CN105102696B - 用于目标分子检测的基于亲和力的划分试验 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了检测样品中目标分子的方法,包括将样品与两种或更多种可检测经标记探针孵育,将样品划分为多个分区并在同一分区中检测是否存在两种或更多种探针。
Description
相关申请的交叉参考
本申请要求2013年2月8日提交的美国临时申请号61/762,707的优先权,该申请通过引用纳入本文用于所有目的。
发明背景
定量来自对象的样品中生物分子的含量可为多种临床应用提供有用的信息。检测和定量生物分子(如蛋白质)的一种方法是通过酶联免疫吸附实验(ELISA)。然而,该试验有限的检测和定量精确性无法满足多种需求。替代性技术(如免疫PCR)具有提高检测灵敏度的潜能,但在实践中受限于由于抗体的非特异性结合而产生的高背景信号的问题。
因此,仍需要提供改进的定量精确性和低末端灵敏度的检测和定量生物分子的方法。
发明内容
在一个方面中,本发明提供了检测样品中目标分子的方法。在一些实施方式中,该方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,该第一和第二探针特异性结合相同的目标分子(如果存在);
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在两种或更多种探针(例如第一探针和第二探针);从而检测样品中的目标分子。
在另一个方面中,本发明提供了检测样品中目标分子的方法,该目标分子连接或能够生成可检测分子。在一些实施方式中,该方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针孵育,该第一探针特异性结合该目标分子(如果存在);
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在第一标记物和可检测的分子;从而检测样品中的目标分子。
在另一个方面中,本发明提供了检测样品中至少第一目标分子与第二目标分子(其形成复合物)的相互作用的方法。在一些实施方式中,该方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,该第一探针特异性结合第一目标分子(如果存在),且该第二探针特异性结合第二目标分子(如果存在);
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在第一标记物和第二标记物;从而检测样品中的目标分子。
在另一个方面中,本发明提供了检测样品中目标分子或目标分子的相互作用的方法,该方法包括:
将混合物中的样品至少与连接产生可检测信号的第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,该第一探针特异性结合目标分子(如果存在于样品中),且该第二探针像第一探针一样特异性结合目标分子,或结合与第一探针特异性结合的目标分子相互作用的第二目标分子(如果存在于样品中);
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
检测至少一个分区中第一标记物和/或第二标记物所生成的可检测信号的淬灭;从而检测样品中的目标分子或目标分子的相互作用。
在另一个方面中,本发明提供了检测样品中目标分子的方法,该方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,该第一探针特异性结合与目标分子相互作用的分子组分,且该第二探针和目标分子竞争与该分子组分相互作用;
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
检测同时表达第一标记物和第二标记物的分区数目的减少;从而检测目标分子。
在一些实施方式中,以两次或多次稀释重复该方法,并使结果对背景信号进行校正。在一些实施方式中,该方法包括将样品至少划分为含有至少两个分区的第一分区文库和含有至少两个分区的第二分区文库,该第一和第二分区文库以不同稀释度形成和/或每个分区具有不同体积。在一些实施方式中,生成单一分区文库,其中各分区的体积变化使得存在至少两种不同体积的分区。
在一些实施方式中,该划分包括生成足够数目的分区,使得至少大部分分区含有不超过五个拷贝的目标分子。
在一些实施方式中,第一和第二标记物包含核酸、荧光部分、亲和标签或点击化学部分,且第一标记物不同于第二标记物。在一些实施方式中,该第一标记物生成第一信号且该第二标记物生成第二信号且第一信号和第二信号是可区分的。
在一些实施方式中,至少一种标记物是酶。在一些实施方式中,该第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶,且该检测包括检测第一和第二酶生成的产物。在一些实施方式中,第一和第二酶选自:辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。在一些实施方式中,在划分后孵育各分区,从而扩增第一和第二酶生成的信号。在一些实施方式中,第一和第二酶的活性在划分前受到抑制。
在一些实施方式中,第一标记物和第二标记物联合产生这样的信号:所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。在一些实施方式中,该第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶且第一和第二酶的活性联合以生成指示第一和第二标记物存在的可检测信号。
在一些实施方式中,该第二标记物淬灭第一标记物生成的信号。在一些实施方式中,第一和第二标记物是荧光共振能量转移(FRET)对的成员。
在一些实施方式中,在划分后放大来自第一标记物的信号和来自第二标记物的信号。在一些实施方式中,第一和第二标记物是核酸标记物。在一些实施方式中,这些核酸标记物经扩增以生成扩增子且该检测包括检测该扩增子。在一些实施方式中,该检测包括检测与扩增子相关的荧光信号。在一些实施方式中,该荧光信号由荧光标记的多核苷酸探针生成。在一些实施方式中,该荧光信号由用于扩增核酸标记物的一个或多个引物生成。在一些实施方式中,该荧光信号由荧光***染料生成。
在一些实施方式中,该方法还包括测定包含第一标记物和第二标记物的分区数目。
在一些实施方式中,这些分区是液滴或微通道。在一些实施方式中,这些液滴被不互溶的运载体液体围绕。
在一些实施方式中,该第一探针和/或第二探针包含结合剂,该结合剂独立地选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。在一些实施方式中,该第一探针和/或第二探针包含目标特异性结合剂,该目标特异性结合剂独立地选自核酸和锌指蛋白。在一些实施方式中,该第一探针在孵育前连接目标分子。在一些实施方式中,该方法包括将混合物中的样品与超过两种探针(例如3、4、5、6、7、8、9、10或更多种探针)孵育。
在一些实施方式中,该目标分子是蛋白质。在一些实施方式中,该目标分子是核酸。在一些实施方式中,该目标分子是DNA。在一些实施方式中,该目标分子是RNA。在一些实施方式中,该目标分子是miRNA或mRNA。在一些实施方式中,该目标分子在检测前未扩增或连接。在一些实施方式中,该目标分子在划分前未扩增或连接。
在一些实施方式中,该目标分子是酶,其能够将混合物中的底物转化为可检测分子或中间分子,该中间分子可被第一标记物进一步转化为可检测分子。在一些实施方式中,该目标分子连接或结合可检测分子。在一些实施方式中,该目标分子包含荧光部分。
在一些实施方式中,其中需要检测相互作用或形成复合物的两种或更多种目标分子,第一和第二目标分子是蛋白质。
在一些实施方式中,该分子组分是酶且该目标分子是该酶的底物。
在一些实施方式中,测量表达第一标记物和/或第二标记物的分区数目的减少或来自第一标记物和/或第二标记物的信号的减少,该测量相对于其中已知不存在目标分子的对照样品进行。
在一些实施方式中,该方法包括使用两种或更多种浓度的至少一种混合物组分分析样品,以区分目标分子特异性共定位与随机共定位。在一些实施方式中,该方法包括估计样品中目标分子的含量和/或浓度,通过从观察到的该样品中共定位事件数目中扣除预期的该样品中随机共定位事件数目来进行。
在另一个方面中,本发明提供了包含两个或更多个分区的分区文库。在一些实施方式中,至少一些分区包含含有第一标记物的第一探针和含有第二标记物的第二探针。在一些实施方式中,该分区文库包含至少500个分区。
在一些实施方式中,大部分分区包含含有第一标记物的第一探针和含有第二标记物的第二探针。在一些实施方式中,该第一探针和/或第二探针包含结合剂,该结合剂选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。在一些实施方式中,这些第一和第二标记物是核酸、荧光部分、亲和标签或点击化学部分,且第一标记物不同于第二标记物。在一些实施方式中,该第一标记物生成第一信号且该第二标记物生成第二信号且该第一信号和该第二信号是可区分的。在一些实施方式中,该第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶且第一和第二酶的活性联合以生成指示第一和第二标记物存在的可检测信号。
在一些实施方式中,至少一些分区包含一种或多种目标分子。在一些实施方式中,各分区中存在平均不超过5个拷贝的一种或多种目标分子。
在一些实施方式中,这些分区是液滴。在一些实施方式中,这些液滴被不互溶的运载体液体围绕。在一些实施方式中,这些分区是微通道。在一些实施方式中,这些分区是微胶囊。
定义
除非另外定义,本文中使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员通常所理解的同样含义。参见例如Lackie,DICTIONARY OF CELLAND MOLECULAR BIOLOGY(《细胞分子生物学词典》),埃尔斯威尔出版社(Elsevier)(第4版2007);Sambrook等,MOLECULARCLONING,A LABORATORY MANUAL(《分子克隆,实验室手册》),冷泉港实验室出版社(冷泉港,纽约1989)。术语“一个”或“一种”意在表示“一个(种)或多个(种)”。当术语“包含”及其各种变体例如“包括”和“含有”位于叙述步骤或要素之前的时候,是用来表示添加其它的步骤或要素是任选的,并且是非排它性的。本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等价的任何方法、装置和材料。本文提供的定义是用来帮助理解本文经常用到的某些术语,不对本发明的范围构成限制。
本文所用术语“划分”或“划分的”指将样品分隔为多个部分,或“分区”。分区可以是固体或液体。在一些实施方式中,分区是固体分区,例如微通道。在一些实施方式中,分区是液体分区,例如液滴。在一些实施方式中,液体分区(如液滴)是不互溶的液体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中,液体分区(如液滴)是水性液滴,其被不互溶的运载体液体(如油)围绕。
术语“探针”指与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的分子(例如蛋白质、核酸、适体等)。与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的分子的非限制性示例包括核酸(如寡核苷酸)、蛋白质(如抗体、转录因子、锌指蛋白、非抗体蛋白支架等)和适体。
“目标分子”指样品中待检测的分子。在一些实施方式中,该目标分子是肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白)、多核苷酸(例如DNA(如dsDNA或ssDNA);RNA(如mRNA或miRNA);或DNA-RNA杂交体)、适体、肽核酸、碳水化合物、病毒、病毒样颗粒、药物化合物、代谢物或细胞。在一些实施方式中,样品中的两种或更多种待检测目标分子包含相互作用的目标分子的复合物(例如蛋白质的配体-受体复合物)。
对于结合目标分子的探针,术语“结合”通常指该探针(如寡核苷酸或抗体)结合纯群体中大部分目标分子,假设探针与目标分子具有合适摩尔比。例如,结合给定目标分子的探针通常结合溶液中至少2/3的目标分子(例如75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%)。本领域技术人员应理解,取决于测定结合的方法和/或阈值,可出现一些变化。
术语“特异性结合”或“与……特异性相互作用”指探针(如寡核苷酸或抗体)与目标分子的结合亲和性比非目标分子高至少2倍,例如至少4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、25倍、50倍或100倍。例如,特异性结合特定目标分子的探针通常以与非目标分子相比高至少2倍的亲和性结合目标分子。
术语“标记物”和“可检测标记物”可互换地指可通过光谱、光化学、生物化学、免疫化学、化学或其它物理手段检测的组合物。例如,可用的标记物包括荧光染料、发光剂、放射性同位素(如32P、3H)、高电子密度试剂、酶、生物素、地高辛或半抗原以及可被检测的蛋白质、核酸或其他实体,例如通过将放射性标记物整合至与目标分子特异性反应的抗体、肽或寡核苷酸中。可以采用本领域已知的用于偶联探针与标记物的任何方法,例如,使用如下文献中所述的方法:Hermanson,Bioconjugate Techniques(《生物结合技术》)1996,学术出版社有限公司(Academic Press,Inc.),圣迭戈。
“连接”至标记物的分子(例如本文所述经标记探针)是共价(通过接头或化学键)或非共价(通过离子、范德华力、静电或氢键)地结合标记物的分子,从而可通过检测与该分子结合的标记物来检测是否存在该分子。
附图说明
图1.图2-4、6和7中示意图的图示说明。(A)用于结合目标分子(如抗体、适体等)的探针的代表。(B)与一个目标分子结合的两个探针(如识别目标分子上不同表位的抗体)。(C)连接有核酸链(标记物)的探针。(D)连接有核酸链(标记物)的抗体(探针)的细节并显示用于扩增来自标记物的信号的引物和探针。(E)含有与目标分子的不同表位结合的两种抗体的分区(液滴);一种抗体使用可通过基于FAM的试验(表示为F)检测的寡聚物标记且另一种抗体使用可通过基于VIC的试验(表示为V)检测的寡聚物标记。(F)含有与目标分子的不同表位结合且使用荧光标记物标记的两种探针的分区(液滴),该荧光标记物通过将非荧光底物(NFS)酶促切割为可检测标志物来生成信号。
图2.不存在目标分子时探针划分的示意图。各分区间抗体分离很大程度上取决于随机因素,且通过荧光信号的抗体检测显示这些探针很少共定位。
图3.存在目标分子时探针划分的示意图。由于目标分子的存在,抗体非随机地划分。通过相关荧光信号检测到抗体的存在。
图4.存在目标分子时探针划分的示意图。由于目标分子的存在,探针非随机地划分。通过非荧光底物酶促切割生成的相关荧光信号检测到抗体的存在。
图5.样品中经连接物质浓度的评估。在其中使用两种探针(探针A(如具有可检测标记物FAM)和探针B(如具有可检测标记物VIC))的样品中,两者都能够特异性结合相同目标分子,观察到四种可能的事件:N0(两种探针均为阴性)、NA(探针A为阳性且探针B为阴性)、NB(探针B为阳性且探针A为阴性)和NAB(两种探针均为阳性)。清楚测量N0、NA、NB和NAB。一些观察到的双重阳性事件(如液滴)将是由于液滴中单种物质的偶然定位,而一些则是由于实际存在经连接的分子。可如实施例1中所述评估经连接分子的浓度。
图6.由于目标分子的存在,探针非随机地划分。通过一个分区内发生的全部两种转化反应(非荧光底物(NFS)酶促切割为可检测标志物)所生成信号来检测两种探针是否存在。
图7.目标分子联合目标特异性探针的内在活性的检测。在该实施例中,目标分子是碱性磷酸酶(AP)或包含AP的复合物。将通过将4-甲基伞形基磷酸酯(MUP)转化为4-甲基伞形酮(4MU)的AP活性检测与对AP的特定同种型具有特异性的经标记探针(VIC,"V")的检测联用。
发明详述
I.引言
本发明提供了检测样品中一种或多种目标分子的方法、组合物和试剂盒。在一个相关方面中,本发明提供了检测样品中两种或更多种目标分子之间相互作用或目标分子复合物的方法、组合物和试剂盒。将样品与特异性结合目标分子或样品中可能存在的目标分子的两种、三种、四种、五种或更多种探针孵育。这些样品被划分为多个分区并分析(例如使用数字分析)是否存在经标记探针。在一些实施方式中,在检测前扩增信号或经标记探针生成的信号。本文所述方法允许对目标分子的检测具有改进的灵敏度,并允许精确定量目标分子或分子,并降低对直接检测样品中目标分子的限制。
II.通过共定位探针检测目标分子
在一个方面中,本发明涉及使用共定位至目标分子的两种或更多种探针检测样品中目标分子的方法。不受特定理论的限制,认为当对样品高度分配从而每个分区中含有少量探针分子时(例如平均每个分区中小于约5、4、3、2或1个探针),可计算多种不同探针偶然(而非通过特异性结合分区中的目标分子)共定位至特定分区的可能性。多种不同探针与目标分子的结合由于其强制的物理接近导致探针的共定位。存在目标分子提高共定位率。参见图2和3。因此,对于被分配为每个分区具有少量探针分子的样品而言,分区中两种或更多种探针的共定位丰度可被用于计算目标分子的浓度。
在一些实施方式中,该方法包括:
将样品与两种或更多种探针(如第一探针和第二探针)孵育,所述两种或更多种探针(如第一探针和第二探针)特异性结合相同的目标分子(如果存在)。
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在两种或更多种探针(例如第一探针和第二探针);从而检测样品中的目标分子。
在一些实施方式中,该方法包括将混合物中的样品与两种或更多种探针(如第一探针和第二探针)在适合两种或更多种探针特异性结合一种或多种目标分子的条件下孵育。在一些实施方式中,该方法包括将样品与两种或更多种探针孵育,各探针均连接标记物(例如连接第一标记物的第一探针、连接第二标记物的第二探针等)并在至少一个同一分区中检测是否存在两种或更多种标记物(如第一标记物和第二标记物)。两种或更多种探针特异性结合一种或多种目标分子的合适条件将取决于探针和目标分子的性质并可由本领域技术人员容易地确定。
探针
适用于根据本文所述的方法使用的探针是与目标分子特异性相互作用或特异性结合目标分子的任何分子。本发明的方法利用两种或更多种探针(例如2、3、4、5或更多种探针)。在一些实施方式中,两种或更多种探针各自特异性结合相同的目标分子,其结合目标分子的非重叠或部分重叠区域。
在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种探针是相同类型的分子(例如所有都是抗体)。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种探针中至少两种是相同类型的分子(例如至少两种是抗体)。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种探针是不同类型的分子(例如抗体和核酸)。
在一些实施方式中,该探针是肽、多肽或蛋白质。本文所用术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换地指代两个或更多个氨基酸残基的聚合物。该术语可用于表示其中一个或多个氨基酸残基是相应天然产生氨基酸的人造化学模拟物的氨基酸聚合物,以及天然产生的氨基酸聚合物和非天然产生的氨基酸聚合物。在一些实施方式中,该探针是抗体。本文中,“抗体”指免疫球蛋白家族的多肽或包含能够非共价、可逆并以特定方式结合相应抗原的免疫球蛋白的片段的多肽。术语抗体也包括通过全抗体修饰,或用重组DNA方法从头合成所产生(例如,单链Fv),或用噬菌体展示文库鉴定的抗体片段(参见如McCafferty等,Nature348:552-554(1990))。制备抗体的方法是本领域已知的;参见例如Kohler和Milstein,Nature256:495-497(1975);Kozbor等,Immunology Today 4:72(1983);Cole等,Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(《单克隆抗体和癌症治疗》),第77-96页,ARL公司(Alan R.Liss,Inc.)1985。在一些实施方式中,该探针是非抗体蛋白支架。本文中,“非抗体蛋白支架”指能够以高特异性结合目标分子的非免疫原性多肽。在一些实施方式中,该蛋白支架具有衍生自蛋白A、脂质运载蛋白、纤连蛋白结构域、锚蛋白共有重复结构域或硫氧还蛋白的结构。制备非抗体蛋白支架的方法是本领域已知的;参见例如Binz和Pluckthun,CurrOpinBiotechnol 16:459-469(2005);Koide等,J MolBiol 415:393-405(2012);以及Gilbreth和Koide,CurrOpinStructBiol 22:413-420(2012)。
在一些实施方式中,该探针是核酸。本文所用术语“核酸”和“多核苷酸”互换使用以表示脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形式的聚合物。该术语包括含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或连接的核酸,其可以是合成、天然产生的和非天然产生的,其与参比核酸具有相似结合性质,且以与参比核苷酸相似的方式代谢。这类类似物的例子包括但不限于:硫代磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。合成多核苷酸的方法是本领域已知的。参见例如Carruthers等,Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.47:411-418(1982),和Adams等,J.Am.Chem.Soc.105:661(1983)。在一些实施方式中,该探针是与目标分子杂交的寡核苷酸。在一些实施方式中,寡核苷酸探针的长度是至少5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个核苷酸。
在一些实施方式中,该探针是适体。本文中,“适体”指对目标分子具有特异性结合亲和性的DNA或RNA分子,如蛋白质或核酸。在一些实施方式中,适体选自基于其以基于与目标分子的非沃森克里克相互作用的高亲和特异性结合其他分子能力的随机池(参见例如,Cox和Ellington,Bioorg.Med.Chem.9:2525-2531(2001);Lee等,Nuc.Acids Res.32:D95-D100(2004))。例如,可使用称为通过指数富集的配体***性演化(SELEX)的选择过程选择适体。参见例如Gold等,US5,270,163。可选择结合例如核酸、蛋白质、小有机化合物、维生素或无机化合物的适体。
样品
本发明的方法可用于检测任何类型样品中的一种或多种目标分子。在一些实施方式中,该样品是生物样品。生物样品可获自任何生物体,例如动物、植物、真菌、细菌或任何其他有机体。在一些实施方式中,该生物样品来自动物,例如哺乳动物(如人或非人灵长类动物、奶牛、马、猪、绵羊、猫、狗、小鼠或大鼠)、鸟(如鸡)或鱼。生物样品可以是获自生物体的任何组织或体液,例如血液,血液成分或血液产品(如血清、血浆、血小板、血红细胞等),痰液或唾液,组织(如肾、肺、肝、心、脑、神经组织、甲状腺、眼、骨骼肌、软骨或骨组织);培养的细胞,例如原代培养物,外植体,和转化的细胞,干细胞,粪便,尿液等。
在一些实施方式中,一种或多种待检测目标分子是肽、蛋白质(如抗体、酶、生长调节剂、凝血因子或磷蛋白)、多核苷酸(例如DNA(如dsDNA或ssDNA);RNA(如mRNA或miRNA);或DNA-RNA杂交体)、适体、免疫原、肽核酸、病毒、病毒样颗粒、多糖、碳水化合物、脂质、毒素(如病毒或细菌毒素)、微生物、药物化合物、代谢物或细胞。在一些实施方式中,待检测的目标分子是蛋白质。在一些实施方式中,待检测的目标分子是RNA,例如mRNA或miRNA。
在一些实施方式中,两种、三种、四种、五种或更多种不同目标分子待检测。在一些实施方式中,其中两种或更多种不同的目标分子待检测,所述两种或更多种不同的目标分子是相同类型的分子(例如复合物中存在的两种或更多种蛋白质)。在一些实施方式中,其中两种或更多种不同的目标分子待检测,所述两种或更多种不同的目标分子是不同类型的分子(例如与蛋白质相互作用的药物化合物)。
待分析的样品中目标分子的拷贝数可以是0或约或至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10,000、20,000、30,000、40,000或50,000。在一些实施方式中,该样品包含低浓度和/或拷贝数的一种或多种目标分子。
在一些实施方式中,可制备样品以改进目标分子的有效检测。例如,在一些实施方式中,可对样品进行片段化、分馏、匀化或超声。在一些实施方式中,可从样品(如生物样品)中提取或分离目标分子或感兴趣的分子或包含目标分子或感兴趣的分子的子组分。在一些实施方式中,富集该样品的存在的一种或多种目标分子。在一些实施方式中,通过亲和方法在样品中富集目标分子,例如免疫亲和富集。在一些实施方式中,使用尺寸选择(如除去非常小的片段或分子或非常长的片段或分子)在样品中富集目标分子。
在一些实施方式中,该样品在划分样品前与两种或更多种探针孵育。在一些实施方式中,两种或更多种探针存在于混合物中。包含两种或更多种探针的混合物可包含一种或多种缓冲剂(如水性缓冲剂)和任选的一种或多种添加剂(如封闭剂或生物防腐剂)。
如下文所述,在一些实施方式中,两种或更多种探针各自设计为特异性结合相同的目标分子(如果存在),例如在目标分子的不同位置处。在一些实施方式中,两种或更多种探针设计为特异性结合不同的目标分子(如果存在),这些目标分子彼此相互作用或形成复合物(例如受体-配体、药物-效应子等)。在适合两种或更多种探针特异性结合一种或多种目标分子的条件下使样品与两种或更多种探针孵育(例如在含有两种或更多种探针的混合物中)。
在一些实施方式中,其中包含目标分子的样品与两种或更多种探针孵育,在划分样品前抑制探针的活性。例如,在一些实施方式中,其中样品与第一酶和第二酶孵育,在划分样品前抑制第一和第二酶的活性。
在一些实施方式中,在适合两种或更多种探针特异性结合一种或多种目标分子的条件下使样品与两种或更多种探针孵育后,清洗样品以除去不特异性结合其目标分子的探针。在一些实施方式中,将样品与第一探针孵育,随后在将样品与第二探针孵育前任选地进行清洗步骤。在一些实施方式中,对于两种、三种、四种、五种或更多种探针,可依次将样品与探针孵育,随后任选地将样品置于清洗条件,随后将样品与不同的探针孵育。
适当清洗条件、清洗缓冲液等的选择将基于诸如探针、目标分子等的条件变化且可由本领域技术人员确定。例如,在一些实施方式中,其中探针-目标复合物比单独的探针更密集,可通过离心清洗样品以沉淀探针-目标分子复合物,随后重悬缺少探针的缓冲液。作为另一个实例,在一些实施方式中,可使样品通过密度梯度或其他梯度(如通过电荷分离)以分离探针-目标分子复合物与未结合的探针。作为另一个实例,在一些实施方式中,可使样品通过柱(如尺寸排阻柱)来清洗探针-目标分子复合物以分离复合物与未结合的探针。需要时,可重复清洗过程以进行额外的清洗。在一些实施方式中,在划分前清洗样品。在一些实施方式中,在划分后清洗样品。在一些实施方式中,在使样品与探针孵育后和检测探针前不进行间插的清洗步骤。
在一些实施方式中,在划分样品之前、期间和/或之后,将样品维持在受控的温度或温度范围下。在一些实施方式中,在划分样品之前、期间和/或之后,将样品维持在约20°、25°、30°、35°、40°、45°、50°、55°、60°、65°、70°、75°、80°、85°、90°或95℃的温度下,例如允许由一种或多种经标记探针所生成信号扩增的温度下。
可检测标记物
通过检测连接各探针的标记物来检测本文所述的探针。该标记物可直接连接探针(例如通过共价键)或可以间接连接(例如使用螯合剂或接头分子)。术语“标记物”和“可检测标记物”在本文中的含义相同。在一些实施方式中,各探针标记物(如连接第一探针的第一标记物、连接第二探针的第二标记物等)生成可检测信号且这些信号(例如第一标记物生成的第一信号、第二标记物生成的第二信号等)是可区分的。在一些实施方式中,两种或更多种探针标记物包含相同类型的试剂(例如作为第一标记物的第一荧光剂和作为第二标记物的第二荧光剂)。在一些实施方式中,两种或更多种探针标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号,该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。
可检测标记物的示例包括但不限于:生物素/链霉亲和素标记物、核酸(例如寡核苷酸)标记物、化学反应性标记物、荧光标记物、酶标记物、放射性标记物、量子点、聚合物点、质量标记物及其组合。在一些实施方式中,该标记物可包括光学试剂,如荧光剂、磷光剂、化学发光剂等。多种试剂(如染料、探针或指示剂)是本领域已知的并可用于本发明。(参见例如Invitrogen,The Handbook—A Guide to Fluorescent Probes and LabelingTechnologies(《手册——荧光探针和标记技术指导》),第10版(2005))。荧光剂可包括多种有机和/或无机小分子或多种荧光蛋白及其衍生物。例如,荧光剂可包括但不限于:花青、酞菁、卟啉、吲哚菁、若丹明、吩噁嗪、苯基呫吨、吩噻嗪、吩硒嗪、荧光素(例如FITC、5-羧基荧光素和6-羧基荧光素)、苯并卟啉、方酸菁、二吡咯并嘧啶酮、并四苯、喹啉、吡嗪、咕啉、克酮酸、吖啶酮、菲啶、若丹明(例如TAMRA、TMR和若丹明红)、吖啶、蒽醌、硫族吡喃鎓(chalcogenopyrylium)类似物、氯、萘菁、次甲基染料、方菁染料、偶氮化合物、甘菊蓝、氮杂甘菊蓝、三苯基甲烷型染料、吲哚、苯并吲哚、吲哚羰花青、苯并吲哚羰花青、BODIPYTM和BODIPYTM衍生物,及其类似物。在一些实施方式中,荧光剂是Alexa Fluor染料。在一些实施方式中,荧光剂是聚合物点或量子点。荧光染料和荧光标记物试剂包括可购自英杰/分子探针公司(Invitrogen/Molecular Probes)(俄勒冈州尤金市)和皮尔斯生物技术公司(Pierce Biotechnology,Inc.)(伊利诺斯州洛克福德)。在一些实施方式中,该光学试剂是***染料。在一些实施方式中,用于检测目标分子的2、3、4、5或更多种探针各自用诸如荧光剂的光学试剂标记(例如使用第一荧光标记物标记第一探针,使用第二荧光标记物标记第二探针等),且使用光学试剂标记的各探针通过检测该光学试剂生成的信号(例如荧光标记物生成的荧光信号)来检测。在一些实施方式中,用于检测目标分子所有探针都使用光学试剂标记,且各光学试剂标记的探针都通过检测该光学试剂生成的信号来检测。
在一些实施方式中,该标记物是放射性同位素。放射性同位素包括放射性核素,其发射γ射线、正电子、β和α颗粒和X射线。合适的放射性核素包括但不限于:225Ac、72As、211At、11B、128Ba、212Bi、75Br、77Br、14C、109Cd、62Cu、64Cu、67Cu、18F、67Ga、68Ga、3H、166Ho、123I、124I、125I、130I、131I、111In、177Lu、13N、15O、32P、33P、212Pb、103Pd、186Re、188Re、47Sc、153Sm、89Sr、99mTc、88Y和90Y。在一些实施方式中,用于检测目标分子的2、3、4、5或更多种探针各自用放射性同位素标记(例如使用第一放射性同位素标记第一探针,使用第二放射性同位素标记第二探针等),且使用放射性同位素标记的各探针通过检测该放射性同位素生成的放射性来检测。在一些实施方式中,用于检测目标分子所有探针都使用放射性同位素标记,且各放射性同位素标记的探针都通过检测该放射性同位素生成的放射性来检测。
在一些实施方式中,该标记物是酶,并通过检测该酶生成的产物来检测探针。合适的酶的示例包括但不限于:脲酶、碱性磷酸酶、(辣根)过氧化氢酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。例如,辣根过氧化物酶检测***可与发光底物四甲基联苯胺(TMB)联用,其在过氧化氢存在下产生在450nm处可检测的可溶产物。碱性磷酸酶检测***可与发光底物对硝基苯基磷酸盐联用,其产生405nm处可容易地检测的可溶性产物。β-半乳糖苷酶检测***可与生色底物邻硝基苯-β-D-半乳糖苷(ONPG)联用,产生在410nm处可检测的可溶性产物。脲酶检测***可与底物如脲溴甲酚紫(西格玛免疫化学品公司(Sigma Immunochemicals),密苏里州圣路易斯)联用。在一些实施方式中,用于检测目标分子的2、3、4、5或更多种探针各自用酶标记(例如使用第一酶标记第一探针,使用第二酶标记第二探针等),且使用酶标记的各探针通过检测该酶生成的产物来检测。在一些实施方式中,用于检测目标分子所有探针都使用酶标记,且各酶标记的探针都通过检测该酶生成的产物来检测。参见图4。
在一些实施方式中,该标记物是亲和标签。合适的亲和标签的示例包括但不限于:生物素、肽标签(如FLAG标签、HA标签、His标签、Myc标签、S标签、SBP标签、Strep标签)和蛋白质标签(如GST标签、MBP标签、GFP标签)。
在一些实施方式中,该标记物是核酸标记物。合适的核酸标记物的示例包括但不限于:寡核苷酸序列、单链DNA、双链DNA、RNA(如mRNA或miRNA)或DNA-RNA杂交体。在一些实施方式中,该核酸标记物的长度是约10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900或1000个核苷酸。
在一些实施方式中,该标记物是“点击”化学部分。点击化学使用简单稳健的反应(如铜催化的炔和叠氮化物的环加成)来建立分子间连接。对于点击化学的综述,参见Kolb等,Agnew Chem 40:2004-2021(2001)。在一些实施方式中,点击化学部分(如叠氮化物或炔部分)可使用另一种可检测标记物(例如荧光标记、生物素化或放射性标记的炔或叠氮化物部分)来检测。
连接可检测标记物与探针的技术是熟知的。例如,常见蛋白标记技术的综述可参见Biochemical Techniques:Theory and Practice(《生物化学技术:理论和实践》),JohnF.Robyt和Bernard J.White,维弗兰德出版公司(Waveland Press,Inc.)(1987)。其他标记技术综述于,例如,R.Haugland,Excited States of Biopolymers(《生物聚合物的兴奋状态》),Steiner编,普莱南出版社(Plenum Press)(1983);Fluorogenic Probe Design andSynthesis:A Technical Guide(《荧光探针设计与合成:技术指南》),PE应用生物***公司(PE Applied Biosystems)(1996);以及G.T.Herman,Bioconjugate Techniques(《生物偶联技术》),学术出版社(Academic Press)(1996)。
在一些实施方式中,两种或更多种标记物(如第一标记物、第二标记物等)联合生成可检测信号,该可检测信号是在一种或多种标记物不存在时无法生成的。例如,在一些实施方式中,各标记物是酶,且这些酶的活性联合生成指示是否存在标记物(并因此指示特异性结合目标分子的探针)的可检测信号。参见图6。联合生成可检测信号的酶的示例包括成对的试验,例如使用己糖激酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶的成对试验;以及与葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、β-D-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶试验偶联的针对NAD(P)H的化学发光试验。参见例如Maeda等,J BioluminChemilumin 1989,4:140-148。
检测
可使用多种检测装置中的任一种来检测可检测标记物。检测方法的示例包括放射性检测、吸光度检测(如荧光或化学发光)或质谱检测。作为非限制性示例,可使用配备生成激发光的模块(所述激发光可被荧光剂吸收)以及检测由荧光剂发射的光的模块的检测装置来检测荧光标记物。
在一些实施方式中,可整体检测经划分的样品中的可检测标记物。例如,可将经划分的样品(如液滴)分配至板(如96孔或384孔板)的一个或多个孔中,并可使用酶标仪检测信号(如荧光信号)。
在一些实施方式中,该检测器还具有对经划分样品(如液滴)的处理能力,其中单个经划分样品进入检测器、经历检测并随后离开检测器。在一些实施方式中,可在经划分样品流动时连续检测经划分样品(如液滴)。在一些实施方式中,经划分样品(如液滴)在表面上形成阵列且检测器相对于该表面移动,检测含有单个分区的各位置处的信号。检测器的示例提供于WO 2010/036352,其内容通过引用纳入本文。在一些实施方式中,经划分样品中的可检测标记物可在不使经划分样品流动(例如使用腔式载玻片)的情况下连续检测。
获取荧光检测数据后,可使用通用目的计算机***(本文中称作“主机”)来储存和处理数据。可使用计算机可执行逻辑进行诸如扣减背景信号、对目标和/或参考序列赋值和量化数据的功能。主机可用于显示、储存、检索或计算来自分子谱分析的结果;储存、检索或计算来自表达分析的原始数据;或者显示、储存、检索或计算用于本发明的方法中的任何样品或患者信息。
主机可配置许多不同的硬件组件并可以许多尺寸和形式制造(例如台式PC、笔记本、平板PC、手持式计算机、服务器、工作站、大型机)。可包含标准组件,例如监视器、键盘、磁盘驱动器、CD和/或DVD驱动器等。当主机与网络相连时,可通过任何合适的传输介质(如导线、光和/或无线介质)和任何合适的通信协议(如TCP/IP)来提供连接;主机可包括合适的网络硬件(例如调制解调器、以太网卡、WiFi卡)。主机可使用多种操作***中的任一种,包括UNIX、Linux、Microsoft Windows、MacOS或任何其他操作***。
可以多种语言书写用于实施本发明的各方面的计算机代码,包括PERL、C、C++、Java、JavaScript、VBScript、AWK或任何其他的可在主机上执行或可经编译在主机上执行的脚本或编程语言。代码也可以低级语言书写或分配,例如汇编语言或机器语言。
主机***通过用户控制操作的工具有利地提供界面。在本文所述的实施例中,软件工具以脚本方式实施(例如使用PERL),其执行可由用户从操作***(如Linux或UNIX)的标准控制线界面起始。本领域技术人员应理解,需要时,可使命令适用于操作***。在其他实施方式中,可通过图形化用户界面,使用户使用点击设备控制操作。因此,本发明不限于任何特定的用户界面。
可在用于储存和/或传输的多种计算机可读取介质上编码整合本发明的多种特征的脚本或程序。合适的介质的示例包括:磁盘或磁带、光学储存介质(如光盘(CD)或DVD(数字多功能光盘))、闪速存储器以及经由遵循多种协议的有线、光纤和/或无线网络(包括因特网)的适用于传输的载波信号。
III.不进行目标扩增的检测
在本发明的另一个方面中,在不进行目标分子扩增(“目标扩增”)的情况下检测并定量目标分子。避免目标扩增消除了扩增导致的问题和不准确性,例如对PCR抑制剂的敏感性、污染问题和扩增期间生成的拷贝中原始模板的恢复。
在一些实施方式中,通过检测结合目标分子的经标记探针生成的信号来检测目标分子,其中不扩增经标记探针生成的信号。可在不扩增信号的情况下检测的标记物的示例包括但不限于:荧光团、***染料或试剂、质量标记物和分子信标寡核苷酸。在一些实施方式中,在不扩增经标记探针所生成信号的情况下检测与目标分子结合的至少一种经标记探针。在一些实施方式中,在不扩增经标记探针所生成信号的情况下检测与目标分子结合的所有经标记探针。
在一些实施方式中,使用荧光团直接检测目标分子。文献中报道了许多荧光团并因此为本领域技术人员已知,并且其多数易于从生物技术工业的市场供应商购得。荧光团的文献来源包括Cardullo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:8790-8794(1988);Dexter,D.L.,J.of Chemical Physics 21:836-850(1953);Hochstrasser等,BiophysicalChemistry 45:133-141(1992);Selvin,P.,Methods in Enzymology 246:300-334(1995);Steinberg,I.Ann.Rev.Biochem.,40:83-114(1971);Stryer,L.Ann.Rev.Biochem.,47:819-846(1978);Wang等,Tetrahedron Letters 31:6493-6496(1990);Wang等,Anal.Chem.67:1197-1203(1995)。荧光团的非限制性示例包括:花青、荧光素(例如5'-羧基荧光素(FAM)、俄勒冈绿(Oregon Green)和Alexa488)、若丹明(例如N,N,N',N'-四甲基-6-羧基若丹明(TAMRA)、四甲基若丹明和四甲基若丹明异硫氰酸酯(TRITC))、伊红、香豆素、芘、四吡咯、芳基甲川、噁嗪、聚合物点和量子点。
在一些实施方式中,使用质量标记物(分子质量标记物)直接检测目标分子,所述质量标记物可使用质谱检测。质量标记物是市售可得的,例如塞默飞世尔公司(ThermoFisher)串联质量标签(TMT)。
在一些实施方式中,使用***试剂直接检测目标分子。***试剂在***双链DNA时生成信号。示例性信号包括SYBR GREENTM、SYBR GOLDTM和EVAGREENTM。
在一些实施方式中,使用分子信标寡核苷酸探针直接检测目标分子。“信标探针”方法(描述于Tyagi和Kramer,Nature Biotech.14:303-309(1996),其也是美国专利号5,119,801和5,312,728的主题)依赖于使用能量转移。该方法使用能够形成发夹结构的寡核苷酸杂交探针。在杂交探针的一端上(5'或3'端)存在供体荧光团,且在另一端上存在受体部分。在Tyagi和Kramer方法中,该受体部分是淬灭剂,即该受体吸收由供体释放的能力,但随后其本身不产生荧光。因此,当信标处于开放构象时,供体荧光团的荧光是可检测的,而当信标处于发夹(闭合)构象时,供体荧光团的荧光是淬灭的。
信号扩增
在一些实施方式中,在检测前扩增经标记探针生成的信号(“信号扩增”)。信号扩增可提高信号强度并因此改进目标分子检测,但不引起扩增待检测目标分子所产生的问题。在一些实施方式中,通过酶促反应(例如发色反应)、通过扩增经标记探针而非目标分子的核酸扩增反应、通过分支DNA或通过侵染试验来扩增经标记探针生成的信号。
在一些实施方式中,通过核酸扩增反应(例如聚合酶链式反应(PCR)、定量PCR(qPCR)或连接酶链式反应(LCR))来扩增一种或多种经标记探针生成的信号。在一些实施方式中,使用核酸标记物标记一种或多种探针。一种或多种标记物经扩增以生成扩增子且该检测包括检测该扩增子。在一些实施方式中,该信号扩增方法是免疫-PCR。免疫-PCR描述于,例如,Niemeyer等,Trends Biotechnol.2005;23:208-216。在免疫-PCR中,使用核酸标记物(如寡核苷酸)标记特异性结合目标分子的抗体探针,并通过PCR扩增核酸标记物以生成扩增的信号。在一些实施方式中,用于扩增核酸标记物的一种或多种引物是荧光标记的。随后可检测并定量扩增的信号。该核酸标记物可包含本文所述可检测标签或标记物(例如荧光剂,如探针)用于检测扩增的信号。在一些实施方式中,两种或更多种探针各自是能够特异性结合目标分子的寡核苷酸标记的抗体,并使用不同试剂(如不同的荧光剂)标记各寡核苷酸标记的抗体。在同一分区中检测到全部两种探针指示该分区对于存在目标分子是阳性的。
在一些实施方式中,该信号扩增方法是邻位连接试验。在邻位连接试验中,靶向相同目标分子的不同表位的两种抗体探针各自被“一半”核酸链标记(例如,通过将各核酸链连接结合抗体探针的二抗)。当两种抗体探针都结合目标分子时,这些抗体非常靠近,且两“半”核酸标记物可连接在一起以形成随后可扩增并检测(例如通过qPCR)的全长核酸产物。该核酸标记物可包含本文所述可检测标签或标记物(例如荧光剂,如探针)用于检测扩增的信号。由于抗体探针在非特异性结合中无法以彼此靠近的方式结合,预期这类试验的背景信号较低。
在一些实施方式中,通过酶促反应扩增一种或多种经标记探针生成的信号。如上文所述,已知许多酶促试验,其扩增信号以生成可检测产物,例如荧光、化学发光或比色产物。用于信号扩增的合适的酶的示例包括但不限于:脲酶、碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶(HRP)、葡萄糖氧化酶、-半乳糖苷酶、荧光素酶、酪胺信号扩增(TSATM,帕金埃尔默公司(PerkinElmer Inc.),加利福尼亚州圣克拉拉市)和水解二乙酸荧光素的酯酶。作为非限制性示例,可使用HRP试验来检测经标记探针(如生物素、DIG或荧光素标记的探针)。HRP酶试剂通常与抗体或链霉亲和素偶联,其与包含经标记探针的样品并与HRP底物在适于生成可检测信号的条件下孵育。多种荧光、化学发光或比色HRP底物是本领域已知的,例如TMB、DAB和ABTS。
在一些实施方式中,通过分支DNA或DNA枝状聚合物扩增一种或多种经标记探针生成的信号。通常,在分支DNA信号扩增中,分支DNA分子的一端设计为结合目标(如DNA或RNA序列),而另一端含有许多DNA的分支,其可结合探针用于信号检测。分支DNA描述于,例如,Collins等,Nucleic Acids Res 1997;25:2979-2984;以及Tsongalis,Am J ClinPathol2006;126:448-453。
在一些实施方式中,使用侵染试验扩增一种或多种经标记探针生成的信号。通常,在侵染试验中,目标特异性寡核苷酸探针和“侵染”寡核苷酸探针与目标分子(如目标分子序列)杂交以形成特定的重叠结构。该目标特异性探针含有不与目标序列杂交的“下垂”序列。切割酶(例如内切核酸酶)识别该重叠结构并仅在探针完美杂交时切割目标特异性探针的下垂部分。该试验包含两组目标特异性探针和侵染探针。从目标特异性探针的经切割下垂部分扩增信号,例如使用荧光共振能量转移(FRET)。侵染试验为本领域已知,描述于例如U.S.6,865,572。
本领域技术人员应理解,信号扩增水平可基于诸如试剂浓度、孵育时间和孵育温度的条件变化。
IV.划分用于检测的样品
将包含一种或多种待检测目标分子的样品(例如与包含两种或更多种探针的混合物孵育的样品)划分为多个分区。分区可包括多种类型的分区中的任一种,包括固体分区(如孔或管)和液体分区(如油相内的水性液滴)。在一些实施方式中,这些分区是液滴。在一些实施方式中,这些分区是微通道。划分样品的方法和组合物描述于,例如,公开的专利申请WO 2010/036352、US 2010/0173394、US 2011/0092373和US 2011/0092376,其全部内容各自通过引用纳入本文。
在一些实施方式中,将样品划分为多个液滴。在一些实施方式中,液滴包含乳液组合物,即不互溶的液体(如水和油)的混合物。在一些实施方式中,液滴是水性液滴,其被不互溶的运载体液体(如油)围绕。在一些实施方式中,液滴是油性液滴,其被不互溶的运载体液体(如水性溶液)围绕。在一些实施方式中,本文所述液滴是相对稳定的并在两种或更多种液滴之间具有最小聚结。在一些实施方式中,由样品生成的液滴中至少0.0001%、0.0005%、0.001%、0.005%、0.01%、0.05%、0.1%、0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%或10%与其他液滴聚结。这些乳液还可具有有限的絮凝,一种分散相从薄片中悬浮液产生的过程。
在一些实施方式中,使油相流过包含待检测目标分子的水性样品,从而形成液滴。在一些实施方式中,包含待检测目标分子的水性样品还包含用于检测目标分子的两种或更多种探针和经缓冲的溶液。
该油相可包含氟化基础油,其可通过与氟化表面活性剂(如全氟聚醚)联用而进一步稳定。在一些实施方式中,该基础油包括以下一种或多种:HFE 7500、FC-40、FC-43、FC-70或另一种常见氟化油。在一些实施方式中,该油相包含阴离子含氟表面活性剂。在一些实施方式中,该阴离子含氟表面活性剂是Ammonium Krytox(KAS公司(Krytox-AS))、KrytoxFSH的铵盐或KrytoxFSH的吗啉基衍生物。Krytox-AS的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中,Krytox-AS的浓度是约1.8%。在一些实施方式中,Krytox-AS的浓度是约1.62%。KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度可以是约0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、2.0%、3.0%或4.0%(w/w)。在一些实施方式中,KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.8%。在一些实施方式中,KrytoxFSH的吗啉基衍生物的浓度是约1.62%。
在一些实施方式中,该油相还包含用于调节油性质(如蒸气压、粘性或表面张力)的添加剂。非限制性示例包括全氟辛醇和1H,1H,2H,2H-全氟癸醇。在一些实施方式中,1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.05%、0.06%、0.07%、0.08%、0.09%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%、0.9%、1.0%、1.25%、1.50%、1.75%、2.0%、2.25%、2.5%、2.75%或3.0%(w/w)的浓度添加。在一些实施方式中,1H,1H,2H,2H-全氟癸醇以约0.18%(w/w)的浓度添加。
在一些实施方式中,该乳液配制为生成具有类液界面膜的高度单分散液滴,其可通过加热转化为具有类固界面膜的微胶囊;这类微胶囊可作为生物反应器以通过一段时间的孵育保持其含量。转化为微胶囊可在一经加热后即发生。例如,这类转化可发生于大于约40°、50°、60°、70°、80°、90°或95℃的温度下。加热过程期间,液体或矿物油覆盖物可用于阻止蒸发。可在加热前除去或不除去过量的连续相油。这些生物相容性胶囊可在大范围的热和机械处理下抗聚结和/或絮凝。
转化后,这些微胶囊可储存于约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下。在一些实施方式中,这些胶囊可用于生物医学应用,例如稳定、数字化的大分子包封,特别是包含目标分子(如核酸、蛋白质或上述两者)的混合物的水性生物液体;药物和疫苗递送;生物分子文库;临床成像应用;等。
这些微胶囊分区可含有一种或多种探针(如本文所述经标记探针)并可抗聚结,特别是在高温下。因此,这些胶囊可在非常高的密度(例如每单位体积的分区数)下孵育。在一些实施方式中,可每毫升孵育超过100,000、500,000、1,000,000、1,500,000、2,000,000、2,500,000、5,000,000或10,000,000个分区。在一些实施方式中,样品-探针孵育发生在单个孔中,例如微量滴定板的孔,此时各分区之间不具有内部混合。这些微胶囊还可含有孵育所需的其他组分。
在一些实施方式中,该样品被划分为至少500个分区、至少1000个分区、至少2000个分区、至少3000个分区、至少4000个分区、至少5000个分区、至少6000个分区、至少7000个分区、至少8000个分区、至少10,000个分区、至少15,000个分区、至少20,000个分区、至少30,000个分区、至少40,000个分区、至少50,000个分区、至少60,000个分区、至少70,000个分区、至少80,000个分区、至少90,000个分区、至少100,000个分区、至少200,000个分区、至少300,000个分区、至少400,000个分区、至少500,000个分区、至少600,000个分区、至少700,000个分区、至少800,000个分区、至少900,000个分区、至少1,000,000个分区、至少2,000,000个分区、至少3,000,000个分区、至少4,000,000个分区、至少5,000,000个分区、至少10,000,000个分区、至少20,000,000个分区、至少30,000,000个分区、至少40,000,000个分区、至少50,000,000个分区、至少60,000,000个分区、至少70,000,000个分区、至少80,000,000个分区、至少90,000,000个分区、至少100,000,000个分区、至少150,000,000个分区,或至少200,000,000个分区。
在一些实施方式中,该样品被划分为足量的分区,使得由于结合目标分子而形成的探针的共定位可与随机共定位区分。在一些实施方式中,该划分包括生成含有0个拷贝的目标分子的至少1个分区。在一些实施方式中,该划分包括生成至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个含有0个拷贝的目标分子的分区。在一些实施方式中,该分配包括生成至少1个含有0个拷贝的目标分子的分区和至少1个含有1个或更多个拷贝(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝)的目标分子的分区。在一些实施方式中,该分配包括生成至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个含有0个拷贝的目标分子的分区和且至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个含有1个或更多个拷贝(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝)的目标分子的分区。在一些实施方式中,该分配包括生成足量的分区,使得各探针不共定位在至少1个分区中。在一些实施方式中,该分配包括生成足量的分区,使得两个或更多个探针不共定位在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区中。
在一些实施方式中,该样品被划分为足量的分区,使得至少大部分分区含有不超过5个拷贝的目标分子(例如约0.5、1、2、3、4或5个拷贝的目标分子)。在一些实施方式中,大部分分区含有不超过5个拷贝的一种或多种待检测目标分子。在一些实施方式中,各分区中存在平均不超过5个拷贝的一种或多种目标分子。在一些实施方式中,各分区中存在平均约0.5、1、2、3、4或5个拷贝的目标分子。在一些实施方式中,各分区中存在平均约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、2、3、4或5个探针。
在一些实施方式中,生成的液滴在形状和/或尺寸方面基本均匀。例如,在一些实施方式中,这些液滴在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中,生成的液滴的平均直径为约0.001微米、约0.005微米、约0.01微米、约0.05微米、约0.1微米、约0.5微米、约1微米、约5微米、约10微米、约20微米、约30微米、约40微米、约50微米、约60微米、约70微米、约80微米、约90微米、约100微米、约150微米、约200微米、约300微米、约400微米、约500微米、约600微米、约700微米、约800微米、约900微米,或约1000微米。在一些实施方式中,生成的液滴的平均直径为小于约1000微米、小于约900微米、小于约800微米、小于约700微米、小于约600微米、小于约500微米、小于约400微米、小于约300微米、小于约200微米、小于约100微米、小于约50微米,或小于约25微米。在一些实施方式中,生成的液滴在形状和/或尺寸方面是不均匀的。
在一些实施方式中,生成的液滴在体积上基本均匀。例如,在一些实施方式中,生成的液滴的平均体积为约0.001nL、约0.005nL、约0.01nL、约0.02nL、约0.03nL、约0.04nL、约0.05nL、约0.06nL、约0.07nL、约0.08nL、约0.09nL、约0.1nL、约0.2nL、约0.3nL、约0.4nL、约0.5nL、约0.6nL、约0.7nL、约0.8nL、约0.9nL、约1nL、约1.5nL、约2nL、约2.5nL、约3nL、约3.5nL、约4nL、约4.5nL、约5nL、约5.5nL、约6nL、约6.5nL、约7nL、约7.5nL、约8nL、约8.5nL、约9nL、约9.5nL、约10nL、约11nL、约12nL、约13nL、约14nL、约15nL、约16nL、约17nL、约18nL、约19nL、约20nL、约25nL、约30nL、约35nL、约40nL、约45nL或约50nL。
V.数字分析
可以使用数字读取试验(如数字分析)通过在样品中划分目标分子并鉴定含有目标的分区对目标分子的数目进行计数。通常,数字分析的过程涉及:针对待检测目标分子的存在,确定样品的各分区是阳性还是阴性。对于定量样品中目标分子的含量(例如定量样品中目标分子的浓度或拷贝数),检验分区中各分区是否存在两种或更多种探针。如果分区中检测到与样品孵育的两种或更多种探针中的每一种,则认为该分区对目标分子的存在是“阳性”的。在一些实施方式中,两种或更多种探针各自通过在分区中检测与探针相连的标记物(例如连接探针的荧光、化学发光、放射性或酶标记物)所生成信号的方式来检测,不同标记物生成的信号是可区分的(例如,连接第一探针的第一标记物生成的第一信号与连接第二探针的第二标记物生成的第二信号是可区分的)。在一些实施方式中,通过检测两种经标记探针都存在于同一分区中但同一分区中并非不存在一种或全部两种探针时生成的信号,从而在分区中检测两种或更多种探针。如果分区中未检测到与样品孵育的两种或更多种探针中的至少一种,则认为该分区对于目标分子的存在是“阴性”的。
在一些实施方式中,能够检测单个信号或多个信号的检测器被用于分析各分区中是否存在目标分子。例如,在一些实施方式中,使用双色读取器(荧光检测器)。阳性计数分区的分数可用于测定待测量目标分子的绝对浓度。
一旦确定各样品分区的二态“是-否”结果,即可使用基于泊松统计的算法分析各分区的数据以定量样品中的目标分子含量。定量目标分子的浓度或含量的统计学方法描述于例如WO 2010/036352,其通过引用全文纳入本文。
在一些实施方式中,可通过经验性比较样品中多个不同探针的共定位率与含有已知浓度的目标的样品(包括例如含有0个目标分子的样品)中多个不同探针的共定位率并从共定位事件总数中扣除由于随机共定位产生的共定位事件,从而测定样品中目标分子的浓度。在一些实施方式中,可如下文实施例1所述通过数学计算样品中目标分子的浓度。
VI.检测连接或能够生成可检测分子的目标分子
在另一个方面中,本发明涉及检测样品中目标分子的方法,该目标连接或能够生成可检测分子。在一些实施方式中,该方法包括将样品与至少一种探针(如带有可检测标记的探针)孵育,该探针特异性结合目标分子(如果存在);将混合物划分为两个或更多个分区;并在至少一个同一分区中检测是否存在探针和可检测分子,从而检测样品中的目标分子。
在一些实施方式中,该方法包括在适合探针特异性结合目标分子的条件下将包含目标的样品与探针(如第一探针)孵育,所述目标在混合物中连接或能够生成可检测分子。在一些实施方式中,该探针连接可检测标记物(如连接第一标记物的第一探针)且该方法包括在至少一个同一分区中检测是否存在标记物(如第一标记物)和可检测分子。探针特异性结合目标分子的合适条件将取决于探针和目标分子的性质并可由本领域技术人员容易地确定。
在一些实施方式中,该目标分子连接或结合可检测分子。在一些实施方式中,连接或结合目标分子的可检测分子是光学可检测试剂,例如荧光剂。
在一些实施方式中,该目标分子能够在样品中生成可检测分子。在一些实施方式中,该目标分子是酶,其能够将混合物中的底物转化为可检测分子或将混合物中的底物转化为中间分子,该中间分子可被连接探针的标记物(如第一标记物)进一步转化为可检测分子。在一些实施方式中,该目标分子是蛋白质复合物,例如酶复合物。
在一个非限制性实例中,该目标分子是乳酸脱氢酶(LDH)的同种型,例如LDH1、LDH2、LDH3、LDH4或LDH5。在一些实施方式中,本发明所述方法用于检测是否存在LDH酶以及由于LDH酶的活性的NAD+至NADH的转化。例如,在一些实施方式中,该方法包括孵育在混合物中含有LDH同种型的样品(该混合物中包含针对LDH的经标记抗体探针)并在同一分区中检测经标记抗体探针和LDH酶转化产物(NADH)。在一些实施方式中,该方法包括孵育在混合物中含有LDH同种型的样品(该混合物中包含针对LDH的经标记抗体探针)并在同一分区中通过偶联试验检测经标记抗体探针和LDH活性(该偶联试验例如使用心肌黄酶,其在将NADH转化为NAD+的同时符合化学计量地将刃天青转化为荧光分子试卤灵,从而在LDH存在时生成荧光信号)。在一些实施方式中,该方法包括孵育在混合物中含有LDH同种型的样品(该混合物中包含针对LDH的经标记抗体探针),该抗体偶联至用于检测LDH活性的偶联试验组分(例如偶联至心肌黄酶的抗体)并在同一分区中通过偶联试验(例如上文所述心肌黄酶试验)检测经标记抗体探针和LDH活性。
在另一个非限制性实例中,该目标分子是碱性磷酸酶(AP),其将4-甲基伞形基磷酸酯(MUP)转化为荧光分子4-甲基伞形酮(4MU)。在一些实施方式中,本文所述方法用于检测是否存在AP酶(如AP的特定同种型)以及MUP至4MU的转化。例如,在一些实施方式中,该方法包括孵育在混合物中含有AP同种型的样品(该混合物中包含针对AP的经标记抗体探针)并在同一分区中检测经标记抗体探针和AP酶转化产物(4MU)。参见图7。
在另一个非限制性实例中,该目标分子是酶复合物,例如LDH同种型和IgG的复合物。LDH-IgG同种型可以指示LDH异常的临床显著性。可使用经标记探针(如针对IgG的经标记抗体探针)和酶或酶复合物活性检测(例如上文所述检测LDH活性的偶联反应)的组合来检测酶复合物。
VII.分子相互作用的检测
在另一个方面中,本发明涉及检测样品中两种或更多种目标分子之间相互作用或目标分子复合物的方法。不受特定理论的限制,认为当对样品高度分配从而每个分区中含有少量探针分子时,可计算多种不同探针偶然(而非通过特异性结合分区中的目标分子)共定位至特定分区的可能性。多种不同探针与目标分子复合物或相互作用目标分子的结合由于其强制的物理接近导致探针的共定位。存在目标分子提高了共定位率。因此,对于高度分区的样品,分区中两种或更多种探针的共定位丰度可用于测定目标分子复合或目标分子相互作用的程度。
在一些实施方式中,检测样品中至少第一目标分子与第二目标分子之间相互作用的方法包括:
将样品至少与特异性结合第一目标分子的第一探针(如果存在)和特异性结合第二目标分子的第二探针(如果存在)孵育;
将该样品划分为两个或更多个分区;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在第一探针和第二探针;从而检测样品中第一目标分子与第二目标分子之间的相互作用。
待检测的目标分子复合物或目标分子相互作用可以是任意两种或更多种上文所述目标分子(例如任何肽、蛋白质、多核苷酸、适体、肽核酸、碳水化合物、病毒、病毒样颗粒、药物化合物、代谢物或细胞)之间的任何相互作用或复合物。两种或更多种目标分子可以是相同类型的分子(如两种蛋白质)或者可以是不同类型的分子(如蛋白质和药物化合物或蛋白质和小分子)。在一些实施方式中,待检测的分子相互作用是受体-配体相互作用。在一些实施方式中,待检测的分子相互作用是药物-效应物相互作用。在一些实施方式中,待检测的分子相互作用是抗体-抗原相互作用。在一些实施方式中,待检测的分子相互作用是细胞-细胞相互作用。在一些实施方式中,待检测的分子相互作用是转录因子-识别序列相互作用。
在一些实施方式中,该方法包括在适合第一探针特异性结合第一目标分子和第二探针特异性结合第二目标分子的条件下将混合物中的样品与至少第一探针和第二探针孵育。各探针特异性结合各目标分子的合适条件将取决于探针和目标分子的性质并可由本领域技术人员容易地确定。
在一些实施方式中,该方法包括检测2、3、4、5或更多种探针。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种探针是相同类型的分子(例如所有都是抗体)。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种探针中至少两种是相同类型的分子(例如至少两种是抗体)。在一些实施方式中,2、3、4、5或更多种探针是不同类型的分子(例如抗体和核酸)。用于检测目标分子相互作用或复合物的合适探针包括本文(例如上文部分II)所述探针中的任一种。
在一些实施方式中,该方法包括将样品与至少第一探针和第二探针孵育,各探针均连接标记物(例如连接第一标记物的第一探针、连接第二标记物的第二探针等)并在至少一个同一分区中检测是否存在两种或更多种标记物(如第一标记物和第二标记物)。用于各探针的合适的可检测标记物包括本文(例如上文部分II)所述可检测标记物中的任一种。
在一些实施方式中,该第一标记物生成第一信号且该第二标记物生成第二信号且第一信号和第二信号是可区分的。例如,在一些实施方式中,该第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶,且该检测包括检测第一和第二酶生成的产物。在一些实施方式中,第一标记物和第二标记物联合产生这样的信号:所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。例如,在一些实施方式中,该第一标记物是第一酶且该第二标记物是第二酶且第一和第二酶的活性联合以生成指示第一和第二标记物存在的可检测信号。
在一些实施方式中,直接检测来自用于检测目标分子相互作用或目标分子复合物的第一和第二标记物的信号,例如使用本文所述荧光团、***试剂或质量标记物。在一些实施方式中,在检测前扩增来自用于检测目标分子相互作用或目标分子复合物的第一和第二标记物的信号,例如通过本文所述核酸扩增反应、分支DNA或酶促反应。
VIII.检测来自共定位的信号淬灭
在另一个方面中,提供了用于检测两种或更多种探针与目标分子或目标分子复合物共定位的方法,具体方法为测量生成的一种或多种探针相关信号的降低。在一些实施方式中,该方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,该第一探针特异性结合目标分子(如果存在于样品中),且该第二探针与第一探针一样特异性结合目标分子或结合与第一探针特异性结合的目标分子相互作用的目标分子(如果存在于样品中);
将所述混合物划分为两个或更多个分区;以及
检测至少一个分区中第一标记物和/或第二标记物生成的可检测信号的淬灭;从而检测样品中的目标分子或目标分子复合物。
在一些实施方式中,第一探针和第二探针均特异性结合相同目标分子。在一些实施方式中,第一探针特异性结合第一目标分子,而第二探针特异性结合第二目标分子。合适的探针包括本文所述的任何探针,例如,在上述部分II("通过共定位探针检测目标分子")和/或部分III("不进行目标扩增的检测")。在一些实施方式中,第一探针和/或第二探针是核酸(例如,寡核苷酸)、蛋白质(例如,抗体)、有机化合物(例如,小分子效应物),或受体。
探针可以用本文所述的任何可检测标记物标记,例如,如上述部分II中所述。在一些实施方式中,至少一种标记物是荧光剂。产生荧光信号的合适的荧光剂的示例述于上文部分II。在一些实施方式中,第二标记物淬灭第一标记物产生的荧光信号。在一些实施方式中,第二标记物是荧光剂,且第一和第二标记物是荧光共振能转移(FRET)对的成员。术语"荧光共振能转移"或"FRET"指,至少两种发色团、供体发色团和受体发色团之间的能量转移。通常在FRET中,如果供体和受体足够接近,当该供体被合适波长的光辐射激发时,供体会将其能量转移给受体。受体能够以不同波长的光辐射的形式重新发出转移的能量。合适的FRET对(供体/受体)包括但不限于,EDANS/荧光素、IAEDANS/荧光素、荧光素/四甲基罗丹明、荧光素/LC红640、荧光素/Cy 5、荧光素/Cy 5.5,和荧光素/LC红705。在其中第一和第二标记物是FRET对的一些实施方式中,两种或更多种探针对目标分子或目标分子复合物的共定位可替代性地通过或另通过检测一个或多个分区中第一标记物产生的信号或信号变化和/或第二标记物产生的信号来检测。
在一些实施方式中,第二标记物是淬灭来自第一标记物的信号的非荧光剂("淬灭剂")。在一些实施方式中,第一标记物产生的荧光信号在第二标记物(淬灭剂)不在第一标记物附近时存在或相对增强,并且第一标记物产生的荧光信号在第二标记物处于第一标记物附近(例如,通过在目标分子的具体表位上共定位)时不存在或相对减弱。有用的淬灭剂的非限制性示例包括TAMRA、DABCYL、QSYTM淬灭剂(例如、QSY 7和QSY 21)(俄勒冈州尤金市的分子探针公司)、BlackHole淬灭剂TM(BHQ)(加利福尼亚州诺瓦托的生物研究技术公司)、IowaBlackTM(爱荷华州科拉尔维尔市的整合DNA技术公司)、BlackBerryTM淬灭剂650(BBQ-650)(密歇根州德克斯特的贝瑞阿索科公司(Berry&Assoc.))、顺磁性离子,和金纳米颗粒。合适的荧光供体/淬灭剂对包括但不限于,FAM/DABCLY、FAM/TAMRA、EDANS/DABCYL、德克萨斯红/DABCYL、BODIPY/DABCYL、罗氏黄/DABCYL、香豆素/DABCYL,和荧光素/QSY 7染料。
在一些实施方式中,样品划分为足够数目的分区,从而基于目标分子的结合的探针的共定位可与随机共定位相区分。样品可以本文所述的任何方式划分,例如,如上文部分IV所述。
信号减弱(例如,来自第一标记探针的信号),和/或其中存在信号(例如,来自第一标记探针的信号)的分区数目的减少可通过本文所述任何方法检测信号来确定。可将表达感兴趣的样品的信号的分区的数目与对照样品(例如,缺乏淬灭来自第一探针的信号的试剂的样品)作比较。在一些实施方式中,对照样品的大多数分区表达信号(例如,来自第一标记探针的信号)。在一些实施方式中,如果感兴趣的样品表达信号的分区数目与对照样品(例如,缺乏淬灭来自第一探针的信号的试剂的样品)相比减少至少约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或更多,则感兴趣的样品表达信号的分区数目"减少"。
在一些实施方式中,第一目标分子和第二目标分子直接相互作用。在一些实施方式中,第一目标分子和第二目标分子间接相互作用,例如,通过另一个分子组分或通过信号级联反应。作为非限制性示例,在采用乳酸脱氢酶(LDH)的偶联试验中,荧光读出基于与NADH转化为NAD+符合化学计量学的刃天青向荧光分子试卤灵的转化,从而导致LDH存在下的荧光信号。因此,LDH被间接检测。不含LDH的分区对于试卤灵呈阴性。包含LDH和第一探针刃天青的分区对于试卤灵呈阳性;然而,第一探针刃天青被心肌黄酶而不是LDH转化成试卤灵。封闭LDH活性的第二探针抑制NADH形成并因此抑制来自试卤灵的信号,不论刃天青和LDH的共定位,而是通过与LDH和NAD+的相互作用而非心肌黄酶、刃天青或试卤灵来实现。
序列检测
在另一个方面中,提供用于检测两种或更多种探针与目标分子或目标分子复合物的共定位的方法,所述方法通过依次检测与一种或多种相关的所的信号减少来进行。在一些实施方式中,所述方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针孵育,其中第一探针特异性结合目标分子(若存在于样品中);
将该混合物划分成两个或更多个分区;
检测具有第一标记物产生的可检测信号的分区数目;
使具有第二探针的各分区内容与连接第二标记物的第二探针接触,其中第二探针与第一探针一样特异性结合相同目标分子或结合与第一探针特异性结合的目标分子相互作用的第二目标分子(若存在与样品中),并且其中第二探针的特异性结合使来自第一探针的信号减弱或淬灭;
将该混合物划分成两个或更多个分区;和
检测至少一个分区中第一标记物产生的可检测信号的减弱或淬灭;由此检测样品中的目标分子或目标分子复合物。
IX.竞争试验
在另一个方面,提供用于检测样品中目标分子的方法,通过检测分区中信号的共定位的减少来进行,例如,在竞争试验中进行。本文中所用术语"竞争试验"不限于化学中定义的竞争性抑制,而是还包括非竞争性、无竞争性和混合试验。在一些实施方式中,本文所述的方法可用于检测作为目标分子复合物或分子相互作用的组分的目标分子,例如,受体-配体相互作用,药物-效应物相互作用,酶-底物相互作用,或抗体-抗原相互作用的组分。不受特定理论限制,认为当对样品高度分配从而每个分区中含有少量探针分子时,可计算多种不同探针偶然(而非通过特异性结合分区中的目标分子)共定位至特定分区的可能性。多种不同探针与目标分子复合物或相互作用目标分子的结合由于其强制的物理接近导致探针的共定位。在划分的竞争试验样品中,在不存在目标分子时,与目标分子竞争与第二分子组分相互作用的第一分子组分将与第二分子组分在大量分区中共定位。样品中目标分子的存在减小了共定位率相对于样品中目标分子的量的比例。因此,对于高度分区的样品而言,可利用分区中具有共定位信号的分区数目的减少来检测样品中目标分子的丰度。
在一些实施方式中,所述方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,其中第一探针特异性结合与目标分子相互作用的分子组分,且第二探针与目标分子竞争与该分子组分相互作用或结合与目标分子竞争与第一分子组分相互作用的第二分子组分;
将该混合物划分成两个或更多个分区;和
检测表达第一标记物和第二标记物的分区数目的减少;由此检测目标分子。
在一些实施方式中,检测相对于对照样品(其中已知不存在目标分子)的表达第一标记物和第二标记物的分区数目的减少。在一些实施方式中,如果表达两种标记物的分区数目相对于对照样品(例如,其中已知不存在目标分子的样品)减少至少约1%、2%、3%、4%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、60%、70%、80%、90%或更多,则表达第一标记物和第二标记物的分区数目"减少"。
作为一个非限制性示例,在一些实施方式中,目标分子复合物或分子相互作用是受体-配体相互作用。在一些实施方式中,目标分子是与受体(分子组分)相互作用的配体。第一探针特异性结合受体,因此标记受体。第二探针是与目标分子竞争与受体结合的第二配体。在一些实施方式中,第一和第二探针用荧光剂标记。在一些实施方式中,第二探针过量存在。样品中存在的目标分子(配体)将与第二探针(第二配体)竞争与受体结合,并导致表达第一探针和第二探针的分区数量与样品中存在的目标分子的量成比例减少。
作为另一个非限制性示例,在一些实施方式中,目标分子复合物或分子相互作用是酶-底物相互作用。在一些实施方式中,目标分子是特异性结合酶(分子组分)的底物。第一探针特异性结合酶,从而标记该酶。第二探针是与目标分子竞争结合酶的第二底物。在一些实施方式中,第一和第二探针用荧光剂标记。在一些实施方式中,第二探针过量存在。样品中存在的目标分子(底物)将与第二探针(第二底物)竞争与酶结合,并导致表达第一探针和第二探针的分区数目与样品中目标分子的量成比例减少。
在另一个实施方式中,所述方法包括:
将样品至少与连接第一标记物的第一探针孵育,其中第一探针与目标分子竞争与第一分子组分相互作用,并且其中第一探针在目标分子不存在时与第一分子组分特异性相互作用,由此导致目标分子不存在时的可检测信号;
将混合物划分成两个或更多个分区;和
检测如下情况的减少
(i)通过第一探针和第一分子组分共定位产生的信号的分区数目;或
(ii)一个或多个分区中的信号;
由此检测样品中的目标分子。
作为一个非限制性实例,在一些实施方式中,分子组分和第一探针之间的相互作用是酶-底物相互作用。在一些实施方式中,第一探针是被酶(第一分子组分)特异性切割的底物。在一些实施方式中,目标分子是与第一探针竞争与酶结合的抑制剂。在一些实施方式中,第一探针是被转化成荧光分子的非荧光底物,例如上述的(例如部分II中所述)4-甲基伞形基磷酸酯(MUP)通过碱性磷酸酶向4-甲基伞形酮(4MU)的转化。第一探针和分子组分的共定位导致在目标不存在时的可检测荧光信号;然而,在抑制剂(例如,左旋咪唑)存在时,碱性磷酸酶的活性被减小,导致固定时间间隔中与样品中抑制剂(例如左旋咪唑)的量成比例的信号强度减小和/或达到荧光阈值的分区数目减少。
合适的探针包括本文(例如部分II中)所述的任何探针。在一些实施方式中,探针是核酸(例如,寡核苷酸)、蛋白质(例如,抗体)、非荧光底物或适体。在一些实施方式中,第一探针是结合与目标分子相互作用的分子组分的抗体。在一些实施方式中,第二探针包含与目标分子竞争与分子组分相互作用的分子组分。
探针可用本文(例如部分II)所述的任何可检测标记物标记。在一些实施方式中,所述标记物是荧光剂。产生荧光信号的合适的荧光剂的示例如上文部分II中所述。
X.稀释以改进精确性
使用至少一种组分的两种或更多种浓度提供了区分随机共定位与目标依赖性共定位的机制。当目标分子位于某一分区内时,与目标结合的探针将由于存在该目标而共定位。随机共定位产生的背景信号和目标存在时的信号之间的差异可用于确定目标分子的浓度和/或丰度。
稀释或改变反应混合物的一种或多种组分浓度的其他方法是一种改进对目标浓度估计的方法。稀释可通过将样品物理稀释成不同程度或通过改变各分区中测试体积的虚拟稀释来实现。在一些实施方式中,生成了两种或更多种分区尺寸的分区。例如,可以使用将样品划分为两种或更多种分区尺寸的装置,例如生成至少两种不同单分散液滴尺寸的液滴生成器,生成多分散液滴的乳液,或具有至少两种用于划分样品的体积的板。
稀释降低背景,但可影响动态范围,除非分区的数目也增加。一种解决方法是增加分区数目,但也可使用其他方法。考虑使用不同浓度,其可以是全局性的(即稀释所有组分)或稀释反应组分的子集。在一些实施方式中,比较同样品共定位与无样品对照被用于确定背景对比信号。在其他实施方式中,改变了其他组分的浓度。在一些情况下,各探针的结合特性将是不同的。在一些实施方式下,在不同样品浓度或一种或多种探针的不同浓度下运行相同样品生成特异性对比非特异性结合的不同效果。在一些实施方式下,提高(例如倍增)一种探针浓度对于随机分布具有非常特定的效果,导致数目几乎翻倍(其中对于给定的分区数目,可通过泊松体积预测精确的增加),但只要探针浓度对该目标饱和,其在对特异性结合的作用有限。同样地,在一些实施方式中,降低探针浓度对探针的非特异性共定位产生作用并对探针的特异性共定位产生不同的作用。在一些实施方式中,对样品混合物进行细分(其中一些细分物随后进一步稀释),从而提供区别特异性共定位与随机共定位的机制。如果特定细分物被稀释为更多数目的细分物,由于结合产生的共定位的数目应保持不变,但随机共定位的数目将降低,降低的程度可由稀释因子、分区数目和探针数目预测。由于结合产生的共定位的频率也应降低,但目标数目将不变化。因此,即使“稀释”是虚拟的(例如较小液滴),由于结合产生的共定位也将仅在频率上降低(以可通过稀释因子预测的方式)而不在绝对数量上降低,但随机共定位将以高得多的倍数降低并因此用作区分目标与随机共定位的机制。该方法可类似地用于区分单探针试验的随机与特异性结合。
在低探针浓度下,所有目标分子都不与两种探针结合。此时,提高探针浓度将提高由于存在目标产生的双重阳性数目。一旦所有目标都结合两种探针,添加更多的探针将不会改变由于存在目标产生的双重阳性数目。然而,观察到的双重阳性数目由目标分子和随机产生的双重阳性数目构成。可通过明确改变双重阳性数目来改变随机产生的双重阳性数目。在探针浓度足以饱和目标的情况下,提高未结合的探针量使得随机共定位量以可预测方式变化(如倍增)能够帮助计算随机共定位。例如,探针浓度增加导致的共定位增加与随机共定位产生的原始分布呈正比。具有已知额外输入的观察到的双重阳性增加允许计算先前的随机共定位并因此计算目标依赖性共定位。同样地,通过降低浓度,我们能够类似地通过比较测定目标量。任选地,能够使用双重阳性的减少相对于探针和/或目标的浓度作图。在一些实施方式中,当这类曲线图中降低率偏离时,不再完全结合目标。或者,在一些实施方式中,如果目标的浓度已知(例如通过较高探针浓度下的测量),则共定位率和/或随后的降低率中的偏差点提供关于探针与目标相互作用的信息。
XI.分区文库
在另一个方面中,本发明涉及用于进行本发明所述方法的包含多个分区的分区文库。在一些实施方式中,该分区文库包含两个或更多个分区,该文库的至少一些分区(例如文库中至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%或95%的分区)包含含有第一标记物的第一探针和含有第二标记物的第二探针。在一个实施方式中,该分区文库包含至少500、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、10,000、15,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000、2,000,000、3,000,000、4,000,000、5,000,000、10,000,000、20,000,000、30,000,000、40,000,000、50,000,000、60,000,000、70,000,000、80,000,000、90,000,000、100,000,000、150,000,000或200,000,000个分区。
该分区文库的各分区的探针和探针标记物可以是本发明所述的任何探针或探针标记物。在一些实施方式中,第一探针和/或第二探针包含结合剂,该结合剂选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。在一些实施方式中,第一和第二标记物是核酸、荧光部分、亲和标签或点击化学部分,且第一标记物不同于第二标记物。在一些实施方式中,第一标记物和第二标记物联合产生这样的信号:所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。在一些实施方式中,该第一标记物生成第一信号且该第二标记物生成第二信号且第一信号和第二信号是可区分的。
在一些实施方式中,该分区文库包含足量的分区,使得由于结合目标分子而形成的探针的共定位可与随机共定位区分。在一些实施方式中,该分区文库的至少1个分区含有0个拷贝的目标分子。在一些实施方式中,该分区文库的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区含有0个拷贝的目标分子。在一些实施方式中,该分区文库的至少1个分区含有0个拷贝的目标分子且该分区文库的至少1个分区含有1个或更多个拷贝(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝)的目标分子。在一些实施方式中,该分区文库的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区含有0个拷贝的目标分子且该分区文库的至少约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区含有1个或更多个拷贝(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个拷贝)的目标分子。在一些实施方式中,该分区文库包含足量的分区,使得两个或更多个探针不共定位在至少1个分区中。在一些实施方式中,该分区文库包含足量的分区,使得探针不共定位在至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900或1000或更多个分区中。
在一些实施方式中,该分区文库的至少一些分区包含一种或多种目标分子。在一些实施方式中,该分区文库的至少一些分区包含两种、三种、四种、五种或更多种不同的目标分子。在一些实施方式中,各分区中存在平均不超过5个拷贝(例如不超过5个拷贝、不超过4个拷贝、不超过3个拷贝、不超过2个拷贝或不超过1个拷贝)的一种或多种目标分子。
在一些实施方式中,该分区文库包含多个分区,所述多个分区是固体分区(如孔或管)。在一些实施方式中,这些分区是微通道。在一些实施方式中,该分区文库包含多个分区,所述多个分区是液体分区(如油相中的水性液滴)。在一些实施方式中,这些分区是液滴。在一些实施方式中,这些分区是微胶囊。上文描述了合适的分区和生成分区的方法的示例。
在一些实施方式中,该分区文库包含在形状和/或尺寸方面基本均匀的分区。例如,在一些实施方式中,这些分区(如液滴)在平均直径方面基本均匀。在一些实施方式中,这些分区(如液滴)的平均直径是约0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900或1000微米。在一些实施方式中,这些分区(如液滴)的平均直径小于约1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50或25微米。在一些实施方式中,该分区文库包含在形状和/或尺寸方面不均匀的分区(如液滴)。
在一些实施方式中,这些分区(如液滴)在体积上基本均匀。例如,在一些实施方式中,这些分区(如液滴)的平均体积为约0.001、0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45或50nL。
在一些实施方式中,这些分区(如液滴)是稳定的且能够长期储存。在一些实施方式中,这些分区可在约-70°、-20°、0°、3°、4°、5°、6°、7°、8°、9°、10°、15°、20°、25°、30°、35°或40℃下长时间储存(例如至少30天、至少60天、至少90天或更长)。
实施例
提供以下实施例用于说明而非限制本发明的权利要求。
实施例1:估计目标分子浓度
该实施例提供了估计样品中目标分子浓度的统计学框架,具体方式为测量各分区(如液滴)中对两种不同探针(FAM和VIC)呈阳性的分子的浓度。
对于该实施例,使用了两种探针:探针A(如具有可检测标记物FAM)和探针B(如具有可检测标记物VIC)的样品中,两者都能够特异性结合相同目标分子。可观察四种可能的事件:N0(两种探针均为阴性)、NA(探针A为阳性且探针B为阴性)、NB(探针B为阳性且探针A为阴性)和NAB(两种探针均为阳性)(图5)。对于各液滴,清楚测量事件。一些观察到的双重阳性液滴(NAB)将是由于液滴中单种物质的偶然定位(N偶然AB),而一些NAB将是由于目标分子上实际存在共定位的探针(N共定位AB)。
当目标分子上不存在共定位的探针时,***中不存在***性偏差,且A和B是不相关的。在这种情况下,N偶然AB可估计为:
N偶然AB=(NANB)/N0
当目标分子上存在共定位的探针时,必须从观察到的计数(N观察AB)中扣除偶然计数(N偶然AB):
N共定位AB=N观察AB–N偶然AB=N观察AB-(NANB)/N0
我们可以使用以下公式来计算目标分子上共定位的探针的浓度:
λ共定位=ln(N总)–ln(N0+NA+NB+((NANB)/N0)
应理解,本文所述的实施例和实施方式仅用于说明目的,本领域技术人员应了解据此作出的各种修饰或改变,且它们包括在本申请的主旨和权益以及所附权利要求书的范围内。本文引用的所有发表物、专利和专利申请通过引用全文纳入本文以用于所有目的。
Claims (64)
1.一种检测样品中目标分子的方法,所述方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,所述第一和第二探针特异性结合相同的目标分子,前提是存在这类目标分子;
将所述混合物划分为两个或更多个分区,其中所述分区平均有小于2个探针;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在所述第一标记物和所述第二标记物;从而检测所述样品中的所述目标分子。
2.如权利要求1所述的方法,所述划分包括生成足量的分区,使得由于结合目标分子而形成的所述探针的共定位能够与随机共定位区分。
3.如权利要求1所述的方法,所述第一和第二标记物包含核酸、荧光部分、亲和标签或点击化学部分,且所述第一标记物不同于所述第二标记物。
4.如权利要求1所述的方法,所述第一标记物生成第一信号且所述第二标记物生成第二信号且所述第一信号和所述第二信号是可区分的。
5.如权利要求1所述的方法,其中,至少一种标记物是酶。
6.如权利要求4所述的方法,所述第一标记物是第一酶且所述第二标记物是第二酶,且所述检测包括检测所述第一和第二酶生成的产物。
7.如权利要求6所述的方法,所述第一和第二酶选自:辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶和水解二乙酸荧光素的酯酶。
8.如权利要求6所述的方法,其中,在所述划分后孵育各分区,从而放大所述第一和第二酶生成的信号。
9.如权利要求8所述的方法,所述第一和第二酶的活性在所述划分前被抑制。
10.如权利要求1所述的方法,所述第一标记物和所述第二标记物联合产生这样的信号:所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。
11.如权利要求10所述的方法,所述第一标记物是第一酶且所述第二标记物是第二酶且所述第一和第二酶的活性联合以生成指示所述第一和第二标记物存在的可检测信号。
12.如权利要求1所述的方法,其中,在所述划分后放大来自所述第一标记物的信号和来自所述第二标记物的信号。
13.如权利要求12所述的方法,所述第一和第二标记物是核酸标记物。
14.如权利要求13所述的方法,所述核酸标记物经扩增以生成扩增子且所述检测包括检测所述扩增子。
15.如权利要求14所述的方法,所述检测包括检测与所述扩增子相关的荧光信号。
16.如权利要求15所述的方法,所述荧光信号由荧光标记的多核苷酸探针生成。
17.如权利要求15所述的方法,所述荧光信号由用于扩增所述核酸标记物的一个或多个引物生成。
18.如权利要求15所述的方法,所述荧光信号由荧光***染料生成。
19.如权利要求1所述的方法,所述方法还包括测定包含所述第一标记物和所述第二标记物的分区的数目。
20.如权利要求1所述的方法,所述分区是液滴或微通道。
21.如权利要求20所述的方法,所述液滴被不互溶的运载体液体围绕。
22.如权利要求1所述的方法,所述目标分子是蛋白质。
23.如权利要求1所述的方法,所述目标分子是核酸。
24.如权利要求23所述的方法,所述目标分子是DNA。
25.如权利要求23所述的方法,所述目标分子是RNA。
26.如权利要求25所述的方法,所述RNA是miRNA或mRNA。
27.如权利要求23所述的方法,所述目标分子在所述检测前不经扩增或连接。
28.如权利要求23所述的方法,所述目标分子在所述划分前不经扩增或连接。
29.如权利要求1所述的方法,所述第一探针和/或第二探针包含结合剂,所述结合剂独立地选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。
30.如权利要求1所述的方法,所述第一探针和/或第二探针包含目标特异性结合剂,所述目标特异性结合剂独立地选自核酸和锌指蛋白。
31.如权利要求1所述的方法,所述第一探针在所述孵育前连接所述目标分子。
32.如权利要求1所述的方法,所述方法包括将混合物中的所述样品与超过两种探针孵育。
33.一种检测样品中目标分子的方法,所述目标分子连接或能够生成可检测分子,所述方法包括,
将混合物中的所述样品与连接第一标记物的第一探针孵育,所述第一探针特异性结合所述目标分子,前提是存在所述目标分子;
将所述混合物划分为两个或更多个分区,其中所述分区平均有小于1个探针;
在至少一个同一分区中检测是否存在所述第一标记物和所述可检测分子,从而检测所述样品中的所述目标分子。
34.如权利要求33所述的方法,所述目标分子是酶,其能够将所述混合物中的底物转化为所述可检测分子或中间分子,所述中间分子能进一步被所述第一标记物转化为所述可检测分子。
35.如权利要求33所述的方法,所述目标分子连接或结合所述可检测分子。
36.如权利要求35所述的方法,所述目标分子包含荧光部分。
37.一种检测样品形成复合物的至少第一目标分子与第二目标分子的相互作用的方法,所述方法包括:
将混合物中的所述样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,所述第一探针特异性结合第一目标分子,前提是存在所述第一目标分子,且所述第二探针特异性结合第二目标分子,前提是存在所述第二目标分子;
将所述混合物划分为两个或更多个分区,其中所述分区平均有小于2个探针;以及
在至少一个同一分区中检测是否存在所述第一标记物和所述第二标记物;从而检测所述样品中的所述目标分子。
38.如权利要求37所述的方法,所述第一和第二目标分子是蛋白质。
39.如权利要求38所述的方法,所述第一探针和/或第二探针包含结合剂,所述结合剂独立地选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。
40.如权利要求37所述的方法,所述第一和第二标记物包含核酸、荧光部分、亲和标签或点击化学部分,且所述第一标记物不同于所述第二标记物。
41.如权利要求37所述的方法,所述第一标记物生成第一信号且所述第二标记物生成第二信号且所述第一信号和所述第二信号是可区分的。
42.如权利要求37所述的方法,所述第一标记物和所述第二标记物联合产生这样的信号:所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。
43.一种检测样品中目标分子或多个目标分子的相互作用的方法,所述方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,所述第一标记物生成可检测信号,所述第一探针特异性结合目标分子,前提是所述第一目标分子存在于所述样品中,且所述第二探针与第一探针特异性结合相同的目标分子或结合与所述第一探针特异性结合的目标分子相互作用的第二目标分子,前提是这类目标分子存在于所述样品中;
将所述混合物划分为两个或更多个分区,其中所述分区平均有小于2个探针;以及
检测至少一个分区中所述第一标记物和/或所述第二标记物生成的可检测信号的淬灭;从而检测所述样品中的目标分子或多个目标分子的相互作用。
44.如权利要求43所述的方法,所述第二标记物淬灭所述第一标记物生成的信号。
45.如权利要求43所述的方法,所述第一和第二标记物是荧光共振能转移(FRET)对的成员。
46.一种检测样品中目标分子的方法,所述方法包括:
将混合物中的样品至少与连接第一标记物的第一探针和连接第二标记物的第二探针孵育,所述第一探针特异性结合与所述目标分子相互作用的分子组分,且所述第二探针与所述目标分子竞争与所述分子组分相互作用;
将所述混合物划分为两个或更多个分区,其中所述分区平均有小于2个探针;以及
检测同时表达所述第一标记物和所述第二标记物的分区数目的减少;从而检测所述目标分子。
47.如权利要求46所述的方法,其中,相对于对照样品测量同时表达所述第一标记物和所述第二标记物的分区数目的减少,所述对照样品中已知不存在所述目标分子。
48.如权利要求46所述的方法,所述分子组分是酶且所述目标分子是所述酶的底物。
49.如权利要求1所述的方法,所述方法包括使用混合物的至少一种组分的两种或更多种浓度分析所述样品以区分目标分子特异性共定位与随机共定位。
50.如权利要求49所述的方法,所述方法包括估计所述样品中所述目标分子的含量和/或浓度,具体方法为从观察到的所述样品中共定位事件数目中扣除预期的所述样品中随机共定位事件数目。
51.一种按照权利要求1生成的分区文库,其中所述分区文库包含两个或更多个分区,并且其中所述分区平均有小于2个探针。
52.如权利要求51所述的分区文库,包含至少500个分区。
53.如权利要求51所述的分区文库,其中,至少一些分区包含含有第一标记物的第一探针和含有第二标记物的第二探针。
54.如权利要求53所述的分区文库,所述第一和第二标记物包含核酸、荧光部分、亲和标签或点击化学部分,且所述第一标记物不同于所述第二标记物。
55.如权利要求53所述的分区文库,所述第一标记物和所述第二标记物联合产生这样的信号:所述信号当所述第一标记物、所述第二标记物或两者不存在的情况下不会产生。
56.如权利要求53所述的分区文库,所述第一标记物生成第一信号且所述第二标记物生成第二信号且所述第一信号和所述第二信号是可区分的。
57.如权利要求56所述的分区文库,所述第一标记物是第一酶且所述第二标记物是第二酶且所述第一和第二酶的活性联合以生成指示所述第一和第二标记物存在的可检测信号。
58.如权利要求53所述的分区文库,所述第一探针和/或第二探针包含结合剂,所述结合剂选自抗体、适体和非抗体蛋白质支架。
59.如权利要求51所述的分区文库,其中,至少一些分区包含一种或多种目标分子。
60.如权利要求59所述的分区文库,其中,各分区中存在平均不超过5个拷贝的一种或多种目标分子。
61.如权利要求51所述的分区文库,所述分区是液滴。
62.如权利要求61所述的分区文库,所述液滴被不互溶的运载体液体围绕。
63.如权利要求51所述的分区文库,所述分区是微通道。
64.如权利要求51所述的分区文库,所述分区是微胶囊。
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