JP2016026490A - 多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】多能性幹細胞、例えば人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）から肝細胞を短期間で分化誘導する方法、並びに該方法に使用する物質の提供。
【解決手段】ｉＰＳ細胞から肝芽細胞を分化誘導するための新規分化誘導培養培地（ＨＤＩ）を開発。該培地は従来の肝細胞選択培地（ＨＳＭ）に対してオンコスタチンM、ＦＰＨ１、Ｍ５００５４、ＮＥＡＡ、ピルビン酸ナトリウム、ニコチンアミド、及びL-グルタミンが添加されているＨＤＩを用いてｉＰＳ細胞から肝芽細胞を分化誘導する方法。
【選択図】なし

Description

本発明は、多能性幹細胞から肝芽細胞（hepatoblast）を分化誘導する培養培地および方法に関する。より詳しくは本発明は、人工多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法に関する。
多能性幹細胞は、自分自身を複製する自己複製能と多分化能を共に有する細胞である。近年、多能性幹細胞から分化させた細胞を使用する移植療法が、機能不全や機能障害を起こした細胞、組織、器官の再生や機能の回復を目的とした再生医療において注目されている。また、多能性幹細胞から分化させた細胞を、薬剤の毒性試験などに応用することが期待されている。このように、多能性幹細胞から目的とする細胞を分化誘導し、増幅することは、医薬分野において大きな課題である。
多能性幹細胞は、人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：以下、iPS細胞と略称することがある）および胚性幹細胞（embryonic stem cells：以下、ES細胞と略称することがある）が知られている。これら細胞は、目的とする細胞を分化誘導させて使用する移植療法などによる再生医学や、薬剤の毒性試験などへの応用が期待されている。
例えば、ヒトiPS細胞やヒトES細胞から肝細胞を分化誘導することができれば肝不全症例に対する移植療法への発展が期待される。肝臓は、主に肝実質細胞である肝細胞と、胆管上皮細胞などの肝非実質細胞などにより構成される。肝臓は、胆汁の分泌、吸収栄養分の濾過と解毒、薬物代謝、糖分の貯蔵と血糖の調節を行う他に、フィブリノーゲン、ヘパリンおよび貧血阻止物質などの生成器官であり生命必須のものである。そのため、機能する肝細胞が極度に減少する肝不全は致命的な病態であり、肝不全の症例では極度の凝固因子の不足による出血傾向、肝性昏睡などの大変重篤な状態となる。肝細胞の移植はこのような病態の根本的な治療法になり得る。
本発明者は、ES細胞から肝細胞を分化誘導し、かつ分化した肝細胞を含む細胞群から実質的に肝細胞からなる細胞培養物を得る方法を提供している（特許文献1および2）。具体的には、肝細胞は解糖系や尿素サイクルなどに関連する一連の酵素群を有するため、それらの産物のブドウ糖およびアルギニンを除き、基質のガラクトースおよびオルニチンを添加した培地で生存することに着目し、かかる培地で培養することにより、ES細胞から分化した細胞のうち、肝細胞以外の別の細胞へ分化した細胞を死滅させて、実質的に肝細胞からなる細胞培養物を得る方法を提供している。
しかし、ヒトES細胞のヒトへの適用に関しては、当該ES細胞が他人由来の胚性幹細胞であることに由来する免疫拒絶や倫理的な問題が存在する。
一方、iPS細胞は、ヒト線維芽細胞などの体細胞から遺伝子組換え技術により誘導される多能性幹細胞であり、自己の細胞から作製可能であるため、免疫拒絶などの問題が少なく、再生医学への応用が期待されている（非特許文献1）。
ヒトiPS細胞から肝細胞を分化誘導する技術は、肝細胞への分化を促進する増殖因子および／または転写因子をそれぞれヒトiPS細胞の培養に添加し、導入する方法などが報告されている（非特許文献2−4）。
また、ヒトiPS細胞から肝臓を形成する方法が報告されている（非特許文献5）。この方法は、まずインビトロ（in vitro）でiPS細胞から肝細胞への分化を促進し、次いで血管内皮細胞および間葉系幹細胞と混合してマウスの脳に移植することにより肝臓を作成するものである。ヒトに応用するときには異種タンパクへの曝露のないことが条件となる。また、肝細胞への分化を促進したiPS細胞は、マウスの脳に移植しないでインビトロで維持すると死滅してしまう。さらに、かかる方法によるインビトロでの肝細胞への分化誘導には数週間を要し、しかも成熟した肝細胞は得られない（非特許文献6）。したがってヒトに応用するためには、異種タンパクに曝露しないiPS細胞から肝細胞を短期間に製造する方法の開発が必須である。
このように、iPS細胞は再生医学への応用が期待されているが、iPS細胞から目的の細胞をインビトロで分化誘導する場合、得られる細胞群には目的の細胞の他に未分化のiPS細胞が含まれるため、移植すると残存する未分化iPS細胞が腫瘍を形成する可能性がある（非特許文献7）。したがって、iPS細胞から分化誘導された細胞を移植などの再生医療に利用するためには、分化誘導された細胞と未分化iPS細胞とを含む細胞群から、分化誘導された細胞を分離する必要がある。
本発明者は、ヒトiPS細胞とヒト初代培養肝細胞との共培養より、ヒトiPS細胞を死滅させヒト初代培養肝細胞のみを回収する方法、および該方法で使用する肝細胞選択培地（hepatocyte selection medium, HSM）を開発して報告している（非特許文献8および特許文献3）。この培地は、細胞の生存に必須のブドウ糖およびアルギニンを除き、ガラクトースおよびオルニチンを添加して作成する。肝細胞は糖新生や尿素サイクルに関する一連の酵素群を有するのでブドウ糖およびアルギニンを合成することができ、そのためHSMで培養しても生存することができる。しかし、ヒトiPS細胞は糖新生や尿素サイクルを有さないので、HSMで培養すると3日で死滅する。そのため、ヒトiPS細胞から肝細胞を製造する方法が確立された場合、製造された細胞群をHSMで3日間培養することにより、残存する未分化なヒトiPS細胞を細胞群から除去することができ、実質的に肝細胞からなる細胞培養物を得ることができる。HSMでは通常の培地に含有される成分のみで構成されるので、得られた肝細胞に障害が生じる可能性は極めて低い。
特許第4759723号公報 特開2005-253374号公報 特願2012-286978号 特開2012-143229号公報
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本発明の課題は、ヒトiPS細胞から肝細胞を短期間で分化誘導する方法や該方法に使用する物質を提供することにある。
本発明者は上記課題を解決すべく鋭意検討した結果、iPS細胞を2日間培養することにより、肝芽細胞を分化誘導することのできる培養培地を見出した。また、該培養培地を使用して、iPS細胞から分化誘導した肝芽細胞と未分化のiPS細胞とを含む細胞群を培養することにより、該細胞群から実質的に肝芽細胞からなる細胞培養物を分別して得ることを見出した。本発明はかかる知見を基に完成されたものである。
すなわち、本発明は、多能性幹細胞から肝芽細胞を得る方法であって、多能性幹細胞を下記表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程を含む方法に関する。
本発明はまた、多能性幹細胞を上記表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程の前に、下記培養培地
（1）リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）、
（2）ウィリアムE培地（William's E medium）、および
（3）ダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）
から選択されるいずれか1の培養培地で多能性幹細胞を培養する工程を含む、多能性幹細胞から肝芽細胞を得る上記方法に関する。
本発明はさらに、多能性幹細胞がiPS細胞である上記方法に関する。
本発明はさらにまた、表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程が、該培養培地で少なくとも2日間培養する工程である上記いずれかの方法に関する
本発明はまた、表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程が、該培養培地で2日間培養する工程である上記いずれかの方法に関する。
本発明はさらに、iPS細胞から肝芽細胞を得る方法であって、iPS細胞を上記表1に記載の組成からなる培養培地で2日間培養する工程を含む方法に関する。
本発明はさらにまた、iPS細胞から肝芽細胞を得る方法であって、
（A）下記培養培地
（1）リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）、
（2）ウィリアムE培地（William's E medium）、および
（3）ダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）
から選択されるいずれか1の培養培地でiPS細胞を7日間培養する工程、および
該工程の後に
（B）該工程で得られた細胞を上記表1に記載の組成からなる培養培地で2日間培養する工程、を含む方法に関する。
本発明はまた、上記表1に記載の組成からなる、多能性幹細胞からの肝芽細胞の分化誘導用培養培地に関する。
本発明はさらに、上記いずれかの方法で製造された細胞培養物に関する。
本発明は、多能性幹細胞、例えばiPS細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法を提供するものである。本発明に係る培養培地は、2日間の培養により、iPS細胞から肝芽細胞を分化誘導することができる。
得られた培養細胞は、肝芽細胞のマーカーであるα-フェトプロテイン（α-feto protein；以下、AFPと略称することがある）およびデルタ様1ホモログ（Delta like-1 homolog；以下、DLK-1と略称することがある）の発現亢進が認められ、また、薬物代謝に関連する酵素であるチトクロムP-450ニフェジピンオキシダーゼ（cytochrome P-450 nifedipine oxidase；CYP3A4と略称することがある）およびアルコール代謝に関連する酵素であるアルデヒドデヒドロゲナーゼ2（aldehyde dehydrogenase 2；ALDH2と略称することがある）が、胎児肝に匹敵するレベルに増加していた。したがって肝細胞の有する薬物代謝機能やアルコール代謝機能に関するin vitroでの試験、および薬剤の毒性試験などに、このような培養で得られた肝芽細胞を使用することが可能と期待される。
一方、かかる培養細胞におけるNanogの発現は胎児肝と同程度に減少していたので、未分化能は失われていると考えられる。したがって、かかる培養で得られた肝芽細胞は、肝疾患治療のために移植した場合に腫瘍を形成する可能性は極めて低いと考えられ、ゆえに有用性が高い。
このように、本発明により、iPS細胞から分化誘導させた肝芽細胞を含む細胞培養物を提供することができる。
ヒトiPS細胞株（201B7）をHSMで2日培養して得られた細胞培養物では、胎生期の肝細胞のマーカーであるAFPの発現が亢進していたことを示す図である。図の縦軸は相対的発現レベル（Relative expression level）を示す。図中、FFはコントロール培地であるReproFFを意味する。（実施例1）
ヒトiPS細胞株（201B7）の培養中のアポトーシスを阻害する物質を探索した結果、アポトーシス阻害剤であるM50054が、ヒトiPS細胞株のアポトーシスの抑制に効果を示したことを示す図である。パネルAは、M50054が、CTP阻害剤やDAPK阻害剤よりも、ヒトiPS細胞株のアポトーシスの抑制に効果を示したことを説明する。CTP阻害剤（CTP inhibitor）はミトコンドリアクエン酸輸送タンパク質（Mitochondrial Citrate Transport Protein）の阻害剤であり、DAPK阻害剤（DAPK inhibitor）は細胞死関連タンパク質キナーゼ（death-associated protein kinase）の阻害剤である。原倍率は100倍であり、スケールバーは50μmである。パネルBは、M50054が100μg/mlの濃度で最も高いアポトーシス阻害効果を示したことを説明する。生細胞はMTSアッセイで測定した。縦軸は、M50054を添加した培養における生細胞の、非添加培養における生細胞に対する割合（％）を示す。「*」は、一元配置分散分析（One-way analysis of variance；JMP10.0.2；SAS Institute）による統計解析で有意差（P<0.05）が認められたことを示す。（実施例1） マウスES細胞の生存に効果のある非必須アミノ酸（non-essential amino acid；NEAAと略称することがある）およびピルビン酸ナトリウムが、ヒトiPS細胞株（201B7）をHSMで培養して得られる培養細胞の生存に効果を示したことを示す図である。パネルAは、HSMにNEAAおよびピルビン酸ナトリウムを添加した培地で培養した結果を示す。パネルBは、HSMにM50054を添加した培地で培養した結果を示す。縦軸は、AFPの相対的発現レベル（Relative expression level）を示す。図中、FFはコントロール培地であるReproFFを意味する。（実施例1） ヒトiPS細胞株（201B7）から肝細胞への分化を促進する増殖因子を探索した結果を示す図である。パネルAは、各種の増殖因子を添加した培地でiPS細胞を1週間培養した後の培養細胞におけるAFPの相対的発現レベル（Relative expression level）を示す。図中、FFはコントロール培地であるReproFF、(-)は増殖因子非添加、ActはアクチビンA、FGFは塩基性線維芽細胞増殖因子、NFGはβ-神経成長因子、Dexはデキサメタゾン、ITSはインスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム添加剤、EGFは上皮成長因子、TGFはトランスフォーミング成長因子、BMPは骨形成タンパク質-4、RAは全トランス型レチノイン酸、OnMはオンコスタチンM、およびHGFは肝細胞増殖因子を意味する。パネルBは、オンコスタチンMまたは肝細胞増殖因子を添加したHSMでiPS細胞を48時間培養した後の培養細胞におけるAFPの相対的発現レベル（Relative expression level）を示す。図中、Fetalは胎児肝を意味する。（実施例1） 肝細胞への分化を促進する低分子化合物である肝細胞機能性増殖誘導物質1（hepatocyte functional proliferation inducer 1；以下、FPH1と略称する）が、HSMで培養したヒトiPS細胞株（201B7）におけるAFPの相対的発現レベル（Relative expression level）を増強したことを説明する図である。一方、肝細胞機能性増強剤1（hepatocyte functional enhancer 1；以下、FH1と略称する）は、このような効果は示さなかった。図中、FFはコントロール培地であるReproFFを意味する。（実施例1） HSMに、オンコスタチンM、FPH1、M50054、NEAA、ピルビン酸ナトリウム、ニコチンアミド、およびL-グルタミンを添加して作製した培養培地（以下、肝細胞分化誘導物質（hepatocyte differentiation inducer）と称し、HDIと略称することがある）で、ヒトiPS細胞株（201B7）を2日間培養後の培養細胞の形態、および、各種遺伝子の相対的発現レベル（Relative expression level）を示す図である。パネルAは光学顕微鏡にて観察した細胞形態を示す。原倍率は100倍である。パネルBは各種遺伝子の相対的発現レベルを示す。図中、AFPはα-フェトプロテイン、Albuminはアルブミン、DLK-1はデルタ様1ホモログ、G-GTPはγ-グルタミルトランスペプチダーゼ、A1-ATはα1‐アンチトリプシン、TATはチロシンアミノトランスフェラーゼ、FFはコントロール培地であるReproFF、Fetalは胎児肝、Adultは成人肝を意味する。（実施例1） HDIでヒトiPS細胞株（201B7）を2日間培養後の培養細胞における各種遺伝子の相対的発現レベル（Relative expression level）を示す図である。図中、CEBPAはCAAT／エンハンサー結合タンパク質α（CCAAT/enhancer binding protein α）、CEBPBはCCAAT／エンハンサー結合タンパク質β（CCAAT/enhancer binding protein β）、CEBPDはCCAAT／エンハンサー結合タンパク質δ（CCAAT/enhancer binding protein δ）、HNF4Gは肝細胞核因子4γ（hepatocyte nuclear factor 4γ）、HNF4Aは肝細胞核因子4α転写変異体2（hepatocyte nuclear factor 4α, transcript variant 2）、FoxA3はフォークヘッドボックスタンパク質A3（forkhead box protein A3）、FoxA2はフォークヘッドボックスタンパク質A2（forkhead box protein A2）、HNF1Aは肝細胞核因子1α（hepatocyte nuclear factor 1α）、Sox7は性決定領域Y‐ボックス7（sex determining region Y-box7）、FoxA1はフォークヘッドボックスタンパク質A1（forkhead box protein A1）、GATA6はGATA結合タンパク質6（GATA binding protein 6）、HNF1Bは肝細胞核因子1β（hepatocyte nuclear factor 1β）、HEXはヘマトポイエティカリー エクスプレスド ホメオボックス（hematopoietically expressed homeobox）、GATA4はGATA結合タンパク質4（GATA binding protein 4）、FFはコントロール培地であるReproFF、Fetalは胎児肝、Adultは成人肝を意味する。（実施例1） HDIでヒトiPS細胞株（201B7）を2日間培養後の培養細胞において、ガラクトース代謝に関連するガラクトキナーゼ2（GALK2）および尿素サイクルに関連するオルニチントランスカルバミラーゼ（OTC）の相対的発現レベル（Relative expression level）が亢進していたことを説明する図である。ブドウ糖代謝に関連するグルコース-6-ホスファターゼ（G6P）の発現も亢進していた。一方、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）およびフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）の発現量は胎児肝と同程度に亢進していたが、成人肝のレベルには及ばなかった。（実施例1） HDIでヒトiPS細胞株（201B7）を2日間培養後の培養細胞において、薬物代謝に関連するチトクロムP-450ニフェジピンオキシダーゼ（CYP3A4）の相対的発現レベル（Relative expression level）が胎児肝と同程度に亢進していたことを説明する図である。一方、アルコール代謝に関連するアルデヒドデヒドロゲナーゼ2（ALDH2）の発現量は不十分であった。（実施例1） 14種類の培養培地でヒトiPS細胞株（201B7）を7日培養して得られた各細胞培養物におけるAFP発現量を示す図である。図の縦軸は相対的発現レベル（Relative expression level）を示す。細胞におけるAFP発現量のコントロールとして、ヒト胎児肝由来RNAを使用した。図中の略号を以下に説明する。FF: ReproFF、L15: Leibovitz's-15、DMEM: Dulbecco's Modified Eagle Medium、RPMI: Roswell Park Memorial Institute -1640、WE: William's E medium、DF12: Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12、MEM: Minimum Essential Medium、GMEM: Glasgow Minimum Essential Medium、improved MEM: improved Minimum Essential Medium、IMDM: Iscove's Modified Dulbecco's Medium、CMRL: Medium 1066: Connaught Medical Research Laboratories Medium 1066、BME: Basal Medium Eagle、McCoy: McCoy's 5A、MCDB: MCDB131、fetal:ヒト胎児肝。（実施例2） ヒトiPS細胞株（201B7）を、Leibovitz's-15、William's E medium、およびDulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12の各培養培地にて7日間培養した細胞（それぞれパネルA、パネルC、およびパネルE）、並びに該7日間培養した細胞の培養培地をHDIに変更してさらに2日培養した細胞（それぞれパネルB、パネルD、およびパネルF）を光学顕微鏡下で観察した結果を示す図である。原倍率 ×200、スケールバー 25 μm。（実施例2） ヒトiPS細胞株（201B7）を、Leibovitz's-15、William's E medium、およびDulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12の各培養培地にて7日間培養後、培養培地をHDIに変更してさらに2日培養した細胞では、ReproFFで培養した細胞と比較して、AFP発現量が著しく増加したことを示す図である。図中の略号を以下に説明する。FF: ReproFFで培養した細胞、L15-HDI: Leibovitz's-15で培養後HDIに変更して培養した細胞、WE-HDI: William's E mediumにて培養後HDIに変更して培養した細胞、DF12-HDI: Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12にて培養後HDIに変更して培養した細胞。（実施例2）
本発明は、多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法に関する。以下、用語「培養培地」を単に培地と称することがある。より詳しくは本発明は、人工多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導する培養培地および方法に関する。本発明はまた、本発明に係る方法で製造された細胞培養物に関する。
本発明に係る培養培地は、肝細胞選択培地（HSM；非特許文献8および特許文献3）にオンコスタチンM、肝細胞機能性増殖誘導物質1（hepatocyte functional proliferation inducer 1；FPH1）、M50054、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ニコチンアミド、およびL-グルタミンを添加して作製された培養培地である。本明細書において、本願に係る培養培地を、肝細胞分化誘導物質（hepatocyte differentiation inducer）と称し、HDIと略称することがある。
HDIは、血清または血清代替物質、好ましくは血清代替物質を添加して使用することが好ましい。血清は、多能性幹細胞、肝芽細胞、および肝細胞の培養に一般的に使用されているものであればいずれも使用できる。血清を使用する場合、培養する細胞の種と同種の生物由来の血清を使用することが好ましい。例えば、培養する細胞がヒト細胞である場合、ヒト由来の血清を使用することが好ましい。血清代替物質は、血清の代わりに細胞の維持や生育に使用される物質であり、化学的組成が明らかな組成物を意味する。血清代替物質は、多能性幹細胞、肝芽細胞、および肝細胞の培養に一般的に使用されているものであればいずれも使用でき、例えばノックアウト商標 セラム リプレースメント（Life Technologies社製）、CDM-HD血清代替物（FiberCell Systems社製）、StemSure血清代替品（和光純薬工業株式会社製）、Nu-Serum商標（Becton Dickinson社製）を例示できる。血清または血清代替物質の用量は簡単な繰り返し実験によって決定することができる。
HDIとして、具体的には、下記表1に示す組成で示される培地を例示できる。HDIは、表1に示す組成にインスリン、デキサメタゾン、およびアプロチニンを添加した組成からなる培地であってもよい。培地へのインスリン、デキサメタゾン、およびアプロチニン添加の有無は、iPS細胞からの肝芽細胞の分化誘導効果にはほとんど影響しない。インスリンは、最終濃度が10-8 M〜10-10 M、好ましくは10-9 M〜10-10 M、より好ましくは10-9 Mとなるように添加すればよい。デキサメタゾンの添加濃度は、最終濃度が10-8 M〜10-10 M、好ましくは10-9 M〜10-10 M、より好ましくは10-9 Mとなるように添加すればよい。アプロチニンは、最終濃度が10 U/ml〜300 U/ml、好ましくは30 U/ml〜200 U/ml、より好ましくは50 U/ml〜100 U/ml、さらに好ましくは50 U/mlとなるように添加すればよい。インスリン、デキサメタゾン、およびアプロチニンの添加量はこれら例示した濃度に限定されず、人工多能性幹細胞から肝芽細胞を分化誘導することができる限りにおいていずれの濃度であってもよく、簡単な繰り返し実験により容易に決定できる。
表1に示す組成で示される培地において、MEM ビタミン溶液を構成する成分の濃度は、最終濃度として、塩化ナトリウム0.085 g、塩化コリン0.001 g、葉酸0.001 g、myo-イノシトール0.001 g、ナイアシンアミド0.001 g、D-パントテン酸.1/2 Ca 0.001 g、ピリドキサール.HCl 0.001 g、リボフラビン 0.0001 g、およびチアミン.HCl 0.001 gである。
多能性幹細胞とは、所定の培養条件下において長期に自己複製能を有し、所定の分化誘導条件下において多種の細胞への多分化能を有する幹細胞をいう。多能性幹細胞は、自分自身を複製する自己複製能と多分化能を共に有する細胞である限りにおいて、いずれの細胞も使用できる。具体的には、iPS細胞やES細胞を例示でき、好ましくはiPS細胞が推奨される。
iPS細胞は、ヒト線維芽細胞などの体細胞から遺伝子組換え技術により誘導される多能性幹細胞である。iPS細胞は、哺乳動物、例えばヒトやマウスの体細胞から製造されたものであれば、いずれの種に由来するものであってもよいが、移植などの再生医療に使用する場合は、再生医療の対象となる種由来の体細胞から製造されたものが好ましく、該対象個体から採取された体細胞から製造されたものがより好ましい。
iPS細胞は通常用いられる方法のいずれの方法で調製してもよい（非特許文献1など）。また、iPS細胞は、未分化の状態のまま維持培養する公知の方法を用いて継代培養することができる（特許文献4、非特許文献9）。
肝芽細胞は、前腸内胚葉由来の組織幹細胞であり、肝組織発生に必須の細胞である。肝芽細胞は、胎児肝における組織幹細胞として位置づけられており、成熟肝における存在は極少ない。成熟肝に存在する肝芽細胞は、肝傷害に伴い活性化され、肝修復に重要な役割を果たすと考えられる。肝芽細胞の肝細胞への分化には、多くの転写因子や非実質細胞が産生する種々の細胞外基質、たとえば肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor、HGF）やトランスフォーミング増殖因子β（Transforming growth factor β、TGFβ）などの関与が報告されている。肝芽細胞はin vitroで培養が可能であり、適当な培養条件下で培養することにより肝実質細胞や胆管上皮細胞に分化することができる。
肝細胞は、本明細書において、肝前駆細胞（hepatic progenitor cell）や成熟肝細胞など、肝細胞への分化が決定された全ての分化段階の細胞を含む意味として使用される。成熟肝細胞は、成熟肝実質細胞ともいい、多種多様な肝特異的機能、例えばコレステロール合成能、アミノ酸輸送活性、グルコース-6-ホスファターゼ（glucose-6-phosphatase）活性などの機能を発現する最終分化細胞であるが、一方、肝再生現象でよく知られるように活発な増殖能力を有する。肝前駆細胞は、胎生期にみられる活発に増殖し、肝細胞と胆管上皮に分化する能力を有する細胞とする報告（非特許文献10）と、肝臓が再生する過程で生じる小型で円形の細胞（oval cell）とする報告（非特許文献11）があり、増殖能および肝細胞と胆管上皮細胞に分化する能力を有する。肝前駆細胞は成熟した肝細胞よりも増殖能が高く、胆管上皮も形成するので肝臓に移植した場合、速やかに既存の肝構築を形成し、肝細胞のみを移植するよりも効果的に失われた肝臓を再現することが期待できる（非特許文献11）。
本願明細書において、多能性幹細胞から肝細胞への分化が決定された細胞を肝細胞系細胞と称することがある。肝細胞系細胞には、多能性幹細胞から肝細胞への分化過程の初期の段階にある細胞から成熟肝細胞までの様々な分化過程の細胞が包含される。
本発明に係る方法は、HDIで多能性幹細胞を培養することを特徴とする。HDIで多能性幹細胞を培養する期間は、少なくとも2日以上であることが好ましく、2日〜7日がより好ましく、2日〜4日がさらに好ましく、2日であることがさらにより好ましい。培養条件は、通常の培養条件、好ましくは多能性幹細胞の培養や、多能性幹細胞から肝芽細胞や肝細胞を分化誘導する培養で使用されている公知の条件をいずれも使用することができる。具体的には、95% 空気、5% CO2の雰囲気下にて、35〜40℃、好ましくは37℃で行う培養条件を例示できる。培地交換は、好ましくは1〜2日、より好ましくは2日に一度行うことが適当である。
また、本発明に係る方法は、HDI以外の培養培地で多能性幹細胞を前培養し、その後、培養培地をHDIに変更して、さらに少なくとも2日以上、好ましくは2日〜7日、さらに好ましくは2日〜4日、より好ましくは2日培養する方法であり得る。前培養に使用する培養培地として、リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）、ウィリアムE培地（William's E medium）、およびダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）を例示でき、リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）をより好ましく例示できる。これら培養培地は、血清または血清代替物質、好ましくは血清代替物質を添加して使用することが好ましい。また、これら培養培地には、所望の細胞の生育に効果のある化合物や試薬、例えばプロリンやニコチンアミドを、その有効量を添加して使用することができる。前培養の期間は、少なくとも2日以上であることが好ましく、7日であることがより好ましい。前培養の培養条件は、通常の培養条件、好ましくは多能性幹細胞の培養や、多能性幹細胞から肝芽細胞や肝細胞を分化誘導する培養で使用されている公知の条件をいずれも使用することができる。具体的には、95% 空気、5% CO2の雰囲気下にて、35〜40℃、好ましくは37℃で行う培養条件を例示できる。HDI以外の培養培地で多能性幹細胞を前培養した後にHDIで培養することにより、前培養をしない場合と比較して、細胞の生存率が増加し、その結果、得られる肝芽細胞数が増加する。したがって、本発明に係る方法では、HDI以外の培養培地で多能性幹細胞を前培養した後にHDIで培養することがより好ましい。
本発明に係る方法によりiPS細胞から肝芽細胞や幹細胞が分化誘導されたことは、肝芽細胞や肝細胞の公知マーカーの発現を検出することにより確認することができる。このようなマーカーとして、肝芽細胞のマーカーであるAFPやDLK-1、および肝細胞に特徴的に発現している酵素、たとえば薬物代謝に関連するCYP3A4やアルコール代謝に関連するALDH2を例示できる。また、肝細胞のマーカーとしてアルブミンを例示できる。
肝芽細胞や肝細胞のマーカーの検出は、細胞内の対象タンパク質のmRNAを逆転写後、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）、逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）、またはリアルタイム定量ポリメラーゼ連鎖反応などの公知の遺伝子工学的手法によって測定するか、さらに、被検タンパク質に対する抗体を用いる酵素免疫測定法（ELISA法）や免疫染色法によっても確認できるが、これら方法に限定されず、公知の方法をいずれも使用することができる。
本発明に係る方法により得られた培養細胞では、多能性幹細胞や初期胚に特異的に発現しているNanogの発現がほぼ消失しており、このことから該細胞は未分化能を失っていると考えることができる。従って、かかる培養細胞は、肝疾患治療のための移植に使用した場合に腫瘍を形成する可能性は極めて低いと考えられる。
本発明の方法により得られる細胞培養物は、肝芽細胞を含む細胞培養物である。「細胞培養物」とは、細胞を培養した後に得られる細胞群をいう。本細胞培養物には、未分化能を有する細胞は実質的に含有されていない。「実質的に含有されていない」とは、肝芽細胞と未分化能を有する細胞との比（肝芽細胞：未分化能を有する細胞）が1,000：1以下、好ましくは10,000：1以下、さらに好ましくは100,000：1以下であることをいう。また、本細胞培養物には、肝芽細胞の他、肝芽細胞からさらに分化した細胞が含まれていることがある。
本発明に係る方法により得られる培養細胞物は、例えば、劇症肝炎、部分肝切除術後、または肝硬変の自然経過中に生じる肝不全などの肝疾患の移植治療を含む再生医療に医薬として用いることができる。本発明の方法により得られる細胞培養物を有効成分として含有する医薬は、薬理学的に許容される生理食塩水、添加剤、または培地などを含んでもよいが、異種血清やウィルスなどの不純物の混入のないものが好ましい。
本発明の方法により得られる細胞培養物はまた、in vitroで、適当な培養条件下で培養することにより、肝実質細胞や胆管上皮細胞に分化させることができる。例えば、肝芽細胞の肝細胞への分化には、多くの転写因子や、非実質細胞が産生するHGFおよびTGFβなどの種々の細胞外基質の関与が報告されており、これら物質を利用して肝芽細胞から肝細胞への分化誘導をin vitroで実施できる。このように、本発明に係る培養培地および方法により得られた細胞培養物は、さらに公知方法で分化誘導させることにより、肝実質細胞や胆管上皮細胞を得るために使用することができる。
さらに、本発明の方法により得られる細胞培養物は、肝細胞の有する薬物代謝機能やアルコール代謝機能に関するin vitroでの試験や、肝細胞に対する薬剤の毒性試験などに、利用することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲は下記の実施例に限定されることはない。
ヒトiPS細胞から、短期間の培養で肝芽細胞または肝細胞を分化誘導する効果を示す物質、および培地の探索を行った。具体的には、ヒトiPS細胞の培養に被験物質を加え、培養細胞における肝細胞特異的遺伝子発現を検出することにより、肝芽細胞または肝細胞への分化誘導効果を有する物質の選択を行った。
1. 細胞培養
ヒトiPS細胞株（201B7、理研細胞バンク）は、マトリゲルコーティングした25 cm2フラスコ（旭硝子株式会社製）、6孔プレート（旭硝子株式会社製）、または96孔平底プレート（旭硝子株式会社製）に播き、37℃でCO2 5％のインキュベータ内で培養した。マトリゲルコーティングは、マトリゲル商標（Becton Dickinson社製）0.3 mlにダルベッコ改変イーグル培地／栄養剤 F-12 ハム（Dalbecco's Modified Eagle's Medium/Nutrient F-12 Ham；Sigma社製）8.7 mlを添加して作製した溶液を、25 cm2フラスコ、6孔プレート、および96孔平底プレートにそれぞれ1 ml、0.5 ml、および20μl添加して室温で30分間静置することにより行った。細胞培養培地にはReproFF（株式会社リプロセル製）を用いた。ReproFFは、霊長類ES細胞やヒトiPS細胞の未分化維持培養を達成する培養培地である。細胞の継代は25 cm2フラスコを用いた培養により行った。細胞の分散には、培地を吸引後、25cm2フラスコ一個あたり1 mlの生理食塩水にてリンスし、該食塩水を吸引後、アキュターゼ（Accutase；Innovative Cell Technoligies社製）を0.5 ml添加し、インキュベータにて5分間インキュベーションした。0.5 mlのReproFFを添加して細胞を回収し、1000 rpmで3分間の遠心処理を行い、上澄みを吸引除去後に、沈殿した細胞をReproFFに懸濁して使用した。
各種増殖因子の探索試験には、ダルベッコ最小必須培地−F12（Dulbecco's Minimum Essential Medium-F12；Sigma Aldrich社製）に20％ ノックアウト商標 セラム リプレースメント（以下、KSRと略称する；Life Technologies社製）、最小必須アミノ酸（Minimum Essential Amino Acids；Life Technologies社製）、2 mM L-グルタミン（Life Technologies社製、および1 mM 2-メルカプトエタノール（Sigma Aldrich社製）を添加した培地（以下、iPSm[-]と略称する）を使用した（非特許文献1）。
光学顕微鏡による細胞の観察には、光学顕微鏡CKX41N-31PHP（オリンパス社製）を使用した。
2. リアルタイム定量PCR
細胞の分化の確認は、発現遺伝子をリアルタイム定量PCRで測定することにより実施した。RNAの抽出は、アイソゲン（株式会社ニッポンジーン製）を用いて、使用説明書に従って行った。5μgのトータルRNAを、オリゴdTプライマーを用いてスーパースクリプト3 ファーストストランド合成システム フォー PCR（Superscript3 first-strand synthesis system for PCR；Life Technologies社製）を用いて、使用説明書に従って合成した。合成したcDNAを1サンプルあたり4 ng用いてリアルタイム定量PCRを行った。使用したプライマーを表2に示す。PCRサイクルは、変性（denaturation）：5秒、およびアニーリング−伸長（annealing-extension）：5秒のサイクルを40サイクル行った。反応にはサイバー グリーン マスター ミックス（SYBR Green Master Mix；Life Technologies社製）を用いた。リアルタイムPCRの検出には、ミニ オプティコン システム（Mini Opticon system；Bio-Rad社製）を使用した。各遺伝子の発現量は、3孔から得られたデータの平均値として算出した。内部標準（Internal control）としてリボソーマル プロテインL-19（ribosomal protein L (RPL)-19）を用い、各遺伝子の発現量をRPL-19の発現量に対する相対発現レベル（relative expression level）として表示した。
3. 細胞増殖アッセイ
ヒトiPS細胞株（201B7、理研細胞バンク）を、マトリゲルコーティングした96孔平底プレートに、1孔あたり1000個/50μlとなるように播いた。48時間培養後、MTS（3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-5-(3-カルボキシメトキシフェニル)-2-(4-スルホフェニル)-2H-テトラゾリウム分子内塩（3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium inner salt；Promega社製）を1孔あたり5μl添加し、インキュベータ内で2時間インキュベーション後、iMark商標マイクロプレート吸光度リーダー（iMarkTM Microplate Absorbance Reader；Bio-Rad）を用いて波長490 nmの吸光度を測定することにより、細胞増殖を検証した。
4. 試薬
実施例で使用した試薬および検討対象化合物を以下に列記する。
100倍濃縮NEAA（Life Technologies社製）。100倍濃縮NEAAの組成は、グリシン 750.0 mg/L、L-アラニン 890.0 mg/L、L-アスパラギン 1320.0 mg/L、L-アスパラギン酸 1330.0 mg/L、L-グルタミン酸 1470.0 mg/L、L-プロリン 1150.0 mg/L、L-セリン 1050.0 mg/Lである。
100倍濃度ピルビン酸ナトリウム（sodium pyruvate；Life Technologies社製）。ピルビン酸ナトリウムは、培養培地への添加によりエネルギー源と、同化作用プロセスのための炭素骨格を提供する。無血清培地や低濃度血清培地での培養や、クローニングを目的とした培養など、特別な条件下での培養に添加される。
CTP阻害剤である4-クロロ-3-[[(3-ニトロフェニル)アミノ]スルホニル]-安息香酸（4-Chloro-3-[[(3-nitrophenyl)amino]sulfonyl]-benzoic acid）はSigma社製のものを使用した。。
M50054（2,2′-メチレンビス(1,3-シクロヘキサンジオン)（2,2′-Methylenebis(1,3-cyclohexanedione)））はMerk社製のものを使用した。M5054は、アポトーシス阻害剤として知られている。
DAPK阻害剤である(4Z)-4-(3-ピリジルメチレン)-2-スチリル-オキサゾール-5-オン（(4Z)-4-(3-Pyridylmethylene)-2-styryl-oxazol-5-one）はMerk社製のものを使用した。
オンコスタチンM（Oncostatin M；以下、OnMと略称することがある；和光純薬工業株式会社製）。オンコスタチンMは、造血、免疫、および代謝などにおいて重要な機能を果たす IL-6ファミリーのサイトカインである。
肝細胞増殖因子（Hepatocyte growth factor；以下、HGFと略称する）は、和光純薬工業株式会社製のものを使用した。
肝細胞機能性増殖誘導物質1（hepatocyte functional proliferation inducer 1；以下、FPH1と略称する）である2-(N-(5-クロロ-2-メチルフェニル)メチルスルホンアミド)-N-(2,6-ジフルオロフェニル)アセトアミド（2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)acetamide）は、XcessBio社製のものを使用した。
肝細胞機能性増強剤1（hepatocyte functional enhancer 1；以下、FH1と略称する）である N,N'-(メチレンビス(4,1-フェニレン))ジアセトアミド（N,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide）は、XcessBio社製のものを使用した。
アクチビンA（Activin A；以下、Actと略称することがある）は、R&D systems社製のものを使用した。アクチビンAは、発生の過程で多数の細胞種によって生産されるトランスフォーミング成長因子-β（TGF-β）スーパーファミリーに属するサイトカインであり、細胞の増殖や分化に関与することが知られている。
塩基性線維芽細胞増殖因子（Basic fibroblast growth factor；以下、FGFと略称することがある）は、和光純薬工業株式会社製のものを使用した。FGFは血管新生や胚発生に関係する成長因子として知られている。
β-神経成長因子（β-nerve growth factor；以下、NGFと略称することがある）は、R&D systems社製のものを使用した。。NGFは、神経軸策の伸長、神経細胞の維持、細胞損傷時の修復、および脳神経の機能回復などの作用が知られている。
デキサメタゾン（Dexamethasone；以下、Dexと略称することがある）は、和光純薬工業株式会社製のものを使用した。Dexはステロイド系抗炎症薬として使用されているが、肝細胞などの初代単層培養において、培地に添加することにより細胞の接着や維持に関与することが知られている。
インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウム添加剤（Insulin-transferrin-sodium-selenite media supplement、以下、ITSと略称する）は、Sigma社製のものを使用した。100倍濃縮溶液で市販されているため、培養には100倍に希釈して使用した。100倍濃縮ITSの組成は、ヒト インスリン 1.0 mg/ml、ヒト トランスフェリン0.55 mg/ml（鉄は含まず）、亜セレン酸ナトリウム 0.5μg/mlである。
上皮成長因子（Epidermal growth factor；以下、EGFと略称することがある）は、和光純薬工業株式会社製のものを使用した。EGFは、外胚葉および中胚葉に由来する広範な種類の細胞の増殖および分化に関与することが知られている。
トランスフォーミング成長因子-1（Transforming growth factor-1；以下、TGFと略称することがある）は、R&D systems社製のものを使用した。TGFは、組織発生や細胞***に関する情報伝達に関与するサイトカインである。
骨形成タンパク質-4（Bone morphogenic protein-4；以下、BMP-4と略称する）は、和光純薬工業株式会社製のものを使用した。BMP-4は、TGF-βスーパーファミリーに属するタンパク質であり、発生期の組織や器官の誘導、パターン形成、細胞死の誘導、および細胞分化の制御など、発生過程に関与することが知られている。
全トランス型レチノイン酸（All trans retinoic acid；以下、RAと略称することがある）は、Sigma社製のものを使用した。RAは、細胞の分化・増殖に関与することが知られている。
ヒト胎児肝由来トータルRNAは、Clontech社製のものを使用した。
ヒト成人肝由来トータルRNA は、Clontech社製のものを使用した。
5. 肝細胞分化誘導物質の調製
HDIは、肝細胞選択培地（hepatocyte selection medium；HSM；非特許文献8および特許文献3）に、オンコスタチンM 20 ng/ml、 FPH1 10 nM、 M50054 100μg/mlを加え、さらに、100倍濃度のNEAAと100倍濃度のピルビン酸ナトリウムをそれぞれ1/100濃度になるように希釈して添加することにより作成した。ニコチンアミド（和光純薬工業株式会社製）を1.2 mg/ml、およびL-グルタミン（和光純薬工業株式会社製）を0.3 mg/mlの濃度で添加した。ニコチンアミドは初代培養肝細胞の細胞***に必須である（非特許文献12）。
HDIの組成は、上記表1に示した組成である。また、HSMの組成を表3に示す。
6.結果
まず、HSMでiPS細胞の培養を行い、iPS細胞からの肝細胞の分化を確認した。具体的には、HSMでiPS細胞を2日間培養後、その遺伝子発現をリアルタイム定量PCRで測定することにより、iPS細胞から肝細胞への分化誘導を検出した。コントロール培地として、ReproFFを使用し、同様の検討を行った。
図1に示すように、HSMでiPS細胞を培養することにより、胎生期肝細胞のマーカーであるAFP遺伝子の発現亢進が認められた。一方、ReproFFでiPS細胞を培養した場合は、該遺伝子の発現が低レベルであった。このことから、既報（非特許文献8）に記載されているように、HSMで培養すると3日でiPS細胞からの肝細胞への分化が誘導されるが、iPS細胞は死滅している可能性が示唆された。
HSMで培養するとiPS細胞はアポトーシスに陥ることが報告されている（非特許文献8）。そこで、アポトーシスを阻害することによりiPS細胞の生存を高める試薬を検索した。具体的には、M50054、CTP阻害剤、およびDAPK阻害剤を各種濃度にて、HSMでのiPS細胞の培養に添加し、3日後光学顕微鏡にて観察した。
図2のパネルAに示すように、検討した試薬のうちCTP阻害剤およびDAPK阻害剤を添加した培養ではiPS細胞は死滅したが、M50054を100μg/mlの濃度で添加した培養では、生存するiPS細胞が認められた。
そこで、M50054添加後48時間、MTSアッセイを行ったところ、図2のパネルBに示すように、100 g/ml の濃度でM50054を添加した培養で、最大の吸光度が認められた。一元配置分散分析（One-way analysis of variance；JMP10.0.2；SAS Institute）にて統計解析したところ、M50054は100μg/mlでは、0および1000μg/mlに比して有意に高値を呈した（P<0.05）。1000μg/mlでは毒性が生じた可能性がある。
マウスES細胞の生存には、NEAAとピルビン酸ナトリウムが好ましい効果を示すことが報告されている（非特許文献13）。多能性幹細胞ではクエン酸経路が未熟なため解糖系が主なエネルギー源である。すなわち、多能性幹細胞はその生存に多くのブドウ糖を必要とし、そのため解糖系の産物であるピルビン酸ナトリウムを必要とする。また各種アミノ酸代謝の経路も未熟なため、その培養にはNEAAの添加が望ましい。
一方、HSMは、iPS細胞から肝細胞を分化させるときに、未分化なiPS細胞を死滅させて肝細胞を選択することを目的として開発された培地であり、そのためにNEAAとピルビン酸ナトリウムは添加していない（非特許文献8）。
本実施例では、iPS細胞の生存を高めることを目的として、HSMへのNEAAとピルビン酸ナトリウム（1 mM）の添加を検討した。具体的には、HSMにNEAAとピルビン酸ナトリウム（1 mM）を添加した培地で、iPS細胞を2日間培養し、AFP遺伝子の発現をリアルタイム定量PCRで測定した。また、HSMにM50054を100 g/ml添加した培地で、iPS細胞を48時間培養し、AFP遺伝子の発現をリアルタイム定量PCRで測定した。
図3のパネルAに示すように、HSMにNEAAとピルビン酸ナトリウム（1 mM）を添加した培地でiPS細胞を2日間培養したところ、培養細胞のAFP遺伝子発現の亢進が認められた。また、図3のパネルBに示すように、HSMにM50054を100 g/ml添加した培地でiPS細胞を48時間培養したところ、培養細胞のAFP遺伝子発現の亢進が認められた。
次に、iPS細胞からの肝細胞への分化を促進する増殖因子を探索した。具体的には、iPSm(-)に各種の増殖因子を添加してiPS細胞を1週間培養後、RNAを抽出してリアルタイム定量PCRを行いAFP遺伝子の発現量を解析した。
図4のパネルAに示すように、検討した増殖因子の中で、オンコスタチンMとHGFが、iPS細胞を培養した細胞でのAFP遺伝子発現を亢進する効果を示した。
そこで、HSMにオンコスタチンMとHGFをそれぞれ単独で添加し、iPS細胞を48時間培養後にRNAを抽出し、AFP遺伝子の発現量をリアルタイム定量PCRにより検出した。図4のパネルBに示すように、オンコスタチンMはHGFに比してAFP遺伝子の発現亢進に高い効果を示した。オンコスタチンMを加えた培地で培養した細胞のAFP遺伝子の発現は、胎児肝における該遺伝子の発現よりも亢進していた。図4のパネルAに示した結果と異なりオンコスタチンMがHGFよりもAFP遺伝子の発現亢進に高い効果を示した原因は、図4のパネルAに示した結果とパネルBに示した結果では、培養期間および培地などの実験条件に差異があることが挙げられる。
FPH1とFH1はiPS細胞から肝細胞への分化を促進する低分子化合物である（非特許文献14）。そこで、FPH1とFH1とをHSMに添加した培地を使用して、iPS細胞から肝細胞への分化を検討した。具体的には、FPH1（10μM）およびFH1（10μM）をそれぞれ単独、または組み合わせてHSMに添加した培地で、iPS細胞を2日間培養後にRNAを抽出してリアルタイム定量PCRにてAFP遺伝子の発現量を解析し、AFPの発現が高値を呈する条件を検討した。
図5に示すように、HSMにFPH1を単独で添加した培地で培養することにより、培養細胞のAFP遺伝子発現量が増加することが明らかになった。
以上の結果より明らかになった条件を勘案して、HDIを作製した。そして、HDIでiPS細胞を2日間培養後に光学顕微鏡にて形態を観察し、さらにRNAを抽出してリアルタイム定量PCRにて各種遺伝子の発現量を解析した。
図6のパネルAに示すように、HDIによる培養では、HSMによる培養に比して多くの細胞が生存していた。
また、図6のパネルBに示すように、HDIで培養すると、AFPの発現が亢進し、さらに、胆管上皮細胞のマーカーであるγ-グルタミル トランスペプチダーゼ（γ-glutamyl transpeptidase；以下、G-GTPと略称する）の発現が、胎児肝と同様に亢進することが判明した。HDIで培養した細胞は、このように、肝細胞および胆管上皮細胞両者のマーカーを発現することから、該細胞は肝芽細胞（未分化な肝細胞で肝細胞と胆管上皮細胞に分化する能力を有する）と類似していることが示唆された。また、アルブミンの発現が認められないことから、HDIで培養した細胞は肝細胞より未分化な段階の肝芽細胞に留まっていると考えられた。さらに、HDIで培養した細胞は、肝芽細胞のマーカーであるDLK-1の発現が亢進しており、このことから該細胞が肝芽細胞に類似していることが裏付けられた。一方、多能性幹細胞や初期胚に特異的に発現しているNanogの発現は、HDIで培養した細胞ではほぼ消失しており、このことから該細胞は未分化能を失っていると考えることができる。
さらに、図7に示すように、iPS細胞をHDIで培養した後の細胞では、肝細胞に特異的な転写因子の発現量の亢進が認められた。発現量の亢進が認められた肝細胞特異的転写因子は、CEBPA、CEBPB、CEBPD、HNF4G、HNF4A、FoxA3、FoxA2、HNF1A、Sox7、FoxA1、GATA6、HNF1B、HEX、およびGATA4である。以上の結果から、HDIでiPS細胞を培養した後には、培養細胞において肝細胞に特異的な転写因子の発現量が亢進することが示唆された。
また、代謝酵素の発現を検討したところ、図8に示すように、ガラクトース代謝に関連する酵素であるGALK2、および尿素サイクルに関連する酵素であるOTCの発現が亢進していた。また、ブドウ糖代謝に関連する酵素であるG6Pの発現も亢進していた。一方、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（PEPCK）およびフェニルアラニンヒドロキシラーゼ（PAH）の発現量は胎児肝と同程度に亢進していたが、成人肝には及ばなかった。以上の結果から、HDIでiPS細胞を培養した後には、培養細胞においてガラクトース代謝およびオルニチン代謝が亢進していることが示唆された。このように、かかる培養細胞は肝細胞への分化が誘導されているものの、その分化状態は依然未分化段階に留まると考えられた。
次に、薬物代謝に関連する酵素であるCYP3A4およびアルコール代謝に関連する酵素であるALDH2の発現について検討を行った。
図9に示すように、CYP3A4の発現は胎児肝と同程度に亢進していたが、ALDH2の発現量は不十分であった。この結果から、HDIでiPS細胞を培養した後には、培養細胞において肝細胞における代謝関連機能の一部が亢進するが、しかしながらその肝細胞への分化状態は未分化段階に留まると考えられた。
上記のように、表1に示した組成からなるHDIでiPS細胞を2日間培養することにより、培養細胞において、肝芽細胞マーカーであるAFP、DLK-1、およびG-GTPの発現が胎児肝と同程度に認められた。一方、成熟した肝細胞マーカーであるアルブミンの発現は認められなかった。したがって、HDIでiPS細胞を培養して得られた細胞は肝芽細胞であると考えることができる。薬物代謝に関連するCYP3A4、アルコール代謝に関連するALDH2の発現も胎児肝に匹敵するレベルに増加していることが判明した。したがって肝細胞の有する薬物代謝機能やアルコール代謝機能に関するin vitroでの試験には、このような培養で得られた肝芽細胞を使用することが可能と期待される。一方、かかる培養細胞におけるNanogの発現は胎児肝と同程度に減少していたので未分化能は失っていると考えられる。したがってかかる培養で得られた肝芽細胞は、肝疾患治療のために移植した場合に腫瘍を形成する可能性は極めて低いと考えられ、ゆえに有用性が高い。
実施例1に示したように、表1に示した組成からなるHDIでiPS細胞を培養することにより、短期間で肝芽細胞が分化誘導されることが明らかになった。HDIを使用する肝細胞系細胞への分化誘導方法において、さらに多くの肝細胞系細胞を得るための条件、および、さらに成熟した肝細胞への分化を誘導する条件の検討を行った。
具体的には、iPS細胞をHDI以外の培養培地で培養した後に、培養培地をHDIに変更してさらに培養する条件を試みた。
1. 被検培地
HDI以外の培養培地として下記培地を使用し、上記検討を行った。
（1）ReproFF（品番：RCHEMD004、株式会社リプロセル製）
（2）リーボビッツ-15（Leibovitz's-15、品番：11415、Life Technologies社製）
（3）ダルベッコ改変イーグル培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium、品番：D5796、Sigma-Aldrich社製）
（4）ロスウェルパークメモリアルインスティチュート‐1640（Roswell Park Memorial Institute -1640、品番：R8758、 Sigma-Aldrich社製）
（5）ウィリアムE培地（William's E medium、Life Technologies社製）
（6）ダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12、品番：11330-032、Life Technologies社製）
（7）イーグル最小必須培地（Minimum Essential Medium、品番：11090-081、Life Technologies社製）
（8）グラスゴー最少必須培地（Glasgow Minimum Essential Medium、品番：11710-035、Life Technologies社製）
（9）改良最小必須培地（Improved Minimum Essential Medium、品番：10373-017、Life Technologies社製）
（10）イスコフ改変ダルベッコ培地（Iscove's Modified Dulbecco's Medium、品番：12440-053、Life Technologies社製）
（11）コンノート医学研究所1066培地（Connaught Medical Research Laboratories Medium 1066、品番：11530-037、Life Technologies社製）
（12）イーグル基礎培地（Basal Medium Eagle、品番：21010-046、Life Technologies社製）
（13）マッコイ5A培地（McCoy's 5A Medium、品番：16600-082、Life Technologies社製）
（14）MCDB 131培地（MCDB 131 Medium、品番：10372-019、Life Technologies社製）
2. 細胞培養
201B7細胞を、実施例1に記載の方法に基づいてマトリゲルコーティングした6孔プレート（旭硝子株式会社製）に播き、ReproFFを細胞培養培地として使用して、37℃でCO2 5％のインキュベータ内で培養した。70%コンフルエントに到達後、被検培地に10% KSR、プロリン 0.03 mg/ml、ニコチンアミド 1.2 mg/mlを添加し7日間培養した。被検培地にて7日間培養後、培養培地をHDIに変更し、さらに2日間培養した。
3. AFP発現量の測定
細胞の分化の確認は、AFP遺伝子の発現をリアルタイム定量PCRで測定することにより実施した。RNAの抽出、cDNAの合成、およびリアルタイム定量PCRは、実施例1に記載の方法と同じ方法で実施した。対照としてヒト胎児肝由来トータルRNA（Clontech社製）を用いた。
4. 結果
まずは、201B7細胞をHDIで培養する前の培養（以下、前培養と称することがある）に使用する培養培地の選択を行った。培養培地の選択は、数々の被検培地で201B7細胞を培養し、得られた細胞のAFP発現量を測定し、AFP発現量を増加させる培養培地を201B7細胞から肝細胞系細胞への分化誘導を開始し得る培養培地であると判定することにより行った。
図10に示すように、検討した14種類の被検培地のうち3種類の培養培地、すなわちLeibovitz's-15（以下、L15と略称することがある）、William's E medium（以下、WEと略称することがある）、およびDulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12（以下、DF12と略称することがある）による培養が、他の被検培地による培養と比較して、細胞におけるAFP発現量が高いことが判明した。これら3種類の培養培地が201B7細胞から肝細胞系細胞への分化に適した培地の可能性が示唆された。
次に、201B7細胞を、選択した3種類の培養培地で7日間前培養した後に培養培地をHDIに変更して2日間培養し、得られた細胞を光学顕微鏡下で観察した。また、得られた細胞のAFP発現量を測定した。
201B7細胞をその培養開示時からHDIで培養すると、実施例1および図6に示したように、多能性幹細胞などの未分化能を有する細胞は死滅し、肝芽細胞などの肝細胞系細胞のみが生存する。また、201B7細胞をReproFFで培養した後にHDIで培養すると、著しい細胞の減少が認められる。
一方、L15、WE、およびDF12で7日培養した細胞（それぞれ図11のパネルA、B、およびC）を、HDIでさらに2日間培養した場合（それぞれ図11のパネルA、B、およびC）には、細胞は死滅せず、多くの細胞の生存が認められた。したがって、L15、WE、およびDF12で培養した201B7細胞は、肝細胞系細胞への分化誘導が開始されていることが確認された。
また、図12に示すように、L15、WE、およびDF12にて7日間培養後HDIにてさらに2日培養した細胞では、AFP発現量が、ReproFFで培養した細胞や、L15、WE、およびDF12それぞれ単独で7日間培養した細胞（図10参照）と比較して著しく増加していることが明らかになった。3種類の培地の中では、L15で前培養してHDIにてさらに2日培養した細胞におけるAFP発現が著しい。この結果からも、L15、WE、およびDF12で培養した201B7細胞は、肝細胞系細胞への分化誘導が開始されていることが確認された。
上記結果から、ヒトiPS細胞をHDI以外の培養培地で培養して肝細胞系細胞への分化誘導を開始した後に、培養培地をHDIに変更してさらに培養することにより、細胞の生存率はHDIにて最初から培養したヒトiPS細胞と比較して増加すること、および得られた細胞におけるAFP発現量が亢進することが確認された。また、このような培養方法で得られる肝芽細胞などの肝細胞系細胞は、ヒトiPS細胞を培養当初からHDIにより培養する方法と比較して、得られる量が多い。したがって、このような培養条件は、ヒトiPS細胞から肝細胞系細胞への分化を誘導した後に成熟した肝細胞へ分化を完成させる方法に応用可能であると期待される。
本発明により、多能性幹細胞、例えばiPS細胞の短期間の培養で、肝芽細胞を得ることができる。
本発明は、医薬開発分野や再生医療分野において極めて有用である。
配列番号1：ヒトNanog遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号2：ヒトNanog遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号3：ヒトNanog遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号4：ヒトα-フェトプロテイン遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号5：ヒトリボソーマルタンパク質L-19遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号6：ヒトリボソーマルタンパク質L-19遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号7：ヒトアルブミン遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号8：ヒトアルブミン遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号9：ヒトヘマトポイエティカリー エクスプレスド ホメオボックス遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号10：ヒトヘマトポイエティカリー エクスプレスド ホメオボックス遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号11：ヒトGATA結合タンパク質4遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号12：ヒトGATA結合タンパク質4遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号13：ヒトCCAAT/エンハンサータンパク質α遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号14：ヒトCCAAT/エンハンサータンパク質α遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号15：ヒトデルタ様1ホモログ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号16：ヒトデルタ様1ホモログ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号17：ヒトγ-グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号18：ヒトγ-グルタミルトランスペプチダーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号19：ヒトGATA結合タンパク質6遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号20：ヒトGATA結合タンパク質6遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号21：フォークヘッド ボックスタンパク質A1遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号22：フォークヘッド ボックスタンパク質A1遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号23：ヒト肝細胞核因子1β遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号24：ヒト肝細胞核因子1β遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号25：ガラクトキナーゼ-1遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号26：ガラクトキナーゼ-1遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号27：ガラクトキナーゼ-2遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号28：ガラクトキナーゼ-2遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号29：ヒトオルニチン トランスカルバミラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号30：ヒトオルニチン トランスカルバミラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号31：ヒトチトクローム P-450 ニフェジピンオキシダーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号32：ヒトチトクローム P-450 ニフェジピンオキシダーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号33：アルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号34：アルデヒド デヒドロゲナーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号35：ヒトα1-アンチトリプシン遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号36：ヒトα1-アンチトリプシン遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号37：ヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号38：ヒトチロシンアミノトランスフェラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号39：CCAAT/エンハンサータンパク質β遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号40：CCAAT/エンハンサータンパク質β遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号41：CCAAT/エンハンサータンパク質δ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号42：CCAAT/エンハンサータンパク質δ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号43：グルコース-6-ホスファターゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号44：グルコース-6-ホスファターゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号45：ヒトホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号46：ヒトホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号47：フォークヘッド ボックスタンパク質A3遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号48：フォークヘッド ボックスタンパク質A3遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号49：ヒトフェニルアラニン ヒドロキシラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号50：ヒトフェニルアラニン ヒドロキシラーゼ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号51：ヒト肝細胞核因子4α遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号52：ヒト肝細胞核因子4α遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号53：ヒト性決定領域 Y-ボックス7遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号54：ヒト性決定領域 Y-ボックス7遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号55：ヒト肝細胞核因子1α遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号56：ヒト肝細胞核因子1α遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号57：ヒトフォークヘッド ボックスタンパク質A2遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号58：ヒトフォークヘッド ボックスタンパク質A2遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号59：ヒト肝細胞核因子4γ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。
配列番号60：ヒト肝細胞核因子4γ遺伝子の増幅用プライマーとして設計されたオリゴヌクレオチド。

Claims (9)

  1. 多能性幹細胞から肝芽細胞を得る方法であって、多能性幹細胞を下記表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程を含む方法。
  2. 多能性幹細胞を表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程の前に、下記培養培地
    （1）リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）、
    （2）ウィリアムE培地（William's E medium）、および
    （3）ダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）
    から選択されるいずれか1の培養培地で多能性幹細胞を培養する工程を含む、請求項1に記載の多能性幹細胞から肝芽細胞を得る方法。
  3. 多能性幹細胞が人工多能性幹細胞（induced pluripotent stem cells：以下、iPS細胞と略称する）である請求項1または請求項2に記載の方法。
  4. 表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程が、該培養培地で少なくとも2日間培養する工程である請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
  5. 表1に記載の組成からなる培養培地で培養する工程が、該培養培地で2日間培養する工程である請求項1から3のいずれか1項に記載の方法。
  6. iPS細胞から肝芽細胞を得る方法であって、iPS細胞を下記表1に記載の組成からなる培養培地で2日間培養する工程を含む方法。
  7. iPS細胞から肝芽細胞を得る方法であって、
    （A）下記培養培地
    （1）リーボビッツ-15（Leibovitz's-15）、
    （2）ウィリアムE培地（William's E medium）、および
    （3）ダルベッコ改変イーグル培地／ハムF-12混合培地（Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12）
    から選択されるいずれか1の培養培地でiPS細胞を7日間培養する工程、および
    該工程の後に
    （B）該工程で得られた細胞を下記表1に記載の組成からなる培養培地で2日間培養する工程、
    を含む方法。
  8. 下記表1に記載の組成からなる、多能性幹細胞からの肝芽細胞の分化誘導用培養培地。
  9. 請求項1から7のいずれか1項に記載の方法により製造された細胞培養物。
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