CN113337459A - 一种提高多能干细胞分化效能的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高多能干细胞分化效能的方法,所述提高多能干细胞分化效能的方法包括对多能干细胞进行微分化处理,具体的,所述微分化处理包括使用E6培养基培养多能干细胞和/或DMSO处理多能干细胞。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,尤其涉及提高多能干细胞分化效能的方法、培养基、细胞培养***和试剂盒。
背景技术
多能干细胞(Pluripotent Stem Cells)是一类具有自我更新、自我复制能力的多潜能细胞,是当前干细胞研究的热点和焦点。在细胞治疗、组织工程学和再生医学以及药物和生物技术应用上有着巨大的前景。它可以分化成体内所有的细胞,进而形成身体的所有组织和器官,但失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制。因此,多能干细胞的研究不仅具有重要的理论意义,而且在器官再生、修复和疾病治疗方面极具应用价值,基于其具有的强大的自我更新能力和多向分化潜能使之成为创伤修复、再生医学或组织工程学等研究领域的热点,为再生医学疗法铺平了道路。
干细胞的定向分化是生物体发育、生长和修复的基础,是由细胞内外因素共同控制、调节特定基因的表达来实现的。在干性维持培养基中,ESC/iPSC会逐步的自动分化成不同的胚层细胞,这也是ESC/iPSC干性的体现。因此,在ESC/iPSC培养时,会在干性维持培养基中添加干性维持因子(bFGF和TGFβ),或者添加抑制信号通路的小分子化合物,从而维持ESC/iPSC的干性。在我们进行定向分化时,会通过添加特定的小分子化合物到分化培养基中,引导ESC/iPSC分化。
ESC/iPSC可以分化为我们体内任何类型的细胞,但是不同的ESC/iPSC细胞系干性维持能力不一致,导致分化能力不一,进而影响分化效率。由于ESC/iPSC长期在干性维持培养基中扩增培养,突然地使用分化培养基,会引起ESC/iPSC的大量死亡,分化效率低下等状况。
本专利提供了一种提高ESC/iPSC的分化效能的方法,在干性维持和分化中间,添加了一个微分化处理的过程,在分化实验之前用E6培养基培养多能干细胞或用DMSO处理多能干细胞一定时间之后再进行分化实验,可以提高多能干细胞的分化效能及活率。
发明内容
本发明提供了一种提高多能干细胞分化效能的方法、***和试剂盒。
方法
一方面,本发明提供了一种提高多能干细胞分化效能的方法,所述方法包括对多能干细胞进行微分化处理。
在一种实施方式中,所述微分化处理包括使用E6培养基培养多能干细胞和/或DMSO处理多能干细胞,微分化处理是使用E6培养基培养多能干细胞和/或DMSO处理多能干细胞。
在一种实施方式中,所述E6培养基的成分包括DMEM/F12,碳酸氢钠,L-抗坏血酸,胰岛素,胰岛素转铁蛋白和***钠中的一种或多种;优选地,所述E6培养基的成分是DMEM/F12,碳酸氢钠,L-抗坏血酸,胰岛素,胰岛素转铁蛋白和***钠;优选地,所述E6培养基是向DMEM/F12培养基中添加15–22mM的碳酸氢钠,60-220μM的L-抗坏血酸,20μg/ml胰岛素,10μg/ml胰岛素转铁蛋白和20ng/ml***钠配置而成。
在一种实施方式中,所述E6培养基还可以是Essential 6TMMedium;优选地,所述E6培养基是商品化的培养基;更优选地,是赛默飞世尔,货号为A1516401的培养基。
在一种实施方式中,所述E6培养基还可以添加干性维持因子或小分子化合物;优选地,所述E6培养基还可以添加TGFβ和/或bFGF;优选地,所述TGFβ的工作浓度是1-10ng/ml,所述bFGF的工作浓度是50-100ng/ml。
在一种实施方式中,所述E6培养基可以是购买的商品化培养基,也可以是人为配置的培养基。
在一种实施方式中,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞0-72小时;优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞0-48小时;优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞0-24小时,具体的包括:1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时;优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞24小时。
在一种实施方式中,所述DMSO处理多能干细胞包括将DMSO添加到微分化处理培养基中对细胞进行培养;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是将DMSO添加到微分化处理培养基中对细胞进行培养。
在一种实施方式中,所述DMSO的工作浓度是1%-2%,具体的:1%,1.1%,1.2%,1.3%,1.4%,1.5%,1.6%,1.7%,1.8%,1.9%,2%;优选地,所述DMSO的工作浓度是1.5%-2%;更优选地,所述DMSO的工作浓度是2%。
在一种实施方式中,所述微分化处理培养基包括Essential 8TMMedium、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、最小必需培养基(MEM,Minimal Essential Medium)、伊格尔基本培养基(BME,Basal Medium Eagle)、F-10,F-12、α-最小必需培养基(α-MEM,α-Minimal Essential Medium)、G-最小必需培养基(G-MEM,Glasgow’s Minimal Essential Medium)、IMPM(IMDM,Iscove’s Modified Dulbecco’sMedium)、AmnioMax、新型二代羊水培养基(Amino MaxⅡcomplete Medium,Gibco,Newyork,USA)、Chang’s培养基、MesemCult-XF培养基(STEMCELL Technologies,Vancouver,Canada)、RPMI 1640、Ham’s F12、DMEM/F12、Ham's F-12K Medium,HepatoZYME-SFM、William’s EMedium、Waymouth’s Medium或Hepatocyte Culture Medium中的任意一种或多种的组合;优选地,微分化处理培养基是Essential 8TMMedium培养基。
在一种实施方式中,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞0-72小时;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞0-48小时,0-36小时;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞0-24小时,具体的包括:1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时、24小时;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞24小时。
在一种实施方式中,所述多能干细胞包括ESC、iPSC、拟胚体、细胞造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的一种或多种;
优选地,所述多能干细胞包括ESC和/或iPSC;
优选地,所述多能干细胞包括iPSC;
更优选地,所述多能干细胞是iPSC。
在一种实施方式中,所述iPSC可以是商品化的细胞系,也可以是由供体细胞诱导而来,所述供体细胞的来源包括绒毛细胞,皮肤(成纤维细胞和角质形成细胞),羊水,胚外组织(胎盘和脐带),脐带血,骨膜,牙组织,脂肪组织,神经干细胞,肝细胞,羊膜来源的间质干细胞,羊膜来源的外周血细胞,乳腺上皮细胞,脂肪干细胞,脐带基质和胎盘中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述多能干细胞可以是人源多能干细胞或非人源多能干细胞;所述非人源多能干细胞包括哺乳动物(如鼠、猴、牛、羊、猪、马、鸡)来源的多能干细胞。
优选地,所述胚胎干细胞包括E14.1小鼠胚胎干细胞系、R1/E小鼠胚胎干细胞系、Oct4-Neo小鼠胚胎干细胞系、J1小鼠胚胎干细胞系、CE3小鼠胚胎干细胞系、Nanog-GFP小鼠胚胎干细胞系、RW.4小鼠胚胎干细胞系、R1小鼠胚胎干细胞系、G-Olig2小鼠胚胎干细胞系、ESF158小鼠胚胎干细胞系、EDJ22小鼠胚胎干细胞系、C57BL/6小鼠胚胎干细胞系、HN4人类胚胎干细胞系、H9人类胚胎干细胞系、H1人类胚胎干细胞系。
优选地,所述人胚胎干细胞包括HN4人类胚胎干细胞系、H9人类胚胎干细胞系和H1人类胚胎干细胞系中的一种或多种。
优选地,所述人诱导多能干细胞包括UiPSC-013(UC-013)细胞系和/或UiPS C-015(UC-015)细胞系。
在一种实施方式中,所述提高分化效能是指提高多能干细胞分化为终端细胞或其前体细胞的能力;优选地,所述提高分化效能是指多能干细胞分化出更多的终端细胞;优选地,所述提高分化效能可以通过细胞检测体现。
在一种实施方式中,所述细胞检测可以是定量检测和/或定性检测。
在一种实施方式中,所述细胞检测可以是细胞活性检测、基于免疫的检测、流式细胞仪检测、比色检测、基于金纳米颗粒的检测、荧光检测、紫外检测、目标终端细胞的前体细胞标志物和目标终端细胞标志物的检测中的一种或多种;优选地,所述细胞检测是荧光检测、目标终端细胞的前体细胞标志物和目标终端细胞标志物的检测中的一种或多种;
优选地,所述前体细胞标志物是MESP2,NKX2.5和PDGFRA中的一种或多种;
优选地,所述目标终端细胞标志物是心肌细胞标志物;优选地,所述目标终端细胞标志物是心肌细胞标志物TNNT和/或β-MHC。
在一种实施方式中,所述细胞检测可以在诱导分化处理进行了0-50天之后进行;优选地,所述细胞检测可以在诱导分化处理进行了0-30天之后进行,所述细胞检测可以在诱导分化处理进行了3-15天之后进行。
在一种实施方式中,所述终端细胞包括心肌细胞,祖细胞,类器官,神经干细胞,多巴胺能神经元细胞,少突胶质细胞,少突胶质前体细胞,多巴胺能神经元,肝细胞,肾相关细胞,胰岛小体细胞,内皮祖细胞,色素上皮细胞,视锥细胞,皮肤细胞,血液相关细胞,间充质肝细胞;
优选地,所述终端细胞是心肌细胞。
在一种实施方式中,所述方法还可以包括微分化处理前的基础培养、微分化处理后的诱导分化处理和诱导分化处理后的扩增培养中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述微分化处理前的干性维持培养是使用干性维持培养基培养多能干细胞。
在一种实施方式中,所述干性维持培养基包括以下一种或多种的组合:Essential 8TMMedium、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle’sMedium)、最小必需培养基(MEM,Minimal Essential Medium)、伊格尔基本培养基(BME,Basal Medium Eagle)、F-10,F-12、α-最小必需培养基(α-MEM,α-Minimal EssentialMedium)、G-最小必需培养基(G-MEM,Glasgow’s Minimal Essential Medium)、IMPM(IMDM,Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、AmnioMax、新型二代羊水培养基(Amino MaxⅡcomplete Medium,Gibco,New york,USA)、Chang’s培养基、MesemCult-XF培养基(STEMCELLTechnologies,Vancouver,Canada)、RPMI 1640、Ham’s F12、DMEM/F12、Ham's F-12KMedium,HepatoZYME-SFM、William’s EMedium、Waymouth’s Medium或Hepatocyte CultureMedium;优选地,所述干性维持培养基包括Essential 8TMMedium;优选地,所述干性维持培养基是Essential 8TMMedium。
在一种实施方式中,所述干性维持培养基可以是商品化的培养基或自行配制的培养基。
优选地,所述对多能干细胞进行干性维持培养在微分化处理之前进行;优选地,所述对多能干细胞进行干性维持培养在对多能干细胞进行微分化处理之前持续0-60小时;优选地,0-48小时,0-36小时,0-24小时,12-24小时,24小时。
优选地,所述干性维持培养还包括检测细胞含量;优选地,所述检测细胞步骤在微分化处理前0-5小时进行;优选地,0-2小时。
在一种实施方式中,所述微分化处理后的诱导分化处理包括使用第一分化培养基和/或第二分化培养基培养微分化处理后的细胞,所述第一分化培养基可以在第二分化培养基之前或之后培养微分化处理后的细胞;
优选地,所述第一分化培养基培养微分化处理后的细胞持续0-96小时;优选的,0-48小时;优选地,48小时。
优选地,所述第二分化培养基培养细胞持续0-96小时;优选的,0-48小时;优选地,48小时。
优选地,所述第一分化培养基和第二分化培养基可以包含促进心肌细胞分化的物质、抑制Wnt信号通路的物质和抑制mTOR信号通路的物质中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述具有促进心肌细胞分化的物质包括BMP4、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、激活素A(Activin A)、Noggin、Dorsomorphin、6-溴靛玉红-3'-肟(6-bromoindirubin-3'-oxime,IO)中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述具有抑制Wnt信号通路的物质包括Wnt-C59,dickkopf同源物1(dickkopf homolog 1,KKl)、IWP、IWR(inhibitors of Wntresponse)中的一种或多种。
在一种实施方式中,所述具有抑制mTOR信号通路的物质包括雷帕霉素(Rapamycin)、依维莫司(RAD001)、KU-0063794、AZD8055、Temsirolimus、INK128、Ridaforolimus。
优选地,所述第一分化培养基的成分中包括DMEM/F12,1×B27(minus vitaminA)supplement,L-glutamine,1-thioglycerol,L-AA,BMP4,CHIR99021中的至少一种,所述第一分化培养基的成分中包括DMEM/F12,1×B27(minus vitaminA)supplement,1%L-glutamine,400μM1-thioglycerol,50μg/ml L-AA,25ng/mL BMP4,3μM CHIR99021,所述第一分化培养基的成分是DMEM/F12,1×B27(minus vitaminA)supplement,1%L-glutamine,400μM 1-thioglycerol,50μg/ml L-AA,25ng/mL BMP4,3μM CHIR99021。
优选地,所述第二分化培养基的成分包括RPMI 1640,1×B27(minus insulin)supplement,L-glutamine,BMP4,Wnt-C59中的一种或多种;优选地,所述第二分化培养基的成分包括RPMI 1640,1×B27(minus insulin)supplement,1%L-glutamine,10ng/mlBMP4,2μM Wnt-C59;优选地,所述第二分化培养基的成分是RPMI 1640,1×B27(minusinsulin)supplement,1%L-glutamine,10ng/ml BMP4,2μM Wnt-C59。
在一种实施方式中,所述第一分化培养基和第二分化培养基可以是购买的商品化培养基或者自行配制的培养基。
在一种实施方式中,所述诱导分化处理后的扩增培养是使用扩增培养基培养细胞。
在一种实施方式中,所述扩增培养基是适用于终端细胞扩增的培养基;优选地,所述扩增培养基是适用于心肌细胞扩增的培养基。
优选地,所述扩增培养基的成分包括RPMI 1640,1×B27 supplement,L-glutamine;优选地,所述扩增培养基的成分是包括RPMI 1640,1×B27 supplement,1%L-glutamine。
在一种实施方式中,所述扩增培养基可以是购买的商品化培养基或者自行配制。
细胞
另一方面,本发明提供了一种经过微分化处理的细胞。
在一种实施方式中,所述细胞是心肌细胞。
另一方面,本发明提供了由经过微分化处理的细胞组成的组合物和药剂。
在一种实施方式中,所述组合物还可以包括其他细胞培养相关的培养基、生长因子或添加剂。
在一种实施方式中,所述药剂还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂和药学活性剂中的一种或多种。
另一方面,本发明提供了前述细胞、药剂和组合物在制备细胞移植治疗所用药物中的应用;优选地,所述药物可以治疗心脏疾病。
培养基
另一方面,本发明提供了一种提高多能干细胞分化效能的培养基,所述培养基包括E6培养基和/或添加DMSO的微分化处理培养基;优选地,所述培养基是E6培养基和/或添加DMSO的微分化处理培养基。
培养基组合
另一方面,本发明提供了一种提高多能干细胞分化效能的培养基组合,所述培养基组合包含前述E6培养基和/或添加DMSO的微分化处理培养基;优选地,所述培养基组合还包括前述干性维持培养基、第一分化培养基、第二分化培养基和扩增培养基中的一种或多种。
细胞培养***
另一方面,本发明还提供了一种提高多能干细胞分化效能的细胞培养***,所述细胞培养***使用微分化处理所需的试剂,所述细胞培养***包括对细胞进行微分化处理的单元;优选地,所述细胞培养***还包括干性维持培养单元和/或诱导分化单元;优选地,所述***还可以包括监测细胞状态的单元和/或对细胞进行分离清洗的单元。
在一种实施方式中,所述细胞培养***包括对细胞进行微分化处理的单元;优选地,所述细胞培养***还包括干性维持培养单元、诱导分化单元和扩增培养单元中的一种或多种;优选地,所述***还可以包括监测细胞状态的单元和/或对细胞进行分离清洗的单元。
试剂盒
另一方面,本发明还提供了一种提高多能干细胞分化效能的试剂盒,所述试剂盒包括微分化处理所需的试剂;优选地,微分化处理所需的试剂包括E6培养基和/或添加DMSO的微分化处理培养基;更优选地,微分化处理所需的试剂是E6培养基和/或添加DMSO的微分化处理培养基。
在一种实施方式中,所述试剂盒还包括对细胞进行微分化处理所需要的仪器和/或装置。
应用
另一方面,本发明还提供了DMSO、E6培养基或添加了DMSO的微分化处理培养基在制备提高多能干细胞分化效能的培养基、培养基组合、细胞培养***或试剂盒中的应用。
另一方面,本发明还提供了上述DMSO、微分化处理培养基、E6培养基、培养基、培养基组合、细胞培养***或试剂盒在提高多能干细胞分化效能中的应用。
另一方面,本发明还提供了提高多能干细胞分化效能的培养基、提高多能干细胞分化效能的培养基组合、提高多能干细胞分化效能的细胞培养***或提高多能干细胞分化效能的试剂盒在制备细胞中的应用。
另一方面,本发明还提供了上述细胞、培养基、培养基组合、细胞培养***或试剂盒,在制备用于细胞移植治疗的细胞、药剂或组合物中的应用;优选地,在制备用于细胞移植治疗心脏疾病的细胞、药剂或组合物中的应用。
另一方面,本发明还提供了DMSO、添加了DMSO的微分化处理培养基或E6培养基、前述培养基组合、前述细胞培养***或前述试剂盒在制备经过微分化处理的细胞中的应用;
优选地,所述细胞是用于细胞移植治疗疾病的细胞;更优选的,所述细胞是用于细胞移植治疗心脏疾病的细胞;更优选地,所述细胞是用于细胞移植治疗心脏疾病的心肌细胞。
另一方面,本发明还提供了一种经过微分化处理的细胞在细胞移植治疗疾病中的应用;优选地,所述的细胞在细胞移植治疗心脏疾病中的应用。
一般定义:
除非另有定义,否则本文所用的技术和科学术语具有与所属领域的普通技术人员之一通常理解的相同的含义。
培养基
本发明的培养基包括但不限于Essential 8TMMedium、达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM,Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)、最小必需培养基(MEM,MinimalEssential Medium)、伊格尔基本培养基(BME,Basal Medium Eagle)、F-10,F-12、α-最小必需培养基(α-MEM,α-Minimal Essential Medium)、G-最小必需培养基(G-MEM,Glasgow’sMinimal Essential Medium)、IMPM(IMDM,Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)、AmnioMax、新型二代羊水培养基(Amino MaxⅡcomplete Medium,Gibco,Newyork,USA)、Chang’s培养基、MesemCult-XF培养基(STEMCELL Technologies,Vancouver,Canada)、RPMI1640、Ham’s F12、DMEM/F12、Ham's F-12K Medium,HepatoZYME-SFM、William’s EMedium、Waymouth’s Medium或Hepatocyte Culture Medium。
本发明的培养基还可包含细胞生长所需细胞因子、生长因子和小分子化合物,所述小分子化合物选自TGF-β信号通路、表观修饰剂、钙离子通道激动剂和代谢通路调节剂等功能群,所述细胞因子和蛋白多肽包括成纤维细胞生长因子1、成纤维细胞生长因子2、表皮生长因子、血小板衍生生长因子、胰岛素、***1、血管内皮细胞生长因子、胎盘生长因子、白血病抑制因子、干细胞因子、转铁蛋白和人血清白蛋白。
本发明的培养基还可包含营养混合物(Nutrient Mixture),所述营养混合物为包含通常用于细胞培养的各种氨基酸、维生素、无机盐等的混合物,混合上述氨基酸、维生素、无机盐等可以制备获得营养混合物;或者可使用商业性制备的营养混合物。
所述维生素包括生物素、氯化胆碱、D-泛酸钙、叶酸、肌醇、烟酰胺、吡哆醇盐酸盐、核黄素、盐酸石克氨、辅酶Q10、维生素B12、腐胺二盐酸盐、维生素C和维生素E;
所述盐类包括碳酸氢钠、氯化钙、氯化钾、氯化镁、硫酸镁、氯化钠、一水磷酸二氢钠、磷酸氢二钠和丙酮酸钠;
商业性制备的营养混合物包括M199、MCDB110、MCDB202、MCDB302中的一种或多种。
多能干细胞
多能干细胞(pluripotent stem cell,psc)是具有分化出多种细胞组织的潜能,但失去了发育成完整个体的能力,发育潜能受到一定的限制的细胞。这种干细胞具有分化出多种细胞组织的潜能,但失去了发育完整个体的能力。例如:胚胎干细胞、诱导多能干细胞、造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞等。
在本发明中多能干细胞还包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞在体外一定的培养条件下形成的拟胚体。
在本发明中多能干细胞还包括胚胎干细胞或诱导多能干细胞在体外一定的培养条件下形成的外胚层祖细胞、中胚层祖细胞和内胚层祖细胞。
ESC(embryonic stem cell,ES cells)胚胎干细胞
当胚胎发育到囊胚时,其干细胞具有分化为各种细胞类型的能力,是多能干细胞。胚胎干细胞在解除分化抑制的条件下能参与包括生殖腺在内的各种组织的发育潜力,但无法独自发育成一个个体。它可以发育成为外胚层、中胚层及内胚层三种胚层的细胞组织。
iPSC(induced pluripotent stem cells,iPS,iPSCs)诱导多能干细胞
诱导多能干细胞是由体细胞经转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入重编程而来的,并且具有与胚胎干细胞相似分化能力的细胞,成为研究人类疾病发病机制、组织细胞替代治疗的重要细胞来源,并且不存在伦理问题,医疗领域的应用前景非常广阔。以iPSCs作为来源细胞,可以将其在体外扩增并诱导分化为特定的组织细胞,应用iPSCs已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织。
分化
分化是非特化的(“未定型的”)或较少特化的细胞获得特化细胞(例如心肌细胞)特征的过程。已分化的或分化诱导的细胞是在细胞谱系中具有更加特化的(“定型的”)位置的细胞。
维持
维持通常指的是在易于细胞生长和/或***的条件下放入生长培养基中的细胞,其可能或可能不产生更大群的细胞。
传代
传代指的是把细胞从一个培养容器移去,并在易于细胞生长和/或***的条件下把它们置于第二个培养容器的过程。
细胞移植治疗
细胞移植治疗是把健康的细胞移植到患者体内,以达到修复或替换受损细胞或组织,从而达到治愈的目的。
前体细胞
一类只能向特定终端分化的,较祖细胞更有限的增殖能力的成体细胞。心肌前体细胞即为具有心肌特异性分化能力且具有自我增殖能力的细胞
附图说明
图1是使用E6培养基进行微分化处理的细胞在第6-15天显微镜下观察到的心肌分化形态图。
图2是使用E6培养基进行微分化处理的细胞进行免疫荧光检测的结果图。
图3是使用DMSO进行微分化处理的细胞在第6-15天显微镜下观察到的心肌分化形态图。
图4是使用DMSO进行微分化处理的细胞进行免疫荧光检测的结果图。
图5是通过qPCR方法检测,不同处理方式下,细胞中心肌前体细胞标志性基因MESP2,NKX2.5以及PDGFRA表达量的结果图。
图6是通过qPCR方法检测,不同处理方式下,细胞中心肌细胞标志性基因TNNT以及β-MHC表达量的结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明,以下所述,仅是对本发明的较佳实施例而已,并非对本发明做其他形式的限制,任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容,依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化,均落在本发明的保护范围内。
实施例1、心肌细胞的诱导分化
本实施例中使用到的试剂详细信息如下:
1、前期准备-干性维持培养
第-2天:铺种iPSC到matrigel包被的12孔培养板,密度为5w/cm2,放入培养箱前,上下左右各5下摇匀,使细胞均匀铺种,使用Essential 8TMMedium培养基(赛默飞世尔,A1517001),加10μM Y-27632 2HCl。
2、微分化处理
第-1天:
对照组:继续使用Essential 8TMMedium培养;
E6实验组:将Essential 8TMMedium培养基换为Essential 6TMMedium(购买于赛默飞世尔,货号A1516401)培养基,培养24小时;
DMSO实验组:将Essential 8TMMedium培养基换为含有2%二甲基亚砜(DMSO,购买于西格玛,货号D2650)的Essential 8TMMedium,培养24小时。
3、分化实验-诱导分化
第0-2天:更换为中胚层分化培养基(第一分化培养基),主要成分包括:DMEM/F12,1×B27(minus vitaminA)supplement,1%L-glutamine,400μM 1-thioglycerol,50μg/mlL-AA,25ng/mL BMP4,3μM CHIR99021;
第3-5天,更换为心肌细胞分化培养基(第二分化培养基),主要成分包括:RPMI1640,1×B27(minus insulin)supplement,1%L-glutamine,10ng/ml BMP4,2μM Wnt-C59。
4、扩增培养
第6-14天,更换为心肌细胞扩增培养基,主要成分包括:RPMI 1640,1×B27supplement,1%L-glutamine。
5、检测
E6实验组的细胞:
显微镜下观察:在分化实验的过程中,在第6-15天观察,记录第6、8、10、12、14、15天时分化的细胞形态,细胞形态如图1所示:心肌分化过程中,在第6-8天开始形成细胞网状结构,并在第8天细胞开始跳动,第10天形成非常明显的心肌纤维网,说明通过上述方法可以分化得到心肌细胞。
荧光检测:cTNT是心肌细胞的标记性基因,通过对第15天成熟的心肌进行免疫荧光检测,证明cTNT在iPSC来源的心肌细胞中表达,说明通过上述方法可以分化得到心肌细胞,结果如图2所示,如图浅灰色为散发荧光的部位。
DMSO实验组:
显微镜下观察:在分化实验的过程中,在第6-15天观察细胞,记录第6、8、10、12、14、15天时分化的细胞形态,细胞形态如图3所示:心肌分化过程中,在第6-8天开始形成细胞网状结构,并在第8天细胞开始跳动,第10天形成非常明显的心肌纤维网,说明通过上述方法可以分化得到心肌细胞。
荧光检测:cTNT是心肌细胞的标记性基因,通过对第15天成熟的心肌进行免疫荧光检测,证明cTNT在iPSC来源的心肌细胞中表达,说明通过上述方法可以分化得到心肌细胞,结果如图4所示,如图浅灰色为散发荧光的部位。
qPCR检测心肌前体细胞标志基因:在心肌分化过程中的第三天,通过qPCR方法,对心肌前体细胞标志性基因MESP2,NKX2.5以及PDGFRA进行检测,发现相较于iPSC细胞和未经过微分化处理的细胞,经过E6培养基培养或DMSO处理的细胞中心肌前体细胞标志基因的表达显著提高,说明微分化处理能够提高iPSC分化效能,qPCR检测结果如图5所示。
qPCR检测心肌细胞标志性基因:在心肌分化过程中的第15天,通过qPCR方法,对心肌细胞标志性基因TNNT以及β-MHC进行检测,发现相较于iPSC细胞和未经过微分化处理的细胞,经过E6培养基培养或DMSO处理的细胞中TNNT以及β-MHC等心肌细胞标志基因表达显著提高,说明微分化处理能够提高iPSC分化效能,qPCR检测结果如图6所示。
以上检测结果表明微分化处理可以有效提高多能干细胞的分化效能,尤其是iPSC分化为心肌前体细胞和心肌细胞的效能。
Claims (10)
1.一种提高多能干细胞分化效能的方法,其特征在于,所述方法包括对多能干细胞进行微分化处理;优选地,所述微分化处理包括使用E6培养基培养多能干细胞和/或DMSO处理多能干细胞;优选地,微分化处理是使用E6培养基培养多能干细胞和/或DMSO处理多能干细胞;
优选地,所述E6培养基的成分包括DMEM/F12,碳酸氢钠,L-抗坏血酸,胰岛素,胰岛素转铁蛋白和***钠中的一种或多种;优选地,所述E6培养基的成分是DMEM/F12,碳酸氢钠,L-抗坏血酸,胰岛素,胰岛素转铁蛋白和***钠;优选地,所述E6培养基是向DMEM/F12培养基中添加15–22mM的碳酸氢钠,60-220μM的L-抗坏血酸,20μg/ml胰岛素,10μg/ml胰岛素转铁蛋白和20ng/ml***钠配置而成;
优选地,所述E6培养基还可以是Essential 6TMMedium;优选地,所述E6培养基是商品化的培养基;更优选地,是赛默飞世尔的货号为A1516401的培养基;
优选地,所述E6培养基还可以添加干性维持因子或小分子化合物;优选地,所述E6培养基还可以添加TGFβ和/或bFGF;优选地,所述TGFβ的工作浓度是1-10ng/ml,所述bFGF的工作浓度是50-100ng/ml;
优选地,所述DMSO处理多能干细胞包括将DMSO添加到微分化处理培养基中对细胞进行培养;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是将DMSO添加到微分化处理培养基中对细胞进行培养;
优选地,所述微分化处理培养基包括Essential 8TMMedium、达尔伯克改良伊格尔培养基、最小必需培养基、伊格尔基本培养基、RPMI 1640、F-10、F-12、α-最小必需培养基、G-最小必需培养基、IMPM、AmnioMax、新型二代羊水培养基、Chang’s培养基、MesemCult-XF培养基、Ham’s F12、DM EM/F12、Ham’s F-12K Medium、HepatoZYME-SFM、William’s E Mediu m、Waymouth’s Medium和Hepatocyte Culture Medium中的任意一种或多种的组合;优选地,微分化处理培养基是Essential 8TMMedium培养基;
优选地,所述DMSO的工作浓度是1%-2%;优选地,所述DMSO的工作浓度是1.5%-2%;更优选地,所述DMSO的工作浓度是2%;
优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞0-72小时;优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞0-48小时;优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞0-24小时;优选地,所述E6培养基培养多能干细胞是指使用E6培养基培养多能干细胞24小时;
优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞0-72小时;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞0-48小时;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞0-24小时;优选地,所述DMSO处理多能干细胞是指使用DMSO处理多能干细胞24小时。
2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述多能干细胞包括ESC、iPSC、拟胚体、细胞造血干细胞、神经干细胞、间充质干细胞、皮肤干细胞、脂肪干细胞、脐血干细胞中的一种或多种;优选地,所述多能干细胞包括ESC和/或iPSC;优选地,所述多能干细胞包括iPSC;更优选地,所述多能干细胞是iPSC;
优选地,所述iPSC可以是商品化的细胞系,也可以是由供体细胞诱导而来;
优选地,所述多能干细胞可以是人源多能干细胞或非人源多能干细胞。
3.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述提高分化效能是指提高多能干细胞分化为终端细胞的能力;优选地,所述提高分化效能是指多能干细胞分化出更多的终端细胞;所述终端细胞包括心肌细胞,祖细胞,类器官,神经干细胞,多巴胺能神经元细胞,少突胶质细胞,少突胶质前体细胞,多巴胺能神经元,肝细胞,肾相关细胞,胰岛小体细胞,内皮祖细胞,色素上皮细胞,视锥细胞,皮肤细胞,血液相关细胞和间充质肝细胞中的一种或多种;优选地,所述终端细胞是心肌细胞;
优选地,所述提高分化效能可以通过细胞检测体现,所述细胞检测可以是定量检测和/或定性检测;
优选地,所述细胞检测可以是细胞活性检测、基于免疫的检测、流式细胞仪检测、比色检测、基于金纳米颗粒的检测、荧光检测、紫外检测、目标终端细胞的前体细胞标志物和目标终端细胞标志物的检测中的一种或多种;优选地,所述细胞检测是荧光检测、目标终端细胞的前体细胞标志物和目标终端细胞标志物的检测中的一种或多种;
优选地,所述前体细胞标志物是MESP2,NKX2.5和PDGFRA中的一种或多种;
优选地,所述目标终端细胞标志物是心肌细胞标志物;优选地,所述目标终端细胞标志物是心肌细胞标志物TNNT和/或β-MHC。
4.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,所述方法还可以包括微分化处理前的干性维持培养、微分化处理后的诱导分化处理和诱导分化处理后的扩增培养中的一种或多种;
优选地,所述微分化处理前的干性维持培养使用的培养基是干性维持培养基;优选地,所述干性维持培养基是Essential 8TMMedium;
优选地,所述微分化处理后的诱导分化处理使用的培养基是第一分化培养基和/或第二分化培养基;优选地,所述第一分化培养基的成分是DMEM/F12,1×B27(minus vitaminA)supplement,1%L-glutamine,400μM 1-thioglycerol,50ug/ml L-AA,25ng/mL BMP4,3μMCHIR99021;优选地,所述第二分化培养基的成分是RPMI 1640,1×B27(minus insulin)supplement,1%L-glutamine,10ng/ml BMP4,2μM Wnt-C59;
优选地,所述诱导分化处理后的扩增培养使用的培养基是扩增培养基;优选地,所述扩增培养基的成分是RPMI 1640,1×B27 supplement,1%L-glutamine;
优选地,所述微分化处理前的干性维持培养基、第一分化培养基、第二分化培养基和扩增培养基可以是购买的商品化培养基或者自行配制的。
5.一种细胞或其构成的组合物或药剂,其特征在于,所述细胞经过了微分化处理;优选地,所述细胞是心肌细胞;优选地,所述细胞是经过权利要求1-4任一方法制得的细胞;
优选地,所述组合物还可以包括其他细胞培养相关的培养基、生长因子或添加剂;
优选地,所述药剂还可以包括药学上可接受的载体、赋形剂和药学活性剂中的一种或多种。
6.一种提高多能干细胞分化效能的培养基,所述培养基包括E6培养基和/或权利要求1-4任一方法中使用的添加DMSO的微分化处理培养基;优选地,所述培养基是E6培养基和/或权利要求1-4任一方法中使用的添加DMSO的微分化处理培养基。
7.一种提高多能干细胞分化效能的培养基组合,所述培养基组合包含E6培养基和/或权利要求1-4任一方法中使用的添加DMSO的微分化处理培养基;优选地,所述培养基组合还包括权利要求1-4任一方法中使用的干性维持培养基、权利要求1-4任一方法中使用的第一分化培养基、权利要求1-4任一方法中使用的第二分化培养基和权利要求1-4任一方法中使用的扩增培养基中的一种或多种。
8.一种提高多能干细胞分化效能的细胞培养***,所述细胞培养***包括对细胞进行微分化处理的单元;优选地,所述微分化处理的单元是指对细胞进行权利要求1-4任一方法中的微分化处理;
优选地,所述细胞培养***还包括干性维持培养单元、诱导分化单元和扩增培养单元中的一种或多种;优选地,所述干性维持培养单元是指对细胞进行权利要求1-4任一方法中的干性维持培养,所述诱导分化单元是指对细胞进行权利要求1-4任一方法中的诱导分化处理,所述干扩增培养单元是指对细胞进行权利要求1-4任一方法中的扩增培养;
优选地,所述***还可以包括监测细胞状态的单元和/或对细胞进行分离清洗的单元。
9.一种提高多能干细胞分化效能的试剂盒,所述试剂盒包括微分化处理所需的试剂;优选地,所述微分化处理是指权利要求1-4任一方法中的微分化处理;优选地,所述试剂盒还包括对细胞进行微分化处理所需要的仪器和/或装置。
10.一种应用,其特征在于,所述应用包括以下任一一种:
1)DMSO、权利要求1-4任一方法中使用的添加DMSO的微分化处理培养基或权利要求1-4任一方法中使用的E6培养基在制备提高多能干细胞分化效能的培养基、提高多能干细胞分化效能的培养基组合、提高多能干细胞分化效能的细胞培养***或提高多能干细胞分化效能的试剂盒的应用;
优选地,所述提高多能干细胞分化效能的培养基包括权利要求6所述的培养基;优选地,所述提高多能干细胞分化效能的培养基是权利要求6所述的培养基;
优选地,所述提高多能干细胞分化效能的培养基组合包括权利要求7所述的培养基组合;优选地,所述提高多能干细胞分化效能的培养基组合是权利要求7所述的培养基组合;
优选地,所述提高多能干细胞分化效能的试剂盒包括权利要求8所述的试剂盒;优选地,所述提高多能干细胞分化效能的试剂盒是权利要求8所述的试剂盒;
优选地,所述提高多能干细胞分化效能的细胞培养***包括权利要求9所述的细胞培养***;优选地,所述提高多能干细胞分化效能的细胞培养***是权利要求9所述的细胞培养***;
2)DMSO、权利要求1-4任一方法中使用的添加DMSO的微分化处理培养基或权利要求1-4任一方法中使用的E6培养基、权利要求6所述的培养基、权利要求7所述的培养基组合、权利要求8所述的细胞培养***或权利要求9所述的试剂盒在提高多能干细胞分化效能中的应用;
3)DMSO、权利要求1-4任一方法中使用的添加DMSO的微分化处理培养基或权利要求1-4任一方法中使用的E6培养基、权利要求6所述的培养基、权利要求7所述的培养基组合、权利要求8所述的细胞培养***或权利要求9所述的试剂盒在制备经过微分化处理的细胞中的应用;
优选地,所述细胞是经过权利要求1-4任一方法中微分化处理的细胞;
优选地,所述细胞是权利要求5中所述的细胞;
优选地,所述细胞是用于细胞移植治疗疾病的细胞;优选的,所述细胞是用于细胞移植治疗心脏疾病的细胞;优选地,所述细胞是心肌细胞;
4)权利要求5所述的细胞、组合物或药剂在制备细胞移植治疗药物中的应用;优选地,所述细胞移植治疗的是心脏疾病;
5)权利要求5所述的细胞在制备权利要求5所述的组合物和药剂中的应用。
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