CN112105718A - 多能干细胞分化促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明解决的课题在于提供一种用于有效地从多能干细胞获得分化细胞的原材料。即，本发明提供了一种多能干细胞分化促进剂以及使多能干细胞分化的方法，所述多能干细胞分化促进剂的特征在于，以β‑烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物作为有效成分；所述使多能干细胞分化的方法的特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β‑烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。

Description

多能干细胞分化促进剂
技术领域
本发明涉及一种促进多能干细胞的分化的原材料以及使用该原材料使多能干细胞分化的方法。
本申请基于2018年3月22日在日本申请的日本特愿2018-055186号而主张优先权，并将其内容引用于本说明书中。
背景技术
多能干细胞是具有自我复制能力的未分化细胞，是能够分化为各种细胞的细胞。近年来，人们正在积极地研究将多能干细胞、由多能干细胞分化诱导而成的细胞移植到患者受损的组织而实现其功能再生的再生医疗。再生医疗中，由于需要准备大量的多能干细胞或其分化细胞，因此人们在积极开发使多能干细胞高效增殖的方法、使多能干细胞高效分化的方法。
作为促进多能干细胞的分化的方法，例如，有报告称，将人干细胞在包含TGFβ超家族(分化诱导因子)的分化诱导用培养基中培养之前，预先用烟酰胺(NAM)培养，从而能够促进人干细胞向视网膜色素上皮细胞分化(例如，参见专利文献1)。另外，作为多能干细胞的培养方法，例如，有报告称，通过将间充质干细胞在包含烟酰胺(NAM)和成纤维细胞生长因子4(FGF4)的培养基中培养，能够使间充质干细胞高效增殖(例如，参见专利文献2)。还有报告称，若在NAM存在下培养诱导性多能干细胞(iPS细胞)，则NAM会抑制去乙酰化酶或PARP的功能，从而能够有效地制造基因表达模式与胚胎干细胞(ES细胞)非常类似的iPS细胞(例如，参见专利文献3)。通过将利用这些方法有效地制备的多能干细胞在分化诱导用培养基中培养，能够有效地获得分化细胞。此外，还报告了NAM能消除多能干细胞的多能性的缺失及重编程的障碍(例如，参见非专利文献1)。
另一方面，烟酰胺单核苷酸(NMN)是辅酶NAD+的生物合成中间代谢产物。近年来，有报告称NMN具有改善衰老小鼠的胰岛素分泌能力的效果，在因高脂饮食、衰老而引起的2型糖尿病的小鼠模型中具有显著改善胰岛素敏感性或分泌的效果(例如，参照专利文献4)，具有显著提高衰老的肌肉的线粒体功能的效果等。此外，还有报告称通过给药NMN，在伴随年龄增长而发生的肥胖、血脂浓度上升、胰岛素敏感性降低、记忆力降低以及黄斑变性等眼功能恶化等各种疾病的症状的改善、预防方面是有用的(例如，参照专利文献5)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表2010-524457号公报
专利文献2：日本特表2015-507921号公报
专利文献3：国际公开第2011/102333号
专利文献4：美国专利第7737158号说明书
专利文献5：国际公开第2014/146044号
非专利文献
非专利文献1：Son，et al.，STEM CELLS，2013，vol.31，p.1121-1135.
发明内容
发明想要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种用于有效地从多能干细胞获得分化细胞的原材料、以及使用该原材料促进多能干细胞的分化的方法。
用于解决课题的手段
为了解决上述课题，本发明人等进行了潜心研究，结果发现，通过在β-烟酰胺单核苷酸(β-NMN)存在下使多能干细胞分化可以得到更多的分化细胞，由此完成了本发明。
即，本发明提供以下的多能干细胞分化促进剂、使多能干细胞分化的方法、以及促进多能干细胞的分化的方法。
项[1]一种多能干细胞分化促进剂，其特征在于，以β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物作为有效成分。
项[2]根据上述项[1]的多能干细胞分化促进剂，其通过以β-烟酰胺单核苷酸换算计为0.01mM～10mM的方式被添加于多能干细胞的培养基中。
项[3]根据上述项[1]或项[2]的多能干细胞分化促进剂，其用于从多能干细胞获得分化细胞，所述多能干细胞选自由胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞以及皮肤干细胞所组成的组中的一种以上。
项[4]一种使多能干细胞分化的方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
项[5]根据上述项[4]的方法，其中，所述培养基的β-烟酰胺单核苷酸浓度为0.01mM～10mM。
项[6]根据上述项[4]或项[5]的方法，其中，所述培养基是分化诱导用培养基，所述分化诱导用培养基含有使多能干细胞分化的一种以上的分化诱导因子。
项[7]根据上述项[6]的方法，其中，所述分化诱导用培养基是用于将多能干细胞分化诱导为内胚层、中胚层或外胚层中的任一者的培养基。
项[8]根据上述项[4]或项[5]的方法，其中，将所述多能干细胞在含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物的保持多能性的培养基中培养之后，在含有一种以上的分化诱导因子的分化诱导用培养基中培养。
项[9]根据上述项[4]至项[8]中的任一项的方法，其中，所述多能干细胞选自由胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞以及皮肤干细胞所组成的组中的一种以上。
项[10]一种促进多能干细胞的分化的方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
发明效果
本发明中的多能干细胞分化促进剂通过作用于iPS细胞、ES细胞等多能干细胞而能够促进从多能干细胞向分化细胞的分化。因而，通过将多能干细胞在含有该多能干细胞分化促进剂的培养基中培养，能够有效地制备更多的分化细胞。
附图说明
图1是示出实施例1中在添加有β-NMN的分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞的各标志物的表达量的RT-PCR调查结果的图。
图2中，(A)是示出实施例2中在添加有β-NMN的外胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞的细胞数量的经时变化的图，(B)是示出实施例2中在添加有β-NMN的外胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞接种后第7天的细胞数量的图。
图3是示出实施例2中在添加有β-NMN的外胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞用Nestin(巢蛋白)和Pax6的表达量划分而得到的结果的图。
图4是示出实施例3中在添加有β-NMN的中胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞的接种后第7天的细胞数量的图。
图5是示出实施例3中在添加有β-NMN的中胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞用Brachyury和CD56的表达量划分而得到的结果的图。
图6是示出实施例4中在添加有β-NMN的内胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞接种后第7天的细胞数量的图。
图7是示出实施例4中在添加有β-NMN的内胚层分化诱导用培养基中培养后的iPS细胞用Sox17和CXCR4的表达量划分而得到的结果的图。
图8是示出实施例5中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经内胚层分化诱导的iPS细胞接种后第7天的细胞数量的图。
图9是示出了实施例5中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经内胚层分化诱导的iPS细胞用Sox17的表达量划分而得到的结果的图。
图10是示出实施例6中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经中胚层分化诱导的iPS细胞接种后第7天的细胞数量的图。
图11是示出实施例6中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经中胚层分化诱导的iPS细胞用Brachyury和CD56的表达量的划分而得到的结果的图。
图12中，(A)是示出实施例7中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经外胚层分化诱导的iPS细胞的细胞数量的经时变化的图，(B)是示出实施例7中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经外胚层分化诱导的iPS细胞接种后第9天的细胞数量的图。
图13是示出实施例7中在添加有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养之后再经外胚层分化诱导的iPS细胞用Nestin和Pax6的表达量划分而得到的结果的图。
图14是实施例8中在添加有β-NMN的增殖用培养基中培养后的间充质干细胞经骨分化诱导而得到的分化细胞的茜素S染色图像。
图15是实施例9中在添加有β-NMN的增殖用培养基中培养后的间充质干细胞经脂肪分化诱导而得到的分化细胞的油红O染色图像。
图16是示出实施例9中在添加有β-NMN的增殖用培养基中培养后的间充质干细胞经脂肪分化诱导而得到的分化细胞的PPARγ基因的相对表达量的测定结果的图。
图17是示出实施例9中在添加有β-NMN的增殖用培养基中培养后的间充质干细胞经脂肪分化诱导而得到的分化细胞的Adiponectin(脂联素)基因的相对表达量的测定结果的图。
具体实施方式
在本发明及本申请说明书中，多能干细胞是指具有自我复制能力并且具备多分化能(可以向各种细胞物种分化的能力)的未分化细胞，例如可列举：ES细胞、iPS细胞等多能干细胞，以及间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞、皮肤干细胞等成体干细胞。优选为也能够分化为外胚层、中胚层、内胚层中的任一者的细胞的多能干细胞。
在本发明及本申请说明书中，“促进多能干细胞的分化”表示在分化诱导多能干细胞时所得到的分化细胞的量增多。具体而言，多能干细胞的分化促进具有下述方式：提高多能干细胞的分化效率的方式，促进分化诱导时的细胞增殖的方式，以及提高多能干细胞的分化效率并促进分化诱导时的细胞增殖的方式。
本发明中的多能干细胞分化促进剂(下面有时称为“本发明的分化促进剂”)以NMN(化学式：C11H15N2O8P)为有效成分，在使多能干细胞分化时添加于其培养基中。NMN能够提高多能干细胞向各种胚层性细胞及体细胞的分化效率，或者提高分化后的体细胞的增殖性。因而，通过在NMN存在下使多能干细胞分化，能够更有效地从多能干细胞获得分化细胞。
NMN中存在α、β两种光学异构体，但作为本发明的分化促进剂的有效成分的NMN为β-NMN(CAS编号：1094-61-7)。β-NMN的结构如下所示。
[化学式1]
Figure BDA0002750243210000061
作为用作有效成分的β-NMN，可以通过任意的方法来制备。例如可以使用将通过化学合成法、酶法、发酵法等人工合成的β-NMN纯化而成的物质作为有效成分。另外，β-NMN是生物体中广泛存在的成分。因而，也可以将从动物、植物、微生物等天然原料中提取并纯化而得到的β-NMN用作有效成分。另外，还可以使用市售的纯化β-NMN。
作为合成β-NMN的化学合成法，例如，可以通过使NAM与L-四乙酰核糖(L-ribosetetracetate)反应并将得到的烟酰胺单核苷进行磷酸化从而制造β-NMN。另外，作为酶法，例如可通过烟酰胺磷酸核糖转移酶(NAMPT)由NAM和5’-磷酸核糖基-1’-焦磷酸(PRPP)制造β-NMN。作为发酵法，例如，能够利用表达NAMPT的微生物的代谢***而由NAM制造β-NMN。
作为本发明的分化促进剂的有效成分，其也可以是β-NMN的药理学上可接受的盐。作为β-NMN的药理学上可接受的盐，其可以是无机酸盐，也可以是具有胺之类的碱性部位的有机酸盐。作为构成这种酸盐的酸，例如可列举：醋酸、苯磺酸、安息香酸、樟脑磺酸、柠檬酸、乙烯磺酸(ethenesulfonic acid)、富马酸、葡萄糖酸、谷氨酸、氢溴酸、盐酸、羟乙基磺酸、乳酸、马来酸、苹果酸、扁桃酸、甲磺酸、粘酸、硝酸、双羟萘酸(pamoic acid)、泛酸、磷酸、琥珀酸、硫酸、酒石酸、对甲苯磺酸等。另外，作为β-NMN的药理学上可接受的盐，其可以是碱盐，也可以是具有羧酸之类的酸性部位的有机盐。作为构成这种酸盐的碱，例如可举出：作为碱金属盐或碱土金属盐的碱的氢化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化铝、氢氧化锂、氢氧化镁、氢氧化锌，以及由氨、三甲基氨、三乙基氨、乙二胺、赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸、胆碱、N,N’－二苄基乙二胺、氯普鲁卡因、普鲁卡因、二乙醇胺、N-苄基苯乙胺、二乙胺、哌嗪、三(羟基甲基)－氨基甲烷、四甲基氢氧化铵等碱衍生的碱。
作为本发明的分化促进剂的有效成分，其可以是游离的β-NMN或β-NMN的药理学上可接受的盐的溶剂化物。作为形成该溶剂化物的溶剂，可列举水、乙醇等。
本发明的分化促进剂除β-NMN之外还可以含有其它有效成分。与β-NMN并用的其它有效成分可以仅为一种，也可以是两种以上的组合。作为该其它有效成分，例如，可以从下述等成分中适当选择使用：白蛋白、抗坏血酸、α-生育酚、胰岛素、转铁蛋白、***钠、乙醇胺、Rock抑制剂等已知会提高多能干细胞的存活效率及增殖效率的成分；丙戊酸、二甲基亚砜、***、丁酸、曲古抑菌素A(trichostatin A)、GSK3抑制剂、BMP抑制剂、Wnt抑制剂、激活素、头蛋白(noggin)等已知会提高多能干细胞的分化效率的成分等。
在分化诱导多能干细胞时，通过使分化诱导用培养基中含有本发明的分化促进剂，能够促进多能干细胞的分化。另外，将多能干细胞在分化诱导前使用含有本发明的分化促进剂的未分化细胞用培养基进行培养后，即使在不含有本发明的分化促进剂的分化诱导用培养基中培养，也能够促进多能干细胞的分化。还可以在分化诱导前使用含有本发明的分化促进剂的未分化细胞用培养基进行培养、然后使用含有本发明的分化促进剂的分化诱导用培养基进行培养。
作为本发明的分化促进剂在分化诱导用培养基或未分化细胞用培养基中的含量，只要是使分化促进剂达到充分浓度以使得分化诱导多能干细胞所得到的分化细胞的量与在不含有该分化促进剂的培养基中培养时相比增多的含量，则没有特别的限定，可以针对多能干细胞种类、目标分化细胞种类、向培养基添加的时段、与培养基的其它成分的平衡等加以考虑后进行适当调节。当培养基的β-NMN浓度过低时，对多能干细胞的分化促进效果可能较弱。在培养基中含有过量β-NMN时，反而可能会抑制分化诱导或分化诱导时的细胞增殖。作为培养基中本发明的分化促进剂的含量，优选为使β-NMN浓度达到0.01～10mM的量，更优选为使β-NMN浓度达到0.05～5mM的量，进一步优选为使β-NMN浓度达到0.1～1mM的量。通过使β-NMN浓度处于上述范围内，能够充分促进多能干细胞的分化。
在本发明的分化促进剂存在下培养多能干细胞时，除了使分化诱导用培养基或未分化细胞用培养基中含有本发明的分化促进剂以外，能够通过常规方法来培养。例如，作为培养条件，能够使用通常培养动物细胞的培养条件，也可以根据需要而适当改变。例如，能够在培养温度30～40℃、CO2浓度1～10体积％、O2浓度0.1～25体积％下培养。
另外，作为含有本发明的分化促进剂的未分化细胞用培养基，例如，能够使用通常为了保持或增殖多能干细胞而用的培养基、为了培养动物细胞而用的培养基。另外，也可以使用市售的各种用于多能干细胞的培养基。作为含有本发明的分化促进剂的未分化细胞用培养基，具体而言，可列举：伊格尔极限必需培养基(MEM)、杜尔贝科改良伊格尔培养基(DMEM)、α伊格尔极限必需培养基(αMEM)、Iscove改良杜尔贝科培养基(IMDM)、F-12培养基、F-10培养基、DMEM/F12培养基、RPMI-1640培养基、间充质细胞基础培养基(MSCBM)、E8(Essential 8)培养基、TeSR-E8培养基、mTeSR1培养基等。可以根据需要向这些培养基中添加氨基酸、无机盐类、维他命类、抗生素等。在这些培养基中也可以适当含有已知能提高多能干细胞的存活效率及增殖效率的成分、已知具有能保持多能干细胞的未分化状态的作用的成分等。作为提高多能干细胞的存活效率的成分，例如，可列举Rho激酶(ROCK)抑制剂。
作为含有本发明的分化促进剂的分化诱导用培养基，能够使用在含有细胞存活所必需的营养成分的培养基中含有一种以上的分化诱导因子而成的培养基。作为含有细胞存活所必需的营养成分的培养基，可列举前述的未分化细胞用培养基。作为未分化细胞用培养基中所含的分化诱导因子，可以根据所使用的多能干细胞种类、目标分化细胞种类等而从各种文献中所记载的各种分化诱导因子中适当选定。此外，也可以使用E6(Essential 6)培养基等市售的分化诱导用培养基。这些培养基中除本发明的分化促进剂之外，还可以适当含有已知会提高多能干细胞的存活效率及增殖效率的成分、已知具有促进多能干细胞的分化的作用的成分等。
作为通过本发明的分化促进剂促进其分化的多能干细胞，优选来自动物的多能干细胞，更优选来自哺乳类的多能干细胞，进一步优选来自人的多能干细胞。另外，作为通过本发明的分化促进剂促进其分化的多能干细胞，优选为来自动物的ES细胞、iPS细胞或间充质干细胞，更优选为来自哺乳类的ES细胞、iPS细胞或间充质干细胞，进一步优选为来自人的ES细胞、iPS细胞或间充质干细胞。
本发明的分化促进剂优选用于促进也可特别地分化为外胚层、中胚层、内胚层中的任一者的细胞的多能干细胞的分化，特别优选用于促进向ES细胞或iPS细胞中的任一者的胚层的分化。例如，针对ES细胞或iPS细胞使用包含一种以上的使这些多能干细胞分化为三胚层中任一种胚层的分化诱导因子以及本发明的分化促进剂的分化诱导用培养基来培养，由此能够促进其向目标胚层细胞的分化。
实施例
接着，通过举出实施例来更详细地描述本发明，但本发明不限定于下面的实施例。
需要指出的是，在下面的实验中，作为iPS细胞用培养基，使用DMEM/F12培养基中添加19.4mg/L的胰岛素、10.7mg/L的转铁蛋白、64mg/L的抗坏血酸、14μg/L的***钠、100μg/L的人FGF2、2μg/L的人TGFβ1、543mg/L的碳酸氢钠而得到的培养基。
[实施例1]
调查了β-NMNiPS在iPS细胞的三胚层分化中的效果。使用人iPS细胞201B7株作为iPS细胞。
<培养>
将iPS细胞，以10000细胞/孔的方式接种于U底96孔板“Nunclon Sphera 96U-wellplate”(赛默飞世尔科技(Thermo Fisher Scientific)公司制造)，并使用如下培养基培养1天，该培养基通过如下方式制成：在作为分化诱导用培养基的E6培养基(Gibco公司制造)中，分别地，添加β-NMN并使其最终浓度成为0、0.25或1mM，添加Rock抑制剂并使其最终浓度成为10μM。Rock抑制剂是为了抑制Rho依赖性凋亡而添加的。在接种后第1天和第5天，使用从接种时的培养基中去除Rock抑制剂而制得的培养基来进行培养基更换。
<通过RT-PCR测定各标志物的表达量>
针对接种后第3天和第7天的细胞进行采样，进行RT-PCR，调查未分化标志物(Nanog、Sox2、Oct3/4、Lin28a、Klf4)、内胚层标志物(Sox17、AFP)、中胚层标志物(MSX1、Brachyury)、外胚层标志物(PAX6)表达的表达量。具体而言，使用RNA提取用试剂盒“RNeasyMini Kit”(Qiagen公司制造)从采样得到的细胞中提取RNA，以所提取的RNA为模板，使用逆转录用试剂盒“SuperScript(注册商标)III First-Strand Synthesis System”(Thermoscientific公司制造)合成cDNA。使用得到的cDNA，通过PCR评价各标志物的表达量。作为内标基因，以G3PDH作为对照。
将PCR产物电泳分离后，将染色的结果示于图1。图中，“第0天”(Day 0)表示即将接种前的细胞的结果，“第3天”(Day 3)及“第7天”(Day 7)分别表示接种后第3天和第7天的细胞的结果。该结果显示，在β-NMN存在下所分化诱导的细胞中，与在β-NMN不存在下所培养的细胞相比，各未分化标志物的表达量降低，分化标志物的表达量升高。
[实施例2]
调查了β-NMN在iPS细胞的外胚层分化诱导时的效果。使用201B7株作为iPS细胞。
<培养>
将iPS细胞以8×105细胞/孔的方式接种于按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的12孔板中。将该12孔板的细胞在后述培养基中培养1天，该培养基是通过如下方式制成：在“STEMdiff Trilineage Differentiation kit”(STEMCELL technology公司制造)的外胚层分化诱导用培养基中，分别地，添加β-NMN并使其最终浓度成为0、0.1、0.25或1mM，添加Rock抑制剂并使其最终浓度成为10μM。从接种后第1天起，每天使用从接种时的培养基中去除Rock抑制剂而制得的培养基来进行培养基更换。
<细胞数量的经时变化>
针对接种后第2天、第4天或第7天的细胞进行采样，并统计细胞数量。将各细胞的细胞数量的经时变化示于图2(A)，将接种后第7天的细胞数量示于图2(B)。其结果显示，用含有β-NMN的外胚层分化诱导用培养基所培养的细胞在细胞数量上多于用未添加β-NMN的培养基所培养的细胞。由该结果可知，基于β-NMN提高了向外胚层分化诱导时的细胞增殖性。
<使用流式细胞仪测定外胚层分化标志物表达细胞>
将接种后第2天、第4天或第7天进行采样得到的细胞用多聚甲醛固定后，用含皂苷的PBS膜进行渗透处理。接着，使用荧光标记的抗Nestin抗体(Biolegend公司制造，clone10C2)及荧光标记的抗Pax6抗体(贝克顿-迪金森公司制造，clone O18-1330)对细胞进行染色。将染色后的细胞清洗后，通过流式细胞仪“FACScaliber”(贝克顿-迪金森公司制造)分析各细胞的抗Nestin抗体的荧光强度以及抗Pax6抗体的荧光强度。Nestin和Pax6为外胚层的分化标志物。
将通过流式细胞仪针对各细胞用Nestin和Pax6的表达量划分而得到的结果示于图3。Nestin阳性且Pax6阳性的细胞是已分化为外胚层的细胞。图中的百分比表示Nestin阳性Pax6阳性细胞相对于细胞总量的比率(％)。其结果是，在β-NMN存在下所培养的细胞的Nestin阳性Pax6阳性细胞的比率更高。即，已确认通过添加β-NMN提高了外胚层分化时的分化效率。
由这些结果可知，β-NMN提高了向外胚层分化诱导时细胞的增殖性及分化效率这两者，并促进了从iPS细胞向外胚层细胞的分化。
[实施例3]
调查了β-NMN在iPS细胞的中胚层分化诱导时的效果。使用201B7株作为iPS细胞。
<培养>
将iPS细胞以1×105细胞/孔的方式接种于按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的24孔板中。将该24孔板的细胞，在以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而得到的iPS细胞用培养基中培养1天。从接种后第1天起，每天更换培养基，更换培养基时，使用在“STEMdiff Trilineage Differentiation kit”(STEMCELL technology公司制造)的中胚层分化诱导用培养基中以使最终浓度成为0、0.1、0.25或1mM的方式添加β-NMN而得到的培养基进行更换。仅在接种后第1天更换培养基时，更换为向所述中胚层分化诱导用培养基添加β-NMN的同时以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而得到的培养基。
<细胞数量的经时变化>
针对接种后第7天的细胞进行采样，并统计细胞数量。将各细胞的接种后第7天的细胞数量示于图4。其结果是，用含有β-NMN的中胚层分化诱导用培养基所培养的细胞在细胞数量上多于用未添加-NMN的培养基所培养的细胞。由该结果可知，基于β-NMN能够提高向中胚层分化诱导时的细胞增殖性。
<使用流式细胞仪测定中胚层分化标志物表达细胞>
将接种后第5天或第7天进行采样得到的细胞用多聚甲醛固定后，用含皂苷的PBS膜进行渗透处理。接着，使用荧光标记的抗Brachyury抗体(Merck公司制造，clone 3E4.2)及荧光标记的抗CD56抗体(Biolegend公司制造，clone HCD56)对细胞进行染色。将染色后的细胞清洗后，通过流式细胞仪“FACScaliber”(贝克顿-迪金森公司制造)分析各细胞的抗Brachyury抗体的荧光强度及抗CD56抗体的荧光强度。Brachyury和CD56是中胚层的分化标志物。
将通过流式细胞仪针对各细胞用Brachyury和CD56的表达量划分而得到的结果示于图5。Brachyury阳性且CD56阳性的细胞是已分化为中胚层的细胞。图中的百分比表示Brachyury阳性CD56阳性细胞相对于细胞总量的比率(％)。其结果是，在β-NMN存在下所培养的细胞与在β-NMN不存在下所培养的细胞的Brachyury阳性CD56阳性细胞的比率方面，没有明确的差异。特别是在添加了1mMβ-NMN的细胞中，与未添加β-NMN而培养时相比，Brachyury阳性CD56阳性细胞的比率明显降低。即，已确认添加β-NMN不太影响中胚层分化时的分化效率。
由这些结果可知，β-NMN虽然在向中胚层分化诱导时会提高细胞的增殖性，但在从iPS细胞向中胚层细胞分化中没有明确的差异。
[实施例4]
调查了β-NMN在iPS细胞的内胚层分化诱导时的效果。使用253G1株作为iPS细胞。
<培养>
将iPS细胞以3×105细胞/孔的方式接种于按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的24孔板中。将该24孔板的细胞在以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂的iPS细胞用培养基中培养1天。从接种后第1天起，每天更换培养基，更换培养基时，使用在“STEMdiff Trilineage Differentiation kit”(STEMCELL technology公司制造)的内胚层分化诱导用培养基中以使最终浓度成为0、0.1、0.25或1mM的方式添加了β-NMN而得到的培养基来进行更换。仅在接种后第1天更换培养基时，更换为在所述内胚层分化诱导用培养基中添加β-NMN的同时以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而得到的培养基。
<细胞数量的经时变化>
针对接种后第7天的细胞进行采样，并统计细胞数量。将各细胞的接种后第7天的细胞数量示于图6。其结果是，用含有β-NMN的内胚层分化诱导用培养基所培养的细胞在细胞数量上多于用未添加β-NMN的培养基所培养的细胞。由该结果可知，基于β-NMN能提高向内胚层分化诱导时的细胞增殖性。
<使用流式细胞仪测定内胚层分化标志物表达细胞>
将接种后5或第7天进行采样得到的细胞用多聚甲醛固定后，用含皂苷的PBS膜进行渗透处理。接着，使用荧光标记的抗Sox17抗体(贝克顿-迪金森公司制造，clone P7-969)及荧光标记的抗CXCR4抗体(Biolegend公司制造，clone 12G5)对细胞进行染色。将染色后的细胞清洗后，通过流式细胞仪“FACScaliber”(贝克顿-迪金森公司制造)分析各细胞的抗Sox17抗体的荧光强度及抗CXCR4抗体的荧光强度。Sox17和CXCR4是内胚层的分化标志物。
将通过流式细胞仪针对各细胞用Sox17和CXCR4的表达量划分而得到的结果示于图7。Sox17阳性且CXCR4阳性的细胞是已分化为内胚层的细胞。图中的百分比表示Sox17阳性CXCR4阳性细胞相对于细胞总量的比率(％)。其结果是，在β-NMN存在下所培养的细胞与在β-NMN不存在下所培养的细胞的Sox17阳性CXCR4阳性细胞的比率方面，没有明确的差异。即，已确认β-NMN的添加不太影响内胚层分化时的分化效率。
由这些结果可知，β-NMN虽然在向内胚层分化诱导时会提高细胞的增殖性，但从iPS细胞向内胚层细胞的分化中没有明确的差异。
[实施例5]
调查了分化诱导前在β-NMN存在下培养对iPS细胞的内胚层分化诱导的效果。使用253G1株作为iPS细胞。
<培养>
将按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的培养皿中所接种的iPS细胞，在后述培养基中培养1天，该培养基是通过如下方式制成：在iPS细胞用培养基中分别地以使最终浓度成为0、0.25或1mM的方式添加β-NMN、并且以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂，再向如上得到的培养基中以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂。从接种后第1天起，每天使用从接种时的培养基中去除Rock抑制剂而制得的培养基来进行培养基更换。在达到70～80％汇合度的时刻，从培养皿中剥离回收iPS细胞。
将回收的iPS细胞，以3×105细胞/孔的方式接种于按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的24孔板中。该24孔板的细胞在后述培养基中培养1天，该培养基是从在培养皿中培养时的培养基中去除β-NMN并以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而得到的培养基。从接种后第1天起，每天使用“STEMdiff Trilineage Differentiationkit”(STEMCELL technology公司制造)的内胚层分化诱导用培养基来进行培养基更换。
<细胞数量的经时变化>
针对接种后第7天的细胞进行采样，并统计细胞数量。将各细胞的接种后第7天的细胞数量示于图8。其结果是，用含有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养后进行内胚层分化诱导的细胞与用不含β-NMN的iPS细胞用培养基中培养后进行内胚层分化诱导的细胞在细胞数量方面没有明确的差异。即，可知未分化培养时β-NMN的添加不太影响然后内胚层分化时的细胞增殖。
<使用流式细胞仪测定内胚层分化标志物表达细胞>
将接种后5或第7天进行采样得到的细胞用多聚甲醛固定后，用含皂苷的PBS膜进行渗透处理。接着，使用荧光标记的抗Sox17抗体(贝克顿-迪金森公司制造，clone P7-969)及荧光标记的抗FoxA2抗体(贝克顿-迪金森公司制造，clone N17-280)对细胞进行染色。将染色后的细胞清洗后，通过流式细胞仪“FACScaliber”(贝克顿-迪金森公司制造)分析各细胞的抗Sox17抗体的荧光强度及抗FoxA2抗体的荧光强度。Sox17和FoxA2是内胚层的分化标志物。
将通过流式细胞仪针对各细胞用Sox17的表达量划分而得到的结果使用图9。Sox17阳性的细胞是已分化为内胚层的细胞。图中的百分比表示Sox17阳性细胞相对于细胞总量的比率(％)。其结果是，未分化培养时在β-NMN存在下所培养的iPS细胞的Sox17阳性细胞的比率比在β-NMN非存在下所向培养的iPS细胞更高。即，已确认通过未分化培养时在β-NMN存在下培养而提高了内胚层分化时的分化效率。
由这些结果可知，通过将iPS细胞预先在β-NMN存在下培养后再进行内胚层分化诱导，向内胚层的分化效率提高，进而促进从iPS细胞向内胚层细胞的分化。
[实施例6]
调查了分化诱导前在β-NMN存在下培养对iPS细胞的中胚层分化诱导的效果。使用201B7株作为iPS细胞。
<培养>
将iPS细胞与实施例5同样地在培养皿中培养，并在达到70～80％汇合度的时刻，从培养皿中剥离回收iPS细胞。
将回收的iPS细胞以1×105细胞/孔的方式接种于按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的24孔板。将该24孔板的细胞在培养基中培养1天，该培养基是从培养皿中培养时的培养基中去除β-NMN、再以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而得到的。从接种后第1天起，每天使用“STEMdiff Trilineage Differentiation kit”(STEMCELLtechnology公司制造)的中胚层分化诱导用培养基来进行培养基更换。
<细胞数量的经时变化>
针对接种后第7天的细胞进行采样，并统计细胞数量。将各细胞的接种后第7天的细胞数量示于图10。其结果是，用含有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养后再进行中胚层分化诱导的细胞在细胞数量上多于用不含β-NMN的iPS细胞用培养基中培养后再进行中胚层分化诱导的细胞。即，可知通过在未分化培养时添加β-NMN会提高其后的中胚层分化时的细胞增殖。
<使用流式细胞仪测定中胚层分化标志物表达细胞>
与实施例3同样地，将接种后第5天或第7天进行采样得到的细胞用荧光标记的抗Brachyury抗体及荧光标记的抗CD56抗体染色，通过流式细胞仪分析各细胞的抗Brachyury抗体的荧光强度及抗CD56抗体的荧光强度。
将通过流式细胞仪针对各细胞用Brachyury和CD56的表达量划分而得到的结果示于图11。Brachyury阳性且CD56阳性的细胞是已分化为中胚层的细胞。图中的百分比表示Brachyury阳性CD56阳性细胞相对于细胞总量的比率(％)。其结果是，中胚层分化诱导前在β-NMN存在下所培养的细胞和在β-NMN不存在下所培养的细胞的分化诱导后的Brachyury阳性CD56阳性细胞的比率方面，没有明确的差异。即，已确认未分化培养时的β-NMN不太会影响其后的中胚层分化诱导时的分化效率。
由这些结果可知，通过将iPS细胞预先在β-NMN存在下培养后再进行中胚层分化诱导，虽然中胚层分化诱导时的细胞增殖性得到提高，但从iPS细胞向中胚层细胞的分化中未见明确的差异。
[实施例7]
调查了分化诱导前在β-NMN存在下培养对iPS细胞的外胚层分化诱导的效果。使用201B7株作为iPS细胞。
<培养>
将iPS细胞与实施例5同样地在培养皿中培养，在达到70～80％汇合度的时刻，从培养皿中剥离回收iPS细胞。
将回收的iPS细胞以3×105细胞/孔的方式接种于按照制造商规定用基质胶(康宁公司制造)涂覆后的24孔板。将该24孔板的细胞在培养基中培养1天，该培养基是从培养皿中培养时的培养基中去除β-NMN、再以使最终浓度成为10μM的方式添加Rock抑制剂而得到的。从接种后第1天起，每天使用“STEMdiff Trilineage Differentiation kit”(STEMCELLtechnology公司制造)的外胚层分化诱导用培养基来进行培养基更换。
<细胞数量的经时变化>
针对接种后第7天或第9天的细胞进行采样，并统计细胞数量。将各细胞的细胞数量的经时变化示于图12(A)，将接种后第9天的细胞数量示于图12(B)。其结果是，用含有β-NMN的iPS细胞用培养基中培养后再进行外胚层分化诱导的细胞在细胞数量上多于用不含β-NMN的iPS细胞用培养基中培养后再进行外胚层分化诱导的细胞。即，可知通过未分化培养时添加β-NMN，会提高其后的外胚层分化时的细胞增殖。
<使用流式细胞仪测定外胚层分化标志物表达细胞>
与实施例2同样地，将接种后第7天或第9天进行采样得到的细胞用荧光标记的抗Nestin抗体及荧光标记的抗Pax6抗体染色，通过流式细胞仪分析各细胞的抗Nestin抗体的荧光强度及抗Pax6抗体的荧光强度。
将通过流式细胞仪针对各细胞用Nestin和Pax6的表达量划分而得到的结果示于图13。Nestin阳性且Pax6阳性的细胞是已分化为外胚层的细胞。图中的百分比表示Nestin阳性Pax6阳性细胞相对于细胞总量的比率(％)。其结果是，在外胚层分化诱导前在β-NMN存在下所培养的细胞和在β-NMN不存在下所培养的细胞的、分化诱导后的Nestin阳性Pax6阳性细胞的比率方面，没有明确的差异。即，已确认未分化培养时的β-NMN不太会影响其后的外胚层分化诱导时的分化效率。
由这些结果可知，通过将iPS细胞预先在β-NMN存在下培养之后再进行外胚层分化诱导，虽然外胚层分化诱导时的细胞增殖性得到提高，但从iPS细胞向外胚层细胞的分化中未见明确的差异。
[实施例8]
调查了分化诱导前在β-NMN存在下培养对间充质干细胞的骨分化诱导的效果。使用来自人脂肪组织的间充质干细胞(Lonza公司制造，Cat#PT5006)作为间充质干细胞。
<培养基>
使用向“MSCGM Bullet Kit”(Lonza公司制造，Cat#PT3001)中适当添加β-MNM而得到的培养基作为增殖用培养基。
向α-MEM培养基中以使最终浓度成为10容量％的方式添加胎牛血清、以使最终浓度成为10nM的方式添加***、以使最终浓度成为10mM的方式添加β甘油磷酸、以使最终浓度成为50μg/mL的方式添加抗坏血酸、并以使最终浓度成为0.1％的方式添加青霉素-链霉素，将由此得到的培养基用作骨分化诱导用培养基。
<间充质干细胞的培养>
将间充质干细胞，以5×103细胞/cm2的方式接种于使用了未添加β-MNM的增殖用培养基的培养皿中，并在37℃、5体积％(CO2)下静置培养1天。从接种起经过了1天之后，每两天使用以使最终浓度成为0、0.1或0.25mM的方式添加β-MNM的增殖用培养基来进行培养基更换。
另外，在培养皿内的细胞密度达到80～90％汇合度的时刻，进行传代。在传代时，首先，从培养皿中去除上清、用PBS清洗后，添加“1×Tryple Select”(Gibco公司制造)，并在37℃、5体积％(CO2)条件下静置4分钟。静置后，轻轻叩击培养皿以使细胞剥离，然后添加增殖用培养基，通过吹打使细胞单个化。接着，将该单个化后的细胞分散在添加有β-MNM的增殖用培养基中，并以5×103细胞/cm2的方式接种于培养皿，在37℃、5体积％(CO2)条件下静置培养。
将经过4次传代培养的细胞用于后面的分化测定。
<分化诱导>
将经β-MNM驯化的细胞以2×104细胞/孔的方式接种于48孔板，并在37℃、5体积％(CO2)下，用含有β-MNM的增殖用培养基培养至孔内的细胞密度达到80～90％汇合度，然后，更换为骨分化诱导用培养基。培养基更换时3至4天进行1次，分化诱导开始后第14天进行染色试验。
<染色试验>
对于分化诱导后的细胞，使用茜素红S进行沉积钙的染色，并用相差显微镜确认染色状态。
将染色图像示于图14。与未添加β-NMN(0mM)的细胞相比，用添加有0.1mM或0.25mM的β-NMN的培养基所培养的细胞可见钙沉积更强。由这些结果表明，在β-NMN存在下增殖培养后的细胞向骨的分化得以促进。
[实施例9]
调查了分化诱导前在β-NMN存在下培养对间充质干细胞的脂肪分化诱导的效果。与实施例8同样地，使用来自人脂肪组织的间充质干细胞(Lonza公司制造，Cat#PT5006)作为间充质干细胞。
<培养基>
与实施例8同样地，使用向“MSCGM Bullet Kit”(Lonza公司制造，Cat#PT3001)中适当添加β-MNM而得到的培养基作为增殖用培养基。
向DMEM-High Glucose培养基中以使最终浓度成为10容量％的方式添加胎牛血清、以使最终浓度成为0.5mM的方式添加IBMX、以使最终浓度成为1μM的方式添加***、以使最终浓度成为200μM的方式添加吲哚美辛、并以使最终浓度成为0.1％的方式添加青霉素-链霉素，将由此得到的培养基用作脂肪分化诱导用培养基。
<间充质干细胞的培养>
分化诱导前的间充质干细胞的培养与实施例8同样地进行。
<分化诱导>
除了使用脂肪分化诱导用培养基替代骨分化诱导用培养基之外，与实施例8同样地进行分化诱导。分化诱导开始后第14天进行染色试验及细胞的RNA的回收。
<染色试验>
针对分化诱导后的细胞，使用油红O进行细胞内脂肪滴的染色，并用相差显微镜确认染色状态。
将染色图像示于图15。与未添加β-NMN(0mM)的细胞相比，用添加有0.1mM或0.25mM的β-NMN的培养基所培养的细胞中可见有大量的脂肪滴的蓄积。
<qPCR测定>
使用“RNeasy Mini Plus Kit”(QIAGENE公司制造)从分化诱导后的细胞中提取RNA，将其作为模板，使用“SuperScript(注册商标)III First-Strand Synthesis Super Mix”(Invitrogen公司制造)合成cDNA。将得到的cDNA作为模板，使用表1中记载的引物和试剂“TB Green Fast qPCR Mix”(TaKaRa公司制造)进行qPCR，并测定PPARγ基因、Adiponectin基因及GAPDH基因的表达量。测定装置使用实时PCR***“7500Fast Real-Time PCRSystem”(Applied Biosystems公司制造)。将GAPDH基因用作内标。
[表1]
Figure BDA0002750243210000201
由分化诱导为脂肪的细胞的qPCR的结果求取各基因的相对表达量。将未添加β-NMN(0mM)的细胞的基因表达量设为1。图16示出PPARγ基因的相对表达量的测定结果，图17示出Adiponectin基因的相对表达量的测定结果。PPARγ及Adiponectin均为脂肪分化标志物。与未添加β-NMN(0mM)的细胞相比，用添加0.1mM或0.25mM的β-NMN的培养基所培养的细胞中确认到两种基因的表达量增加。
由油红O染色及qPCR的结果表明，在β-NMN存在下增殖培养的细胞向脂肪的分化得以促进。
序列表
<110> 东方酵母工业株式会社(Oriental Yeast Co.,Ltd.)
<120> 多能干细胞分化促进剂
<130> PC-27444
<160> 6
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列描述: PPARgamma的引物（Description of Artificial Sequence:Primer of PPARgamma）
<400> 1
gagcccaagt ttgagtttgc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列描述: PPARgamma的引物（Description of Artificial Sequence:Primer of PPARgamma）
<400> 2
tcaatgggct tcacattcag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列描述: 脂联素的引物（Description of Artificial Sequence:Primer of Adiponectin）
<400> 3
cctggtgaga agggtgagaa 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列描述: 脂联素的引物（Description of Artificial Sequence:Primer of Adiponectin）
<400> 4
ctcctttcct gccttggatt 20
<210> 5
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列描述: GAPDH的引物（Description of Artificial Sequence:Primer of GAPDH）
<400> 5
aacgggaagc ttgtcatcaa tggaaa 26
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220>
<223> 人工序列描述: GAPDH的引物（Description of Artificial Sequence:Primer of GAPDH）
<400> 6
gcatcagcag agggggcaga g 21

Claims (10)

1.一种多能干细胞分化促进剂，其特征在于，以β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物作为有效成分。
2.如权利要求1所述的多能干细胞分化促进剂，其通过以β-烟酰胺单核苷酸换算计为0.01mM～10mM的方式被添加于多能干细胞的培养基中。
3.如权利要求1或2所述的多能干细胞分化促进剂，其用于从多能干细胞获得分化细胞，所述多能干细胞选自由胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞以及皮肤干细胞所组成的组中的一种以上。
4.一种使多能干细胞分化的方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
5.如权利要求4所述的方法，其中，所述培养基的β-烟酰胺单核苷酸浓度为0.01mM～10mM。
6.如权利要求4或5所述的方法，其中，所述培养基是分化诱导用培养基，所述分化诱导用培养基含有使多能干细胞分化的一种以上的分化诱导因子。
7.如权利要求6所述的方法，其中，所述分化诱导用培养基是用于将多能干细胞分化诱导为内胚层、中胚层或外胚层中的任一者的培养基。
8.如权利要求4或5所述的方法，其中，将所述多能干细胞在含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物的保持多能性的培养基中培养之后，在含有一种以上的分化诱导因子的分化诱导用培养基中培养。
9.如权利要求4至8中任一项所述的方法，其中，所述多能干细胞选自由胚胎干细胞、诱导性多能干细胞、间充质干细胞、造血干细胞、神经干细胞以及皮肤干细胞所组成的组中的一种以上。
10.一种促进多能干细胞的分化的方法，其特征在于，在培养基中培养多能干细胞，所述培养基含有β-烟酰胺单核苷酸或其药理学上可接受的盐、以及它们的溶剂化物。
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