이용
Jiang et al. Biochemical characterization and mutational studies of a novel 3-methlyadenine DNA glycosylase II from the hyperthermophilic Thermococcus gammatolerans
JPH09508806A (ja) 高度に精製された組み換え逆転写酵素
US20120083018A1 (en) Thermostable dna polymerases and methods of use
JP7180944B1 (ja) 改変型ｄｎａポリメラーゼ
WO2006081463A2 (en) Thermococcus zilligii dna polymerases and variants thereof
US20080311626A1 (en) Dna Polymerases Having Strand Displacement Activity
US6444429B1 (en) Gene coding for DNA ligase of hyperthermophilic bacteria Aquifex pyrophilus and protein expressed therefrom
JP2009508488A (ja) サーモコッカス種（９°ｎ−７株）ｄｎａリガーゼの発見、クローニング及び精製
Lim et al. Molecular cloning and characterization of thermostable DNA ligase from Aquifex pyrophilus, a hyperthermophilic bacterium
KR100689795B1 (ko) 복합체 형성 방법
JP3440954B2 (ja) Ｄｎａポリメラーゼ遺伝子
US20100291638A1 (en) Thermostable dna polymerases and methods of use
JP2022550810A (ja) 海洋性ｄｎａポリメラーゼｉ
JP2003508012A (ja) ピロバクルム・イスランジカム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍｉｓｌａｎｄｉｃｕｍ）由来のＤＮＡポリメラーゼ

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20111202

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20130111

Year of fee payment: 5

LAPS Lapse due to unpaid annual fee