CN105940101A - 由人多能干细胞特化功能性颅基板衍生物 - Google Patents

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Abstract

颅基板是感觉和内分泌器官发育必不可少的胚胎结构。公开了自人多能干细胞有效地得到颅基板，其中定时除去BMP抑制剂Noggin——神经诱导的双SMAD抑制策略的一种组分——以CNS结局为代价触发基板诱导。在前基板阶段进一步的结局特化使得能够选择性地产生能在体内植入的源自基板的三叉神经节、成熟晶状体纤维和在移植时在体内产生包括但不限于人生长激素和促肾上腺皮质激素的产生垂体前叶激素的细胞。另外可选地，产生垂体前叶激素的细胞可以在体外在细胞培养***中产生。

Description

由人多能干细胞特化功能性颅基板衍生物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2013年11月21日提交的美国临时申请第61/907,302号的优先权，在此将其内容全文并入作为参考。
发明领域
本发明主要涉及干细胞细胞生物学领域，更具体地，涉及使用新的培养条件下的多能或专能干细胞的定向分化，上述多能或专能干细胞包括人胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞和诱导的人多能干细胞(hiPSC)。具体地，通过在前基板(pre-placode)阶段与进一步结局特化相结合的双SMAD抑制策略神经诱导，由人多能干细胞得到颅基板。该方法产生来自基板的三叉神经节、成熟晶状体纤维和产生垂体前叶激素的细胞。这些细胞的应用包括，但不限于，感觉和内分泌疾病中基于人细胞的疗法。
背景技术
对于用于遗传、恶性和退行性疾病的细胞置换疗法来说，胚胎和成体干细胞的分化能力具有开放的可能性。神经退行性障碍、病状和疾病及其通过基于细胞的疗法的治疗代表着有前途的预防、减轻或消除症状的措施。这些疾病包括亨廷顿氏舞蹈病、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病和肌萎缩性脊索侧索硬化症。它们也提供了筛选关键小分子的细胞来源，上述关键小分子(i)可以用于疾病的治疗；或者(ii)用于确定神经组织的细胞结局(fate)。而且，对这些细胞进行研究，以表征与正常或病理谱系(lineages)的关键基因、mRNA转录物和蛋白质。
神经发育由指导神经前体特性的复杂信号集合在时间和空间上决定。尽管在动物模型中作出显著的进展，人神经发育仍保持知之甚少。
之前的研究报道了小鼠(Wichterle等人,2002；Barberi等人,2003；Watanabe等人,2005)和人(Perrier等人,2004；Li等人,2008；Eiraku等人,2008)ESC响应于界定前面/后面(A/P)和背侧-/腹侧(D/V)CNS身份的模式(patterning)因子定向分化成特定的神经类型。这些研究证明了特化(specify)主要CNS区域的信号传导***的进化保守性。在哺乳动物中，音猬因子(sonic hedgehog)(SHH)是在初级神经外植体中(Briscoe和Ericson,1999)和在小鼠ES细胞中(Mizuseki等人,2003)以依赖于剂量的方式作用于特化各种腹细胞类型包括表达底板(FP)的细胞的腹侧化(ventralizing)因子。尽管显示了将SHH应用于来自hESC的神经细胞诱导各种腹侧神经元类型，底板(FP)组织自身的衍生并未报道。由于FP是一种用于诱导分化通路和后续定向细胞谱系的信号转导中心，由人ES细胞产生FP的能力在早期人神经发育的进一步研究中将会是重要的进步。而且，由于缺乏组织可及性(accessibility)，关于人中的FP发育知之甚少。
在动物中，FP是SHH产生的重要位点，若干种人的发育失常与中间SHH信号传导中的改变有关(Mullor等人,2002)，上述发育失常包括某些形式的前脑无裂畸形和小眼，骨骼疾病包括各种腭裂综合征(cleft plate syndromes)，以及肿瘤病状例如戈林氏综合征(Gorlin’s syndrome)；SHH受体Patched 1中的突变导致的罕见遗传疾病。但是，尚未知晓中间SHH信号传导中的类似改变是否会导致人的这些疾病。
因此，对于由人胚胎干细胞(hESC)诱导人底板组织存在关键的需求，用以提供人底板细胞的来源。对于在用于确定人类中发育疾病的原因和治疗的医学研究中的用途，以及对于人神经模式和轴突导向(pathfinding)的比较发育研究，这些人底板细胞是必需的。
发明内容
本发明主要涉及干细胞细胞生物学领域，更具体地，涉及使用新的培养条件下的多能或专能干细胞的定向分化，上述多能或专能干细胞包括人胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞和诱导的人多能干细胞(hiPSC)。具体地，通过在前基板阶段与进一步结局特化相结合的双SMAD抑制策略神经诱导，由人多能干细胞得到颅基板。该方法产生来自基板的三叉神经节、成熟晶状体纤维和产生垂体前叶激素的细胞。这些细胞的应用包括，但不限于，感觉和内分泌疾病中基于人细胞的疗法。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括：a)在N2细胞培养基中提供或平板接种多种颅基板前体细胞；b)使所述多种基板前体细胞与包括脑源性神经营养因子的组合物接触，其中产生多种三叉神经基板细胞。在一实施方式中，该方法进一步包括在产生三叉神经神经元的条件下孵育三叉神经基板细胞。在一实施方式中，颅基板前体细胞表达SIX1、PAX6和TFAP2A。在一实施方式中，三叉神经基板细胞表达SIX1和PAX3。在一实施方式中，三叉神经基板前体细胞可以用于识别药理学药剂，以抑制感觉神经元致病因子。在一实施方式中，感觉神经元致病因子包括水痘带状疱疹病毒(即，其感染导致水痘)。在一实施方式中，感染的感觉神经元是三叉神经神经元。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括：a)在细胞培养基中提供或平板接种多种颅基板前体细胞；和b)使所述多种基板前体细胞与包括音猬因子、purmorphamine和γ-分泌酶抑制剂的组合物接触，其中产生多种垂体基板细胞。在一实施方式中，该方法进一步包括在产生能够分泌激素的多种垂体细胞的条件下孵育所述垂体基板细胞，上述多种垂体细胞包括，但不限于***细胞、促肾上腺皮质激素细胞和促生长激素细胞。在一实施方式中，分泌的激素包括，但不限于，甾类激素、促肾上腺皮质激素和/或生长激素。在一实施方式中，颅基板前体细胞表达SIX1、PAX6和TFAP2A。在一实施方式中，垂体基板细胞表达SIX1和PITX1。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括：a)在细胞培养基中提供或平板接种多种颅基板前体细胞；和b)使所述多种基板前体细胞与包括音猬因子、purmorphamine、γ-分泌酶抑制剂和FGF-抑制剂的组合物接触，其中产生多种晶状体基板细胞。在一实施方式中，该方法进一步包括在产生晶状体纤维的条件下孵育晶状体基板细胞。在一实施方式中，颅基板前体细胞表达SIX1、PAX6和TFAP2A。在一实施方式中，晶状体基板细胞表达SIX1和PITX3。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括将三叉神经基板细胞移植给表现疼痛综合征的至少一种症状的受试者，其中所述疼痛综合征的至少一种症状得以减轻。在一实施方式中，疼痛综合征包括，但不限于三叉神经麻痹、三叉神经痛和/或偏头痛。在一实施方式中，移植在脑桥上进行。在一实施方式中，三叉神经基板细胞迁移至三叉神经核。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括将垂体基板细胞移植给表现神经内分泌紊乱(neuroendocrine disorder)的至少一种症状的受试者，其中所述神经内分泌紊乱的至少一种症状得以减轻。在一实施方式中，移植的垂体基板细胞分泌生长激素。在一实施方式中，移植的垂体基板细胞分泌促肾上腺皮质激素。在一实施方式中，移植在腿部肌肉上进行。在一实施方式中，移植在下丘脑-垂体轴上。在一实施方式中，移植在下丘脑上。在一实施方式中，移植在蝶鞍(sella)上。在一实施方式中，神经内分泌紊乱包括糖尿病。在一实施方式中，神经内分泌紊乱包括垂体机能减退症。在一实施方式中，神经内分泌紊乱包括垂体肿瘤。在一实施方式中，神经内分泌紊乱包括放射疗法。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括将晶状体基板细胞移植给表现眼睛疾病的至少一种症状的受试者，其中所述眼睛疾病的至少一种症状得以减轻。在一实施方式中，眼睛疾病的至少一种症状包括失明。在一实施方式中，眼睛疾病的至少一种症状包括黄斑变性。在一实施方式中，眼睛疾病的至少一种症状包括白内障。在一实施方式中，眼睛疾病的至少一种症状包括散光。在一实施方式中，眼睛疾病的至少一种症状包括近视。在一实施方式中，眼睛疾病的至少一种症状包括远视。在一实施方式中，移植的晶状体基板细胞分泌多种晶状体纤维蛋白质。在一实施方式中，多种晶状体纤维蛋白质包括αβ-晶体晶状体纤维蛋白质。在一实施方式中，多种晶状体纤维蛋白质是分层的。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括：a)在培养基中提供或平板接种包括人多能干细胞的细胞培养物；b)使所述细胞培养物与SMAD(Small Mothers AgainstDecapentaplegic)蛋白质信号传导第一抑制剂和4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)接触；和c)在形成颅基板前体细胞的条件下去除所述第一SMAD抑制剂。在一实施方式中，第一SMAD抑制剂选自Noggin、二硫键连接的Noggin同型二聚体、Dorsomorphin、LDN-193189及其混合物。在一实施方式中，颅基板前体细胞表达SIX1、PAX6和TFAP2A。在一实施方式中，培养基包括N2培养基。在一实施方式中，培养基包括敲除血清替代培养基(knockout serum replacement medium)。在一实施方式中，接触之后至少48小时进行去除。
本发明提供一种通过以下产生人神经细胞(神经干细胞、神经元亚型、成熟神经元、神经谱系细胞)的方法：(i)获得干细胞(hESC、hiPSC、成体干细胞、癌症干细胞、人或哺乳动物多能或专能细胞)；和(ii)在阻断SMAD信号传导的条件下培养人干细胞。在优选的实施方式中，培养方法包括无饲养层***中的条件。在优选的实施方式中，干细胞在单层中培养。在优选的实施方式中，预计使用补充有化合物Noggin和/或Dorsomorphin和SB431542的培养基。
在一实施方式中，本发明提供一种试剂盒，其包括SMAD(Small Mothers AgainstDecapentaplegic)蛋白质信号传导第一抑制剂和SMAD(Small Mothers AgainstDecapentaplegic)蛋白质信号传导第二抑制剂。在一实施方式中，所述第一抑制剂选自二硫键连接的Noggin同型二聚体(SEQ ID NO:50)、Dorsomorphin、LDN-193189、其组合及其混合物。在一实施方式中，所述Noggin选自小鼠、人、大鼠和爪蟾(xenopus)。在一实施方式中，所述Noggin是(SEQ ID NO:50)。在一实施方式中，所述第二抑制剂抑制间变性淋巴瘤激酶信号传导通路。在一实施方式中，所述第二抑制剂抑制选自Lefty、Activin和TGFbeta的信号传导通路。在一实施方式中，所述第二抑制剂抑制激活素和Nodal二者的信号传导。在一实施方式中，所述第二抑制剂是4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)及其衍生物。在一实施方式中，所述试剂盒进一步包括人干细胞。在一实施方式中，试剂盒进一步包括说明书。
在一实施方式中，本发明提供一种组合物，其包括干细胞、SMAD(Small MothersAgainst Decapentaplegic)蛋白质信号传导第一抑制剂和SMAD(Small Mothers AgainstDecapentaplegic)蛋白质信号传导第二抑制剂。在一实施方式中，所述第一抑制剂选自二硫键连接的Noggin同型二聚体、Dorsomorphin、LDN-193189、其组合及其混合物。在一实施方式中，所述Noggin选自小鼠、人、大鼠和爪蟾(xenopus)。在一实施方式中，所述Noggin是(SEQ ID NO:50)。在一实施方式中，所述第二抑制剂通过阻断ALK4、ALK5和ALK7受体的磷酸化来抑制Lefty/Activin/TGFbeta通路。在一实施方式中，所述第二抑制剂抑制激活素/Nodal信号传导。在一实施方式中，所述第二抑制剂是4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)及其衍生物。在一实施方式中，所述干细胞选自人胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞和诱导的人多能干细胞(hiPSC)。
在一实施方式中，本发明提供一种诱导干细胞中分化的方法，其包括，a)提供：i)包括人干细胞的细胞培养物、ii)SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic)蛋白质信号传导第一抑制剂、iii)SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic)蛋白质信号传导第二抑制剂；和b)在干细胞中诱导分化成非默认(non-default)分化的细胞的条件下，使所述干细胞与所述SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic)蛋白质信号传导第一抑制剂和所述测试化合物接触。在一实施方式中，所述第一抑制剂选自二硫键连接的Noggin同型二聚体、Dorsomorphin、LDN-193189、其结合及其组合物。在一实施方式中，所述Noggin选自小鼠、人、大鼠和爪蟾。在一实施方式中，所述Noggin是(SEQ ID NO:50)。在一实施方式中，所述第二抑制剂是ALK4受体抑制剂。在一实施方式中，所述第二抑制剂是4-[4-(1,3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]苯甲酰胺(SB431542)及其衍生物。在一实施方式中，所述非默认分化的细胞是神经祖细胞。在一实施方式中，所述非默认分化的细胞是培养细胞种群的一部分。在一实施方式中，所述非默认分化的细胞是所述培养细胞种群的至少10％直至100％。在一实施方式中，在培养细胞种群中所述非默认分化的细胞表达配对框基因(paired box gene)6蛋白质。在一实施方式中，所述配对框基因6蛋白质在至少10％的所述培养细胞种群中表达。在一实施方式中，所述干细胞选自人胚胎干细胞(hESC)、人成体干细胞、诱导的人多能干细胞(hiPSC)。在一实施方式中，所述非默认分化的细胞是神经细胞。在一实施方式中，所述神经细胞选自多巴胺阳性神经元和底板细胞。
在一实施方式中，本发明提供一种组合物，其包括分离的人胚胎神经细胞。在一实施方式中，所述分离的人胚胎神经细胞来自人胚胎细胞。在一实施方式中，所述人胚胎神经细胞在体外培养。在一实施方式中，所述人胚胎神经细胞是贴壁细胞。在一实施方式中，所述组合物是进一步包括第二细胞类型的共培养物。
在一实施方式中，本发明提供一种筛选生物药剂的方法，其包括，a)提供：i)包括人胚胎干细胞(hESC)的细胞培养物和ii)测试化合物；和b)在诱导神经底板细胞的条件下使所述干细胞与所述测试化合物接触。在一实施方式中，所述测试化合物是音猬因子或其片段。在一实施方式中，所述人胚胎干细胞是菊形团阶段(rosette-stage)的神经细胞。
在一实施方式中，本发明提供一种提供分化细胞的方法，其包括，a)提供：i)人胚胎干细胞(hESC)的细胞培养物和ii)诱导分化的化合物；和b)在诱导神经底板细胞的条件下使所述干细胞与所述测试化合物接触。在一实施方式中，所述化合物是音猬因子蛋白质或其片段。在一实施方式中，所述诱导由以下组成：在与没有所述测试化合物的情况下培养的所述人胚胎干细胞中表现的特征相比较，增加选自以下的所述特征：扁平的细胞形态学、表达音猬因子、表达叉头框(forkhead box)蛋白A2(FOXA2)、表达Netrin-1和表达F-Spondin。在一实施方式中，所述诱导由以下组成：在与没有所述测试化合物的情况下培养的所述人胚胎干细胞中的特征相比较，降低选自以下的所述特征：菊形团结构、BF1表达、配对框同源异型基因-6(PAX6)表达、NK6同源框1(NKX6.1)、同源框蛋白质SIX6表达。在一实施方式中，该方法进一步提供和包括Noggin蛋白质和用于阻断选自激活素受体样激酶4(ALK4)、激活素受体样激酶5(ALK5)和激活素受体样激酶7(ALK7)受体的受体的磷酸化的药剂，以及在加入所述化合物之前，使所述人干细胞与所述noggin接触和使所述药剂与人干细胞接触。在一实施方式中，该方法进一步提供抗体，其中所述抗体是dickkopt同源物1(DKK-1)抗体，以及使所述干细胞与用于降低DKK-1蛋白质功能的所述抗体接触。在一实施方式中，该方法进一步包括提供和包括选自无翼型(wingless-type)MMTV整合位点家族、成员1(Wnt-1)和视黄酸(RA)的尾化因子(caudalizing factor)。在一实施方式中，该方法进一步提供和包括神经元诱导化合物和步骤c)加入用于诱导祖神经元(progenitor neuron)的所述神经元诱导化合物。在一实施方式中，所述多巴胺神经元表达选自corin、丝氨酸肽酶(CORIN)和肾母细胞瘤超量表达的基因(NOV)的标志物。在一实施方式中，所述祖神经元是表达选自LIM同源框转录因子1、beta(LMX1B)和神经原素(neurogenin)2(NGN2)的标志物的多巴胺神经元。在一实施方式中，该方法进一步提供和包括干细胞，以及步骤d)将所述人神经底板细胞与所述干细胞共培养，用于由所述干细胞产生神经突突起生长(neuriteoutgrowth)。
在一实施方式中，本发明提供通过本文所述方法产生的神经底板细胞。在一实施方式中，本发明提供通过本文所述方法产生的基板细胞。在一实施方式中，本发明提供通过本文所述方法产生的晶状体细胞。
本发明考虑用于评价衍生的神经细胞的神经身份(neural identity)的方法。该方法可以是通过形态学手段、功能评价和测量与某些谱系相关的蛋白质的表达或下调。在优选的方法中，利用运动神经元的多巴胺能活性或功能测定。
本发明可以用于将作用剂(agent)或神经细胞以有效诊断、预防、治疗疾病、紊乱的量递送至大脑，或者用于患有神经损伤形式中风的患者。这些细胞共同朝向神经结局。
在一实施方式中，本发明考虑一种组合物，其包括分离的人胚胎底板细胞。在一实施方式中，分离的人胚胎底板细胞源自人胚胎细胞。在一实施方式中，人胚胎底板细胞是体外培养的。在一实施方式中，人胚胎底板细胞是贴壁细胞。在一实施方式中，组合物是进一步包括第二细胞类型的共培养物。
在一实施方式中，本发明考虑一种筛选生物药剂的方法，其包括，a)提供：i)包括人胚胎干细胞(hESC)的细胞培养物和ii)测试化合物，和b)在诱导神经底板细胞的条件下使所述干细胞与所述测试化合物接触。在一实施方式中，测试化合物是音猬因子或其片段。在一实施方式中，人胚胎干细胞是菊形团阶段的神经细胞。
在一实施方式中，本发明考虑一种提供分化细胞的方法，其包括，a)提供：i)人胚胎干细胞(hESC)的细胞培养物和ii)用于诱导分化的化合物，和b)在诱导神经底板细胞的条件下使所述干细胞与所述测试化合物接触。在一实施方式中，化合物是音猬因子蛋白质或其片段。在一实施方式中，诱导由以下组成：在与没有所述测试化合物的情况下培养的所述人胚胎干细胞中表达的特征相比较，增加选自以下的所述特征：扁平的细胞形态学、表达音猬因子、表达叉头框蛋白A2(FOXA2)、表达Netrin-1和表达F-Spondin。在一实施方式中，所述诱导由以下组成：在与没有所述测试化合物的情况下培养的所述人胚胎干细胞中的特征相比较，降低选自以下的所述特征：菊形团结构、BF1表达、配对框同源异型基因-6(PAX6)表达、NK6同源框1(NKX6.1)、同源框蛋白质SIX6表达。在一实施方式中，该方法进一步提供Noggin蛋白质和用于阻断选自激活素受体样激酶4(ALK4)、激活素受体样激酶5(ALK5)和激活素受体样激酶7(ALK7)受体的受体的磷酸化的药剂，以及在加入所述化合物之前，使所述人干细胞与所述noggin接触和使所述药剂与人干细胞接触。在一实施方式中，该方法进一步提供抗体，其中所述抗体是dickkopt同源物1(DKK-1)抗体，以及使所述干细胞与用于降低DKK-1蛋白质功能的所述抗体接触。在一实施方式中，该方法进一步包括提供选自无翼型MMTV整合位点家族、成员1(Wnt-1)和视黄酸(RA)的尾化因子。在一实施方式中，该方法进一步包括，提供神经元诱导化合物，和步骤c)加入用于诱导祖神经元的所述神经元诱导化合物。在一实施方式中，多巴胺神经元表达选自corin、丝氨酸肽酶(CORIN)和肾母细胞瘤超量表达基因(NOV)的标志物。在一实施方式中，祖神经元是表达选自LIM同源框转录因子1、beta(LMX1B)和神经原素2(NGN2)的标志物的多巴胺神经元。在一实施方式中，该方法进一步包括，提供干细胞，以及步骤d)将所述人神经底板细胞与所述干细胞共培养，用于由所述干细胞产生神经突突起生长。
附图说明
图1显示了在7天内在贴壁培养中允许高度有效的无饲养层神经诱导的示例性双SMAD抑制。(a)结合ALK抑制剂SB431542和BMP抑制剂Noggin实现用于实现神经诱导的分化方案。(b)双SMAD抑制将神经分化(PAX6表达，绿色)大大提高至大于80％。当使用单一因子时，观察到的神经分化很罕见(<10％PAX6+细胞)。(c)早期胚层标志物CDX2、SOX1、SOX17和Brachyury的实时PCR。(d)OCT4(红色)和PAX6(绿色)表达的免疫荧光表明到第7天发生迅速的神经化。(e)双SMAD抑制过程中PAX6、OTX2、FGF5、OCT4的实时PCR显示了在第5天的上胚层干细胞(epistem cell)中间体。(f)朝向神经外胚层的双SMAD抑制分化过程中神经和神经元标志物的实时PCR。(g)使用BAC报道基因系(HES5-GFP)对使用MS5基质细胞(用Noggin)或双SMAD抑制(SB431542和Noggin)的方法的神经诱导百分比进行定量。误差条表示S.E.M.，p-值使用Student’s T-检验确定。缩写：N，Noggin；SB，SB431542；KSR，敲除血清置换培养基；N2，N2培养基。比例尺：(b)–200μm；(d)–50μm。
图2显示了SMAD4的示例性核定位，其在当hESC细胞用Noggin和SB43152处理24小时后消除。一部分SMAD4再分布至细胞核周围定位，导致明确的细胞质到细胞核的边界较少。
图3显示了所提出的促成Noggin和SB431542作用的机制的示例性模型。这些包括，但不限于，使TGF/激活素-和Nanog-介导的多能性网络去稳定化、通过抑制内源性激活素和Nodal信号来抑制中内胚层结局和/或通过BMP抑制促进原始外胚层的神经化。(a)在高密度下，在分化19d内，主要形成作为PAX6+的CNS细胞，其能够产生R-NS细胞以及运动神经元和多巴胺能神经元的可图式化(patternable)神经元种群。(b)在低密度下，观察到具有(a)中所述特性的CNS结局和神经嵴结局二者。神经嵴谱系包括可修整成图式化和亚型特化响应的黑素细胞和神经嵴前体细胞。除细胞密度以外，可能还有进一步信号传导通路包括BMP路径的操纵可以使CNS相对于神经嵴结局的该比例偏斜。实线箭头指示表现的细胞结局潜力；虚线箭头指示基于目前的文献提出的细胞结局。
图4显示了示例性nanog实时基因表达。对用敲除血清(KSR)、KSR中的Noggin(N)、SB431542(SB)或者Noggin和SB431542(N+SM)处理过的hESC考察Nanog表达。加入SB431542观察到最显著的减量调节。误差条表示S.E.M.。
图5显示了示例性的HES5-GFP BAC报道基因hESC系的GFP表达。在两种用于神经诱导的条件下观察GFP(在分化第13天，MS5上的Noggin或者Noggin与SB431542)。
图6显示了MS5饲养细胞上的示例性内皮糖蛋白(CD105)表达。与使用结合SMAD抑制在第13天分化的hESC相比较，基于FACS分析，用于分化hESC的MS5细胞对于内皮糖蛋白(CD105)表达一致为阳性。内皮糖蛋白表达用于将MS5细胞与HES5-BAC hESC区分并去除。
图7显示了通过双SMAD抑制的示例性hESC的神经化，其允许具有多巴胺能和运动神经元潜力的菊形团前神经干细胞。PAX6阳性神经阻滞(绿色)表达菊形团标志物(红色)(a)Nestin、(b)PLZF、(c)ZO1。(d)当PAX6+组织传代至促进菊形团(BASF)的条件时，形成菊形团，其通过动力间(interkinetic)胞核迁移的证据——KI67(绿色)和内腔磷酸化组蛋白H3(红色)表达而确认。在不存在带来区域神经元特异性的因素的情况下，PAX6+神经组织(绿色)表达(e)OTX2和(f)BF1，表明前脑特化的组织默认性(defaults)。基于(g)AP2、(h)HNK1、(i)PAX7和(j)p75表达(红色)，神经嵴可以在PAX6阳性组织的周围上识别(绿色)。一经传代，神经嵴细胞产生(l)表达HMB45(绿色)的(k)色素细胞，表明有黑素体合成。(m)在第5-9天加入super sonic，之后在第9-12天加入脑源性神经营养因子(BDNF)、抗坏血酸、音猬因子和FGF8，引发多巴胺能神经元图式化。在第12-19天用BDNF、抗坏血酸、GDNF、TGFb3和cAMP使多巴胺能细胞成熟。在第5天加入BDNF、抗坏血酸、音猬因子和视黄酸，引发运动神经元图式化。细胞在第11天传代。(n-p)在没有传代的情况下，到第19天可以观察到酪氨酸羟化酶(TH)阳性细胞。(p)当在第12天全体传代时，观察到来自TH阳性细胞更多的成熟过程。对于运动神经元诱导，在由hESC分化的全部19天内，观察到运动神经元标志物(q)ISL1和(r)HB9的核表达。标尺：(a、b、c、e、f、g、h、i、j、o、p、q和r–100μm；(c、d)–50μm；(k、l、n)–200μm。
图8显示了影响PNS相对于CNS细胞产生的示例性平板接种密度。初始hESC平板接种密度决定了分化第11天存在的神经嵴(HNK1，p75；红色)与神经组织(PAX6；绿色)的比例，密度较高有利于神经分化。
图9显示示例性诱导的多能干细胞(IPS)，其使用双SMAD抑制分化成神经组织，并可图式化成多巴胺能神经元和运动神经元。(a-i，ii)产生两种IPS克隆(IPSC14，IPSC27)，并筛选OCT4(红色)以及其他的多能性因子(Tra-1-81、Tra-1-60、SSEA-4和Nanog)。(b-i，ii)通过双SMAD抑制使两种克隆神经化(PAX6表达，绿色)，通过HNK1染色可以观察到神经嵴(c-i、ii)。来自IPS克隆的神经组织可以基于KI-67(红色)和磷酸化组蛋白H3(绿色)表达诱导形成菊形团-NSC(d-i，ii)，基于HB9表达(绿色)诱导形成运动神经元(e-i，ii)，以及基于TUJ1(绿色)和TH(红色)共表达诱导形成多巴胺能神经元(f-i，ii)。标尺：200μm–(a)；50μm–(b，c，d，e，f)。
图10显示了神经诱导的前5天过程中的示例性组合SMAD抑制。当在第5天取消培养基中补充的SB431542和Noggin时，在第11天观察到同源性PAX6表达。
图11显示了示例性的使用改良的N-SB方案衍生Six1+基板前体。
A)定时noggin撤销范例的示意图，以确定基板细胞特化中内源性BMP信号传导的时间要求。
B)将(A)中所述的改良的N-SB方案与分化自始至终保持N-SB处理(SBN条件)相比较，基板标志物(Dlx3、Eya1和Six1)的相对诱导。当细胞用noggin处理48小时时，观察到最佳的Dlx3、Eya1和Six1共表达。数据表示在第11天通过qRT-PCR测量的mRNA表达的倍数变化。
C)显示分化第11天Six1(基板标志物)和Pax6(前神经外胚层标志物)表达的免疫细胞化学分析。用改良的N-SB方案处理的细胞(分化后2天取消noggin)显示出高百分含量的Six1+细胞。
D)与标准(前神经外胚层诱导)11天noggin处理相比较，大约百分之七十使用改良的N-SB条件(2天noggin)产生的细胞是Six1+。
图12显示了人ES细胞衍生的基板特化过程中的示例性时间性全基因表达谱。A-D)进行改良的(基板诱导)相对于标准(前神经外胚层诱导)N-SB方案的hESC子代中最分化表达的基因的分化第5天、第7天、第9天和第11天的成对比较。E)微阵列数据的非监督式(Unsupervised)聚类根据重复、时间性取样和处理条件分离数据。F)数据的主成分分析证实，人ES细胞分化过程中的样品与分化后期改良的与标准N-SB处理的细胞的分离增加具有密切的时间相关性。
图13显示了源自hESC基板的感觉神经元的示例性衍生。A-C)分化第20天的免疫细胞化学分析说明，基板前体细胞有效地产生最初保持Six1表达的神经元。D，E)通过源自Six1+簇集物的大多数神经元中Brn3A和Isl1的表达，确认感觉神经元身份。F)在第40天，分化神经元表现出外周蛋白的表达增加，并且成熟周围神经元结局特征性的Tuj1染色水平降低。G)源自hESC的基板细胞的感觉神经元特化过程中标志物表达的示意图。
图14显示了源自hESC的基板前体的示例性展望性分离。A)在分化第11天，源自hESC的细胞分离成互相排斥的p75+和Forse1+前体细胞区域。B)在分化第11天p75和HNK1表达的FACS分析。C)细胞基于p75和HNK1的表达分离之后Six1mRNA表达的qRT-PCR数据。与其他组相比较，对于p75呈单阳性但对于HNK1呈阴性的细胞(展望性基板前体)表现出Six1mRNA表达的显著增加。D)与标准(前神经外胚层诱导型)N-SB诱导条件相比较，当前体在改良的条件下衍生时(基板诱导型)，观察到对p75呈阳性、且对HNK1呈阴性的细胞的部分增加。
图15显示了示例性的高SHH水平、增加的FOXA2和降低的BF1表达。(A)第1次传代，神经分化的第21天没有显示出在第15天加入时SHH处理的作用。结果在右图加以定量，*p<0.01N＝3。标尺，200um。(B)神经分化第21天，显示在第9天进行Sonic C25II处理之后菊形团状结构减少。菊形团减少在右图加以定量，*p<0.01N＝4。标尺，100um。(C)Sonic C25II处理导致在第21天BF1降低，Foxa2增加。在右图加以定量，*p<0.05N＝4。标尺，200um。(D)第21天神经分化显示ZO1/BF1+菊形团结构的降低。该降低加以定量，*p<0.01N＝4。标尺，50um。(E)Sonic C25II处理之后在第21天PAX6表达降低。该降低加以定量，*p<0.01N＝4。标尺，200um。(F)对Sonic和Sonic C25II对于FOXA2诱导的效力加以比较的剂量反应曲线。(E)对诱导FP标志物(FOXA2和Netrin-1)和另一SHH反应型基因NKX6.1加以比较的Sonic C25II剂量反应曲线。
图16显示了具有早期短的时间性图式化窗口(window)的示例性底板诱导。(A)显示神经诱导方案过程中加入Sonic C25II的不同时间点的示意图。(B-C)左边的标题说明加入Sonic C25II的那一天，顶部的标题说明何时停止测定。加入Sonic C25II越早，细胞暴露于其的时间越长，导致FOXA2的百分比非常高。(C)对该结果进行定量，*p<0.01，N＝3。标尺，200um，高倍放大，50um。(D)用Sonic C25II进行延长处理(暴露9天)不产生FOXA2诱导的增加。(E)其余研究要使用的FOXA2诱导最优方案的示意图。
图17显示了示例性的有功能的源自hESC的FP。(A)显示何时收集条件培养基的示意图。(B)ELISA，其显示当早期向神经诱导中加入Sonic C25II时在第9天和第11天分泌至培养基中的Netrin-1的水平的增加，*p<0.01N＝3。(C)收集来自NSB和NSB+Sonic C25II的条件培养基，并将其置于含有源自NSB的神经前体细胞的培养基上，qRT-PCR显示腹侧基因(NKX6.1和NKX2.1)以及SHH反应性基因(GLI2)的诱导。这些诱导在SHH拮抗剂环巴胺的存在下受到抑制。(C’)使用GFP表达系，NKX6.1的诱导在蛋白质水平上表现。与NSB CM相比较，*p<0.01，与FP CM相比较，#p<0.05，N＝3。标尺，200um(D和E)自与NSB+Sonic C25II组织共培养的E8.5神经外胚层分离的神经外植体表现出异位FOXA2染色。小图显示M6(绿色)和FOXA2(红色)的共定位。(E)对该结果进行定量，*p<0.001N＝4外植体。标尺，50um。
图18显示了揭示与FP发育有关的新的基因的示例性转录分析。(A-J)qRT-PCR数据，其显示11天方案长度上的表达时间进程。基因着眼于表现的不同种群，其包括FP标志物(A-D)、SHH反应性基因(E-G)、神经标志物(H)、AN标志物(I和J)以及与中胚层和内胚层定型有关的基因(K和L)。(M-R)详细的时间进程微阵列分析(M-N)第7天(M)和第11天(N)的GO语义，其显示于NSB对照相比较的增加或降低。FP条件显示出与轴突导向相关的基因和分泌的蛋白质的富集，同时显示与前神经外胚层发育有关的基因的降低。(O-R)成对比较，其显示在第3天(D)、第5天(P)、第7天(Q)和第11天(R)与NSB对照条件相比较的基因增量和减量调节。
图19显示了示例性的FP诱导的DKK-1抑制。(A)对照NSB条件下随着时间的DKK-1表达的qPCR。(B)ELISA，其测量第5天、第7天和第11天培养基中的DKK-1蛋白质水平，表明在Sonic C25II处理之后Dkk-1水平降低，*p<0.05N＝3。(C)NSB+Sonic C25II条件下随着时间的DKK-1表达的qPCR。(D和E)BF1(D)和FOXA2(E)的qPCR，其显示在加入DKK-1之后，BF1增加，FOXA2降低，当加入DKK-1抗体时，FOXA2增加。(F)FOXA2的免疫染色，说明当加入DKK-1时，FOXA2+细胞降低。标尺，200um。(G)BF1表达的qPCR，说明DKK-1抗体处理导致在早期时间点(第3天至第5天)表达降低。(H和I)早期加入DKK-1抗体导致FOXA2表达增加，但当在较晚的时间点加入时没有影响。(I)免疫细胞化学数据说明，在分化第5天(或更晚)开始的Dkk-1处理不会提高SHH-介导的FOXA2表达。
(J-K”)用对照物或BF1shRNA(J和K)转导的hESC，GFP是转导标志物(A'和B')。当分化成神经组织时，与对照(J”和K”)相比较，在蛋白质水平上观察到BF1的降低。标尺，A和B，100um，J”和K”，200um。(L)第11天的qRT-PCR分析显示，与对照相比较，在BF1shRNA系中FP标志物(FOXA2、SHH、Netrin-1和F-Spondin)增加，p<0.01N＝3。(M)BF1shRNA导致在蛋白质水平上观察到FOXA2的增量调节。标尺，200um。
图20显示，示例性的源自hESC的FP沿着A/P轴移动。(A)免疫染色显示响应于FGF8、Wnt-1和视黄酸的FOXA2增加。标尺，200um。(B)qPCR显示，例如FGF8、Wnt-1和视黄酸(RA)的尾化剂导致与NSB+Sonic C25II相比较，FOXA2增加，SIX6降低。(C)一组中脑FP标志物(CORIN和NOV)和中脑DA祖先标志物(LMX1B、NGN2和EN1)组的qPCR。具体地，Wnt-1处理导致中脑FP标志物和中脑DA先祖标志物二者的增量调节。(D)将FP细胞用Shh增强子转染，其驱动表达至前腹轴(SBE2)或中脑腹轴(SBE1)。默认FP表现出SBE2活性，表明前部定位。这在加入Wnt1和FGF8时消除，并且现观察到SBE1活性，说明从前部身份转换至中脑。标尺，200um。(E)hESC分化过程中FP与AN特化的示意图。当暴露于Noggin和SB431542时，引发神经分化。分化第1天开始的SHH暴露诱导FP分化，并经由DKK-1和BF1的抑制来抑制AN特化。默认情况下产生的FP细胞的区域身份是前部，但在例如Wnt-1、FGFF8或RA的尾化剂的存在下，诱导后部的FP组织。
图21显示了表达适当标志物的示例性源自hESC的FP。(A)第11天的qRT-PCR数据显示，相对于对照NSB条件，底板标志物FOXA2、SHH、Netrin-1和F-Spondin增加。(B)对免疫染色实验结果进行定量的表格。(C-F)FOXA2+细胞的免疫染色显示用若干标志物例如(C)Nestin、(D)SOX2、(E)Nkx2.2和(F)Tuj1共标记。标尺，(D和F，50um)(E和G，100um)。(G-H)第11天的qRT-PCR数据，显示用NSB+Sonic C25II处理分化的FOXA2和SOX17细胞以及朝向内胚层谱系分化的细胞的水平。SOX17在Sonic C25II条件下不表达，但是在内胚层中高度表达。这一点通过免疫染色(H)在蛋白质水平上得以显示。标尺，200um。
图22显示诱导神经突增生的FP细胞上小脑板外植体的示例性共培养。将来自E8.5小鼠的小脑板外植体接种在NSB神经细胞或NSB+Sonic(FP)细胞上。3天之后，与对照相比较，在NSB+Sonic(FP)条件下观察到显著的神经突增生。
图23显示了验证微阵列中基因变化的示例性qPCR。(A)FP基因的qPCR，显示与NSB对照相比较，在Sonic C25II条件下有富集。(B-D)qPCR，验证与NSB对照条件相比较在SonicC25II条件下发生变化的新的基因。
图24显示了抑制FP诱导的示例性BF1表达。(A)神经分化过程中在两点处的qRT-PCR，显示与对照相比较，在BF shRNA hESC系中BF1水平降低，*p<0.01N＝3。(B)细胞周期分析显示，两种谱系的细胞周期动力学没有差异。(C)通过GFP可视化的表达BF1的hESC。标尺，20um。(D)超量表达BF的细胞缺乏FOXA2+表达。标尺，200um。(E)第11天的qRT-PCR数据，显示Sonic C25II处理之后表达BF1的hESC中缺乏FP诱导。
图25显示了伴着FP分化示例性早期加入WNT1，其可以导致DA神经元分化。(A)早期加入WNTs或GSK3β-抑制剂(BIO 100nM)可以增加FOXA2表达。(B)向后期神经菊形团细胞中加入WNT1对FOXA2诱导没有影响，标尺200um。(C)WNT1处理过的FP培养物可以增加表达FOXA2的DA神经元，标尺50um。
图26显示示意性的格雷氏解剖学(Gray's Anatomy)。板A：一系列穿过犬胚胎的横截面，前面至后面，I–V。截面I是最前面。在V中，神经板几乎扁平地展开。格雷氏解剖学，Henry Gray著。
图27显示了涉及各种人ESC和iPSC谱系的方案的基板诱导、表征和验证的示例性数据。误差条表示SEM。(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001，与对照N-SB条件相比较(n＝3独立实验)。标尺对应于50μm。
A)人神经板阶段胚胎背视图的示意图(基于(O'Rahilly,1987))。在模式生物中的结局研究已经在头外胚层中识别出一种独特的马蹄铁状区位，其含有所有基板前体，称作基板前区域(PPR；在此以红色标记)。神经外胚层形成神经板(标记为浅蓝色)。神经板的最侧方形成神经褶(标记为粉色)，其产生未来的神经嵴细胞。
B)根据形态学BMP4处理诱导滋养外胚层样谱系。
C)BMP4处理或SB+BMP4处理之后第11天的CDX2表达。数据表示与N-SB条件相比较通过qRT-PCR的mRNA表达的倍数变化。
D)分化第11天的SIX1(红色)和PAX6(绿色)表达。
E)N-SB和PIP条件下DACH1(红色)表达的免疫细胞化学。
F)使用SOX10::GFP hESC报道基因谱系PIP第11天SOX10表达的流式分析。
G，H)基板诱导方案(PIP)跨多种hESC(H9、I6和Hs293)和hiPSC谱系(C14、M3X和C27)是坚固的。对于每个谱系，在(G)中显示了代表性的SIX1/PAX6免疫细胞化学图片，具有放大倍数更高的小图，在(H)中，对PIP条件下SIX1+细胞的百分含量进行定量。
I)测定EYA1::GFP增强子在哺乳动物***中的特异性的实验设计图。分离来自E11.5小鼠胚胎的主要培养物嗅觉(OLF)区域和中脑(MB)区域，并用基板特异性EYA1::GFP增强子核感染(nucleofected)。
J)仅有初级嗅觉培养物(OLF)显示出EYA1增强子的激活，而中脑初级培养物没有显示出GFP表达。
K)在PIP和N-SB条件下通过FACS分析对GFP表达进行定量。
图28显示了使用改良的双SMAD抑制方案衍生Six1+基板前体的示例性数据。误差条表示SD。(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001，与N-SB条件相比较(n＝3独立实验)。
A)定时Noggin撤销范例的示意图，以确定基板特化过程中内源性BMP信号传导的时间性要求。方案基于对用于CNS诱导开发的Noggin+SB431542(NSB)方案(Chambers等人,2009)加以修改。
B)将改良的NSB方案(取消Noggin的不同时间点)与分化自始至终保持N-SB处理(NSB条件)相比较，基板标志物的相对诱导。数据表示第11天通过qRT-PCR测量的mRNA表达的倍数变化。
C)分化第11天SIX1和PAX6表达的免疫细胞化学分析。小图显示共焦截面(confocal section)，以说明簇集物内的SIX1表达。标尺对应于50μm。
D)在改良的N-SB(SB3＝基板诱导(PIP)方案)与N-SB条件下对产生的Six1+细胞的百分含量进行定量。
E)基板簇集物中基板标志物EYA1、DACH1和FOXG1的免疫细胞化学分析。小图显示各个标志物放大倍数更高的图像。标尺对应于50μm。F-H)PIP与N-SB方案中基因表达的时间性分析。将数值归一化至未分化的hESC中观察到的表达。
F)多能性(NANOG、OCT4/POU5F1)和滋养外胚层(TE)标志物表达的丧失；
G)中胚层标志物T表达的缺乏；H)通过监测多能性标志物(NANOG、OCT4)、滋养外胚层(CDX2)、中胚层(T)、内胚层(SOX17)和基板标志物(DLX3、SIX1、FOXG1)的时间进程表达，非神经结局和基板结局的诱导。
图29显示了基板(PIP条件)与CNS(NSB条件)结局的时间性基因表达分析的示例性数据：
A)数据主成分分析确认，hESC分化过程中样品与分化后期用PIP与N-SB处理过的细胞的分离增加有密切的时间性相关性。
B)通过qRT-PCR确认微阵列数据。
C)在PIP方案第7天增量调节的基因的基因本体论分析。
D)在PIP中在第5天、第7天和第9天增量调节的基因比较的维恩图。
E)在PIP中在第7天、第9天和第11天增量调节的基因比较的维恩图。
图30显示了源自hESC的基板特化过程中时间性全基因表达图谱的示例性数据。
A)PIP与N-SB方案过程中差异性调节的基因的聚簇。B-E)在第5天、第7天、第9天和第11天PIP与N-SB方案中倍数变化最多的20个显著增量调节(红色)和减量调节(蓝色)的基因。
F-G)在PIP条件下(第11天)在蛋白质水平上确认ISL1和TFAP2A表达。
H)通过免疫细胞化学确认OVOL2表达(第11天)。
I)PIP、N-SB和神经嵴(NC)方案过程中OVOL2基因表达的时间进程分析。F、G和H中的标尺对应于50μm。
图31显示了在人基板诱导过程中调节FGF信号传导和BMP和WNT信号传导作用时表皮与基板结局诱导的示例性数据：误差条表示SEM。(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001(n＝3独立实验)。
A)用于早期角化细胞诱导的分化条件的示意性总结。
B)在第42天角化细胞斑块共表达E-CADHERIN(绿色)和KRT14(红色)。
C)在第42天，斑块中央表达KI67，而到第60天KI67阳性细胞消失。KRT14阳性细胞对于KI67呈阴性。误差条对应于50μm。
D)在PIP第3天开始用WNT信号传导的药理学抑制剂(XAV939)和激活剂(CHIR99021)处理之后在第11天SIX1和SOX10表达的分析。
E)在PIP第3天开始用BMP信号传导的抑制剂(Noggin)和激活剂(BMP4)处理之后在第11天CDX2和SIX1表达的分析。
图32显示了其中FGF信号传导决定基板与非神经外胚层/表皮结局的示例性数据。误差条表示SD。误差条表示SD。(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001，与对照PIP条件比较(n＝3独立实验)。C和G中的标尺对应于50μm。
A-B)PIP条件下TFAP2A和SIX1诱导的时间进程。
C)TFAP2A(绿色)在基板和表面外胚层中表达，而SIX1(红色)仅仅在基板细胞中表达。经由内源性FGF信号传导的药理学抑制阻断PIP，阻断SIX1+细胞的形成。
D)用FGF抑制剂SU5402处理之后SIX1基因表达丧失的定量。
E)早期表皮标志物KRT8的表达。数据表示在第11天与PIP条件相比较通过qRT-PCRmRNA表达的倍数变化。
F)角化细胞分化过程中晚期表皮标志物KRT14的表达。数据表示与hESC相比较在第11天和第42天通过qRT-PCR mRNA表达的倍数变化。
G)长期SU5402处理的培养物正在表达KRT 14蛋白质，表明表皮/角化细胞结局。
图33显示了跨多种人ESC和iPSC谱系的源自基板的三叉神经感觉神经元的示例性表征数据：误差条表示SEM(n＝3独立实验)。
A)分化第20天的免疫细胞化学分析显示，SIX1+基板簇集物有效地产生大量最初保持SIX1表达的TUJ1阳性神经元。
B)在第42天，分化的神经元表达外周蛋白(绿色)。
C-E)C)RUNX1、D)RET1、E)TRK受体的三叉神经神经元mRNA表达的短期(第23天)和长期(第55天)培养物，数据表示mRNA表达的倍数变化(FC)，均一化至hESC。
F)TRKA的三叉神经神经元染色(活染色)。
G)三叉神经感觉神经元的分化方案的示意图。聚簇在第13-17天人工传代。
H)三叉神经型感觉神经元可以由不同的hESC(I6)和hiPSC(C27、M3X、J1-5)系在相同的PIP条件下高效率获得。
图34显示了源自hESC的三叉神经型感觉神经元的衍生、表征和移植。所有标尺均对应于50μm。
A)在前基板细胞的发育过程中衍生的各种基板的示意图，上述前基板细胞包括产生激素的细胞(垂体基板)、结构细胞例如晶状体纤维(晶状体基板)和感觉神经元(三叉神经基板)。在PIP条件下三叉神经基板结局(以橙色强调)似乎是默认值。
B)在第11天在基板阶段，三叉神经基板标志物PAX3在SIX1+基板簇集物中表达。
C)默认基板簇集物迅速产生表达感觉神经元标志物例如ISL1和HNK1的细胞。
D)分化第20天的免疫细胞化学分析显示，SIX1+基板簇集物有效地产生大量最初保持SIX1表达的TUJ1阳性神经元。
E)感觉神经元身份通过大多数源自SIX1+簇集物的神经元中的BRN3A表达加以进一步确认。
F)在分化第42天，神经元显示出外周蛋白表达增加，TUJ1染色水平降低，说明采取更加成熟的周围神经元结局。
G)谷氨酸的三叉神经神经元染色。
H)表达RUNX因子，
I)TRK受体，
J、K)负责热(TRPV1)和冷(TRPM8)的感觉以及负责炎性痛(P2X3；n＝3独立实验)的三叉神经神经元中的伤害感受器特异性通道和受体。
L、M)分化第53天源自hESC的三叉神经型神经元中的单细胞膜片箝电生理学分析的例子。
N)刺激强度从-125pA开始，以25pA增加，直至观察到单个动作电位。显示的步骤对应于25pA增量。
O)电生理学定量参数的总结显示双极型和三极型神经元二者的可比较的图式。
P-S)移植到鸡胚胎中的三叉神经原基中。P)GFP标记的细胞和移植之后2天的移植物形态。
Q)低倍图像显示GFP+纤维束：GFP(绿色)和DAPI(蓝色)。小图，中脑水平的截面显示，GFP+纤维束邻近于三叉神经原基。
R)人纤维束表达人细胞质标志物(绿色)和感觉神经元标志物外周蛋白(红色)。
S)GFP+/PERIPHERIN+细胞体在体内以神经节样聚簇排列。
图35显示了源自hESC的三叉神经神经元前体的体内性质评价范例的示例性数据：
A)在分化过程中(第30天)源自hESC的三叉神经神经元在体外形成束，如白色圆圈所示。
B)鸡和小鼠移植实验的示意图。
C)鸡胚胎实验的移植时间和收集时间。
D)移植在鸡的神经板区处部分中的阴性染色对照。
E-H)将三叉神经神经元前体移植到成年小鼠脑桥中，以测试移植的源自hESC的三叉神经神经元轴突树(axonal arbors)到达三叉神经核中目标的能力。E)移植1个月后脑桥核(Pn)内移植的GFP(绿色)标记的人三叉神经神经元的定位和形态。F)朝向三叉神经核Aqueduct(Aq)行进的人GFP神经元突起。G)移植的细胞中BRN3A(红色)、GFP(绿色)和DAPI(蓝色)共表达的免疫组织化学。H)人神经元纤维束共表达hNCAM和GFP。
图36显示了假定的前基板的识别和朝向人晶状体基板谱系的定向分化的示例性数据。(G)中的标尺对应于50μm。误差条表示SD。(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001，与对照PIP条件比较(n＝3独立实验)。
A)分化第3天TFAP2A和PAX6的免疫细胞化学分析。B)PIP分化的第5、7、9和11天的时间进程分析显示了分化第7天和第9天TFAP2A和PAX6的共表达。
C)N-SB分化第5、7、9和11天的时间进程分析显示，在CNS神经外胚层细胞中缺乏TFAP2A表达，但显示有PAX6表达。A-C中的标尺对应于25μm。
D)PIP与NSB方案过程中PAX3基因表达的时间性分析。
E)PIP过程中用FGF(FGF8、SU5402)和WNT信号传导(CHIR99021、XAV939)激活剂或抑制剂处理(第7-11天)之后的PAX3表达水平。F)使用与(E)中相同的处理的PAX6表达水平。
F)四种信号传导通路筛选结果(在PIP第7-11天加入的BMP、FGF、WNT和SHH信号传导的调节剂)。当用BMP信号传导激活剂(BMP4)或FGF信号传导抑制剂(SU5402)处理时，通过qRT-PCR观察到晶状体基板标志物PITX3的诱导。
G)改良的基板培养物在分化第57天分化成具有成熟晶状体纤维形态的Crystalline+细胞。
图37显示了前基板细胞在用BMP处理时可以进一步分化成晶状体基板的示例性数据。标尺对应于50μm。
A)在PIP条件下TFAP2A、PAX6和SIX1共表达标记短暂的假定基板前阶段。PIP条件下分化第7天SIX1(红色)、TFAP2A(蓝色)和PAX6(绿色)的免疫细胞化学分析。标尺对应于50μm。
B)用于早期晶状体诱导的分化条件的示意图。
图38显示了产生激素的垂体基板衍生物的特化和功能性表征的示例性数据。标尺为：在(C、P)中，100μm，在(D、H、I、J、Q、R、S)中，50μm，在(K)中，10μm。误差条表示SEM，(*)P<0.05；(**)P<0.01；(***)P<0.001，在(B)中与对照PIP条件相比较，在(E，F，G；n＝3独立实验)中与hESC相比较，在(L)中与没有细胞的HBSS相比较，在(N，O；n＝3，n＝5动物)中与来自仅注射基质胶(Sham)的动物的血浆样品相比较。
A)在体内正常垂体谱系发育的示意图(Tabar,2011)。使用我们的改良PIP产生的产生激素的细胞的例子以黑体列出(ACTH、GH、FSH)。
B)如qRT-PCR所评价，从PIP分化第7-11天用SHH处理诱导PITX1和SIX6表达。PITX1和SIX6标记垂体原基。低SHH：20ng/ml C25II SHH；高SHH：100ng/ml C25II SHH+1μMpurmorphamine。
C)免疫细胞化学分析显示，在SHH处理的存在下，在簇集物子集中显示出蛋白质水平的SIX6表达。
D)(SHH处理时)在第16天LHX3表达的免疫细胞化学分析。
E-G)明确的内分泌前体谱系的诱导：E)到第20天TBX19表达被高度诱导。F)在分化第20天和第32天的PIT1表达(处理范例参见图S7A)。G)分化第20天和第32天的GATA2表达。
H-L)激素产生的免疫细胞化学证据。H)在SHH处理的PIP培养物中到第16天很容易检测到CGA表达。I)FSH到第27天得以表达。
J)到分化第30天ACTH表达在SHH处理的PIP培养物中丰度最高。
K)分化第30天的GH表达。
L)在HBSS中暴露10min后体外激素产生的ELISA测量。
M)裸大鼠宿主中移植范例的示意图。
N)移植后第4和6周移植的成年裸大鼠和假移植的对照中的ACTH血浆水平。
O)使用人特异性ELISA的GH血浆水平(移植后6周)。P-R)移植6周后的组织学分析：P)hNCAM+人细胞的强壮存活。在体内表达Q)ACTH和R)GH的细胞。
图39显示了体内移植研究中产生垂体前叶基板和产生激素的细胞的方案的示例性数据。
A)用于早期垂体诱导的分化条件示意图。
B，C)在NOD-SCID小鼠中皮下注射源自hESC的GFP+早期垂体细胞时的短期体内分析。
D)小鼠移植物中GSU(CGA)和GFP标记的细胞的共表达。
E)小鼠移植物中FSU和GFP标记的细胞的共表达。
图40说明了提出的自hPSC衍生人基板的模型的示例性数据。基板诱导依赖于使用dSMADi方案对BMP信号传导进行去抑制(de-repression)。连续的BMP抑制诱导CNS结局，BMP的去抑制结合SU5402抑制FGF信号传导而触发表皮结局。通过在分化第7天调节FGF、BMP或SHH信号传导，前基板细胞可以进一步朝向特定的基板结局图式化，产生功能性晶状体、三叉神经神经元和垂体前叶衍生物。
图41A-E显示：(A-C)描绘用来产生SIX1::H2B-GFP报道基因细胞系的方案的示意图；和(D-E)表达SIX1::H2B-GFP报道基因构建物的基板细胞。
图42A-B显示了(A)用于在E8/E6细胞培养基中培养细胞的PIP方案，其中培养基在培养第0-11天补充有SMAD抑制剂SB431542，第0-2天补充有SMAD抑制剂LD193189。(B)显示了使用PIP方案和E8/E6培养基诱导的细胞中基板前体标志物SIX1和PAX6的表达。
图43A-C显示了(A)用于改良的PIP-E6方案的方案，其在培养第1-3天过程中将E8/E6培养基补充有BMP4和单一SMAD抑制剂SB431542；(B-C)显示了根据PIP-E6方案用0、1、5、10、15和20ng/ml BMP4培养的细胞中的AP2表达。
图44A-C显示：(A)用于培养SIX1::H2B-GFP细胞的PIP-E6方案；(B)当第0-3天在培养基中BMP4以5ng/ml BMP4的浓度存在时诱导的细胞中AP2和SIX1的表达；和(C)当第0-3天在培养基中BMP4以20ng/ml BMP4的浓度存在时诱导的细胞中AP2和SIX1的表达。
图45A-B显示了(A)用于培养SIX1::H2B-GFP细胞的PIP-E6方案，其在培养的第0-1、0-2和0-3培养日使用(B)5ng/ml BMP4，以及导致的SIX1和AP2的表达。在0-3日方案之后发生最高水平的SIX1和AP2表达。
图46显示了根据PIP-E6方案(培养第3天之后取消BMP4)在SIX::H2B-GFP细胞的培养过程中随着时间的各种基板标志物的基因表达水平。另外显示了多能性(OCT4)的丧失、肌肉(MyoD)或普通中胚层(Brachyury)诱导的缺乏以及内胚层(SOX17)或神经嵴(SOX10)诱导的缺乏。
图47显示了各种蛋白质的染色，其确认了使用PIP-E6方案(培养第3天之后取消BMP4)在E8/E6培养基中培养的细胞中的基板身份。
图48显示了使用PIP-E6(E8/E6培养基)和PIP(KSR培养基)方案产生的基板前体细胞的收率和可变性。PIP-E6得到的基板前体细胞较少，但与PIP相比较可变性更低。
图49A-B显示：(A)补充有CHIR(Wnt激活剂)以诱导三叉神经基板作为默认基板的PIP-E6方案(在培养第2-4天过程中补充)；和(B)根据改良的PIP-E6方案在培养11和12天之后培养的细胞表达的三叉神经基板标志物SIX1和PAX3。
图50显示了可以使用PIP-E6培养方案诱导的垂体、晶状体和三叉神经基板。
图51显示了使用在培养第2-4天过程中补充CHIR的PIP-E6方案诱导的三叉神经基板细胞中富含的细胞表面标志物GD2。
图52显示了GD2的化学结构。
图53A-B显示了使用在培养第2-4天过程中补充CHIR的PIP-E6方案诱导的三叉神经基板细胞中GD2和基板标志物SIX1::GFP的共表达。
图54A-B显示的是阳性对照细胞，其中CD24和SIX1::GFP在所有神经细胞中得以表达，上述神经细胞包括使用在培养第2-4天过程中补充CHIR的PIP-E6方案诱导的三叉神经基板细胞。
图55显示了在使用PIP-E6方案诱导的三叉神经基板细胞中富含的细胞表面标志物CD57(HNK1)。
图56A-B显示了使用在培养第2-4天过程中补充CHIR的PIP-E6方案诱导的三叉神经基板细胞中CD57(HNK1)和SIX1::GFP的共表达。
图57显示了可以用于产生三叉神经基板作为默认基板结局的PIP-E6方案，其中基于其GD2标志物的表达来分离和分选基板。
图58显示了与GD2阴性细胞相比较，在分化28天之后(GD2分选后14天)使用改良的PIP-E6方案(补充有CHIR)诱导的GD2阳性三叉神经细胞的形态。
图59显示了分化48天之后(GD2分选后33天)使用改良的PIP-E6方案(补充有CHIR)诱导的三叉神经神经元。
图60显示了促进使用PIP-E6方案进行的基板诱导的化合物的高通量筛选的示意图，其中在PIP-E6方案第3天将测试化合物加入到培养基中。
图61显示了促进基板诱导的化合物的高通量筛选结果。在筛选中识别出三种候选化合物作为诱导增强剂：BRL-54443、菲咯啉一水合物(Phenanthroline monohydrate)和小白菊内酯(Parthenolide)。
图62A显示候选基板诱导增强剂BRL-54443、菲咯啉一水合物(phenanthrolinemonohydrate)和小白菊内酯(Parthenolide)的结构。
图63A-B显示：(A)用于诱导垂体基板细胞的PIP-E-6方案，其中在培养第6-15天将垂体图式化因子补充至PIP-E6培养基中；和(B)垂体基板得以诱导，如垂体基板标志物Pitx1、Pitx2、Lhx3和Lhx4的表达所证实。
图64显示，使用改良的PIP-E6方案分化到第30天之后，垂体基板细胞分化成与所有三种垂体前体谱系衍生物对应的表达激素的细胞。
图65显示，三种垂体前体谱系中每一种的比例通过将细胞用Notch信号传导抑制剂(DAPT)处理来加以调节，通过CHIR(Wnt激活剂)调节程度较小。
图66显示，根据在培养第6天加入垂体图式化因子而改良的PIP-E6方案诱导的表达垂体激素的细胞响应于外部刺激。细胞响应于生长激素释放因子(somatocrinin)释放生长激素(GH)。细胞响应于那法瑞林(nafarelin)释放促卵泡激素(FSH)。
图67显示，根据补充有BMP2的PIP-E6方案培养细胞能够增加若干垂体亚型特异性标志物的产率。
图68显示了用于诱导脑垂腺前叶细胞的改良的PIP-E6方案，其中根据PIP-E6方案培养SIX1::GFP hPSC，其中从第6-14天在培养基中包括有垂体图式化因子，例如FGF8、FGF10或SHH等。
图69显示，在培养第6-14天，根据PIP-E6并补充FGF2或FGF8来培养SIX1::GFPhPSC可以增加假定垂体干细胞的数量，如Ki67和Sox2的表达所证实。
图70显示，通过使用改良的PIP-E6(补充有垂体图式化因子)方案诱导成垂体激素表达结局的细胞在移植到无损伤成年大鼠脑(邻近于垂体/下丘脑)中时存活，并且与对照相比较，移植的动物中可检测ACTH的水平增加。
图71显示，将诱导的垂体激素释放细胞的混合物移植到垂体切除的大鼠中时，在3个移植的动物中有2个ACTH水平似乎增加。
具体实施方式
定义
如本文所用，术语“抑制剂”在指抑制信号传导目标或信号传导目标通路时是指如下的化合物，当与未经处理的细胞或者用不抑制所处理的细胞或组织的化合物进行处理的细胞相比较时，其干扰(即，降低或消除或阻遏)产生的目标分子或目标化合物或目标过程，例如特定的分化结果(例如，抑制促进默认细胞类型分化的活跃信号传导通路，从而诱导分化成非默认细胞类型)。
如本文所用，术语“Small Mothers Against Decapentaplegic”或“SMAD”是指一种信号传导分子。
如本文所用，术语“神经细胞”或“神经元细胞”是指在体内将会成为神经***一部分并且在培养中通过本发明的方法得到的细胞，例如，CNS祖细胞、运动神经元和多巴胺能神经元的可成型(patternable)(即，能够经历进一步分化)神经元种群、基板前体细胞、高效运动神经元细胞等。
如本文所用，术语“高效运动神经元细胞”是指能够传导电流的神经元细胞。
如本文所用，术语“结局”在指细胞例如“细胞结局决定”时，通常是指具有遗传确定的谱系的细胞，其子代细胞能够取决于体内或体外的培养条件而成为许多种细胞类型或少数特定的细胞类型。换言之，细胞预定的结局通过其环境来确定，以预定为特定的分化路径，使得细胞成为一种细胞类型而不是其他细胞类型，例如，干细胞的子代细胞的“神经结局”是成为神经细胞，而不是肌肉细胞或皮肤细胞。通常，除非在高度特异性的条件下，细胞的“结局”是不可逆的。在另一例子中，“CNS结局”是指能够成为中枢神经***相关细胞的细胞。相反，结局是成为神经细胞的细胞可以称作“神经祖细胞”。
如本文所用，术语“神经祖细胞”是指能够形成神经***一部分的细胞，例如神经细胞、胶质细胞等。
如本文所用，术语“神经元亚型”是指神经元***的任何细胞，例如多巴胺表达神经元、外周蛋白+神经元、运动神经元细胞等。
如本文所用，术语“神经谱系细胞”是指沿着神经前体路径分化的细胞。
如本文所述，术语“基板”在指细胞时，是指能够成为感觉神经***相关细胞的细胞。在一实施方式中，基板细胞对于Six1+是阳性的，对于p75是阳性的，而对于HNK1是阴性的。在一实施方式中，使用本发明的方法得到的基板细胞能够形成晶状体细胞。
如本文所用，术语“腺垂体前体”在指细胞时，是指其在体内的子代细胞将会是或成为脑下垂体一部分的细胞。本发明的腺垂体前体细胞是指能够表达Lhx3和CGA的细胞。
如本文所用，术语“表达”在涉及基因或蛋白质时是指产生mRNA或蛋白质，其可以使用检测例如微阵列检测、抗体染色检测等观察。
如本文所用，术语“SMAD抑制剂”在指抑制信号传导分子或信号传导分子的通路例如SMAD信号传导抑制剂时，是指干扰(即，降低或消除或阻遏)分子或通路的信号传导功能的化合物。在一实施方式中，本发明的抑制剂将分化从默认情形诱导(改变)或变更成非默认细胞类型，例如，包括两种SMAD信号传导抑制剂的本发明方法之一产生非默认的神经祖细胞。
如本文所用，术语“Small Mothers Against Decapentaplegic”或“SMAD”是指一种信号传导分子。
如本文所用，术语“细胞分化”是指较少分化的细胞(即干细胞)发育或成熟为具有更为明确的形式和功能(例如，神经板)的路径。
如本文所用，术语“分化”就分化细胞***中的细胞而言使用时，是指细胞从一种细胞类型(例如，专能、全能或多能的可分化细胞)分化成另一细胞类型例如目标分化细胞的过程。
如本文所用，术语“细胞分化”在指路径时，是指较少分化的细胞(即干细胞)发育或成熟或分化以具有更为明确的形式和/或功能而成为更加特化的细胞或分化的细胞(即，神经细胞、神经板细胞、垂体细胞、肾上腺细胞等)的过程。
如本文所用，术语“神经干细胞”或“NSC”是指能够在体内成为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、胶质细胞等并且在培养物中能够成为神经元细胞子代和神经胶质子代的细胞，但是，其在体外朝向多种区域特异性神经元类型分化的潜力低。
如本文所用，术语“默认”(default)或“被动”(passive)在指细胞分化路径时，是指如下路径：其中较少特化的细胞在培养中在不用某些化合物处理时，即在正常细胞培养条件下，成为某个分化的细胞类型。换言之，当细胞不与能够改变分化细胞类型的分子(即形态发生素)接触时，产生默认细胞。相反，“非默认”在指细胞时，是指导致与默认细胞不同的细胞类型的分化细胞类型，即，非默认细胞是由非默认条件产生的分化细胞类型，例如本发明的细胞，包括多巴胺阳性神经细胞、底板细胞、后侧FP组织等。默认细胞还可以是在没有随后的形态发生化合物的情况下使细胞与形态发生素接触以成为非默认细胞之后的默认细胞，例如，随后成为本发明的非默认细胞的默认后侧FP细胞的非默认底板细胞。
如本文所用，术语“同型二聚体”在指SMAD分子时是指至少两个例如通过二硫键连接在一起的SMAD分子。
如本文所用，术语“Noggin”是指分泌的同型二聚糖蛋白，其与信号传导蛋白质的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员结合并使其灭活，例如骨形成蛋白-4(BMP4)。Noggin典型地是在人细胞中表达为糖基化的二硫键连接的二聚体的65kDa蛋白质。(Groppe等人，(2002).Nature 420，636-642；Xu等人，(2005)Nat Methods 2，185-190；Wang等人，(2005)Biochem Biophys Res Commun 330，934-942)。Noggin氨基酸序列的一个例子为：编号#U79163的单氨基酸小鼠Noggin(SEQ ID NO：50)：
MERCPSLGVTLYALVVVLGLRAAPAGGQHYLHIRPAPSDNLPLVDFTLIEHPDPIFDPKEKDLNETLLRSLLGGHYDPGFMATSPPEDRPGGGGGPAGGAEDLAELFTDQLLRQRPSGAMPSEIKGLEFSEGLAQGKKQRLSKKLRRKLQMWLWSQTFCPVLYAWNDFTLGSRFWPRYVKVGSCFSKRSCSVPEGMVCKPSKSVHLTVLRWRCQRRGGQRCGWIPIQYFTPIISECKCSC.
如本文所用，术语“SB431542”是指以下分子，其CAS编号为CAS 301836-41-9，分子式为C22H18N4O3，名称为4-[4-(1，3-苯并二氧戊环-5-基)-5-(2-吡啶基)-1H-咪唑-2-基]-苯甲酰胺，例如，参见下式：
如本文所用，术语“Dorsomorphin”是指以下分子，其CAS编号为CAS 866405-64-3，分子式为C24H25N5O，名称为6-[4-[2-(1-哌啶基)乙氧基]苯基]-3-(4-吡啶基)-吡唑并[1，5-a]嘧啶二盐酸化物，例如，参见以下结构。
如本文所用，术语“Lefty”是指转化生长因子β超家族的抑制TGF-β的新成员，其包括但不限于LEFTY1、LEFTY2、LEFTYA等，也称作“EBAF”或“子宫内膜出血(endometrialbleeding)相关因子”或“左右决定因子A”转化生长因子β超家族))。Lefty蛋白质是哺乳动物器官***左右不对称性决定所需要的。
如本文所述，术语“激活素”是指转化生长因子-β(TGF-β)超家族成员，例如激活素A、激活素B等。
如本文所用，术语“转化生长因子β”或“TGF-β”是指调节不同细胞类型生长和分化的细胞因子。
如本文所用，术语“nodal”是指信号传导分子TGF-β家族的成员。Nodal信号传导抑制人胚胎干细胞沿着神经外胚层默认路径的分化(Vallier等人,Dev.Biol.275,403-421)。
如本文所用，术语“ALK”或“间变性淋巴瘤激酶”或“间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶”或“Ki-1”是指膜相关的酪氨酸激酶受体。
如本文所用，术语“ALK4”在指I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体时是指与激活素结合以起到激活素受体作用的间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶4受体。
如本文所用，术语“ALK5”在指I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体时是指与TGF-β1结合以起到TGF-β1受体作用的间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶5受体。
如本文所用，术语“ALK7”在指I型丝氨酸/苏氨酸激酶受体时是指与Nodal和Nodal相关蛋白质结合以起到Nodal和Nodal相关蛋白质受体作用的间变性淋巴瘤受体酪氨酸激酶7受体。
如本文所用，术语“成对框基因6”或“PAX6”是指非默认神经祖细胞的标志物。
如本文所用，术语“试剂盒”是指任何用于递送材料的递送***。在细胞分化的上下文中，试剂盒可以指用于接触干细胞的材料的组合，这样的递送***包括使得人们可以将适当容器(例如，管等)中的反应试剂(例如，化合物、蛋白质、检测剂(例如PAX6抗体)等和/或支持材料(例如，缓冲剂、进行细胞分化的书面说明书等)存储、运输或从一处递送至另一处的***。例如，试剂盒包括含有相关反应试剂(例如Noggin(或Noggin取代物)和SB431542(SB431542替代物)等)和/或支持材料的一个或多个附件(enclosures)(例如，盒子，或袋子等)。
如本文所用，术语“诱导分化”在指细胞时，是指将默认细胞类型(基因型和/或表型)改变成非默认细胞类型(基因型和/或表型)。因此，“诱导干细胞中的分化”是指诱导细胞***成具有与干细胞不同的特性的子代细胞，例如基因型(即，基因表达变化，如通过基因分析例如微阵列所确定)和/或表型(即，蛋白质表达变化，例如PAX6或一组蛋白质，例如HMB45阳性(+)而对于SOX10阴性(-))。
如本文所用，术语使细胞与本发明的化合物“接触”是指将化合物置于使其触及细胞的位置，以便产生“接触”的细胞。接触可以使用任何适当的方法进行。例如，在一实施方式中，接触是通过将化合物加入至细胞试管中。接触也可以通过将化合物加入到细胞培养物中实现。
如本文所用，术语“干细胞”是指全能、多能或专能并且能够分化成一种或多种不同细胞类型的细胞，例如胚胎干细胞、自器官分离的干细胞，例如皮肤干细胞。
如本文所用，术语“胚胎干细胞”是指干细胞系的细胞，例如WA-09，或者自胚胎或胎盘或脐带分离的细胞。
如本文所用，术语“成体干细胞”是指从出生后的生物体得到的干细胞。
如本文所用，术语“神经干细胞”或“NSC”是指能够在体内成为神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞和胶质细胞并且在培养物中能够成为神经元细胞子代和神经胶质子代的细胞，但是，其在体外朝向多种区域特异性神经元类型分化的潜力低。
如本文所用，术语“中胚层细胞系”是指表现出中胚层细胞相关特征的细胞系。
如本文所用，术语“内胚层细胞系”是指表现出通常与内胚层细胞相关的特征的细胞系。
如本文所用，术语“神经细胞系”是指表现出通常与神经细胞相关的特征的细胞系。这些特征的例子包括，但不限于，表达FOXA2、SHH、Netrin-1、F-Spondin等。
如本文所用，术语“全能”是指细胞分化成分化有机体中任何细胞类型以及胚胎外材料例如胎盘等的细胞的能力。
如本文所用，术语“多能”是指能够分化成任何分化细胞类型的细胞系。
如本文所用，术语“专能”是指能够分化成至少两种分化细胞类型的细胞系。
如本文所用，术语“分化”就分化细胞***中的细胞而言使用时，是指细胞从一种细胞类型(例如，专能、全能或多能的可分化细胞)分化成另一细胞类型例如目标分化细胞的过程。
如本文所用，术语“细胞培养物”是指任何体外的细胞培养物。该术语中包括的是传代细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如非转化细胞)和任何其他体外保持的细胞种群，包括***和胚胎。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境，以及在人工环境内发生的过程或反应。体外环境可以由试管和细胞培养物组成，但并不限于此。术语“体内”是指自然环境(例如动物或细胞)，以及在自然环境内发生的过程或反应。
如本文所用，术语“神经板”或“髓板”是指发育中的胚胎的中间体区域中的外胚层(神经管的不成对纵向腹侧区)增厚带，其发育(分化)成神经管和神经嵴；参见图12。在胚胎发育过程中，神经板细胞经历一系列发育阶段，随后发育成形成脑、脊髓和其他中枢神经***组织的细胞。
如本文所用，术语“底板”或“FP”或“腹板”或“基板”或“神经底板”是指在神经板的中线发育并位于神经管腹侧中线的细胞的区域，参见图12。
如本文所用，术语“神经底板细胞”或“FP细胞”或“底板细胞”在指细胞时是指在发育中的胚胎中在神经底板中发现的也称作“特化的神经上皮细胞”的细胞组。在体外FP细胞是表达某些同样在体内FP细胞中发现而其他细胞中没有发现的细胞标志物的细胞。
如本文所用，术语“顶板”或“翼板”或“背顶板”是指位于形成中的或形成的神经管区域的背侧区域——神经管的不成对背侧纵向区中的细胞组。
如本文所用，术语“神经管”是指由早期胚胎神经外胚层细胞通过神经沟闭合使得神经外胚层细胞可以分化成脑细胞和脊髓细胞而形成的神经上皮细胞的中空圆柱形结构。
如本文所用，术语“推定”或“祖先”在指细胞或细胞区域时，是指在适当条件下即在与适当的生长因子、化合物、细胞外信号、细胞内信号等接触时会发育(分化成)的细胞类型或细胞区域。例如，“祖神经元”是指具有发育成神经元的能力的细胞。
如本文所用，术语“多巴胺神经元”或“多巴胺能神经元”通常是指能够表达多巴胺的细胞。“中脑多巴胺神经元”或“mDA”是指前脑结构中的推定多巴胺表达细胞和前脑结构中的多巴胺表达细胞。
如本文所用，术语“默认”在指细胞分化路径时是指特化较少的细胞在不与改变分化细胞类型的分子接触时成为某种分化细胞类型的路径。
如本文所用，术语“细胞分化”是指较少特化的细胞(即干细胞)发育或成熟以具备更加明确的形式和功能(即神经板)的路径。
如本文所用，术语“神经突突起生长”(neurite outgrowth)是指观察到细胞质自细胞延伸的膜包围的突出。
如本文所用，术语“贴壁细胞”是指在体外生长的细胞，其中细胞接触培养器皿的底部或侧边，贴壁细胞可以经由细胞外基质分子等与器皿接触。与悬浮培养中的细胞相反。
如本文所用，术语“标志物”或“细胞标志物”是指识别特定细胞或细胞类型的基因或蛋白质。细胞标志物可以不限于一种标志物，标志物可以指标志物“图式”(patter)，使得指定的一组标志物可以从其他细胞或细胞类型中识别出细胞或细胞类型。例如，本发明的FP细胞表达一种或多种标志物，其将FP细胞即FOXA2阳性和BF1阴性细胞区分于非FP细胞即FOXA2阴性和BF1阳性细胞。
如本文所用，术语“测试化合物”是指任何用于提供本发明的细胞的化学实体、药剂、药物等。
如本文所用，术语“菊形团阶段神经细胞”或“R-NSC”是指在体外具有广泛分化潜力的神经干细胞类型，其能够形成中枢神经***(CNS)和周围神经***(PNS)细胞(结局)，并能够在体内移植。换言之，菊形团阶段神经细胞能够形成菊形团结构，菊形团阶段神经细胞种群具有神经元分化特征。
如本文所用，术语“菊形团结构”或“菊形团”(rosette)在指细胞时是指细胞的晕轮或辐轮排列。
如本文所用，术语“增加”在指特征时是指当与对照中的所述特征比较时，特征的量较大，例如，比较在有和没有测试化合物的情况下培养的人胚胎干细胞中标志物的量时。
如本文所用，术语“降低”在指特征时是指当与对照中的所述特征比较时，特征的量较小，例如，比较在有和没有测试化合物的情况下培养的人胚胎干细胞中标志物的量时。
如本文所用，术语“降低蛋白质功能”或“丧失功能”是指干扰或阻断功能，以减低该功能，例如，通过阻断抗体减低DKK-1的功能。
如本文所用，术语“神经元诱导化合物”是指导致沿着细胞路径的分化而导向神经元细胞的物质。
如本文所用，术语“阻断受体磷酸化的药剂”是指通过降低磷酸化降低受体功能的物质。
如本文所用，术语“响应”就检测而言使用时，是指产生可检测的信号(例如，报道基因蛋白质的积累、离子浓度的增加、可检测化学产物的积累)。
术语“样品”以其广义使用。在某种意义上，其可以指细胞或组织。在另一意义上，其是要包括从任何来源获得的标本或培养物，包括流体、固体和组织。环境样品包括环境材料，例如表面物质、土壤、水和工业样品。这些例子不应理解成限制适用于本发明的样品类型。
如本文所用，术语“提纯的”、“提纯”、“纯化”“分离的”、“将……分离”、“分离”及其语法上的等同物是指样品中至少一种污染物的量减少。例如，将细胞类型提纯至少10％，优选至少30％，更优选至少50％，再更优选至少75％，最优选至少90％，不需要的细胞类型的量的降低，例如，与非FP细胞例如混合细胞培养物中存在的细胞分离的分化的FP细胞。因此，细胞类型的提纯导致“富集”，即，样品中核苷酸序列的量增加。
如本文所用，术语“天然存在的”在应用于物体(例如细胞、组织等)和/或化合物(例如蛋白质、氨基酸序列、核酸序列、密码子等)时，是指物体和/或化合物是自然界发现的。例如，天然存在的细胞是指细胞存在于有机体中，其可以从天然来源分离出，例如胚胎细胞，其中细胞没有在实验室中人为有意修饰。
如本文所用，术语“体外”是指人工环境，以及人工环境内发生的过程或反应。体外环境的例子有，但不限于，试管和细胞培养物。
如本文所用，术语“体内”是指天然环境(例如，动物或细胞)，以及天然环境内发生的过程或反应，例如胚胎发育、细胞分化、形成神经管等。
如本文所用，术语“增殖”是指细胞数目的增加。
如本文所用，术语“配体”是指与第二分子结合的分子。具体地分子可以是指配体和第二分子中的一个或二者。第二分子的例子包括配体的受体和与配体结合的抗体。
术语“源自”或“建立自”或“分化自”在指本文公开的任意细胞时，是指使用任何操纵方式，例如，但不限于，单细胞分离、体内培养、处理和/或诱变(使用例如蛋白质、化学物质、放射、用病毒感染、用DNA序列转染例如用形态发生素等)、对培养的亲代细胞中含有的任何细胞的选择(例如通过连续培养)，自细胞系、组织(例如，分离的胚胎)或流体中的亲代细胞获得(例如，分离，提纯等)细胞。衍生的细胞可以通过响应于生长因子、细胞因子、细胞因子处理的选择进展、粘着性、缺乏粘着性、分选过程等从混合种群中选择。
如本文所用，术语“生物活性”是指分子(例如，肽、核酸序列、碳水化合物分子、有机或无机分子等)具有结构化的、调节的和/或生物化学功能。
如本文所用，术语“原代细胞”是在没有培养的情况下从动物组织(例如血液)或器官直接获得的细胞。典型地，尽管并非必需，在衰老或停止增殖之前，原代细胞能够进行十次或较少次的传代。相反，“培养细胞”是已经在体外保持和/或繁殖十次或更多次传代的细胞。
如本文所用，术语“培养细胞”是指与来自相同来源的原代细胞相比较，细胞能够在停止增殖和/或衰老之前在体外更多次传代。培养细胞包括“细胞系”和“原代培养细胞”。
如本文所用，术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。该术语内包括传代细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如非转化细胞)和任何其他体外保持的细胞种群，包括胚胎和胚胎细胞。
如本文所用，术语“细胞系”是指体外培养的细胞，包括原代细胞系、有限细胞系、传代细胞系和转化细胞系，但不要求细胞能够在培养物中无限次数传代。细胞系可以自发产生或通过转化产生。
如本文所用，术语“原代细胞培养物”和“原代培养物”是指已在体内直接由细胞例如由动物组织获得的细胞培养物。这些培养物可以获自成体以及胎儿组织。
如本文所用，术语“单层”、“单层培养物”和“单层细胞培养物”是指附着于基质并作为厚度一个细胞的层生长的细胞，换言之，“贴壁细胞”。单层可以任何形式生长，其包括但不限于，烧瓶、试管、盖玻片(例如shell vial瓶)、滚瓶等。
如本文所用，术语“饲养细胞层”或“饲养细胞种群”是指用于为相邻细胞提供粘附分子和/或生长因子的细胞单层，例如在共培养中用于维持多能干细胞。
如本文所用，术语“悬浮”和“悬浮培养”是指细胞在不附着于基质的情况下存活并增殖。悬浮培养物通常使用造血细胞、转化细胞系和来自恶性肿瘤的细胞产生。
如本文所用，术语“培养基”和“细胞培养基”是指适合于在体外支持细胞生长(即，细胞培养物、细胞系等)的介质。该术语无意限定于任何具体的培养基。例如，该定义意在包括副产品(outgrowth)和维持培养基。事实上，该术语意在包括任何适合于所关注的细胞培养物和细胞的生长的培养基。
术语“细胞生物学”或“细胞的生物学”是指对活细胞的研究，例如，细胞的解剖学和功能，例如，细胞的生理特性、结构、细胞器以及其与环境的相互作用、其生命周期、***和死亡。
如本文所用，术语“细胞”是指单个细胞以及细胞种群(即多于一个)。种群可以是包括一种细胞类型的单纯种群，例如神经元细胞种群或未分化的胚胎细胞种群。另外可选地，种群可以包括多于一种的细胞类型，例如混合细胞种群。无意于限制种群中细胞的数目，例如，混合细胞种群可以包括至少一种分化细胞。在一实施方式中，混合种群可以包括至少一种分化细胞。在本发明中，对细胞种群可以包括的细胞类型的数目没有限定。
如本文所用，术语“阳性细胞”在涉及染色时是指细胞表达标志物，因此，对于在对照或比较细胞之上的可检测的定量和/或定性的量的该标志物“染色”。阳性细胞也可以指对于分子例如FOXA2等染色的细胞。
如本文所用，术语“阴性细胞”是指细胞不存在标志物的可检测信号，例如，细胞在用FOXA2抗体检测方法等接触之后不能染色。
如本文所用，术语“尾化”是指在胚胎发育过程中在背侧化(dorsalized)外胚层中引发神经发育的后侧路径，例如，背侧化外胚层取决于尾化程度发育出各种水平的后侧神经组织。
如本文所用，术语“尾化剂”或“尾化因子”是指诱导尾化的化合物，例如Wnt-1和视黄酸(RA)。
如本文所用，术语“报道基因”或“报道基因构建物”是指包括编码以下蛋白质的核酸的基因构建物：其易于检出或易于检测，例如有色蛋白质、荧光蛋白质或酶，例如β-半乳糖苷酶(lacZ基因)。
如本文所用，术语“基因靶向”是指将外源性DNA在其表达可以加以适当控制的位点整合到细胞的基因组中。该整合由于同源重组而发生。
如本文所用，“敲入”方法是指将所需的核酸序列例如编码报道基因的序列经由同源重组***到宿主细胞中的特定基因座中的过程。
如本文所用，术语“基因组”是指有机体的遗传物质(例如染色体)。
术语“关注的核苷酸序列”是指任何核苷酸序列(例如，RNA或DNA)，其操纵可以出于任意原因(例如，治疗疾病、产生提高的品质、在宿主细胞中表达所关注的蛋白质、表达核酶等)被本领域普通技术人员视作是合意的。这些核苷酸序列包括，但不限于，结构基因(报道基因、选择标志物基因、致癌基因、药物抗性基因、生长因子等)的编码序列，以及不编码mRNA或蛋白质产物的非编码调节序列(例如，启动子序列、聚腺苷酸化序列、终止序列、增强子序列等)。
如本文所用，术语“关注的蛋白质”是指由所关注的核酸编码的蛋白质。
如本文所用，术语“外源性基因”是指并非天然存在于宿主有机体或细胞中或者人工引入到宿主有机体或细胞中的基因。
术语“基因”是指包括对于产生多肽或前体(例如，胰岛素原)所必需的编码序列的核酸(例如，DNA或RNA)序列。多肽可以由全长编码序列编码，或者由编码序列的任意部分编码，只要保留全长或片段的所需活性或功能特性(例如，酶活性、配体结合、信号转导等)即可。该术语还包括结构基因的编码区，并包括位置与5’端和3’端上的编码区相邻的序列，距离在任一端上为大约1kb或更多，使得基因对应于全长mRNA的长度。位于编码区5’并且存在于mRNA上的序列称作5’未翻译序列。位于编码区3’或下游并且存在于mRNA上的序列称作3’未翻译序列。术语“基因”包括基因的cDNA和基因组形式。基因组形式或基因克隆含有被称作“内含子”或“间插区”或“间插序列”的非编码序列打断的编码区。内含子是转录成核RNA(hnRNA)的基因片段；内含子可以含有调节元件，例如增强子。内含子从核转录物或初级转录物中除去或“剪接出”；因此，内含子在信使RNA(mRNA)转录物中不存在。mRNA在翻译过程中发挥作用，以指定新生多肽中的序列或氨基酸顺序。
如本文所用，术语“基因表达”是指将基因中编码的遗传信息通过基因的“转录”(即，经由RNA聚合酶的酶作用)转化成RNA(例如mRNA、rRNA、tRNA或snRNA)以及对于编码蛋白质的基因通过mRNA的“翻译”转化成蛋白质的过程。基因表达可以在该过程中的许多阶段加以调节。“上调”或“激活”是指增加基因表达产物(即RNA或蛋白质)的产出的调节，而“下调”或“抑制”是指降低产出的调节。参与上调或下调的分子(例如，转录因子)常常分别称作“激活剂”和“抑制剂”。
如本文所用，术语“核酸分子编码”、“DNA序列编码”、“DNA编码”、“RNA序列编码”和“RNA编码”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸沿着脱氧核糖核酸或核糖核酸的链的顺序或序列。这些脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的顺序决定了氨基酸沿着多肽(蛋白质)链的顺序。因此，DNA或RNA序列编码了氨基酸序列。
如本文所用，术语“疑似具有”是指患者表现出的身体状况(medical condition)或一组身体状况(例如，初步症状)，其不足以提供鉴别诊断。然而，表现出的状况可以为进一步的测试(例如，自身抗体测试)提供依据，以得到进一步信息作为诊断基础。
如本文所用，术语“有风险”是指患者表现出的身体状况或一组身体状况，其可能使患者易患特定的疾病或痛苦。例如，这些状况可以由包括、但不限于以下的影响导致：行为、情绪、化学、生物化学或环境影响。
如本文所用，术语“有效量”是指特定量的实现临床有益结果(即，例如，症状减轻)的包括治疗剂的药学组合物。这些组合物的毒性和治疗效力可以通过标准药学方法在细胞培养物或实验动物中测定，例如，测定LD50(致死50％种群的剂量)和ED50(在50％种群中治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比是治疗指数，其可以表达成比例LD50/ED50。优选表现出大的治疗指数的化合物。从这些细胞培养测定和额外的动物研究得到的数据可以用于指定人用的剂量范围。这些化合物的剂量优选地处于循环浓度范围内，其包括没有或几乎没有毒性的ED50。剂量取决于采用的剂型、患者的敏感度和给药路径在该范围内变化。
如本文所用，术语“症状”是指患者观察到的任何疾病或身体障碍的主观或客观证据。例如，主观证据通常是基于患者自述，可以包括，但不限于，疼痛、头痛、视觉障碍、恶心和/或呕吐。另外可选地，客观证据通常是医学测试的结果，其包括，但不限于，体温、全部血球数、血脂谱、甲状腺谱(thyroid panels)、血压、心率、心电图、组织和/或身体图像扫描。
如本文所用，术语“疾病”或“身体状况”是指使重要功能表现中断或改变的对于动物或植物活体或者其部分之一的正常状态的任何损伤。通常通过区别性征兆和症状显现，通常是对以下的响应：i)环境因子(如营养不良、工业危险或气候)；ii)特定的传染物(如虫、细菌或病毒)；iii)有机体固有缺陷(例如遗传异常)；和/或iv)这些因素的组合。
术语“减少”、“抑制”、“消除”、“阻遏”、“降低”、“防止”和语法等同物(包括“更低”、“更小”等)在指未经治疗的受试者相对于经治疗的受试者的任何症状的表现时，是指经治疗的受试者中症状的量和/或等级以任何经医学训练的人士认定为临床相关的任意量低于未经治疗的受试者。在一实施方式中，经治疗的受试者中症状的量和/或等级比未经治疗的受试者中症状的量和/或等级低至少10％、至少25％、至少50％、至少75％和/或至少90％。
如本文所用，术语“患者”或“受试者”是人或动物，不必需住院。例如，门诊患者、疗养院中的人是“患者”。患者可以包括任何年龄的人或非人动物，因此包括成人和青少年(即儿童)。术语“患者”并无意于意味着需要医学治疗，因此，患者可以自愿地或非自觉地是无论临床还是支持基础科学研究的实验的一部分。
术语“移植”、“植入”、“移植术”或“植入术”是指任何将供体活组织置于受体活组织中的方法。例如，可以将大量活基板细胞在使得供体细胞变得有生存力地附着并正常发育的条件下置于到受体活组织上。
发明详述
本发明主要涉及干细胞细胞生物学领域，更具体地，涉及使用新的培养条件下的多能或专能干细胞的定向分化，上述多能或专能干细胞包括人胚胎干细胞(hESC)、成体干细胞和诱导的人多能干细胞(hiPSC)。具体地，通过在前基板阶段与进一步结局特化相结合的双SMAD抑制策略神经诱导，由人多能干细胞得到颅基板。该方法产生来自基板的三叉神经节、成熟晶状体纤维和产生垂体前叶激素的细胞。这些细胞的应用包括，但不限于，感觉和内分泌疾病中基于人细胞的疗法。
I.神经元分化路径
转化生长因子(TGF-β)及其家族成员，其包括但不限于，骨形成蛋白(BMP)、Nodal和激活素，可以参与各种器官的发育和保持，其中干细胞发挥着有益的作用。据信胚胎外胚层的胚层产生神经外胚层(中枢和周围神经***、神经嵴细胞和衍生物)。许多证据说明了神经诱导过程中Smad信号传导的作用。通常，Smad蛋白质在TGF-β超家族配体的下游，当其特异性受体被激活时，它们刺激受体调节的Smad(R-Smads：Smadl、Smad2、Smad3、Smad5和Smad 8，Smads 2和3被激活素/nodal和TGF-βI型受体特异性激活，Smads 1、5和8被BMP I型受体激活)的磷酸化。两种不同的路径在Smad 4方面相反。
青蛙中的研究识别出骨形成蛋白(BMP)抑制剂是Spearman组织者中至关重要的神经诱导因子，上述抑制剂包括脊索发生素(Sasai等人,Cell 79(5):779(1994))、follistatin(Hemmati-Brivanlou等人,Cell77(2):283(1994))和noggin(Smith等人,Cell70(5):829(1992))。哺乳动物noggin(Valenzuela等人,J Neurosci 15(9):6077(1995))具有相当的神经诱导特性，用重组Noggin处理已经用于若干hESC神经诱导方案中(Lee等人,Stem Cells 25(8):1931(2007)；Elkabetz等人,Genes Dev22(2):152(2008))。近来，药物SB431542已经显示在基于hESC神经诱导方案的胚状体(EB)中促进神经诱导(Smith等人,Dev Biol313(1):107(2008))。SB431542通过阻断ALK4、ALK5、ALK7受体的磷酸化抑制Lefty/Activin/TGFβ路径。尽管Noggin或SB431542处理提高神经诱导的效率，但任一单独的治疗在明确的或贴壁条件下不足以在神经上使hESC转变。
II.干细胞培养技术
在稳健、高度可重复的条件下培养干细胞并且使交叉污染的机会最小化的努力尚未完全成功。对于建立定义明确的培养基和方法的努力可以使得使用干细胞作为治疗剂具有可重复性和准确性，已经有行动建立起不含非人添加剂和不确定因素的培养基和培养条件。细胞培养***的改良已经成为若干近期专利的焦点。美国专利第7,005,252号讨论了灵长类动物胚胎干细胞在存在成纤维细胞生长因(FGF)和饲养细胞层、但不存在任何动物血清的情况下的生长，在此将其并入作为参考。美国专利第7,297,539号讨论了多能干细胞在含有成纤维细胞生长因子的培养基中使用含有细胞外基质(matrix)的***、但在没有饲养层的情况下的生长，在此将其并入作为参考。美国专利第7,211,434号说明了在含有另一种用于保持多能性的细胞因子即白血病抑制因子的不含血清、并且不含饲养层的培养基中培养哺乳动物胚胎干细胞的方法，在此将其并入作为参考。识别确定的特定化合物作为培养基添加剂以控制胚胎干细胞的结局是若干旧专利的焦点，其包括美国专利第7,332,336、7,294,510和7,252,995号，在此将其均并入作为参考。
已经提出人干细胞用于细胞置换疗法，近期在体细胞重新编程(reprogramming)至诱导的多能干细胞(hiPSC)方面的进展已经打开了产生用于再生医学和疾病模型的患者特异性细胞的大门(Takahasi等人,2007；Kim等人,Cell,136(3):411-419(2009))。但是，为了实现这些方法的全部潜力，要求有消除使用不确定因素例如神经诱导的细胞体(stoma)(PAX6或MS5细胞(Kawasaki等人,2000；Lee等人,2007))的改善的分化方案，方案收率差的EB分化异源性性质基于神经子代的选择性存活。理解并选择性触发对于hESC中神经指示充分和必要的信号传导通路是这一努力的目标。
神经干细胞祖先和源自干细胞的神经亚型已经成为若干科学出版物和专利申请的焦点，但这些出版物缺乏控制干细胞结局最合意的条件，包括以下能力：以大量细胞开始，实现高度同质的所需细胞结局，并使用不含饲养细胞的方案及在贴壁条件下。Shang等人和Reubinoff人,Nature Biotechnology 19,1134-1140(2001)允许神经细胞类型的被动发育，但不能控制神经分化。
III.干细胞分化
美国专利申请公开第2009/0035285号教导了依赖于EB和菊形团形成产生神经细胞的方法，在此将其并入作为参考。美国专利第6,833,269号提供了依赖于使用饲养细胞和EB形成的细胞分化，在此将其并入作为参考。美国专利第7,011,828号(在此将其并入作为参考)、和申请公开第2005026747号(在此将其并入作为参考)和第20060078543号(在此将其并入作为参考)教导了hESC的增殖和富集种群，其分化成神经祖细胞、神经元或神经胶质细胞。美国专利第6,887,706号教导了使用FGF2将heESC分化成神经前体细胞、从而通过撤出FGF2并在鸟氨酸和层粘连蛋白基板上铺布而诱导体外分化的方法，在此将其并入作为参考。美国专利第7,368,115号教导了用垂体腺苷酸环化酶激活多肽使神经干细胞或神经干细胞子代分化。
在Erceg等人,Stem Cells.January；27(1):78–87(2009)的综述中，在此将其并入作为参考，作者注意到最近公开的干细胞朝向神经谱系分化的方案最重要的担忧在于：(i)非神经细胞污染的风险；(ii)干细胞系、基质胶(Matrigel)或条件培养基的使用，包括依赖于EB形成的方法，具有病原体交叉转移的风险。前述专利或专利申请无一教导在本发明存在的条件下由干细胞得到神经细胞谱系的均质种群。
本发明进一步涉及获得源自人胚胎干细胞(hESC)的神经祖细胞种群的方法，具体地，用于获得神经底板组织的方法。具体地，本发明的一些方法诱导hESC中神经底板发育，用于获得多巴胺(DA)神经细胞。而且，使用本发明一些方法得到的神经底板组织预计作为用于改变分化路径的诱导剂(即图式化)与其他组织共培养。
目前在人ES细胞(hES)中的神经诱导方案依赖于胚状体形成、***饲养层共培养或选择性存活条件；这些策略显示出重大缺陷，例如培养条件明确性差、分化拖延和收率低。
在一实施方式中，本发明考虑包括两种SMAD信号传导抑制剂的协同作用的方法。例如，发现Noggin和SB431542足以在贴壁培养条件下诱导迅速、完全的hESC神经转换(双SMAD抑制方案)。时间性结局分析显示出短暂的FGF5+上胚层样阶段，然后是具有菊形团形成能力的PAX6+神经细胞。最初的细胞密度决定CNS与神经嵴子代的比例。hiPSC定向分化成中脑多巴胺和脊髓运动神经元证实了新诱导方案的稳健性和普适性。基于Noggin/SB4315242的神经诱导应当大大促进hESC和hiPSC在再生医学和疾病模型中的应用，并消除对于***饲养层或基于EB的方案的需求。而且，该方法适应于可以提高得到神经细胞的便利性、收率和速度的培养***。这不应视作限定培养加入额外的分子或生长因子，或考虑结合本领域的其他方法。
许多证据表明了SMAD信号传导在神经诱导中的作用。尽管Noggin或SB431542共处理提高了神经诱导的效率，但单独的处理无一足以在明确的或贴壁条件下使hESC发生神经上的转换。本文显示的数据测试了使用Noggin和SB431542的结合的SMAD信号传导阻断是否足以实现完全的神经转换，并消除对基于EB或***饲养层的方案的需求。
在一实施方式中，本发明考虑一种用于诱导hESC同质神经分化的建立均匀细胞分布的方法。出于该目的，将未分化的hESC分离成单一细胞，并在补充有ROCK抑制剂Y-27632的条件培养基中重新平板接种到覆盖基质胶的皿上(Wananabe等人,2007)。72小时之后，将细胞从hESC条件转换成含有Noggin、SB4315242或两种因子的敲除血清置换培养基(KSR)，并使其分化共计11天(图1a)。当存在Noggin和SB431542时，24小时之后观察到oblige co-Smad、Smad 4的核定位降低(图2)。通过神经外胚层分化早期标志物PAX6的表达监测神经诱导(Callaerts,等人,.Annu Rev Neurosci 20:483(1997))。
与单独使用Noggin或SB431542时小于10％PAX6+细胞相比较，Noggin和SB431542结合处理将神经诱导效率大大增加至大于全部细胞的80％(图1b)。协同作用是出人意料地，有若干种促成noggin和SB431542协同作用的可能机制。这些包括，但不限于，使激活素和Nanog介导的多能性网络去稳定化(Xu等人,Cell Stem Cell 3(2):196(2008))、抑制BMP诱导的朝向滋养层谱系的分化(Xu等人,Nat Biotechnol 20(12):1261(2002))、通过抑制内源性激活素和BMP信号抑制中/内胚层结局(D'Amou等人,Nat Biotechnol 23(12):1534(2005))和通过BMP抑制促进原始外胚层的神经化(Laflamme等人,Nat Biotechnol 25(9):1015(2007))。
基因表达的时间性分析显示，用SB431542处理诱导Nanog表达的迅速丧失(图4)和CDX2表达的大大增加(图1c)。这些数据表明，SB431542介导的多能性的丧失与朝向滋养层谱系的分化有关。在Noggin或Noggin/SB431542的存在下CDX2的抑制说明，Noggin的一项作用是抑制在分化时驱动滋养层结局的内源性BMP信号。Noggin/SB431542处理过的培养物中显著的SOX1诱导证实了双SMAD抑制方案中强烈的朝向神经外胚层谱系的倾向。另外有抑制另外可选的胚胎胚层的证据，例如，Noggin介导的SOX17的抑制(内胚层谱系)和SB431542介导的Brachyury的抑制(中胚层谱系)(图1c)。总之，这些结果表明，SB431542和Noggin在分化的多个阶段协同工作，实现有效的hESC神经转化。
对加入两种抑制剂之后hESC子代的谱系进程进行表征。免疫细胞化学分析显示，到第5天OCT4表达丧失，到第7天PAX6的表达强烈(图1d)。这些数据指向，在分化第5天有对OCT4和PAX6二者均呈阴性的中间体细胞类型存在。基因表达分析揭示，与在神经结局定型过程中保持其表达的另一上胚层(epiblast)标志物Otx2的高表达相随，在分化第5天有上胚层标志物FGF5的峰表达(图1e)。最早期表达的神经标志物是SOX1(图1f)，其在其他神经上皮标志物例如ZIC1或PAX6的诱导之前，并且在前CNS(FOXG1)和神经嵴(p75)标志物的表达之前。SOX1的早期诱导不同于之前表明PAX6表达在SOX1诱导之前的研究(Munoz-Sanjuan等人,Nat Rev Neurosci 3(4):271(2002))。解释这一差异的一个可能性可以是通过SMAD信号传导对SOX1转录的直接调节。近来，说明了用于建立稳定的小鼠(Munoz-Sanjuan等人,Nat Rev Neurosci 3(4):271(2002))和hESC(Placantonakis等人,Stem Cells 27(3):521-532(2009))转基因报道基因系的方法，上述转基因报道基因系携带改造成在细胞类型特异性启动子的控制下表达GFP的细菌人工染色体(BAC)。本文所用的数据使用HES5::eGFPBAC转基因hESC报道基因系，其标记神经干细胞和前体细胞子代，以测量神经诱导的效率(Tesar,Nature 448:196-199(2007)；Placantonakis等人,Stem Cells 27(3):521-532(2009))。
将双SMAD抑制方案与Noggin存在下的标准MS5方案(Perrier等人,Proc NatlAcad Sci U S A 101(34):12543(2004))相比较。出于该目的，在MS5饲养细胞或SB431542的存在下将HES5::eGFP细胞铺布在补充有Noggin的培养基上，并使其分化13天——在两种条件下均很容易观察到GFP+细胞的阶段(图4)。通过流式细胞术对GFP表达进行定量。使用非修饰的H9细胞作为阴性对照。基于对细胞表面分子CD105的阴性选择，将MS5细胞从分析中排除(图5)。双SMAD抑制在第13天产生82％GFP+细胞，与MS5/Noggin方案相比较，增加大于3倍(图1f)。
与要求以低密度平板接种hESC集落的MS5方案相比较(Li等人,Nat Biotechnol23(2):215(2005))，Noggin/SB431542条件允许高的平板接种密度。因此，除百分含量更高以外，双SMAD抑制方案还导致每个培养板的Hes5::eGFP+细胞绝对数量较大。
除了由hESC发育神经嵴干细胞(Lee等人,Stem Cells 25(8),1931(2007))(NCSC)以外，还报道了菊形团神经干细胞的分离(Elkabetz等人,Genes Dev.22,152-165(2008))(R-NSC)。本文公开的数据确定了双SMAD抑制方案中观察到的早期PAX6+神经外胚层细胞与之前所述的R-NSC和NCSC种群的谱系关系。免疫细胞化学分析表明，与R-NSC类似，PAX6+神经外胚层细胞表达通常的NSC标志物例如Nestin和R-NSC标志物，包括PLZF(图7a和7b；分化第11天)。但是，细胞结构和ZO1表达表明，神经上皮细胞在这些条件下是非极化的，并表现出ESC样细胞结构。这些非极化区域散布有由极化的柱状上皮细胞组成的R-NSC样区域(图7c)。在随后的传代时进一步探讨这两种细胞种群的发育序位。在这些条件下早期神经上皮细胞自发地转换成具有顶端ZO1表达和动力间核迁移证据的菊形团结构(图7c、7d)。这些数据说明，Noggin/SB431542方案产生能够形成菊形团的早期PAX6+神经上皮种群。因此，早期PAX6+细胞可以代表迄今分离的最原始的源自hESC的神经前体阶段。已经显示R-NSC默认地获得前CNS标志物(Elkabetz等人,Genes Dev.22:152–165(2008))。经由双SMAD抑制方案产生的PAX6+神经上皮细胞表现出前CNS特征，如类似于R-NSC(Elkabetz等人,Genes Dev.22:152–165(2008))的Otx2和FoxG1B的表达所证实(图7e、f)。PAX6阴性细胞在这些条件下共表达神经嵴标志物，其包括AP2、HNK1、PAX7和p75(NGFR)(图2g-j)。对初始hESC平板接种密度的操纵使PAX6+CNS与PAX6-神经嵴样细胞的比例偏斜。高平板接种密度导致朝向PAX6+细胞的偏向分化，而低密度促进神经嵴样分化(图8)。在菊形团形成之前存在大量的神经嵴样细胞表明，双SMAD抑制产生不同于源自R-NSC的NCSC的早期神经嵴种群(Lee等人,Stem Cells25(8):1931(2007))。支持早期神经嵴种群具有不同的谱系潜力的观点，细胞会很容易富集共表达黑素体标志物HMB45的色素细胞(图7k和7l，详情参见实施例)。相反，源自R-NSC的NCSC通常在相当的条件下不产生色素细胞(Lee等人,Stem Cells 25(8):1931(2007))。但是，一些HMB45+细胞并不共表达神经嵴标志物SOX10，表明存在其他的色素细胞种群，包括PAX6+视网膜色素上皮细胞。
前后侧(AP)和背腹侧(DV)身份以及神经亚型潜能依赖于早期暴露于形态发生因子例如视黄酸、FGF8和SHH。另外对经由双SMAD抑制方案产生的细胞的图式化(patterning)潜能进行评价。例如，分化第5天可以呈现适当的神经图式化发育窗口，因为在第3天和第5天之间Oct4表达是沉默的，在第5天和第7天之间在大多数细胞中神经标志物PAX6得以激活(图1d、e)。分别在分化第5天和第9天开始暴露于SHH和FGF8(Tomishima等人,Stem Cells25(1),39(2007))之后，观察到表达多巴胺神经元标志物的细胞的衍生(图2m)。SHH暴露之后1周，取消FGF8和SHH二者，并进一步在含有BDNF、抗坏血酸、GDNF、TGF-β3和环AMP(BAGTC(Tomishima等人,Stem Cells25(1),39(2007)，参见图7m)的培养基中分化。在分化第19天，神经元大部分Tuj1+神经元共表达多巴胺合成中的限速酶酪氨酸羟化酶(TH)(图7n、o)。即使在不存在细胞传代的情况下，在这些条件下自发地产生TH+神经元。但是，在分化第12天机械分离和全体传代之后，具有长神经突的更加成熟的TH+细胞的衍生得以促进。
暴露于BDNF、抗坏血酸、SHH和视黄酸(BASR；分化第19天)时两周观察到运动神经元标志物ISL1和HB9的核表达，证实了体细胞型运动神经元的衍生(图7q、r)。运动神经元衍生限于在分化大约第11天传代的培养物，表明在非常高的细胞密度下，图式化反应降低，如对于源自hESC的R-NSC所观察(Elkabetz等人,Genes Dev 22(2),152(2008))。这些数据说明，与使用基质饲养细胞介导的诱导方案时30-50天相比较，在短的分化期(大约19天)之后，Noggin/SB431542处理过的神经子代有强烈的图式化反应且衍生相关神经元亚型(Lee等人,Stem Cells 25(8),1931(2007)；Tomishima等人,Stem Cells 25(1),39(2007))。
作为在此所用的特定Smad抑制剂的替代，可以使用另外可选的抑制剂或机制阻断两种不同的Smad路径。Dorsomorphin是靶向相同路径的替代Noggin的小分子。浓度范围10uM至30nM，各单独的量加入至10uM SB431542。基于PAX6+细胞百分含量而言的效率没有用Noggin/SB431542那样高，但dorsomorphin与SB431542的组合使得得到相同效率和细胞活力所需的Noggin浓度降低15倍。尽管目前并没有已知的阻断整个目标范围的SB431542的替代小分子，使用其他的分子也是可能的，但该例子说明总Smad掩盖了两种已知的路径，并可以导致强烈的协同效应，其产生高度同质的神经细胞种群。这些另外可选的方法还可以包括通过包括但不限于以下机制的Smad阻断：干扰DNA(包括反义、siRNA、shRNA和本领域已知的标准方法)或超量表达可以阻断Smad 4功能、与之竞争或以其他方式存在的蛋白质(例如超量表达Smad 7)。
就存活、迁移和在哺乳动物中按需发挥功能的能力来测试特定细胞结局。来自使用Noggin和SB431542方案、然后是多巴胺神经元诱导方案进行分化的hiPSC的神经源性组织的移植可以在受体小鼠(具体地，Nod/SCID)的脑中进行，评价细胞的移植潜能。
而且，当细胞由Noggin和SB431542方案朝向更加成熟的神经元(运动神经元和多巴胺神经元)进一步分化时，可以观察色素细胞。该数据说明，正在产生黑素细胞和视网膜色素上皮细胞二者。此外，观察到PAX6+中枢神经***祖细胞和PAX6-HNK1+周围神经***祖细胞。最近的出版物已经报道了将人类体细胞重新编程为诱导的多能干细胞(hiPSC)(Takahashi等人,Cell 131(5),861(2007)；Suter等人,Stem Cells 27,49–58(2008))。
接下来确定双SMAD抑制是否可以用于可靠地产生广泛的源自hiPSC的神经细胞类型的集合。考虑到hiPSC克隆中预计的固有变异性，可重复的分化结果将会证实本文公开的分化方案的稳健性。例如，使用人胎儿肺成纤维细胞用cMYC、KLF4、OCT4和SOX2的慢病毒转导，产生两种hiPS克隆(IPSC14、IPS C17；图9a-i和a-ii)。两种克隆在未分化阶段表达多能性标志物，包括Nanog、Tra-1-60和SSEA-3，并能够分化成三种胚层的衍生物。在经由noggin/SB431542方案神经诱导时，到分化第11天两种克隆均产生近乎同质的PAX6+细胞种群(图9b-i、b-ii)。使用上述策略操纵细胞密度、传代和图式化因子，两种hiPSC克隆均很容易朝向产生以下而偏斜：HNK1+假定神经嵴子代(图9c-i、c-ii)、源自hiPSC的R-NSC(图9d-i、d-ii)和源自特定hiPSC的神经元亚型，包括体运动神经元(图9e-i、e-ii)和多巴胺神经元(图9f-i、f-ii)。这些数据证明了双SMAD抑制策略在hESC分化以外的稳健性和模块性(modularity)。在一实施方式中，本发明公开的方法提供有效、明确和稳健的用于快速产生源自hiPSC的神经细胞类型的平台。
因此，发现了通过将两种信号传导抑制剂即SB431542和Noggin组合的新的神经分化方法。尽管本文所示的大多数研究使用11天的处理期，随后的研究表明，当处理缩短至分化的最初5天时，可以实现相当的神经诱导水平(图10)。这种处理时间的降低应当进一步降低复杂性和成本，特别是在重组Noggin的情况下。在一些实施方式中，SMAD信号传导抑制剂被骨形成蛋白(BMP信号传导)路径的抑制剂代替。BMP路径的小分子抑制剂也是可利用的，其可以潜在地取代noggin功能并进一步降低成本。因此，在一些实施方式中，noggin被Dorshomophin替代。在其他实施方式中，noggin被LDN-193189替代，示例性结构参见(另一例子，“StemoleculeTMBMP抑制剂LDN-193189”StemGent,Cambridge,Massachusetts)。
颅基板是对于形成晶状体、鼻腔上皮、耳结构、腺垂体细胞和包括三叉神经神经节的多种颅神经来说的至关重要的暂时性发育结构。由于发育过程中组织的不可接近性以及有效标志物的缺乏，关于人基板生物学知之甚少。本领域限于从其他物种例如爪蟾、斑马鱼、鸡以及较少程度上小鼠的发育外推。
在一实施方式中，本发明考虑由人胚胎干细胞(hESC)衍生颅基板和源自基板的感觉神经元。使用改良的双SMAD抑制方案，在分化11天内以高收率(71％总细胞)得到Six1+源自hESC的基板前体。Six1+细胞共表达其他的假定基板标志物，例如眼缺失同源物1(果蝇属)(Eya1)、Dachshund同源物1(Dach1)、眼缺失同源物4(果蝇属)(Eya4)和SIX同源框3(Six3；sine oculis同源框同源物3(果蝇属))，时间性转录组分析识别出额外的基板和亚基板特异性标志物。在不存在HNK1表达的情况下基于p75的表达分离前瞻性的泛基板(pan-placode)前体细胞。特定的增强子GFP构建物使得能够将具有假定特异性的基板细胞标记成基板区域的子集。将源自人ESC的基板细胞高度有效地转化成表达以下的感觉神经元的纯种群：胰岛素基因增强蛋白ISL-1(Isl1)、脑特异性同源框/POU结构域蛋白3A(Brn3a)、β-III-微管蛋白(Tuj1)和外周蛋白。源自hESC的基板的分离代表了研究人基板发育的新的模型***，并且能够得到无限量的之前得不到的感觉神经元种群用于感觉功能和疼痛的研究。
颅基板是产生周围嗅觉***、晶状体、垂体前叶、和包括三叉神经神经元的感觉神经节的暂时性发育结构。基板发育中的缺陷与一系列人先天缺陷有关，包括失明、失聪和丧失嗅觉(Baker等人,Dev Biol,232(1):1-61(2001)；Bailey等人,Curr Top Dev Biol,72:167-204(2001)，在此将其全文并入作为参考)。颅基板发育已经在不同模式生物中得以良好表征，包括爪蟾、鸡和斑马鱼(Baker等人,Dev Biol,232(1):1-61(2001)；Bailey等人,Curr Top Dev Biol,72:167-204(2006)；Bhattacharyya等人,Curr Opin Genet Dev.14(5):520-6(2004)；和Baker等人,Development,2000.127(14):p.3045-56，在此将其均并入作为参考)。尽管基板生物学在发育和疾病中具有重要性，但人基板发育仍然尚未探索。这主要是因为早期人基板组织的不可接近性以及相关的缺乏适当的标志物和技术。
胚胎干细胞具有独特的在保持分化成构成成体有机体的各种细胞类型的能力的同时以接近无限的方式自我更新的能力。在人发育过程中，内细胞团(ICM)的多能细胞和产生人ES细胞的上胚层产生三种胚层和所有的后续衍生物，包括基板细胞。一个问题在于，使用基于人ES细胞的体外培养***，是否约束人ICM的体内分化潜能。
在过去数年已经开发出若干方案用于将人ES细胞定向分化成各种组织特异性细胞类型，例如中脑多巴胺神经元(Perrier等人,Proc Natl Acad Sci USA,101(34):12543-8(2004)，在此将其并入作为参考)、脊髓运动神经元(Li等人,Nat Biotechnol,23(2):215-21(2005)，在此将其并入作为参考)、多能间叶细胞前体(Barberi等人,PLoS Med,2(6):e161(2005)；Barberi等人,Nat Med,2007.13(5):642-8，在此将其并入作为参考)、心肌细胞(Laflamme等人,Nat Biotechnol,25(9):1015-24(2007)，在此将其并入作为参考)和肝细胞样细胞(Agarwal等人,Stem Cells,26(5):1117-27(2008)，在此将其并入作为参考)。定向分化成周围神经元身份的细胞已经通过神经嵴前体中间体实现。最初关于产生源自人ES细胞的神经嵴细胞(Lee等人,Nat Biotechnol,25(12):1468-75(2007)，在此将其并入作为参考)的方法是基于促进神经诱导的MS5共培养***(Perrier等人,Proc Natl Acad SciUSA,101(34):12543-8(2004)；Barberi等人,Nat Biotechnol,21(10):1200-7(2003)，在此将其并入作为参考)。MS5培养***已经成功用于由人ES细胞和人IPS细胞得到并分离各种神经嵴结局，以及用于模拟家族性自主神经功能异常(FD)、影响源自神经嵴的神经元的罕见人遗传病(Lee等人,Nature,461(7262):402-6(Epub 2009Aug 19)，在此将其并入作为参考)。
最近，报道了基于BMP和TGFb/激活素/Nodal信号传导通路伴随抑制的明确的神经诱导策略。Chambers等人,Nat Biotechnol,27(3):275-80(2009)，在此将其并入作为参考。暴露于Noggin(N)和SB431542(SB)在贴壁培养条件下导致人ES细胞或IPS细胞朝向神经结局同步、迅速地分化，因此消除了诱导过程中对共培养和胚状体形成的需求。使用N-SB方案的更加迅速、同步的分化反应使得能够测试体外偏向发育结局中特定形态发生素的精确关系。
在一些实施方式中，改良的N-SB方案使得可以有效得到高度富集的基板前体种群。N-SB诱导后48小时取消noggin处理时，以神经外胚层为代价诱导基板结局。这些数据说明了使用N-SB诱导***优化非CNS衍生物的产生，说明内源性BMP信号传导在hESC分化过程中的重要性，并且能够得到无限量的基板衍生物例如颅感觉神经元用于研究感觉功能和疼痛。
来自本文所述研究的若干观察结果表示如下，以用于本发明的一些方法中。
A.HESC分化过程中依赖BMP的基板结局特化
BMP对体内早期胚胎结局特化发挥广泛的影响，并参与各种胚胎外结构的特化、发育完全的中胚层细胞的决定、非神经外胚层、基板和神经嵴组织的特化。使用N-SB培养***能够高度同步、有效地分化人ES细胞。本文对N-SB***的研究数据说明，两种BMP的剂量和应用时机可以调节基板结局的特化。关于该***是否类似地用于优化朝向非神经外胚层结局的分化和产生原始皮肤前体细胞尚有重要问题。数据说明，在改良的N-SB培养条件下Six1阴性细胞的子集表达发育过程中早期表皮前体的已知标志物p63。
B.人胚胎干细胞(ES)细胞分化过程中假定泛基板结局的出现
人ES细胞分化过程中朝向Six1+结局的高效分化以及又称ISL LIM同源框1(Isl1)+细胞的胰岛素基因增强蛋白ISL-1的迅速出现表明，源自hESC的细胞最初可以采取前基板前体结局。前基板区域的出现已经在爪蟾和斑马鱼发育过程中得以描述，在围绕前神经外胚层细胞的最前侧区域的胚胎中产生马蹄铁状区域。本文所示的数据报道了由Six1+基板区域产生感觉神经元前体。但是，将来的研究可以着重于这些基板细胞在暴露于另外的分化方案时这些基板细胞的可塑性。可以特别关注腺垂体细胞的衍生，以研究不同的产生激素的细胞类型的特化。这些细胞得到关注用于发育研究并用于致力于确定激素释放药理学控制的研究。大致上，在Six1+阶段15％的细胞表达腺垂体前体细胞的标志物Lhx3。在改良的N-SB方案中在分化第11天在人ES细胞分化过程中观察到CGA的表达，CGA是腺垂体激素产生中的前体蛋白质(图12D)。Lhx3+假定腺垂体前体细胞的存在和CGA的表达说明，腺垂体谱系细胞很容易使用改良的N-SB方案诱导。
C.由Six1+基板前体特化感觉神经元
本文公开的发现结果显示了改良的N-SB方案中产生的感觉神经元种群的基板起源。这基于前体簇集物中Six1的表达其分离用于随后的感觉神经元产生和早期感觉神经元中Six-1的共表达。源自基板的感觉神经元与源自神经嵴谱系的感觉神经元共享多种的标志物，例如Brn3A、Isl1和外周蛋白。但是，改良的N-SB方案显示出FoxG1B和在基板前体中表达、早期神经嵴谱系中不表达的其他前侧标志物的高度有效的诱导。初始细胞密度(Chambers等人,Nature Biotechnology27(3)275-280,2009,Corrigendum:in NatureBiotechnology 27(4):1)和Wnt信号传导的调节(参考文献)可以使得能够特化源自基板与神经嵴的感觉神经种群。接近高度提纯的颅感觉神经元种群代表着未来开发高通量药物发现测定的新工具。例如，考虑到已知的临床症状与三叉神经功能紊乱有关，可以特别关注调节源自基板的三叉神经神经元的化合物。
E.由人胚胎干细胞特化功能底板组织以前侧神经外胚层为代价发生
底板(FP)是神经发育过程中关键的信号传导中心，其位置沿着胚胎的腹侧中线。由于缺乏组织可接近性，关于人的FP发育知之甚少。本公开内容说明了人胚胎干细胞(hESC-)的衍生和随后衍生的FP组织，其能够分泌Netrin-1和SHH，并影响初生和源自hESC的组织的图式化。hESC中的FP诱导依赖于早期SHH暴露，并以前侧神经外胚层(AN)为代价发生。全基因表达和功能研究识别出SHH介导的DKK-1抑制是AN抑制的关键因子。源自hESC的FP组织显示出具有前侧SIX6+特征，但响应于抑制SIX6表达并诱导区域特异性SHH增强子表达转换的尾化因子。这些数据建立了作为实验模型***的源自hESC的FP，并明确了调节FP与AN特化的早期信号传导事件。
神经发育在时间和空间上由指导神经前体身份的一组复杂信号支配。尽管已经在动物模型中作出重大进展，但人神经发育仍保持知之甚少。人胚胎干细胞(hESC)提供了可取得并可操纵的细胞平台，以模拟人发育的早期阶段。
之前的研究已经报道了小鼠(Wichterle等人,2002；Barberi等人,2003；Watanabe等人,2005)和人(Perrier等人,2004；Li等人,2008；Eiraku等人,2008)ESC响应于确定前侧/后侧(A/P)和背侧/腹侧(D/V)CNS身份的图式化因子而定向分化成特定的神经元类型。这些研究说明了指定主要CNS区域的信号传导***的进化保守性。在哺乳动物中，音猬因子(SHH)是以依赖于剂量的方式发挥作用指定不同腹侧细胞类型的腹侧化(ventralizing)因子，上述细胞类型包括在最初的神经外植体(Briscoe和Ericson,1999)和小鼠ES细胞(Mizuseki等人,2003)中的表达底板(FP)的细胞。尽管将SHH应用于源自hESC的神经细胞已经显示出诱导各种腹侧神经元类型，底板(FP)组织自身的衍生尚未有报道。由于FP是一信号传导中心，由人ES细胞产生FP的能力将会是朝向进一步理解早期人神经发育的一步。
FP沿着腹侧神经管最内侧延续，最尾部从脊髓通过中脑延伸直至间脑，其前部限正好在丘脑内带状界膜(zona limitans intrathalamica)以下(Jessell等人,1989)。在最前侧FP在前神经外胚层(AN)开始处停止。研究已经显示，AN定型使得细胞不能响应于FP诱导型信号(Placzek等人,2003)。经典研究已经显示出FP细胞表现出独特的扁平形态，并且表达FP特异性标志物，包括SHH、FOXA2、F-Spondin和Netrin-1(Placzek,1995)。小鼠和鸡胚胎中的研究已经识别出两种FP的主要组织者功能：分泌使腹侧神经管图式化的形态发生素SHH(Placzek和Briscoe,2005)，和表达指导跨中线的连合轴突的Netrin-1(Charron等人,2003)。FP通常视作是非神经源性区域。但是，小鼠中的遗传谱系绘制研究最近已经报道，中脑FP选择性地表现出神经源性潜能，并且是腹侧中脑多巴胺神经元的来源(Kittappa等人,2007；Ono等人,2007；Joksimovic等人,2009)。
迄今，由于缺乏组织可接近性，关于人的FP发育知之甚少。在哺乳动物中，FP是产生SHH的主要位点，若干种人发育疾病与中线SHH信号传导的变更有关(Mullor等人,2002)，其包括某些形式的前脑无裂畸形和小眼，骨骼疾病，包括各种腭裂综合征，和肿瘤状况，例如Gorlin’s综合征；SHH受体Patched 1中的突变导致的罕见遗传疾病。因此，理解人FP如何产生将有助于人神经图式化和轴突路径找寻的比较发育研究，产生的细胞可以潜在地用作具有FP起源的特异性神经元类型的来源。
作为首个在体外产生人发育组织体结构的例子，本文提供的数据说明了示例性的hESC定向分化成FP组织。例如，人FP特化可以依赖于早期的高剂量SHH信号传导，该信号传导抑制DKK1介导的AN特化。FP的功能性通过Netrin-1和SHH的分泌以及在最初的小鼠和大鼠外植体中诱导异位FP组织和神经突增生表现。
源自人ESC的FP默认采取前侧身份，但响应于尾化诱因而特化成后侧结局，提供了区域特异性FP组织的获取方法。在此提供的实验***，结合所描述的通过SMAD信号传导双抑制用于人ES和iPS细胞高度有效的神经转化的组合物和方法(Nat.Biotechnol.26,275–280(2009)；2009年3月1日在线公开；2009年3月16日印刷后更正,Corrigendum:Chambers等人)，应当有助于早期人神经发育过程中至关重要的FP介导的信号传导事件的研究。
IV.干细胞系
本发明并不限于使用任何特定类型的人干细胞。实际上，考虑使用许多种类型的人干细胞。用于从人、猴子、小鼠、大鼠、猪、牛和绵羊获得全能或多能细胞的方法之前已经描述。参见，例如，美国专利第5,453,357；5,523,226；5,589,376；5,340,740；和5,166,065号(在此将其均明确地并入作为参考)；以及Evans等人,Theriogenology33(1):125-128,1990；Evans等人,Theriogenology 33(1):125-128,1990；Notarianni等人,J.Reprod.Fertil.41(Suppl.):51-56,1990；Giles等人,Mol.Reprod.Dev.36:130-138,1993；Graves等人,Mol.Reprod.Dev.36:424-433,1993；Sukoyan等人,Mol.Reprod.Dev.33:418-431,1992；Sukoyan等人,Mol.Reprod.Dev.36:148-158,1993；Iannaccone等人,Dev.Biol.163:288-292,1994；Evans&Kaufman,Nature 292:154-156,1981；Martin,ProcNatl Acad Sci USA 78:7634-7638,1981；Doetschmanet al.Dev Biol 127:224-227,1988)；Gileset al.Mol Reprod Dev 36:130-138,1993；Graves&Moreadith,Mol ReprodDev 36:424-433,1993；和Bradley等人,Nature 309:255-256,1984。
在一些实施方式中，考虑使用未分化的人胚胎细胞系，例如，细胞系WA09等。
V.双SMAD分化
本文所述研究的一个结果，是源自胚胎细胞的FP组织的“默认”性质和前侧倾向。在此所示的NSB(Chambers等人,2009；图18)和FP(图18)诱导方案中缺乏任何明显的中胚层中间体，表明神经外胚层和FP组织的体外衍生不依赖于任何额外的源自中胚层的信号。与斑马鱼中的数据相比，其中nodal被视作是FP诱导必需的(Placzek和Briscoe综述,2005)，即使在TGFb/激活素/Nodal信号传导抑制剂SB431542的存在下，FP诱导也很容易发生。在此报道的FP组织的前侧默认性令人联想到源自hESC的神经外胚层细胞中观察到的前侧默认性。鸡发育的研究已经提出两种不同的前侧与后侧FP起源，即上胚层和轴中胚层中的祖先(Placzek等人,2003)。该数据说明，人FP前体细胞与神经外胚层细胞类似，能够响应于包括FGF8和Wnt-1的尾化因子朝向后侧FP身份再特化(respecify)。
迄今，尚未清楚地显示AN标志物的表达是否抑制细胞产生某些谱系的能力。在源自hESC的神经菊形团细胞中，BF1的表达并不排除朝向后侧CNS结局包括HB9+成体运动神经元的图式化。
但是，与BF1-阴性菊形团相比较(Elkabetz等人,2008)，产生尾部神经元结局的效率显著降低。之前在初始小鼠外植体中的研究说明，AN细胞没有能力响应于单独的SHH而分化成FP细胞(Placzek等人,1993)。本发明的发育过程中所述的方法和结果显示了不能FP特化的AN定型。
本文所述的另一关键发现是NSB-介导的神经分化过程中DKK-1的剧烈(强烈)诱导。在小鼠ESC的神经分化过程中，暴露于外在的DKK-1在不含血清的胚状体(SFEB)条件下提高了AN诱导(Watanabe等人,2005)。因此，本发明的一些实施方式预计，神经分化过程中内源性DKK-1的早期诱导至少部分地是hESC中观察到的AN默认表型的原因。在此的功能研究说明，使用阻断抗体抑制DKK-1显著提高了FP收率。而且，在第5天或更晚的时间点与SHH一起加入DKK-1抗体不足以延长FP反应能力的时间性窗口(图19H和19I)。类似地，向神经菊形团阶段细胞中加入WNT(Wnt-1、Wnt3A或GSK抑制剂(BIO))不足以诱导FP反应能力(图25)。这些数据说明，非常早期的DKK1介导的AN倾向抑制源自hESC的前体的FP潜能。
BF1敲低(knockdown)的hESC系中额外的数据显示了随着后侧CNS细胞类型例如HB9+运动神经元的收率提高，FP收率提高。因此，本文所示的模型***预计适合于评价其他具有WNT抑制功能的分子例如Cerberus(Bouwmeester等人,1996)对AN特化和FP结局抑制的贡献。最终，本文所述的***和方法得以识别出调节hESC中AN默认性的DKK-1表达的潜在的上游调节物。
通过早期暴露于高水平外部SHH而抑制DKK-1和随后AN结局的结果是出人意料的结果，因为SHH是经典的腹侧化因子，尚不知晓在神经发育过程中对AP特化施加影响。我们的研究没有解决通过SHH调节DKK-1是直接的还是通过诱导没有DKK-1表达的其它前体种群而引起的。尽管DKK-1抑制FP诱导，暴露于WNT1提高由hESC衍生FP组织。这些数据提出以下问题：诱导FP收率类似增加的RA是否会影响WNT信号传导，或者后侧结局的诱导是否独立于Wnt信号传导而提高FP收率。
无限数量的具有明确区域身份的FP细胞的可得性提供了研究人神经发育的有价值的工具。最近小鼠中的研究表明，一些区域的FP，在神经图式化和轴突路径找寻中的作用以外，还可以用作包括中脑多巴胺神经元的特定神经元类型的来源。基于中脑特异性标志物的表达和中脑特异性SHH增强子元件的激活，源自hESC的FP的区域身份的再特化(Re-specification)显示朝向中脑特征。发现源自hESC的FP组织能够产生TH+/FOXA2+假定中脑DA神经元的证据(图25)。本文显示的结果提供了对人FP与AN结局的诱导和区域特化的深刻理解，并建立了hESC作为有力的模型***，以产生适合于模拟人发育过程中更加复杂的相互作用的功能性组织者组织。
总之，本文所示的示例性数据显示，神经分化hESC通过增量调节DKK-1和随后的BF1默认朝向AN结局，而AN定型积极地抑制hESC子代中的FP能力。但是，早期高水平SHH降低DKK-1水平，使得能够以AN为代价进行FP诱导，同时DKK-1或BF1的功能丧失增加FP产生。因此，源自人ESC的FP默认是前侧的，但响应于尾化因子而后侧化。这一点总结于图6E。
因此，本发明的若干实施方式总结于下表中。
表A.用于获得本发明神经细胞的化合物量的示例性范围.
表B.用于产生本发明神经细胞类型的本发明化合物的示例性加入时间.
VI.颅基板细胞的特化
在一实施方式中，本发明考虑包括三叉神经、晶状体和垂体前叶基板谱系的特化的方法。在一实施方式中，本发明进一步包括使用改良的PIP条件的前体基板细胞的特化。尽管并无必要理解发明机制，据信使用改良的PIP条件也可以得到其他的基板结局。例如，将前基板细胞暴露于FGF8富集ASCL1的表达，其可与嗅觉基板结局相容(Balmer和LaMantia,2005)。暴露于尾化诱因例如WNT3A导致诱导共表达SIX1和SOX10的细胞种群，其可与耳基板结局相容。尽管要求进一步的优化，这些条件支持PIP代表颅基板结局特化的通用平台这一看法。
颅基板是感觉和内分泌器官发育必不可少的胚胎结构。尽管源自基板的组织的功能障碍造成严重的医学状况，但人的基板发育仍保持相当的难以接近。在一些实施方式中，公开了由人多能干细胞有效衍生颅基板。例如，定时除去神经诱导的双SMAD抑制策略中的组分BMP抑制剂Noggin，以其他CNS结局为代价触发基板诱导。另外可选地，伴随的FGF信号传导的抑制可以破坏基板衍生，并诱导表面外胚层。前基板阶段进一步的结局特化使得能够选择性地产生颅基板细胞，其包括，但不限于，能够体内移植的源自基板的三叉神经神经节、成熟晶状体纤维和在移植时在体内产生人GH和ACTH的产生垂体前叶激素的细胞。本文公开的数据建立起有力的实验平台以研究人颅基板发育，并准备开发感觉和内分泌疾病中基于人细胞的疗法。
由于缺乏易控制的实验***、早期人发育过程中该暂时结构的不易接近性以及没有经验证的人基板标志物，对人颅基板发育的理解富有挑战性。本文公开的数据解决了这些主要挑战，并建立起研究人基板和外胚层发育的通用平台(图40)。尽管之前的研究已经观察到某些基板衍生物例如晶状体(Ooto等人,2003；Zhang等人,2010)或耳基板衍生细胞(Chen等人,2012；Oshima等人,2010)的出现，特异性基板诱导的机制尚未解决，而且这些研究中没有提出基板特化的通用模型。
最近的研究已经报道了指导多能干细胞朝向基板结局的能力(Leung等人,2013；Mengarelli和Barberi,2013；Shi等人,2007)。但是，在这些条件下没有产生功能性人基板衍生物。相反，小鼠ESC中的研究已经成功地得到有功能的耳(Koehler等人,2013)和垂体(Suga等人,2011)基板衍生物。
特别关注的发育问题是基板细胞的起源。本领域普遍的假设是响应于来自邻近神经组织的诱导型信号，基板组织源于非神经外胚层(Schlosser,2006)。本发明公开的数据表明，基于TFAP2A表达先于SIX1的诱导、而TFAP2A在N-SB诱导过程中被抑制这一结果，人基板发育类似地起源于非神经外胚层。基于BMP的TFAP2A和GATA3的诱导可用于建立对基板诱导有反应能力的非神经外胚层谱系(Kwon等人,2010)。
通过抑制FGF信号传导以非神经外胚层为代价阻断基板诱导的能力进一步支持非神经外胚层起源，并表明内源性FGF信号可以是负责PIP中基板默认性的神经信号。在一实施方式中，考虑到在分化第7天(前基板)处理细胞诱发各种基板结局之间的开关，但是不影响基板与非神经外胚层结局细胞的比例，方法描绘了到第7天发育定型至基板结局的时间点。
之前的工作描述了FOXG1和DACH1是hPSC分化过程中前神经外胚层和神经菊形团阶段细胞的标志物(Chambers等人,2009；Elkabetz等人,2008)。在此所示的数据表明，在NSB条件下自发地出现百分含量少的SIX1+细胞。因此，致力于产生CNS谱系的分化研究应当解决源自hPSC的神经培养物中是否存在污染基板组织。
尽管理解发明的机制并无必要，但据信这些自发出现的基板细胞有可能是过去的神经分化研究中观察到的类晶状体(lentoid bodies)和其他基板衍生物的来源。本文所示的基因表达数据定义了一组宽泛的基因标志物。例如，之前已经报道OVOL2在小鼠上胚层和表面外胚层中得以表达，丧失OVOL2导致早期胚胎致死现象(Mackay等人,2006)。
在一实施方式中，本发明考虑OVOL2作为人前基板标志物。在其他实施方式中，FOXC1和ISL1是在前基板阶段特异性表达的额外转录因子。本文公开的数据提供了定义将颅基板身份与早期CNS、神经嵴和表面外胚层身份区分的转录网络的框架。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括对采用各种特定基板身份有反应能力的暂时性前基板种群。前基板区域的出现已经在爪蟾和斑马鱼的发育过程中得以描述(Bailey等人,2006；Martin和Groves,2006；Schlosser,2006)。本文所述的数据表明，PIP最初产生在进一步分化时自发地采取更加后侧的PAX3+眼三叉神经结局的PAX6+/SIX1+前侧前基板种群，有可能是因为内源性FGF和WNT信号的尾化作用。
在其他实施方式中，在分化第7天暴露于SHH或抑制FGF信号传导将假定的前基板前体导向为垂体前叶和晶状体基板结局。已经提出晶状体基板是鸡基板发育过程中的默认状态，FGF8是特化嗅觉基板结局充分和必要的(Bailey等人,2006)。小鼠ESC中的其他研究(Koehler等人,2013；Suga等人,2011)已经显示出使用复杂的3D培养***分别生成产生激素的垂体细胞和耳感觉神经元的可行性。
本文公开的数据说明，改良的PIP条件在不需要复杂的3D培养条件下情况下有效地产生人垂体前体。尽管在优先产生TBX19-相关垂体谱系包括产生ACTH的细胞中观察到倾向性，但可以得到全部三种主要前体谱系(GATA-2、TBX19和PIT1谱系，图38A)。因此，有可能方案的进一步优化将会提供单独的垂体激素谱系的选择性获取。
在一实施方式中，本发明考虑一种在体内移植颅基板细胞的方法。在一实施方式中，颅基板细胞包括垂体前叶细胞。在一实施方式中，移植在腿部肌肉上。在一实施方式中，移植在下丘脑-垂体轴组织上。在一实施方式中，移植在下丘脑上。在一实施方式中，移植在蝶鞍上。在一实施方式中，移植的垂体基板细胞产生并分泌垂体激素。
在一实施方式中，本发明考虑一种包括能够衍生三叉神经感觉神经元的基于PIP的分化的方法。已经报道了三叉神经神经元参与若干痛疼综合征，例如三叉神经麻痹、三叉神经痛和偏头痛(Love和Coakham,2001)。因此，产生大量三叉神经神经元的能力将尤其可用于模拟人的伤害感受，并用于在疼痛研究中开发基于细胞的药物筛选。另一重要应用将会是使用人iPSC模拟单纯疱疹性脑炎(Lafaille等人,2012)。HSV-1是在三叉神经神经节内以潜伏的形式特异性存留的病毒(Barnett等人,1994)。
由患者特异性iPSC得到三叉神经神经元的能力应当解决病毒潜伏控制中的缺陷是否促成单纯疱疹性脑炎的问题。三叉神经基板前体的强壮体内存活增加了开发未来再生方法的可能性，其目的是在机械、辐射或化疗导致的损伤之后神经修复。
尽管不必要理解本发明的机制，据信对再生医学显著的潜在影响可以来自于衍生功能性的产生激素的细胞。例如，垂体机能减退症是先天性缺陷、头部损伤或垂体瘤患者或接受放疗的患者中的治疗性干预的常见后果(Tabar,2011)。尽管可以给予替代激素，以使患者中的静止血清水平正常化，这种终身治疗的财务、后勤和医疗成本巨大。而且，激素替代疗法不能够响应于生理节律而动态释放，或者响应于环境或应激激发中的生理学变化而迅速调节。因此，产生大量功能性的产生ACTH和GH的细胞发起了小儿和成人患者中用于恢复内分泌功能的长期治疗性细胞替代策略的可能性。
A.颅基板发育
据信颅基板产生感觉器官细胞，上述感觉器官包括，但不限于，视晶状体、鼻粘膜、耳结构、腺垂体，以及颅神经子集，例如三叉神经神经节。
在发育过程中，在非神经外胚层和神经板的界面处形成感觉基板，其围绕未来中枢神经***(CNS)的前部(图27A)。
基板发育中的缺陷可以导致宽范围的人先天畸形，其范围从失明和失聪到激素失调或嗅觉丧失(Abdelhak等人,1997；Baker和Bronner-Fraser,2001；Ruf等人,2004)。迄今，颅基板发育已经在模式生物中得以表征，其包括青蛙、斑马鱼、鸡，以及程度较小的小鼠(Baker和Bronner-Fraser,2001；Bhattacharyya和Bronner-Fraser,2004；Schlosser,2006)。但是，由于不能获得早期人组织和缺乏特异性基板标志物，人基板发育在很大程度上尚未经探索。
人多能干细胞(hPSC)，包括人胚胎干细胞(hESC)和人诱导型多能干细胞(hiPSC)，具有在保持非常广泛的分化潜能的同时自我更新的潜能。最近数年，已经提出了将hESC的结局引导成特定细胞谱系的方案。例如，本领域开发的首个hESC分化方案当中有CNS细胞的衍生(Reubinoff等人,2001；Zhang等人,2001)。hESC分化成周围神经***的细胞也已实现(Lee等人,2007；Menendez等人,2011)。
与明确的CNS和源自NC的细胞类型的成功衍生和应用相反，在hPSC中模拟颅基板发育方面成功有限。近来，报道了基于骨形成蛋白(BMP)和TGF/激活素/Nodal信号传导通路的伴随抑制(双SMAD抑制(dSMADi))的神经诱导方案(Chambers等人,2009)。该策略使hPSC暴露于Noggin(N)和SB431542(SB)，其导致hPSC同步、迅速、有效地分化成许多种CNS细胞结局。
在一实施方式中，本发明考虑一种方法，其包括dSMADi诱导的分化过程中内源性BMP信号传导的去抑制(de-repression)，其足以选择性地诱导人颅基板。在一实施方式中，新的基板诱导方案(PIP)到分化第11天诱导所有细胞的>70％采用SIX1+颅基板前体结局。
在一实施方式中，本发明考虑一种识别能够分化成选择性基板结局的前基板谱系的方法，上述谱系包括，但不限于，三叉神经感觉神经元、成熟晶状体纤维和/或产生激素的垂体前叶细胞。在一实施方式中，三叉神经感觉神经元通过包括、但不限于以下的技术表征：标志物表达、电生理学和移植到发育中的鸡胚胎和/或成年小鼠CNS中。在其他实施方式中，该方法能够得到在体外和/或体内产生生长激素(GH)和/或促肾上腺皮质激素(ACTH)的人垂体细胞。
B.内源性BMP信号传导的去抑制以神经外胚层为代价诱导基板
为了解决之前报道的dSMADi方案(同上)是否适合于得到基板细胞，确定一组适当的基板标志物。基于模式生物中的研究，已经报道转录因子SIX、EYA和DLX家族的成员来标记人基板结局(Baker和Bronner-Fraser,2001；Schlosser,2006)。在外胚层谱系内，SIX1是基板特异性的，标记早期前基板区域和不同的特异性基板(Schlosser,2006)。基于鸡胚胎中的研究，在体内早期外胚层图式化过程中基板诱导依赖于FGF、BMP和WNT信号的复杂相互作用(Litsiou等人,2005)。外胚层内的BMP活性也被视作具体可用于分配结局。例如，最初已提出模型，其中高水平的信号传导促进表皮结局，适度水平诱导基板，中间水平特化NC，完全不存在BMP活性是形成神经板所要求的(Wilson等人,1997)。通过确认BMP信号传导在建立基板能力中的早期作用(Kwon等人,2010)，同时显示后续阶段要求BMP-抑制而不是BMP激活(Ahrens和Schlosser,2005；Kwon等人,2010；Litsiou等人,2005)，最近的研究已经对上述模型进行了修改。
为了测试早期BMP暴露是否促进SIX1+基板细胞的衍生，将SB(TGFβ抑制剂)处理过的hESC暴露于不同浓度的BMP4。但是，在SB的存在下加入BMP4导致巨大的形态变化和触发CDX2的诱导(图27B、27C)，与之前报道的BMP介导的滋养外胚层样谱系的诱导类似(Xu等人,2002)。
另外对N-SB分化过程中BMP抑制剂Noggin的定时取消进行测试，以确定基板结局是否可以由内源性BMP信号传导的去抑制来诱导。在进行时间进程分析期间在N-SB方案的不同时间点除去Noggin(图28A)。第11天的基因表达分析显示了在分化第2或3天取消Noggin时的DLX3、SIX1和EYA1的强壮诱导(图28B)。相反，在分化第1天取消Noggin导致在不存在SIX1表达和触发的形态改变以及CDX2表达的情况下诱导EYA1，表明有滋养外胚层分化(尽管CDX2和EYA1也可以在源自hESC的中胚层谱系中表达(Bernardo等人,2011))。
这些数据说明，EYA1在滋养外胚层和基板谱系中均得以表达，并且与SIX1共表达可以确定基板谱系。分化第11天对hESC子代的免疫细胞化学分析表明，在第3天(PIP条件)取消Noggin诱导如下转换：从N-SB条件下82％PAX6+神经外胚层细胞到PIP条件下71％SIX1+假定基板前体细胞(图28C、28D、27D)。SIX1+簇集物表达其他的基板标志物，例如EYA1、DACH1和FOXG1(BF1)(图28E)。
DACH1也在标记神经菊形团的前侧神经外胚层细胞(Elkabetz等人,2008)中表达，而在PIP处理过的培养物中DACH1标记基板簇集物(图27E)。PIP条件下基因表达的时间性分析显示了以下标志物的快速减量调节：多能性标志物(OCT4、NANOG)以及滋养外胚层(CDX2)(图28F)、中胚层(T)和内胚层(SOX17)(图28G)的标志物。基板中的SIX1表达在人初生组织中得以确认(Carnegie Stage 15，～5.5周p.c.；数据未显示)。SIX1也在骨骼肌、胸腺和肾细胞的前体中得以表达。
但是，骨骼肌(MYOD)、内胚层(SOX17)或中胚层(Brachyury(T))标志物的表达在PIP过程中没有检测到，确认了源自hESC的SIX1+细胞的基板身份。基于SOX10表达通过免疫细胞化学和SOX10::GFP(Chambers等人,2012；Mica等人,2013)报道基因系表达(图27F)，在PIP条件下观察到极少的(<1％)NC谱系细胞。
到第5天观察到颅基板标志物的诱导，FOXG1先于SIX1和DLX3的表达(图28H)。PIP方案在多种hESC和hiPSC系中得以验证(图27G、27H)。使用保守Eya1增强子元件(Ishihara等人,2008)进一步验证源自hESC的基板前体的身份。在增强子的核转染之后在嗅觉基板中很容易观察到GFP表达，但在证实特异性的年龄匹配的中脑培养物中没有(图27I-J)。在源自hESC的基板中，观察到在PIP中相对于N-SB，具有增强子活性的细胞的百分含量增加8倍(图27K)。
C.微阵列分析揭示新的人基板祖先基因表达
进行时间性转录组分析，以建立体外基板诱导过程的无偏性分子评价。在5个时间点(第1、3、5、7和11天)一式三份在对照N-SB与PIP处理过的培养物中收集RNA(图30A-E；所有原始数据可在GEO上获得(ncbi.nlm.nih.gov/geo/:Accession#pending)。在微阵列分析之前，验证各个样品的质量：一组基板标志物(SIX1、DLX3、EYA1)的表达以及不存在其他谱系标志物(FOXA2(内胚层)、SOX17(内胚层)、MYOD(骨骼肌)、CDX2(滋养层)和T(中胚层))。
簇集物和主要成分分析显示了到分化第7天在PIP与N-SB处理的细胞中转录组数据的时间性分离(图30A、29A)。转录组数据还确定了一组将基板结局区分于神经外胚层结局的基因(表S1、2)。为了获得对基板诱导过程中不同表达的特定基因的深入认识，对于各分化时间点进行了成对比较(图30B-E)。PIP条件下最高度富集的转录物当中有已知的基板标志物，例如GATA3、DLX5、DLX3、TFAP2A和TFAP2C。到分化第9天SIX1在微阵列分析中得以显著增量调节，尽管其并不在最差异化调节的基因当中。这些和其它基因的差异表达通过qRT-PCR验证(图29B)。
在WNT和BMP路径组分中观察到显著的转录变化，例如WNT路径抑制剂DKK-1和BMP拮抗剂例如GREMLIN-1和BAMBI增加(图30B-D)，其是BMP信号传导的已知转录目标(Grotewold等人,2001)。有趣的是，ISL1——据报道为感觉神经元、运动神经元、心脏祖先和胰岛细胞的标志物，也得以诱导(Hunter和Rhodes,2005)。基于ISL1表达的早期发生以及不存在中胚层结局，经总结在PIP条件下，ISL1代表早期人基板标志物。ISL1是PIP分化中诱导的最早的标志物之一。与TFAP2A和SIX1类似(图30F)，到分化第11天在大多数细胞中保持表达的ISL1蛋白部分地与SIX1共定位(图30G)。
本文公开的微阵列表达数据中识别的另一新的基板标志物是——OVOL2——锌指转录因子Ovo家族的成员。OVOL2在PIP过程中到分化第5天富集，基板簇集物显示出对于OVOL2的强烈免疫反应性(图30H)。相反，OVOL2在促进CNS(N-SB)或神经嵴(N-SB/CHIR(Chambers等人,2012；Mica等人,2013))结局的条件下被减量调节(图30I)。
还识别出额外的在前侧基板特化过程中差异化表达的基因，其包括FOXC1和HAPNL1(也称作CRTL1)。FOXC1在鸡发育过程中标记晶状体基板(Bailey等人,2006)，但也可以在前基板阶段表达(Sasaki和Hogan,1993)。HAPNL1是PIP中最差异化表达的基因之一，之前显示在表面外胚层和鸡神经板边界中得以表达(Colas和Schoenwolf,2003)。使用DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov/；(Dennis等人,2003))的基因本体论(GO)分析表明，在与感觉器官、外胚层和上皮发育有关的分化第7天和第9天，BMP和WNT路径转录物在PIP与N-SB条件下得以高度富集(图29C)。到分化第7天差异化表达的基因的总数增加(图29D、29E)，与提出的基板定型(commitment)的时间框架匹配。总之，本文进行的分子分析提供了人基板发育的初步路线图和未来功能性研究的重要资源。
D.用FGF抑制剂早期处理抑制基板并诱导表面外胚层结局
若干脊椎动物物种中的谱系研究表明，颅基板前体起源于表面外胚层，并被发源于邻近神经外胚层的信号诱导(Pieper等人,2012)，而不是具有神经起源。但是，对于人的发育没有这样的数据。
人基板诱导的假定时机(～第20天p.c.)(O'Rahilly,1987)使其成为很大程度上不可取得实验操纵的阶段。PIP过程中的基因表达数据表明，TFAP2A是最早增量调节并差异化表达的基因之一(图30B-E)。在小鼠发育过程中直系同源基因Tcfap2a(E7.5)的早期表达局限于未来的表面外胚层(Arkell和Beddington,1997)。
本文所示的数据说明了TFAP2A诱导在PIP第5天的初始检测，而在N-SB方案中不存在(图32A)。这一观察结果表明，PIP第3天至第5天期间对应于朝向表面外胚层发育的定型。SIX1诱导比TFAP2A晚2天(图32A、32B)，进一步指向表面外胚层中间体。
体内遗传研究表明，在不存在FGF信号传导的情况下，高水平的BMP促进表皮结局，然而在激活FGF时，基板细胞在降低的BMP水平下得以建立(Kudoh等人,2004；Litsiou等人,2005)。尽管并不必要理解本发明的机制，据信在PIP条件下阻断内源性FGF信号传导可以破坏基板诱导并触发表皮结局。例如，本发明数据显示，抑制FGF信号传导的小分子SU5402从分化第3-11天(图32A)在保持TFAP2A表达的同时抑制SIX1+簇集物的出现(图32C)。
在第11天对SIX1和TFAP2A基因表达进行定量，证实了基板标志物表达的完全丧失(图32D)，同时TFAP2A表达得以保持。在PIP+SU5402处理的培养物中表皮前体标志物KRT8的表达支持了TFAP2A+细胞的表皮前体身份(图32E)。而且，长期培养物(第42-60天)显示了成熟角化细胞标志物KRT14的强壮诱导(图32F)，以及形成的在周缘处具有KRT14-免疫反应性细胞的E-CADHERIN阳性斑块(图31B)。表皮前体增殖能力的分析显示了主要在E-CADHERIN+/KRT14-细胞中的KI67表达。到第60天细胞增殖降低，伴随着表达KRT14的细胞的百分含量增加(图32G、31C)。除内源性FGF信号传导的要求以外，还观察到低WNT和BMP水平是将表面外胚层(第3天)过渡到早期基板结局的其他可用参数。暴露于高浓度的CHIR或BMP4分别以NC或假定滋养外胚层的代价抑制基板(图31D、31E)。
E.有效分化成三叉神经型感觉神经元的基板前体
据信颅基板产生范围广泛的特化细胞类型，其包括的，但不限于，产生激素的脑垂腺前叶细胞，结构细胞例如眼中的晶状体纤维，以及感觉神经元，例如但不限于，三叉神经神经元(图34A)。基板可以通过特异性PAX基因的表达来表征(McCauley和Bronner-Fraser,2002)。本文所示的数据显示，在标准PIP条件下大多数SIX1+簇集物共表达PAX3(图34B)，表明眼三叉神经基板身份(McCabe等人,2004；Stark等人,1997)。具有神经元形态的HNK1+(Metcalfe等人,1990)细胞的自发产生以及ISL1的共表达证实了周围感觉神经元身份(图34C)。为了进一步确定PIP条件下感觉神经元的基板起源，对神经元标志物SIX1的共表达进行评价(图34D、33A)。在基于PIP的感觉神经元分化过程中缺乏SOX10的表达排除了神经嵴起源。到分化第20天(重新平板接种之后7天)，细胞形成具有延长的神经元、辐射状突起的神经节样结构，并有感觉神经元标志物BRN3A的核表达(图34D、34E)。大多数神经元到分化第42天保持ISL1表达，并获得周围神经元标志物外周蛋白的表达(图34F、33B)。神经递质表型的免疫细胞化学分析显示了谷氨酸的表达(图34G)，但缺乏TH和GABA的表达(数据未示出)。这些数据与谷氨酸能三叉神经感觉神经元的产生相配。基因表达分析显示了表明感觉/痛感谱系的RUNX1(图34H、33C)和RET(图33D)的诱导。包括NTRK1和NTRK2的TRK受体的表达(图34I、33E)指向痛感和非痛感感觉神经元二者的存在(图33E-G)。
痛感神经元身份的诊断标志物包括特定钠通道(SCN9A、SCN10A、SCN11A；图34J)的表达以及经典的疼痛受体例如辣椒素受体(TRPV1)、用于冷感的受体(TRPM8)和对于ATP介导的炎性痛的感觉至关重要的P2X3受体(图34K)。长期三叉神经神经元培养物(第55天)的基因表达分析显示了RET1和RUNX1的持续表达(图33C、33D)。
源自基板的感觉神经元的功能分析通过全细胞膜片箝记录进行(图33G)。来自记录移液管的神经元填有荧光黄(Lucifer Yellow)，表现出双极或三极形态(图34L、34M)。对于一系列超极化和去极化脉冲测量反应(图34N)。源自hESC的神经元在阈值去极化下产生单一动作电位，与报道的初级胚胎三叉神经神经元的功能特性相配(Grigaliunas等人,2002)。平均静息膜电位(RMP)为-65.6±6.7(图34L、34M)。被动膜和动作电位特性在双极和三极感觉神经元之间是相当的，如图34O中所总结，表明两种形态上不同的种群并不意味着功能上不同的亚群。三叉神经神经元诱导方案的稳健性进一步跨多种hESC和hiPSC谱系加以评价，其中观察到可比较的表达ISL1和BRN3A神经元的百分含量(图33H)。
F.源自hESC的三叉神经神经元在发育中的鸡胚胎和成年小鼠CNS中的体内分析
为了评价源自hESC的三叉神经基板前体的体内特性，将源自组成型表达GFP的hESC系(图35A、35B)的PIP-诱导的神经元簇集物注射到靶向H&H阶段10-12的早期三叉神经原基的发育中的鸡胚胎中(图35C)。基于GFP表达并使用针对细胞质抗原(hCA)的人特异性抗体识别人细胞。卵内移植后2天，发现存活的GFP+细胞分散在内源性鸡三叉神经神经节区域中(图34P)。观察到大量共表达hCA和外周蛋白的GFP+人纤维束(图34Q、34R)。相反，在胚胎神经管中没有hCA或外周蛋白表达(图35D)。移植后2天的体内纤维突起生长令人联想到重新平板接种的三叉神经神经元簇集物的大量体外纤维突起生长(图35A)。体内的外周蛋白表达(图34S)确认了移植细胞的周围神经元身份。
对源自hESC的三叉神经神经元进行其是否可以移植到成年小鼠CNS中并朝向生理指标投射的评价。脑干中的三叉神经核接收来自三叉神经感觉神经节的传入神经支配，其传播至侧丘脑。选择脑桥作为移植位点，因为其在外科上可接近，并且位于自三叉神经神经节接收传入输入的三叉神经脑干核团的邻近部位。因此，将GFP+人三叉神经神经元簇集物经由定向手术注射到成年NOD/SCID小鼠中。移植后4天的组织学分析显示了GFP+人细胞移植物在腹侧脑桥中的存活(图35E)。尽管GFP+细胞体在注射位点处保持高度聚簇，GFP+纤维表现出大量突出到宿主脑中(N＝6)，其包括内源性三叉神经核(图35F)。BRN3A的表达证实了细胞的感觉神经元身份(图35G)。观察到移植物衍生的人纤维束(hNCAM+和GFP+)从移植物核放射(图35H)。
这些数据证明了胚胎鸡和成年小鼠脑中三叉神经基板衍生物的体内存活、沿着感觉神经元谱系的分化以及朝向相关内源性目标的轴突投射的建立。
数据表明，三叉神经感觉神经元可以用于疼痛综合征和偏头痛的药物筛选。例如，可以通过由三叉神经基板细胞产生的三叉神经神经元的体外电生理学进行读出。本文所示的数据说明，基板-三叉神经感觉神经元具有与初级三叉神经感觉神经元记录的功能特性匹配的单一动作电位。而且，这些细胞表达痛感神经元身份的诊断标志物，包括表达特异性钠通道。
G.假定前基板阶段的识别
本文所示的数据表明，PIP条件有效地诱导眼三叉神经基板结局。为了考察使用改良的PIP条件是否可以产生其他的基板结局，确立了培养***中假定前基板细胞的存在。
在脊椎动物发育过程中，前基板(pre-placode)表征为含有能够响应于决定基板身份的信号的前体细胞的发育原基(Martin和Groves,2006)。前基板细胞在不同模式生物中已经显示表达Six1，并且共表达外胚层和神经结局的标志物。但是，人前基板的发育尚未经探索。
对TFAP2A(早期外胚层标志物)和PAX6(早期神经外胚层标志物(Zhang等人,2010))进行时间进程共表达分析。在分化最初3天期间，仅仅观察到少量PAX6或TFAP2A表达细胞的零星斑块，没有共表达的证据(图36A)。在第5天，取消Noggin(PIP)之后2天，在PIP条件下有TFAP2A+细胞的数目增加(图36B)，并伴随N-SB中TFAP2A+细胞的丧失(图36C)。在第7天，N-SB条件产生缺乏TFAP2A表达的PAX6+细胞(图36C)，而PIP处理的培养物表现出大量TFAP2A和PAX6的共表达，表明前基板身份(图36B)。TFAP2A/PAX6双阳性细胞的出现与分化第7天左右SIX1基因表达的发生和SIX1+簇集物的出现一致(图32B、37A)。到第11天，基板簇集物对PAX6呈阴性，但保持TFAP2A的表达(图36B)，表明早期前侧PAX6+前基板细胞产生PAX3+富集的PAX6-阴性后侧基板种群。从PIP第7-11天表现出强壮的PAX3增加的基因表达数据进一步支持这一分化模型(图36D)。从PIP第7-11天用WNT或FGF信号传导抑制剂处理在保持PAX6(图36F)的同时抑制PAX3诱导(图36E)。
这些数据说明，内源性信号有助于从前侧PAX6+前基板过渡到后侧PAX3+基板谱系。在第11天N-SB培养物中的少量TFAP2A细胞(图36C)有可能代表缺乏PAX6表达的神经嵴前体(Chambers等人,2009)。在PIP条件下在第11天污染的SOX10+NC细胞的百分含量<1％(图27F)。
H.在前基板阶段用FGF抑制剂SU5402处理诱导晶状体结局
对假定前基板细胞进行其是否可以分化成三叉神经神经元以外的特定基板结局的测试。之前已经报道了由灵长类动物hESC自发地出现晶状体前体(类晶状体)(Ooto等人,2003；Zhang等人,2010)，尽管在这些研究中并没有探讨谱系起源和诱导信号。
通过使用BMP、FGF、WNT和Hedgehog信号传导的激活剂和抑制剂，测试了四种发育信号传导通路对晶状体基板特化的影响。为了对晶状体基板结局的诱导进行定量，在分化第16天监测晶状体前体标志物PITX3的表达(图37B)。在重组BMP4的存在下或暴露于FGF-抑制分子SU5402时，PITX3表达得以显著诱导(图36F)。之前已经在鸡发育研究中提出了BMP和FGF的作用(等人,2007)。进一步分化显示了到第57天αβ-晶体的强烈诱导和成熟晶状体纤维结构的形成(图36G，左图)。晶状体纤维的特征性分层(图35G，右图)模拟了体内发育中的晶状体的结构特性。
I.在前基板阶段用SHH处理诱导垂体前叶细胞
本文所示的数据表明，前基板细胞可以分化成垂体前叶基板，并再产生不同的垂体前体和产生激素的细胞类型(图38A)。在前基板阶段(第7-11天)用SHH信号传导激动剂进一步处理(图39A)诱导口腔上胚层SIX6和PITX1的表达(图38B)，并控制垂体腺发育的调节物(Tremblay等人,1998)。转录物和蛋白质水平上的PITX1和SIX6诱导依赖于SHH剂量(图38B、38C)。而且，SHH处理触发决定性的垂体前体标志物LHX3的表达(图38D)。
脑垂腺前叶的内分泌细胞源自三种主要的前体谱系(Scully和Rosenfeld,2002)。在PIP+SHH处理之后，观察到强壮的TBX19诱导(图38E)，其对产生生成ACTH和MSH的细胞的前体具有特异性。PIT1和GATA2前体谱系的诱导不太有效，但在用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理之后增加(图38F、38G)。
到第16天垂体激素的免疫细胞化学显示出CGA的表达，而FSH、ACTH和GH的蛋白质表达到分化第25-30天首次观察到(图38H-K)。ACTH+细胞的诱导特别有效(图38J)，通过ELISA很容易检测到ACTH激素的体外释放(图38L)。
而且，这些源自hESC的垂体细胞在小鼠和大鼠异种移植模型中能够在体内存活并发挥功能(图38M、39B、39C)。将GFP-标记的源自hESC的垂体前体皮下注射(分化第16天)到成年雄性NOD/SCID小鼠中，证明了GSU和FSH细胞在体内的存活(图39D、39E)。
雄性裸大鼠中的长期存活研究(n＝8；移植后4-6周)显示，如凌晨期间(昼夜循环过程中内源性ACTH表达低的点)所测量，血清ACTH水平显著增加(图38N)。使用选择性检测人GH但不检测小鼠GH的ELISA测定在体内测量人GH水平(图38O)。
移植到大鼠宿主中使得可以反复抽血，并且显示出与假注射(仅基质胶)的动物相比较，移植的动物中ACTH和GH水平持续增加。最后，组织学分析证明移植后6周，有平均0.46±0.015百万存活hNCAM+细胞(图38P)。大约10％的存活人细胞表达ACTH(图38Q)，6％的细胞对GH具有免疫反应性(图38R)。
考虑到之前在小鼠ESC中的工作说明需要复杂的共培养***诱导垂体谱系，经由改良的PIP条件由hESC得到产生功能性激素的垂体细胞的能力尤其引人关注(Suga等人,2011)。体内存活和产生源自移植物的ACTH和GH表明了对于患有遗传、手术或辐射导致的垂体机能减退症的转换可能性(Tabar,2011)。
源自垂体基板细胞的在体外产生ACTH的垂体细胞可以用于在体外产生ACTH。ACTH对于婴儿痉挛症的治疗来说非常重要。而且，一种市售的组合物(Acthar胶)是用于治疗婴儿痉挛症的长期动物产品。Acthar胶的缺点在于其目前是极为昂贵的药物产品。每瓶的价格已高达$36,000。生长激素也可以用于代谢疾病，例如生长激素缺乏症。VII.由非基板细胞诱导基板细胞
在某些实施方式中，本发明提供用于由非基板细胞诱导基板前体细胞的组合物、试剂盒和方法，例如，如胚胎干细胞(ESC)，其包括人胚胎干细胞(hESC)，或诱导的多能干细胞(iPSC)，其包括人iPSC。在某些实施方式中，通过将非基板细胞与SMAD抑制剂一起培养来诱导基板前体细胞，如本文所述。在某些实施方式中，SMAD抑制剂是ALK抑制剂。在某些实施方式中，ALK抑制剂通过阻断ALK4、ALK5和/或ALK7受体的磷酸化而抑制Lefty/激活素/TGFβ路径。在某些实施方式中，SMAD抑制剂是SB431542。在某些实施方式中，组合物、试剂盒和方法进一步包括BMP活性剂，例如BMP4。在某些实施方式中，将非基板细胞在包括SMAD抑制剂和BMP活性剂的培养基中培养，其中在培养1、或2或3或4或5或6或7或8或9或10天之后从培养基中撤出BMP活性剂。在某些实施方式中，在培养3天之后从培养基中撤出BMP活性剂。在某些实施方式中，BMP活性剂以大约0.5至大约20ng/mL、或大约1至大约15ng/ml、或大约2至大约10ng/ml、或大约3至大约5ng/ml的浓度在培养基中存在。在某些实施方式中，BMP活性剂以大约5ng/ml的浓度在培养基中存在。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法培养非基板细胞诱导表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞的分化。在某些实施方式中，细胞还表达可检测水平的TFAP2A。在某些实施方式中，表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞是基板前体细胞。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法培养非基板细胞诱导表达可检测水平的SIX1和PAX3的细胞。在某些实施方式中，表达可检测水平的SIX1和PAX3的细胞是三叉神经基板细胞。在某些实施方式中，通过将表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞(例如，基板前体细胞)与三叉神经基板诱导剂例如脑源性神经营养因子(BDNF)和/或Wnt一起培养，来诱导表达可检测水平的SIX1和PAX3的细胞。在某些实施方式中，BDNF和Wnt是人BDNF和Wnt。在一些实施方式中，在本文所述的基板诱导细胞培养方案的第3天、或第4天、或第5天、或第6天、或第7天、或第8天、或第9天、或第10天将三叉神经基板诱导剂加入到培养基中。
在某些实施方式中，诱导的表达SIX1和PAX3的细胞还表达可检测水平的GD2。在某些实施方式中，表达SIX1、PAX3和GD2的细胞是三叉神经基板细胞。在某些实施方式中，本发明提供从不表达可检测水平的GD2的细胞混合物中分离或分选表达可检测水平的GD2的细胞的方法。在某些实施方式中，所述方法包括FACS分选或本领域已知的任何其他细胞分选方法。
在某些实施方式中，诱导的表达SIX1和PAX3的细胞还表达可检测水平的CD57(HNK1)。在某些实施方式中，表达SIX1、PAX3和CD57(HNK1)的细胞是三叉神经基板细胞。在某些实施方式中，本发明提供从不表达可检测水平的CD57(HNK1)的细胞混合物中分离或分选表达可检测水平的CD57(HNK1)的细胞的方法。在某些实施方式中，所述方法包括FACS分选或本领域已知的任何其他细胞分选方法。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法培养非基板细胞诱导表达可检测水平的SIX1和PITX3的细胞。在某些实施方式中，表达可检测水平的SIX1和PITX3的细胞是晶状体基板细胞。在某些实施方式中，通过将表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞(例如，基板前体细胞)与晶状体基板诱导剂例如音猬因子(SHH)、purmorphamine、γ-分泌酶抑制剂和/或FGF抑制剂一起培养，来诱导表达可检测水平的SIX1和PITX3的细胞。在某些实施方式中，SHH是人SHH。在某些实施方式中，在本文所述的基板诱导细胞培养方案的第3天、或第4天、或第5天、或第6天、或第7天、或第8天、或第9天、或第10天将晶状体基板诱导剂加入到培养基中。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法培养非基板细胞诱导表达可检测水平的SIX1和PITX1的细胞。在某些实施方式中，表达可检测水平的SIX1和PITX1的细胞是垂体基板细胞。在某些实施方式中，通过将表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞(例如，基板前体细胞)与垂体图式化因子例如音猬因子(SHH)、purmorphamine、γ-分泌酶抑制剂、FGF8、FGF10、BMP2和/或下丘脑CM一起培养，来诱导表达可检测水平的SIX1和PITX1的细胞。在某些实施方式中，SHH、FGF8、FGF10、BMP2和下丘脑CM是人SHH、FGF8、FGF10、BMP2和下丘脑CM。在某些实施方式中，在本文所述的基板诱导细胞培养方案的第3天、或第4天、或第5天、或第6天、或第7天、或第8天、或第9天、或第10天将垂体图式化因子加入到培养基中。在某些实施方式中，在本文所述条件下培养的垂体基板进一步分化成表达垂体激素的细胞。
在某些实施方式中，本发明提供将根据本文所述方法诱导的垂体基板细胞和/或表达垂体激素的细胞移植到对其有需要的受试者中的方法，例如，在诊断为垂体机能减退症或处于其风险中的受试者中。在某些实施方式中，将细胞移植到受试者的脑或垂体腺中。
在某些实施方式中，本发明提供根据本文所述的方法制备的细胞。
在某些实施方式中，蛋白质“可检测”的水平是指蛋白质可通过本领域已知的免疫细胞化学技术检测。
在某些实施方式中，“诱导的多能干细胞”是指由非多能细胞例如由成年细胞例如成年体细胞或由任何其他分化或成熟细胞产生的多能干细胞。
在某些实施方式中，根据本文所述的方法制备、并如本文所述出于治疗目的给予或移植给受体受试者的细胞对于细胞受体是异源的、自体的、同种异体的、异种的或同系的。
VIII.筛选基板诱导剂
在某些实施方式中，本发明提供用于筛选促进基板和由根据本文所述方法培养的非基板细胞诱导的基板前体细胞的诱导的化合物的方法。
在某些实施方式中，筛选方法包括根据本文所述的方法培养非基板细胞，其中在第1天、或第2天、或第3天、或第4天、或第5天、或第6天、或第7天将测试化合物加入到培养基中。在某些实施方式中，在第3天将测试化合物加入到培养基中。在某些实施方式中，筛选方法包括测定与测试化合物一起培养的细胞中基板前体标志物例如SIX1和/或PAX6和/或TFAP2A的可检测表达的水平，并将所述水平与在没有测试化合物的培养基中培养的细胞中相同标志物的表达水平相比较，其中与测试化合物一起培养的细胞中标志物表达的水平增加表示测试化合物提高基板前体诱导。
在某些实施方式中，本发明提供促进本文所述基板前体诱导的化合物。在某些实施方式中，化合物是BRL-54443或其盐，例如BRL-54443马来酸盐。
在某些实施方式中，化合物是小白菊内酯(parthenolide)。
在某些实施方式中，化合物是phenantroline。
在某些实施方式中，本发明提供促进基板前体细胞的诱导的方法，其中根据本文所述的方法培养非基板细胞，其中将细胞培养基补充有浓度大约0.001至大约20mM、或大约0.01至大约15mm、或大约0.1至大约10mM、或大约1至大约10mM、或大约2至5mM的促进基板前体诱导的化合物。
参考文献
参考文献列表1
在此将以下参考文献全文并入。Barberi,等人,(2003).Nat Biotechnol.10:1200-1207；Bouwmeester等人,(1996).Nature 382:595-601；Briscoe,J.和Ericson,J.(1999).Semin Cell Dev Biol.3:353-62；Chambers等人,(2009).Nat Biotechnol 27,275-280；Charrier等人,(2002).Development 129:4785-4796；Charron等人,(2003).Cell113:11-23；D'Amour等人,(2005).Nat Biotechnol 23,1534-1541；Dennis等人,(2003).DAVID:Database for Annotation,Visualization,and IntegratedDiscovery.Genome Biol 4,P3；Eiraku等人,(2008).Cell Stem Cell 3,519-53；Elkabetz等人,(2008).Genes Dev 22:152-165；Ericson等人,(1996).Cell 87,661-673；Fasano等人,(2007).Cell Stem Cell 1,87-99；Fasano等人,(2009).Genes Dev 23,561-574；Glinka等人,(1998).Nature 391,357-362；Haung等人,(2009).Nat Protoc 4,44-57；Hunter等人,(1991).Proc Natl Acad Sci USA 88,3666-3670；Ivanova等人,(2006).Nature 442,533-538；Jeong等人,(2003).Development 130,3891-3902；Jeong等人,(2005).Development.133,7761-7772；Jeong等人,(2008)Nat Genet 40,1348-1353；Jessell,(2000).Nat Rev Genet 1,20-29；Jessell等人,(1989).Ciba Found Symp 144,255-276；discussion 276-280,290-255；Joksimovic等人,(2009).Nat Neurosci 12,125-131；Kimura-Yoshida等人,(2006).PNAS 104,5919-59249；Kittappa等人,(2007).PLoSBiol 5,e325；Li等人,(2008).Stem Cells 4,886-89399；Lois等人,(2002).Science 295,868-872；Lyuksyutova等人,(2003).Science 302,1903-1904；Matise等人,(1998).Development 125,2759-2770；Mizuseki等人,(2003).Proc Natl Acad Sci U S A 100,5828-5833；Mukhopadhyay等人,(2001).Dev Cell 3,423-434；Mullor等人,(2002).TrendsCell Biol 12,562-569；Ono等人,(2007).Development 134,3213-3225；Perrier等人,(2004).Proc Natl Acad Sci U S A 101,12543-12548；Placzek等人,(1993).Development 117,205-218；Placzek,M.(1995).Curr Opin Genet Dev 5,499-506；Placzek等人,(2003).Development 130,4809-4821；Placzek等人,(2005).Nat RevNeurosci 6,230-240；Roelink等人,(1994).Cell 76,761-775；Shen等人,(2006).NatNeurosci 9,743-751；Shirasaki等人,(1995).Neuron 14,961-972；Suter等人,StemCells,27(1):49-58(2009)；Venezia等人,(2003).PLoS Biol 10,e301；Watanabe等人,(2005).Nat Neuro 3,288-296；Weinstein等人,(1999).Annu Rev Cell Dev Biol 15,411-433；Wichterle等人,(2002).Cell 110,385-397；Zhang等人,Nature Biotechnology19,1129-1133(2001)；和Zoltewicz等人,(1999).Development 126,5085-5095.
参考文献列表2
Abdelhak,S.,Kalatzis,V.,Heilig,R.,Compain,S.,Samson,D.,Vincent,C.,Weil,D.,Cruaud,C.,Sahly,I.,Leibovici,M.等人(1997).A human homologue of theDrosophila eyes absent gene underlies branchio-oto-renal(BOR)syndrome andidentifies a novel gene family.Nature genetics 15,157-164.
Ahrens,K.和Schlosser,G.(2005).Tissues and signals involved in theinduction of placodal Six1expression in Xenopus laevis.Developmental biology288,40-59.
Arkell,R.和Beddington,R.S.(1997).BMP-7influences pattern and growthof the developing hindbrain of mouse embryos.Development 124,1-12.
Bailey,A.P.,Bhattacharyya,S.,Bronner-Fraser,M.和Streit,A.(2006).Lensspecification is the ground state of all sensory placodes,from which FGFpromotes olfactory identity.Dev Cell 11,505-517.
Baker,C.V.和Bronner-Fraser,M.(2001).Vertebrate cranial placodesI.Embryonic induction.Dev Biol 232,1-61.
Balmer,C.W.和LaMantia,A.S.(2005).Noses and neurons:induction,morphogenesis,and neuronal differentiation in the peripheral olfactorypathway.Developmental dynamics:an official publication of the AmericanAssociation of Anatomists 234,464-481.
Barnett,E.M.,Jacobsen,G.,Evans,G.,Cassell,M.和Perlman,S.(1994).Herpessimplex encephalitis in the temporal cortex and limbic system aftertrigeminal nerve inoculation.J Infect Dis 169,782-786.
Bernardo,A.S.,Faial,T.,Gardner,L.,Niakan,K.K.,Ortmann,D.,Senner,C.E.,Callery,E.M.,Trotter,M.W.,Hemberger,M.,Smith,J.C.等人,(2011).BRACHYURY andCDX2mediate BMP-induced differentiation of human and mouse pluripotent stemcells into embryonic and extraembryonic lineages.Cell Stem Cell 9,144-155.
Bhattacharyya,S和Bronner-Fraser,M.(2004).Hierarchy of regulatoryevents in sensory placode development.Curr Opin Genet Dev14,520-526.
Chambers,S.M.,Fasano,C.A.,Papapetrou,E.P.,Tomishima,M.,Sadelain,M.和Studer,L.(2009).Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cellsby dual inhibition of SMAD signaling.Nat Biotechnol 27,275-280.
Chambers,S.M.,Qi,Y.,Mica,Y.,Lee,G.,Zhang,X.J.,Niu,L.,Bilsland,J.,Cao,L.,Stevens,E.,Whiting,P.等人(2012).Combined small-molecule inhibitionaccelerates developmental timing and converts human pluripotent stem cellsinto nociceptors.Nat Biotechnol 30,715-720.
Chen,W.,Jongkamonwiwat,N.,Abbas,L.,Eshtan,S.J.,Johnson,S.L.,Kuhn,S.,Milo,M.,Thurlow,J.K.,Andrews,P.W.,Marcotti,W.等人(2012).Restoration ofauditory evoked responses by human EScell-derived otic progenitors.Nature490,278-282.
Colas,J.F.,and Schoenwolf,G.C.(2003).Localization of cartilagelinking protein 1during primary neurulation in the chick embryo.Brain Res DevBrain Res 141,141-148.
Dennis,G.,Sherman,B.T.,Hosack,D.A.,Yang,J.,Gao,W.,Lane,H.C.和Lempicki,R.A.(2003).DAVID:Database for Annotation,Visualization,andIntegrated Discovery.Genome Biology 2003 4:P3 4,P3.
Elkabetz,Y.,Panagiotakos,G.,Al Shamy,G.,Socci,N.D.,Tabar,V.和Studer,L.(2008).Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinctearly neural stem cell stage.Genes Dev 22,152-165.
Grigaliunas,A.,Bradley,R.M.,MacCallum,D.K.和Mistretta,C.M.(2002).Distinctive neurophysiological properties of embryonic trigeminal andgeniculate neurons in culture.Journal of Neurophysiology 88,2058-2074.
Grotewold,L.,Plum,M.,Dildrop,R.,Peters,T.和Rüther,U.(2001).Bambi iscoexpressed with Bmp-4during mouse embryogenesis.Mech Dev 100,327-330.
Hunter,C.S.和Rhodes,S.J.(2005).LIM-homeodomain genes in mammaliandevelopment andhuman disease.Mol Biol Rep 32,67-77.
Ishihara,T.,Sato,S.,Ikeda,K.,Yajima,H.和Kawakami,K.(2008).Multipleevolutionarily conservedenhancers control expression of Eya1.Dev Dyn 237,3142-3156.
Koehler,K.R.,Mikosz,A.M.,Molosh,A.I.,Patel,D.和Hashino,E.(2013).Generation of inner ear sensory epithelia from pluripotent stem cells in 3Dculture.Nature doi:10.1038/nature12298.
Kudoh,T.,Concha,M.L.,Houart,C.,Dawid,I.B.和Wilson,S.W.(2004).Combinatorial Fgf andBmp signalling patterns the gastrula ectoderm intoprospective neural and epidermal domains.Development 131,3581-3592.
Kwon,H.J.,Bhat,N.,Sweet,E.M.,Cornell,R.A.和Riley,B.B.(2010).Identification of early requirements for preplacodal ectoderm and sensoryorgan development.PLoS Genet 6,e1001133.
Lafaille,F.G.,Pessach,I.M.,Zhang,S.-Y.,Ciancanelli,M.J.,Herman,M.,Abhyankar,A.,Ying,S.-Y.,Keros,S.,Goldstein,P.A.,Mostoslavsky,G.等人(2012).Impaired intrinsic immunity to HSV-1in human iPSC-derived TLR3-deficient CNScells.Nature 491,769-773.
Lee,G.,Kim,H.,Elkabetz,Y.,Al Shamy,G.,Panagiotakos,G.,Barberi,T.,Tabar,V.和Studer,L.(2007).Isolation and directed differentiation of neuralcrest stem cells derived from human embryonic stem cells.Nat Biotechnol 25,1468-1475.
Leung,A.W.,Kent Morest,D.和Li,J.Y.(2013).Differential BMP signalingcontrols formation and differentiation of multipotent preplacodal ectodermprogenitors from human embryonic stem cells.Dev Biol 379,208-220.
Litsiou,A.,Hanson,S.和Streit,A.(2005).A balance of FGF,BMP and WNTsignalling positions the future placode territory in the head.Development132,4051-4062.
Love,S.和Coakham,H.B.(2001).Trigeminal neuralgia:pathology andpathogenesis.Brain 124,2347-2360.
Mackay,D.R.,Hu,M.,Li,B.,Rhéaume,C.和Dai,X.(2006).The mouse Ovol2geneis required for cranial neural tube development.Dev Biol 291,38-52.
Martin,K.和Groves,A.K.(2006).Competence of cranial ectoderm torespond to Fgf signaling suggests a two-step model of otic placodeinduction.Development 133,877-887.
McCabe,K.L.,Manzo,A.,Gammill,L.S.和Bronner-Fraser,M.(2004).Discoveryof genes implicated in placode formation.Dev Biol 274,462-477.
McCauley,D.W.和Bronner-Fraser,M.(2002).Conservation of Pax geneexpression in ectodermal mplacodes of the lamprey.Gene 287,129-139.
Menendez,L.,Yatskievych,T.A.,Antin,P.B.和Dalton,S.(2011).Wntsignaling and a Smad pathway blockade direct the differentiation of humanpluripotent stem cells to multipotent neural crest cells.Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America 108,19240-19245.
Mengarelli,I.和Barberi,T.(2013).Derivation of multiple cranialtissues and isolation of lens epithelium-like cells from human embryonic stemcells.Stem Cells Transl Med 2,94-106.
Metcalfe,W.K.,Myers,P.Z.,Trevarrow,B.,Bass,M.B.和Kimmel,C.B.(1990).Primary neurons that express the L2/HNK-1carbohydrate during earlydevelopment in the zebrafish.Development 110,491-504.
Mica,Y.,Lee,G.,Chambers,S.M.,Tomishima,M.J.和Studer,L.(2013).Modelingneural crest induction,melanocyte specification,and disease-relatedpigmentation defects in hESCs and patient specific iPSCs.Cell Rep 3,1140-1152.
O'Rahilly,R.M.,F.(1987).Developmental stages in human embryos,Vol637,(Washington,D.C.:Carnegie Institution of Washington).
Ooto,S.,Haruta,M.,Honda,Y.,Kawasaki,H.,Sasai,Y.和Takahashi,M.(2003).Induction of the differentiation of lentoids from primate embryonic stemcells.Invest Ophthalmol Vis Sci 44,2689-2693.
Oshima,K.,Shin,K.,Diensthuber,M.,Peng,A.W.,Ricci,A.J.和Heller,S.(2010).Mechanosensitive hair cell-like cells from embryonic and inducedpluripotent stem cells.Cell 141,704-716.
Pieper,M.,Ahrens,K.,Rink,E.,Peter,A.和Schlosser,G.(2012).Differentialdistribution of competence for panplacodal and neural crest induction to non-neural and neural ectoderm.Development 139,1175-1187.
Reubinoff,B.E.,Itsykson,P.,Turetsky,T.,Pera,M.F.,Reinhartz,E.,Itzik,A.和Ben-Hur,T.(2001).Neural progenitors from human embryonic stemcells.Nature biotechnology 19,1134-1140.
Ruf,R.G.,Xu,P.X.,Silvius,D.,Otto,E.A.,Beekmann,F.,Muerb,U.T.,Kumar,S.,Neuhaus,T.J.,Kemper,M.J.,Raymond,R.M.,Jr.等人(2004).SIX1mutations causebranchio-oto-renal syndrome by disruption of EYA1-SIX1-DNAcomplexes.Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 101,8090-8095.
Sasaki,H.和Hogan,B.L.(1993).Differential expression of multiple forkhead related genes during gastrulation and axial pattern formation in themouse embryo.Development 118,47-59.
Schlosser,G.(2006).Induction and specification of cranialplacodes.Dev Biol 294,303-351.Scully,K.M.,and Rosenfeld,M.G.(2002).Pituitarydevelopment:regulatory codes in mammalian organogenesis.Science 295,2231-2235.
Shi,F.,Corrales,C.E.,Liberman,M.C.和Edge,A.S.(2007).BMP4induction ofsensory neurons from human embryonic stem cells and reinnervation of sensoryepithelium.Eur J Neurosci 26,3016-3023.
M.,Edlund,T.和Gunhaga,L.(2007).Time of exposure to BMP signalsplays a key role in the specification of the olfactory and lens placodes exvivo.Dev Cell 13,141-149.
Stark,M.R.,Sechrist,J.,Bronner-Fraser,M.和Marcelle,C.(1997).Neuraltube-ectoderm interactions are required for trigeminal placodeformation.Development 124,4287-4295.
Suga,H.,Kadoshima,T.,Minaguchi,M.,Ohgushi,M.,Soen,M.,Nakano,T.,Takata,N.,Wataya,T.,Muguruma,K.,Miyoshi,H.等人(2011).Self-formation offunctional adenohypophysis in three-dimensional culture.Nature 480,57-62.
Tabar,V.(2011).Making a pituitary gland in a dish.Cell Stem Cell 9,490-491.
Tremblay,J.J.,Lanctot,C.和Drouin,J.(1998).The pan-pituitary activatorof transcription,Ptx1(pituitary homeobox 1),acts in synergy with SF-1andPit1and is an upstream regulator of the Limhomeodomain gene Lim3/Lhx3.MolEndocrinol 12,428-441.
Wilson,P.A.,Lagna,G.,Suzuki,A.和Hemmati-Brivanlou,A.(1997).Concentration-dependent patterning of the Xenopus ectoderm by BMP4and itssignal transducer Smad1.Development 124,3177-3184.
Xu,R.H.,Chen,X.,Li,D.S.,Li,R.,Addicks,G.C.,Glennon,C.,Zwaka,T.P.和Thomson,J.A.(2002).BMP4initiates human embryonic stem cell differentiation totrophoblast.Nat Biotechnol 20,1261-1264.
Zhang,S.C.,Wernig,M.,Duncan,I.D.,Brustle,O.和Thomson,J.A.(2001).Invitro differentiation of transplantable neural precursors from humanembryonic stem cells.Nat Biotechnol 19,1129-1133.
Zhang,X.,Huang,C.T.,Chen,J.,Pankratz,M.T.,Xi,J.,Li,J.,Yang,Y.,Lavaute,T.M.,Li,X.,Ayala,M.等人(2010).Pax6is a human neuroectoderm cell fatedeterminant.Cell Stem Cell 7,90-100.
参考文献列表3
Amit,M.和Itskovitz-Eldor,J.(2002).Derivation and spontaneousdifferentiation of human embryonic stem cells.Journal of Anatomy 200,225-232.
Chambers,S.M.,Fasano,C.A.,Papapetrou,E.P.,Tomishima,M.,Sadelain,M.和Studer,L.(2009).Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cellsby dual inhibition of SMAD signaling.Nat Biotechnol 27,275-280.
Chen,G.,Gulbranson,D.R.,Hou,Z.,Bolin,J.M.,Ruotti,V.,Probasco,M.D.,Smuga-Otto,K.,Howden,S.E.,Diol,N.R.,Propson,N.E.等人(2011).Chemically definedconditions for human iPSC derivation and culture.Nat Methods 8,424-429.
Dennis,G.,Sherman,B.T.,Hosack,D.A.,Yang,J.,Gao,W.,Lane,H.C.和Lempicki,R.A.(2003).DAVID:Database for Annotation,Visualization,andIntegrated Discovery.Genome Biology 2003 4:P3 4,P3.
Downey,T.(2006).Analysis of a multifactor microarray study usingPartek genomics solution.Methods Enzymol 411,256-270.
Huang,D.W.,Sherman,B.T.和Lempicki,R.A.(2009).Systematic andintegrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformaticsresources.Nature Protocols 4,44-57.
O'Rahilly,R.M.,F.(1987).Developmental stages in human embryos,Vol637,(Washington,D.C.:Carnegie Institution of Washington).
实验
以下实施例用于说明本发明的某些实施方式和方面，而并非是要限定其范围。在以下公开的实验部分中，应用以下缩写：N(当量)；M(摩尔的)；mM(毫摩尔的)；μM(微摩尔的)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；pmol(皮摩尔)；g(克)；mg(毫克)；μg(微克)；ng(纳克)；pg(皮克)；L(升)；ml(毫升)；μl(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；min(分钟)；s和sec(秒)；deg(度)；和℃(摄氏度)。
以下是通常的细胞培养物配方：
用于维持的hESC培养基(1升)：
800mL DMEM/F12，200mL敲除血清替代物，5mL的200mM L-谷氨酰胺，5mL的Pen/Strep，10mL的10mM MEM最小非必需氨基酸溶液，1000μLβ-巯基乙醇，和bFGF(最终浓度为4ng/mL)。
用于hESC分化的KSR培养基(1升)：
820mL敲除DMEM，150mL敲除血清替代物，10mL的200mM L-谷氨酰胺，10mL的Pen/Strep，10mL的10mM MEM，和1mLβ-巯基乙醇。
用于hESC分化的N2培养基(1升)：
985ml具有DMEM/F12粉末的蒸馏H2O，1.55g葡萄糖，2.00g NaHCO3，25mg胰岛素，0.1g脱铁运铁蛋白，30nM***钠，100μM腐胺，20nM孕酮。
具有10％FBS的DMEM用于制备PMEF(1升)：
885mL DMEM，100mL FBS，10mL Pen/Strep，5mL L-谷氨酰胺
具有10％FBS的αMEM用于制备MS-5饲养层(1升)：
890mLα MEM，100mL FBS，10mL Pen/Strep
凝胶化溶液(500ml)：
将0.5g明胶溶解在500ml温的(50-60℃)Milli-Q水中。冷却至室温。
Noggin购自R&D system，目录号：719-NG，重组小鼠Noggin Fc嵌合体。
实施例1
骨形成蛋白(BMP)水平决定基板结局身份：感觉基板是早期神经外胚层和非神经外胚层组织的界面处形成的发育结构。为了解决N-SB培养***是否适合于基板细胞的衍生，建立起一组标志物，以识别源自人胚胎干细胞(hESC)的培养物中的基板身份。从其他模式生物中的研究，在hESC分化过程中用于识别人基板前体的若干候选标志物包括，但不限于，转录因子Six、Eya和Dlx家族的成员。Six1在模式生物中标记前基板区域和基板细胞，但也在骨骼肌前体中表达。免疫细胞化学分析显示N-SB分化第11天有6％±4％Six1+细胞。在Six1+细胞中部没有骨骼肌标志物的表达，表明了基板前体细胞身份。
大量的发育研究已经说明了在体内早期外胚层图式化过程中BMP信号传导的作用。一种模型表明，外胚层内BMP活性梯度分配不同的细胞结局，其中高水平信号传导促进表皮，适度水平诱导基板，中间水平特化神经嵴，完全不存在BMP活性是体内形成神经板所要求的。Streit等人,Dev Biol,2004.276(1):p.1-15，在此将其并入作为参考。为了测试加入外源性BMP是否促进Six1+细胞的衍生，将SB431542(1μM)处理过的hESC暴露于不同浓度BMP4。但是，早期加入BMP4导致剧烈的细胞形态变化以及cdx2的诱导，表明分化时朝向滋养外胚层结局。不存在SB431542已经说明，在hESC分化过程中早期暴露于BMP可以驱动滋养外胚层结局。Chambers等人,Nat Biotechnol,2009.27(3):p.275-80；Xu等人,NatBiotechnol,2002.20(12):p.1261-4，在此将其并入作为参考。
在N-SB分化过程中撤出BMP抑制剂noggin可以通过内源性BMP信号传导的去抑制来促进基板结局的发生。出于该目的，通过在NSB方案的不同时间点除去noggin(图11A)，同时在分化第11天通过qRT-PCR分析监测基板标志物(图11B)滋养外胚层、神经外胚层的诱导，来进行时间进程研究。在分化第2天或第3天取消noggin产生有效的Six1诱导，而在分化第1天取消noggin导致在不存在Six1表达的情况下诱导Eya1。经历第1天noggin取消的培养物中形态变化和Cdx2表达的诱导说明，分化朝向滋养外胚层结局，并表明除基板细胞以外，Eya1还在滋养外胚层前体中表达。免疫细胞化学分析说明，分化第3天取消noggin诱导了以下转换：从标准N-SB条件下主要得到Pax6+神经外胚层细胞转换为由71％Six1+假定基板前体细胞组成的种群(图11C、D)。共标记研究证明了在不存在骨骼肌结局标志物的情况下Six1+细胞中其他基板标志物例如Eya1的共表达。
微阵列分析揭示新的人基板祖先基因表达：
为了获得基板前体细胞身份的基板诱导的无偏性测量，发明人使用进行Illumina微珠阵列平台进行了全基因表达的时间进程分析。在对照N-SB培养中(产生前侧神经板细胞；noggin/SB431542处理1-11天)和在促进基板结局的条件下(前侧基板细胞：SB431542处理11天；Noggin处理1-3天)，在分化过程中的5个时间点(第1、3、5、7和11天)收集RNA。在微阵列分析之前，验证各个样品的质量：一组基板标志物(Six1、Dlx3、Eya1)的表达以及不存在其他谱系例如Foxa2(内胚层)、Sox17(内胚层)、MyoD(骨骼肌)、cdx2(滋养层)和T(Brachyury)(中胚层))。对于每个时间点和培养条件均以三个独立的样品进行全基因表达研究。将数据转化成log2比例，比较分化过程中基板与N-SB方案中基因表达的水平(图12A-D)。
使用DAVID(david.abcc.ncifcrf.gov/；Dennis等人,Genome Biology2003 4:P3,2003.4(5):p.P3，在此将其并入作为参考)对时间进程数据进行基因本体论(GO)富集分析，作为基板转录图谱的无偏性评价。在分化第5天和第7天在基板条件下与NSB对照培养物中高度富集的转录物当中，有与感觉器官发育、BMP和Wnt路径、内耳发育和神经图式化相关的基因。感觉器官发育和神经图式化因子的富集进一步确认了使用改良的N-SB方案得到的培养物的前侧基板身份。在改良的N-SB中(分化2天后取消noggin)相对于NSB(即用至少2种SMAD或BMP信号传导化合物处理细胞)方案，神经板标志物和神经元标志物也被下调。
为了获得基板特化过程中差异性表达的特定基因的深入认识，发明人在不同的分化阶段进行了成对比较。尽管大多数在分化第5天和第7天显著调节(相较于第1天)的基因在NSB和改良的N-SB方案中是共享的，转录物的子集有差异性调节。具体地，在改良的N-SB方案中观察到Islet-1这种公知的感觉神经元发育标志物的增加。Isl1也在其他谱系例如运动神经元、心脏祖先和胰岛细胞中得到表达。hESC分化过程中表达的早期表达发生表明，Islet-1标记早期基板前体细胞，与其在斑马鱼发育过程中的表达类似，其中其标记前侧前基板区域的马蹄铁形状。因此，Islet-1是人多能干细胞分化过程中表达的最早的基板标志物之一。与NSB条件相比较时，改良的N-SB方案在第5天、第7天、第9天和第11天诱导高度富集的Islet-1的表达。在微阵列数据中，基板基因GATA3、Dlx5、TFAP2a和TFAP2c得以富集。另外还观察到Wnt路径和BMP路径组分的显著变化。例如，早在第5天，便有Wnt路径抑制剂DKK-1的显著增加，这一增加在方案进行过程中得到保持。响应于Noggin的取消观察到若干Wnt受体的显著减量调节。响应于BMP信号传导激活的BMP拮抗剂例如gremlin-1和BAMBI的诱导证实，取消noggin导致hESC分化过程中内源性BMP信号传导的变化，相应地下游基因增加。
而且，识别出在前侧基板特化过程中差异性表达的若干其他的基因，其包括Shisa2、Ovol2和Foxc1。这些和其他基因的差异性表达通过qRT-PCR得以验证。Ovol2是不同模式生物中已知的表面外胚层和基板结局的标志物。在小鼠中，Ovol2敲除是致死的，Ovol2-/-小鼠胚胎不会发育出基板衍生的组织，例如视杯和听囊。
基因聚簇分析显示基因何时表达最高；最大时间(TOM)和最低时间；最小表达时间(TIM)。GO本体论语义映射到该分析中，并且能够识别基板前体细胞特化过程中的精确发育窗口。这些数据额外地证实了源自hESC的基板组织的身份和显示的参与基板与前侧神经板(AN)特化的标志物和路径。
差异性表达的转录物的簇集物(图12E)显示了所有复制物样品的正确匹配。这些数据还显示了样品不依赖于处理的密切时间性匹配，同时查明了将神经外胚层与基板前体区分的基因子集(图12E中的加框区域)。主要成分分析确认了样品的高度时间相关性，在分化后期神经外胚层和基板前体细胞之间的趋异性增加(图12F)
据信基板祖先产生感觉神经元。分离Six1+基板前体，然后在无血清条件下培养，显示了有效分化成保持Six1表达的神经元(图13A-C)。这些细胞的感觉神经元身份通过Brn3A、Isl-1的表达得到证实，其在分化第20天测量(图13D、E)。更长期的分化研究(第40天)产生的细胞具有周围神经元标志物外周蛋白的强烈表达(图13F)和降低的Tuj1表达，与感觉神经元子代的体外成熟相当。从基板前体身份到成熟的感觉神经元结局的体外发育进程在图13G中图示。
结果表明，N-SB方案的简单改良导致从神经外胚层到基板前体的分化转换。使用定时的noggin取消，本发明得到收率71％的表达Six1的总细胞。纯基板前体的分离要求这样的标志物，其预期识别基板结局。预期的标志物的识别也可用于可靠地将基板细胞与其他另外的谱系例如CNS前体、神经嵴谱系和非神经外胚层区分。特别关注将基板衍生的前体与神经嵴衍生的前体分离，以可靠地从基板衍生的神经元种群中分离神经嵴。之前已阐明过神经早期神经分化过程中p75+/HNK1+的细胞的分离标记了结局朝向神经嵴身份的细胞种群(Lee等人,Nature Biotechnology,25(12):1468-75(2007)，在此将其并入作为参考)。在此，测试了基板谱系内这些标志物的关系。观察到NGFR在改良的N-SB方案中有效地标记基板培养物(图14A)，其与表达之前与前侧神经外胚层结局关联的标志物Forse1的前体种群分离(Elkabetz,G&D,2008,在此将其并入作为参考)。P75和人自然杀伤细胞-1(HNK1)表型(也称作CD57)表达的双分选显示，基于qRT-PCR分析，HNK1阴性的p75-单阳性细胞在Six1表达中大大富集(图14B、C)。与神经外胚层诱导经典N-SB方案相比较，基板诱导改良N-SB方案中p75+/HNK1-细胞的数量增加，进一步支持了细胞的基板身份(图14D)。
实施例II
产生IPS细胞
将编码hOct4、hSox2、hKlf4和c-myc的cDNA(购自Open Biosystems)亚克隆到通过人磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子驱动的自灭活的慢病毒载体中。通过将编码载体、pCMVΔR8.91和pUCMD.G的质粒DNA三倍共转染到293T细胞中，产生慢病毒载体上清液。将购自ATCC(CCL-171)的人胎儿肺成纤维细胞(MRC-5)以1.5x104细胞/cm2接种在补充有10％胎牛血清(FBS)的Eagle's极限必需培养基中。次日将成纤维细胞在4ug/ml聚凝胺的存在下用等量的四种慢病毒上清液转导～16小时。转导后6天，通过胰蛋白酶化来收获成纤维细胞，并以2x104细胞/60mm皿接种在丝裂霉素C-处理的小鼠胚胎成纤维细胞(CF-1)饲养层上。次日，将培养基转换成hESC培养基。通过免疫荧光和流式细胞术确认hiPS系对Tra-1-81、Tra-1-60、SSEA-4和Nanog呈阳性。在两种hips克隆中，发现4种载体编码的转基因是沉默的。
材料和方法：
细胞和培养条件(双SMAD和底板)。将hESC(WA-09；传代35-45)在以12-15,000细胞/cm2铺布的小鼠胚胎成纤维细胞上培养(MEFs,Global Stem)。每日更换培养基DMEM/F12、20％敲除血清置换(GIBCO)、0.1mM b-巯基乙醇、6ng/mL FGF-2。使用6U/mL分散酶将细胞在hESC培养基中传代，洗涤，并稀释1:5至1:10再重新铺布。
神经诱导(双SMAD)
将hESC培养物使用Accutase解聚20分钟，用hESC培养基洗涤，并在ROCK抑制剂的存在下在37℃下在明胶上预铺布1小时，以除去MEF。洗涤非贴壁hESC，并在添加有10ng/mLFGF-2和ROCK-抑制剂的MEF条件hESC培养基(CM)中在覆盖基质胶(BD)的皿上以10,000-25,000细胞/cm2的密度平板接种在基质胶上。理想的细胞密度经发现为18,000细胞/cm2。取消ROCK抑制剂，使hESC在CM中扩增3天，或者直至其几乎铺满。初始的分化培养基条件包括具有10nM TGF-β抑制剂(SB431542,Tocris)和500ng/mL Noggin(R&D)的敲除血清置换(KSR)培养基。在分化第5天时，取消TGF-b抑制剂，并每2天将增加量的N2培养基(25％、50％、75％)加入到KSR培养基中，同时保持500ng/mL Noggin。对于MS5诱导，使用之前报道的确定的方法18。
定量实时(双SMAD)
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA。对于每个样品，对1ug总RNA进行DNA污染处理，并使用Quantitect RT试剂盒(Qiagen)进行逆转录。使用Quantitect SYBR绿色探针和PCR试剂盒(Qiagen)在Mastercycler RealPlex2(Eppendorf)上检测扩增的材料。将样品归一化至HPRT对照，每个数据点对2-3个独立生物样品进行4-6次技术重复。
神经图式化和分化(双SMAD)
如之前所述使用BDNF、抗坏血酸、音猬因子和FGF8在N2培养基中进行多巴胺能图式化18，在BDNF、抗坏血酸、GDNF、TGFb-1和环AMP的存在下进行成熟。如之前所述使用BDNF、抗坏血酸、音猬因子和视黄酸在N2培养基中进行运动神经元图式化16。
显微术、抗体和流式细胞术(双SMAD)
将组织用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS洗涤，使用.5％Triton X在PBS中透化处理，并使用1％BSA在PBS中阻断。用于显微术的一级抗体包括PAX6(Covance)、Oct4(Biovision)、AP2(Novus Biologicals)、GBX2(Sigma)、HNK1(Sigma)、HOXB4(Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB))、Nestin(R&D)、NKX6.1(DSHB)、OTX2(gift)、p75(Advanced Target Systems.)、PAX7(DSHB)、PLZF(Calbiochem)、TUJ1(Covance)、ZO1(Zymed)、BF1(FOXG1,gift Esseng Lai)、TH(Sigma)、HB9(DSHB)、ISL1(DSHB)。使用CD105-PE(eBioscience)排除MS5基质细胞，用于在FACScan(BD)上进行流式细胞术。
底板：神经诱导
对于MS5诱导，使用之前的报道确立的方法(Perrier等人,2004)。如之前所述进行不含饲养层的神经诱导(Chambers等人,2009)。简言之，使用Accuse将hESC培养物解聚20分钟，用hESC培养基洗涤，并在ROCK抑制剂的存在下在37℃下在明胶上预平板接种1小时，以出去MEF。洗涤非贴壁hESC，并在添加有10ng/mL FGF-2和ROCK-抑制剂的MEF条件hESC培养基(CM)中在覆盖基质胶(BD)的皿上以20,000细胞/cm2的密度平板接种在基质胶上。取消ROCK抑制剂，使hESC在CM中扩增3天，或者直至其几乎铺满。初始的分化培养基条件包括具有10nM TGF-b抑制剂(SB431542,Tocris)和500ng/mL Noggin(R&D)的敲除血清置换(KSR)培养基。在分化第5天时，每2天将增加量的N2培养基(25％、50％、75％)加入到KSR培养基中，同时保持500ng/mL Noggin和TGF-b抑制剂。对于FP诱导，以200ng/ml加入Sonic C25II。在一些实验中，加入DKK-1(R&D100ng/ml)、FGF8(R&D 50ng/ml)、Wnt-1(Peprotech 50ng/ml)和视黄酸(R&D 1uM)。
定量实时PCR
使用RNeasy试剂盒(Qiagen)提取总RNA。对于每个样品，对1ug总RNA进行DNA污染处理，并使用Superscript III(Invitrogen)进行逆转录。使用Taqman探针和PCR mix(ABI)在Mastercycler RealPlex2(Eppendorf)上检测扩增的材料。将样品归一化至HPRT对照，每个数据点对3个独立生物样品进行3次技术重复。
微阵列分析
在分化第2、3、5、7和11天使用Trizol(Invitrogen)从对照(NSB)和FP(NSB+ShhC25II)分离总RNA。每个时间点使用3个生物复制品。所有样品通过MSKCC Genomics CoreFacility处理，并在Illumina人6寡核苷酸阵列上杂交。均一化和基于模型的表达测量使用Illumina分析软件包(LUMI)进行，其可通过开源Bioconductor项目(www.bioconductor.org)获得，统计学编程语言为R(http://cran.r-project.org/)。使用可通过Bioconductor获得的用于微阵列数据软件包(LIMMA)的线性模型，进行NSB和NSB+Sonic之间的成对比较。经发现调节p-值<.05且倍数变化大于2的基因被视作是显著。表达差异报道为倍数变化的log2。通过将基因名单输入注释、可视化和整合发现的数据库(DAVID；http://www.david.niaid.nih.gov)，确定基因本体论富集(Huang等人,2009；和Dennis等人,2003)。如之前所报道计算最大和最小表达的时机(Venezia等人,2004)。
简言之，将回归线拟合至NSB+Sonic C25II和NSB条件。对于这些趋势线，基于其发生最大和最小表达的时间点对基因进行分类。
微阵列、抗体和流式细胞术
将组织用4％多聚甲醛和苦味酸固定15分钟，用PBS洗涤，使用.3％Triton X在PBS中透化处理，并使用10％驴血清阻断。用于显微术的一级抗体包括PAX6(Covance)、TUJ1(Covance)、ZO1(Zymed)、BF1(FOXG1，gift E.Lai)、TH(Pelfreez)、NKX6.1(DSHB)和FOXA2(SantaCruz)。
载体设计和慢病毒制造
将第三代慢病毒(Lois等人,2002)修饰成由Ub-C启动子表达BF1ORF(Fasano等人,2009)，如所述由H1启动子表达BF1shRNA(Fasano等人,2007；Ivanova等人,2006)。使用之前所述的Foxg1shRNA构建物(Shen等人,2006)。将表达shRNA的慢病毒质粒与质粒pVSV-G和pCMVd8.9共转染到293FT细胞中。收集含有病毒的培养基，将其过滤，并通过超速离心法浓缩。通过在NIH 3T3细胞上连续稀释，然后在72小时后进行流式细胞分析，测量病毒滴度。
产生BF1shRNA和超量表达人ES系
将hESC(WA-09；传代35)分离，并与ROCK抑制剂一起按单一细胞平板接种在基质胶上。平板接种后24小时将ES细胞与对照(空载体)、BF1shRNA、或含有BF-1ORF的载体一起转导。1周后，人工挑选表达GFP的集落，并平板接种在MEF上。然后使细胞扩增，测试支原体和正常核型。
初级外植体的解剖
解剖E8.5,TP Taconic Swiss Webster雌性动物，取出胚胎。解剖神经外胚层组织，并成块铺布在FP细胞之上。对于神经突生长测定，解剖E12.5Sprague-Dawley大鼠小脑板组织，并铺布在源自hESC的FP细胞或对照神经外胚层细胞(NSB方案)之上。在共培养第3天分析大鼠外植体组织的突起。
条件培养基和ELISA
hESC分化成神经或FP细胞，在第6天除去Shh，在培养第9天和第11天收获培养基。根据制造商方案使用人Netrin-1ELISA试剂盒(Axxora)检测Netrin-1蛋白质水平。对于共培养实验，将培养基过滤，并直接添加到培养物中，或者新鲜培养基的1:2稀释液中。
统计学分析
显示的结果是平均值+s.e.m。星号和井字号识别在适用的情况下通过用于多重比较的t-测试、单向ANOV或具有Bonferroni校正的双向ANOVA显著地不同于对照组的实验组(p-值，0.05)。
实施例III
早期高剂量SHH暴露诱导FOXA2并抑制BF1
菊形团阶段的源自hESC的神经细胞分化成CNS和PNS子代，并朝向沿着A/P和D/V轴的多种细胞结局图式化(Elkabetz等人,2008)。这些结果说明，菊形团阶段细胞是高度塑性的，并对包括SHH的图式化诱因有响应。小鼠发育过程中祖细胞特化成FP组织和细胞被认为在早期神经谱系内依赖于SHH信号传导。发明人测试了菊形团状态神经细胞是否能够响应于SHH经历FP特化。小鼠发育过程中需要高浓度SHH以诱导FP(Roelink等人,1994；Ericson等人,1996)。重组的N-端SHH由于缺乏完整SHH作用所需的翻译后修饰，活性范围有限。近来，修饰形式的重组SHH变得可获得，其中SHH系有两个异亮氨酸(Sonic C25II,R&DSystems)，更加接近地模拟哺乳动物SHH蛋白质的效力。在大多数功能测定中，C25II比未经修饰的N-端SHH有效10倍。
但是，本发明发育过程中用常规SHH和SHH-C25II二者进行的关于确立的菊形团阶段神经细胞的剂量-反应研究在任何所测试的条件下均没有产生表达FP标志物例如FOXA2(FP标志物)的细胞。大多数细胞保持菊形团细胞结构，如上所述对于AN标志物BF1着色(图1A)(Elkabetz等人,2008)。这些结果令人惊异，即，暴露于高剂量SHH不足以将确立的菊形团阶段细胞转化成FP。
基于小鼠中的FP特化在早期发育阶段发生的假设，在神经诱导时或在此之前，发明人使用经典的基质细胞饲养层介导的神经诱导方案在菊形团特化时间第9天对SHH诱导研究进行了重复(Elkabetz等人,2008)。在该范例下，发明人注意到细胞形态的显著变化限于用SHH-C25II处理的细胞(图1B)。细胞表现出扁平形态，无菊形团结构。而且，发明人观察到BF1+细胞中强壮的FOXA2+增量调节和伴随的降低(图1C)，以及ZO1+菊形团总数的降低(图1D)。除BF1表达降低以外，发明人还观察到AN中表达的另一标志物PAX的表达降低(图1E)。剂量-反应研究表明，FOXA2+细胞的诱导和伴随的BF1和PAX6表达的降低在125-500ng/ml SHH C25II的浓度下实现(图1F，未示出)。使用未经修饰的N-端SHH在所测试的任何浓度下均没有有效的FOXA2+细胞的诱导。发明人进行了剂量反应研究，以理解与已知响应于较低浓度SHH的基因NKX6.1的表达相比较，FP标志物诱导如何。在低浓度Sonic C25II下，没有FP标志物FOXA2和Netrin-1的表达，但NKX6.1表达有强壮的增加。在较高的浓度下，FP标志物迅速增加，而NKX6.1表达逐渐减少(图1G)。这些数据表明，早期暴露于高浓度SHH降低前侧AN标志物并诱导FP标志物FOXA2。
实施例IV
对FP诱导的反应能力限于窄窗口分化
尽管用初始的步骤诱导FOXA2的强壮(观察到强烈的信号，例如染色)增量调节，在使用经典的基质细胞饲养层介导的神经诱导培养大约21天之后仅有大约30％的细胞呈阳性。因此，本发明测试了若干类型的用于增加表达FOXA2的培养细胞总数的培养组合物和方法。
近来，发明人开发并描述了一种快速、明确的神经诱导范例，其基于经由暴露于noggin和SB431542对SMAD信号传导的抑制而产生显著更大量的神经细胞(NSB方案；(Chambers等人,2009))。使用该方案，与本发明的组合物和方法相结合，发明人致力于通过在神经诱导过程中的不同时间点加入Sonic C25II并测定FOXA2表达，对FP分化进行优化。NSB暴露时分化起始，在第1天、第3天、第5天或第7天加入Sonic C25II(图2A)。在分化第1天开始用SHH处理的培养物中观察到最有效的FOXA2诱导，FOXA2+细胞代表全部细胞的大约65％(图2B和2C)。在分化第11天以外延长SHH处理并没有增加FOXA2产率(图2D)。这些数据表明，需要早期高SHH信号确立FP身份，并提示了FP特化反应能力的关键窗口。而且，分化条件确立了用于在体外诱导人FOXA2+细胞的稳健平台。
FOXA2是FP发育的关键标志物。但是，FOXA2在内胚层中也得到高度表达。为了进一步表征源自hESC的假定FP组织，发明人在第11天对候选标志物进行了qRT-PCR分析。使用NSB方案作为对照，发明人确认了FOXA2和其他FP标志物包括SHH、F-Spondin和Netrin-1表达的显著增加(图7)。发明人使用一组神经前体、神经胶质、神经和非神经标志物进一步表征了FOXA2+假定FP细胞的性质(图7)。FOXA2+细胞仅共标记这些标志物的有限子集包括Nestin(86％)和SOX2(17％)。为了区分源自hESC的FP与内胚层组织中的FOXA2表达，发明人将hESC分化成内胚层(D'Amour等人,2005)。如所预计，在FP和内胚层两种分化条件下，与NSB处理的对照细胞相比较，发明人观察到FOXA2表达的增加。但是，内胚层标志物SOX17的诱导限于内胚层条件，在源自hESC的FP细胞中不存在SOX17(图7)。发明人在源自hESC的FP细胞中也没有观察到其他内胚层标志物例如AFP和白蛋白的表达。这些数据说明，在NSB+SHH方案中源自hESC的FOXA2+细胞表达FP和早期神经前体标志物，缺乏内胚层标志物的表达。
实施例V
源自hESC的FP细胞具有功能性
FP在发育过程中在神经图式化和轴突路径找寻方面具有重要的功能作用(Jessell,2000)。为了评价源自hESC的FP的功能特性，在第9天和第11天分离条件培养基，并使用ELISA测试培养基中Netrin-1的表达(图3A)。在正常NSB条件下，Netrin-1在第9天可检测，在第11天降低，而在NSB+SHH条件下，Netrin-1水平有3.5倍的增加，在第11天增加(图3B)。SHH是FP细胞分泌的关键图式化因子，并以依赖于剂量的方式特化腹侧细胞类型。为了测试源自hESC的FP是否分泌可以特化腹侧前体区域的因子，在分化第9天和第11天分离条件培养基(CM)。在第6天，除去外源性SHH，洗涤培养物，以从培养基中除去任何外源加入的SHH。在对照(NSB)方案的第11天分离天然神经祖细胞，并与NSB CM或FP CM一起培养。在CM的存在下培养5天之后，发明人探测了腹侧前体标志物的表达和SHH响应性基因GLI2的表达。发明人发现，与获自NSB对照培养物的CM相比较，来自源自hESC的FP组织的CM有效地诱导腹侧基因包括NKX2.1和NKX6.1的表达(图3C)。腹侧标志物表达的增加在蛋白质水平上得以确认(图3C)。
为了考察该结构是否是SHH介导的，发明人证明了暴露于来自源自hESC的FP的CM时GLI2表达的增加。当在SHH拮抗剂环巴胺的存在下重复该实验时，所有三种基因NKX2.1、NKX6.1和GLI2均显著降低(3C)，说明了图式化反应对SHH信号传导的依赖。
经典研究表明，FP外植体可以在早期神经外胚层组织中诱导异位FP(Placzek等人,1993)。为了测试源自hESC的FP是否能够在初级小鼠外植体中诱导FP标志物，从E8.5小鼠胚胎分离神经外胚层组织，并将其放置成与源自hESC的FP细胞直接接触。共培养3天之后，基于小鼠特异性M6标志物的表达识别外植体，将其漂洗，并安装在玻片上，进行FOXA2染色。作为对照条件，使用NSB方案将小鼠外植体与源自hESC的神经组织共培养。尽管与对照的源自hESC的神经组织共培养没有产生FOXA2+细胞，与源自hESC的FP细胞共培养的外植体表现出强壮的FOXA2+细胞诱导，特别是在外植体的周围处(图4D和4E)。在初级大鼠E12.5大鼠小脑板外植体中观察到源自hESC的FP细胞的神经突生长促进作用(图8)，该测定之前是用于证实初级啮齿类动物FP组织的轴突生长促进作用(Shirasaki等人,1995)。这些实验表明，通过分泌能够使天然hESC衍生的初级小鼠神经前体细胞腹侧化的Netrin-1和SHH，源自hESC的FP可以作为组织者模拟初级FP组织的功能特性。
实施例VI
时间性转录组分析表明FP特化以AN为代价发生
为了获取对人FP特化的关键因子更深入的认识，在11天方案过程中在6个时间点进行候选标志物的高分辨时间性基因表达图谱。观察到FOXA2表达在分化第3天开始在转录物水平上稳定增长(与NSB相比较)，与免疫染色数据相符(图4A)。有趣的是，其他的FP标志物；SHH、Netrin-1和F-Spondin遵循不同的表达模式(图4B-4D)。所有三张标志物均表现出更加延迟的诱导，在分化第7天表达大大增加(与NSB条件相比较)。
PTCH1表达常常用作SHH活性的转录读出。早在分化第3天便观察到PTCH1表达的显著增加，在接下来的2天水平进一步增加3个因子(图4E)。之前已经表明，SHH下游效应器GLI2是FP诱导必不可少的，但在FP发育后期降低(Matise等人,1998)，但是GLI2可以直接激活FOXA2表达(Jeong和Epstein,2003)。观察到GLI2和FOXA2表达的早期增加(图4A和4F)，之后在第11天GLI2降低，与特异性地在FP诱导过程中GLI2的作用相符。对于GLI1观察到类似的趋势，尽管诱导水平低得多(图4G)。
SOX1是早期神经标志物，在中间FP中不表达(Charrier等人,2002)。与快速神经诱导相符，SOX1在NSB条件下迅速增量调节，并随着时间持续增加。在加入SHH时，与对照NSB条件相比较，在第3天观察到SOX1水平小得多的增加(图4H)。NSB条件产生高水平表达BF1的具有AN倾向的神经细胞(Chambers等人,2009)。但是，向培养物中加入SHH时，在第7天PAX6和BF1大大降低(图4I和4J)。没有观察到内胚层标志物SOX17和中胚层标志物Brachury的诱导(图4K和4L)，说明FP诱导与使用NSB方案的AN诱导类似，在没有明显的中胚层或内胚层中间体的贡献的情况下发生。这些数据说明了源自hESC的FP中适当标志物的表达，其通过GLI2和FOXA2表达引发，之后是功能性FP标志物例如Netrin-1、SHH和F-Spondin的表达。FP特化时PAX6和BF1表达的降低说明FP的诱导以AN为代价发生。
实施例VII
源自HESC的FP特化过程中的全转录组分析
在对照NSB培养物(产生AN)和在Sonic C25II处理的培养物(产生FP；参见图2E)中在本发明的发育过程中(第1、3、5、7和11天)建立分化过程中5个时间点的全基因表达时间性图谱。在微阵列分析之前，验证每个样品表达一组FP标志物的质量(图9)。每个时间点和培养条件在3个独立的样品中进行全基因表达研究。将数据转化成log2比例，比较分化过程中FP与NSB方案中基因表达的水平(图4l-4Q)。原始数据可在GEO数据库中获得(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，编号：GSEXXX(数字在公开时可获得)。
使用DAVID(http://david.abcc.ncifcrf.gov/；Dennis等人,2003)对时程数据作基因本体论(GO)富集分析，作为FP转录图谱的无偏性评价。在分化第7天和第11天在SHH处理的与NSB对照培养物中高度富集的转录物当中，有与Wnt和hedgehog路径、轴突导向和分泌的蛋白质相关的基因(图4L和4M)。图式化和轴突导向因子的富集进一步证实了SHH处理的培养物的FP身份。而且，当与NSB方案培养的细胞相比较时，在用于产生底板细胞的FP培养方法中，当包括参与前脑发育的基因的转录物表现出更大量的减量调节时表现出SHH介导的AN抑制(图4L、M)。
每个分化阶段进行成对比较，以获取对于FP特化过程中差异性表达的特定基因的深入认识。尽管大多数在分化第3天和第5天显著调节(与第1天相比较)的基因在NSB和FP方案中是共享的，转录物的子集是差异性表达的(图4N-4Q)。具体地，观察到一种组分Patched-1(PTCH1)的增加，其是SHH信号传导的已知转录下游目标。在该方案中，PTCH1在所有时间点高度富集，除了其开始降低的D11以外(图4N-4Q)。
本发明的发明人观察到Wnt路径成分的显著变化。早在第5天，便有Wnt路径抑制剂DKK-1的显著降低，该降低在方案进程始终得以保持(图4N-4Q和图7)。另外还在中线中(图4P和4Q)观察到了之前已经显示与小鼠发育过程中的中线轴突导向有关(Lyuksyutova等人,2003)的若干Frizzled基因的显著增量调节。此外，识别出在FP特化过程中差异性表达的若干额外的基因，包括SIX6、CAPN6、IGFBP3和FIBLN1(图4N-4Q)。这些和额外的基因的差异性表达通过qRT-PCR验证(图9)。基于文献和MGI(小鼠基因表达数据库)，尽管在小鼠和人胚胎组织将会要求***性地在线杂交筛选，以验证假定的人FP标志物，许多识别的基因在前正中线和底板组织中具有相容的表达图式，分别地例如，HESX1(Zoltewicz等人,1999)或RBP1(CRBP1–Hunter等人,1991)。
实施例VIII
另外进行了基因聚簇分析，其显示基因何时表达最高；最大时间(TOM)和最低时间；最小时间(TIM)表达。GO本体论语义在该分析中绘制，并且能够识别FP特化过程中的精确发育窗口。这些数据额外地证实了源自hESC的FP组织的身份，并对FP与神经外胚层结局特化过程中差异性表达的基因提供深入的认识。
实施例IX
DKK-1的抑制阻断AN定型并提高FP产生
发明人观察的FP定型以AN为代价发生的观察结果通过本文得到的全基因表达图谱得以加强，其显示了Wnt信号传导抑制剂DKK-1的迅速下调。DKK-1最初识别为在爪蟾头部组织者中表达的因子，其对于诱导头发育是充分和必要的(Glinka等人,1998)。小鼠发育过程中DKK-1-介导的Wnt信号传导的抑制对于前侧脑发育来说是必要的(Mukhopadhyay等人,2001)，并且FOXA2敲除胚胎在E7.5在外胚层中显示出DKK-1表达的增加(Kimura-Yoshida等人,2006)。在NSB诱导过程中，观察到在第5天DKK-1转录水平急剧增加200-5000倍，然后降低回到与DKK-1作为AN诱导剂的作用相符。进行ELISA测定，以测量培养基中的DKK-1蛋白质水平，发现水平高达12ng/ml(图5A、B)。早在Sonic C25II处理后2天便观察到mRNA和蛋白质水平上DKK-1的显著降低(图5B、C)。DKK-1表达的降低得以保持，并且伴随有AN标志物包括PAX6、BF1、OTX1、OTX2和EMX1的降低(图4)。
为了检测hESC分化过程中DKK-1是否在功能上参与FP特化，发明人加入了与SonicC25II结合的重组DKK-1，并评价FP标志物的表达。尽管用单独的Sonic C25II处理导致AN标志物BF1的降低和FOXA2的增量调节(图5D-F)，加入DKK-1导致FOXA2信息和蛋白质的降低以及BF1转录物更加迅速的增加(图5D-F)。相反地，在NSB方案中向细胞中加入DKK-1抗体导致BF1表达水平的显著延迟和降低。这些数据说明，内源性DKK-1水平对于AN特化来说是至关重要的。接下来，在Sonic C25II和DKK-1中和抗体的存在下使hESC分化。在这些条件下，在第5天BF1转录物的早期短暂诱导得到抑制，并伴随有FOXA2水平的增加(图5E和图5G)。
本发明发育过程中得到的数据揭示了神经诱导过程中FP特化的关键窗口。得到DKK-1表达可以抑制FOXA2表达的观察结果，设计以下测试，以说明加入DKK-1阻断抗体是否延伸SHH介导的FP诱导的反应能力窗口。在分化第1天、第5天和第9天加入DKKK-1抗体。在相同的时间点开始暴露于SHH，在SHH暴露9天之后对FOXA2表达进行测定。当在第1天与SHH一起加入Dkk-1时，观察到FOXA2+细胞的增加。但是，当在第5天或第9天加入时，没有观察到DKKK-1抗体FOXA2+细胞(图5H和5I)。这些数据说明，NSB方案中早期高水平内源性DKK-1引发AN定型并抑制FP反应能力。用SHH早期处理抑制DKK-1介导的AN特化，并使得能够朝向FP谱系分化。但是，在第5天或更晚期抑制DKK-1并没有延长FP诱导的时间窗口。
实施例X
Bf1表达抑制Fp定型
本发明的发明人发现，向干细胞培养物添加SHH导致以AN为代价的FP分化，至少部分地通过DKK-1的抑制来介导。DKK-1被显示为特化BF1+神经外胚层BF1(Mukhopadhyay等人,2001)，在NSB诱导过程中BF1在大多数神经细胞中表达(图4和5)。为测试叉头因子BF1的表达是否直接抑制神经诱导过程中的FP反应能力，用BF1shRNA构建物对hESC进行转导(Fasano等人,2009；Shen等人,2006)并衍生克隆细胞系。BF1并未在hESC中高表达，并且在细胞形态学和克隆大小上没有差异(图10)。
但是，在hESC神经分化时，BF1蛋白质表达降低(图5J"和5K")，BF1转录物降低80％(图10)。尽管BF1功能丧失已经与神经前体阶段增殖和细胞周期进程中的缺陷有关，在hESC阶段BF1敲低谱系表现出与对照载体转导的谱系相当的细胞周期动力学(图10)。然后将BF1敲低和对照hESC分化成FP，并对一组FP标志物进行qRT-PCR分析。分化11天之后，在BF1shRNA条件下所有FP标志物的表达均显著增加(图5L)。而且，免疫细胞分析显示了FOXA2+细胞数量的显著增加，在BF1敲低hESC系中代表大于总细胞的90％(图5M)。
使用之前所述的载体通过BF1的超量表达产生hESC系(Fasano等人,2009)。然后将这些转基因细胞在诱导朝向FP谱系分化的条件下培养。在第11天，与对照GFP表达克隆相比较，FOXA2+细胞减少，并且FP标志物的表达降低(图10)。这些数据表明，BF1表达抑制源自hESC的FP的衍生。
实施例XI
FP的A/P轴通过尾化剂改变
尽管某些特性在所有FP细胞当中共享，例如FOXA2和Netrin-1表达，已经报道了底板沿着A/P轴的不同区域之间存在差异(Placzek和Briscoe)。具体地，最近的研究已经表明，中脑FP表达例如CORIN(Ono等人,2007)和NOV(Placzek和Briscoe,2005)的标志物。
此外，中脑FP显示出具有神经能性，产生中脑DA神经元，并表达DA祖先标志物例如LMX1B和NGN2(Joksimovic等人,2009)。相反，后脑和脊髓FP似乎是非神经能的。为了更好的理解由hESC产生的FP细胞的A/P身份，进行中脑FP标志物CORIN和NOV的qRT-PCR分析，以及DA祖先标志物LMX1B和EN1的分析。但是，并未检测到这些标志物的表达。接下来的基因表达数据组可以用于识别差异性调节的转录物标志物，其可以阐明FP细胞的位置身份。
小鼠中的精致研究表明，特定的增强子元件指导沿着FP的A/P轴的不同区域中的Shh表达(Jeong等人,2005)。与NSB对照条件相比较，在FP诱导过程中SIX6大大增加(在分化第5天mRNA水平增加大约50,000倍；图9)。已经显示SIX6与称作SBE2的增强子区的SHH基因结合，其指导SHH表达至腹侧脑的最前侧(Jeong等人,2008)。发明人预计使用SIX6作为前侧FP身份的假定标志物。因此，使用源自hESC的FP的SIX6状态来标记响应于已知尾化剂例如FGF8、Wnt-1和视黄酸的再特化。将各个这些尾化因子与SHH结合加入，对产生的组织进行FP标志物FOXA2和NETRIN-1、AN标志物BF1和假定前侧FP标志物SIX6的表达进行评价。在尾化因子的存在下没有发现FP的产生受损。事实上，基于FOXA2和Netrin-1表达，加入Wnt-1或RA显著加强FP产生(图6A和6B)。在RA和Wnt-1组中FP标志物的表达提高与BF1表达的显著降低有关，进一步支持了AN定型抵消FP诱导的观点(图6B)。令人注意的是，在所有条件下，SIX6表达均有显著降低，Wnt-1和RA条件在抑制前侧FP身份方面最有效。
实施例XII
该实施例显示的示例性实验设计为用于确定本文使用的任意方法(条件)是否会导致中脑FP和DA祖先标志物的增量调节。发明人发现，不同的因素对于标志物表达具有不同的影响(图6B)。具体地，暴露于Wnt-1导致中脑FP标志物CORIN和NOV显著增加，以及DN祖先标志物LMX1B、EN1和NGN2的增加。之前的研究表明，Wnt信号传导在中脑FP的神经源性反应中是至关重要的(Joksimovic等人,2008)。
如上所述，研究已经识别出不同的指导SHH表达至沿着腹侧轴的不同A/P区域(Jeong等人,2008)。为了进一步阐明加入尾化因子使产生的FP组织的A/P身份再特化，在存在或不存在Wnt-1或FGF8的情况下产生源自hESC的FP，并将产生的组织用两种在FP不同的A/P区域中驱动LacZ表达的SHH增强子构建物转染。SBE1构建物将SHH表达导向底板的中脑区，而SBE2增强子将SHH表达导向FP的最前侧区，其中Six6已经显示出结合。在不存在尾化因子(单独的SHH C25II)的情况下，LacZ表达在用SBE2转染之后在此观察到，但用SBE1转染之后没有，支持了源自hESC的FP默认是前侧这一假设(图6C)。相反地，在用Wnt1或FGF8处理时，SBE2活性消失，而SBE1活性在这些条件下得以诱导。这些数据表明，FGF8或Wnt1处理诱导FP身份朝向更加尾部的中脑样身份转换(图6C)。
总之，我们的数据说明，在神经分化时，通过增量调节DKK-1和随后的BF1，hESC默认朝向AN结局，并且AN定型积极地抑制hESC子代中的FP反应能力。但是，早期的高水平SHH降低DKK-1水平，使得能够以AN为代价进行FP诱导，同时DKK-1或BF1的功能丧失增加FP的产生。源自人ESC的FP默认是前侧的，但响应于尾化因子而后侧化。这一点总结于图6E中。
实施例XIII
细胞培养物：hESC(WA-09；传代35-45)，hiPSC系(iPS-14，iPS-27；传代20-30)，I6在未分化状态下保持，并使用之前所述的双SMAD抑制方案朝向CNS谱系分化。对于基板诱导方案(PIP)，在分化第3天除去Noggin。在一些实验中，加入BMP-4、Noggin、DKK-1、FGF8、SU5402、Wnt-3a、DAPT、CHIR99021、Cyclopamine、音猬因子(SHH)和Purmorphamine。对于朝向三叉神经感觉结局的分化，将基板簇集物保持在补充有抗坏血酸和BDNF的N2培养基中。通过从PIP的第7-11天暴露于SHH和Purmorphamine，然后用DAPT处理以促进PIT1+结局，诱导垂体结局。
实施例IVX
细胞表征：将qRT-PCR数据归一化至HPRT，其基于来自至少3次独立实验的4-6次技术重复。根据制造商说明书通过MSKCC基因组核心进行全基因表达分析(Illumina人-6寡核苷酸阵列)。关于免疫细胞化学的一级抗体使用和流式分析以及关于电生理学分析的详细信息在扩展的补充方法中显示。
实施例XV
动物研究：动物研究遵照NIH指南根据动物管理和使用委员会机构(Animal Careand Use Committee)许可的方案进行。将产生激素的细胞皮下注射到成年雄性NOD-SCIDIL2Rgc小鼠和成年8雄性裸大鼠中。移植之后4-6周收集血液，然后进行测定激素水平的ELISA分析。鸡移植研究在HH阶段9-10进行，在HH阶段20收获胚胎。对成年NOD-SCID IL2Rgc小鼠的脑桥的注射通过立体定向手术进行。
实施例XVI
统计学分析：统计学分析使用GraphPad Prism 5.0b版本进行(GraphPadSoftware)。所有数据均获自至少3次独立实验。星号标记通过双尾Students t-测试或者通过ANOVA然后通过Dunnett测试显著不同于对照组的实验组，以将对照与多个独立处理组进行比较。除非另外指出，数据表示成平均值±SEM。
实施例XVII
细胞和培养条件：将hESC(WA-09；XX，传代35-45)、hiPSC系(iPS-14，iPS-27；传代20-30)(Chambers等人,2009)和I6(Amit和Itskovitz-Eldor,2002)在以12-15,000细胞/cm2平板接种的小鼠胚胎成纤维细胞上培养(MEF，Global Stem)，并保持在每日更换的由DMEM/F12、20％敲除血清置换(GIBCO)、0.1mM b-巯基乙醇、6ng/mL FGF-2组成的培养基中或者在hESC-定量MatrigelTM(BD Biosciences,San Jose,CA)涂覆板上的mTeSRTM1中(StemCell Technologies,Inc.,Vancouver,Canada)中。使用6U/mL分散酶将细胞在hESC培养基中传代，洗涤，并稀释1:10至1:15再平板接种。
实施例XVIII
神经诱导和基板诱导：如之前所述进行不含饲养层的神经诱导(Chambers等人,2009)。简言之，将hESC培养物使用accutase解聚20分钟，使用hESC培养基洗涤，并在ROCK抑制剂的存在下在37℃下在明胶上预平板接种1小时，以除去MEF。洗涤非贴壁hESC，并在添加有10ng/mL FGF-2和ROCK-抑制剂的MEF条件hESC培养基(CM)中在覆盖基质胶(BD)的皿上以60,000细胞/cm2的密度平板接种在基质胶上。24小时之后取消ROCK抑制剂，使hESC在CM中扩增2天，或者直至其95％铺满。初始的分化培养基条件包括具有10nM TGF-β抑制剂(SB431542,Tocris)和250ng/mL Noggin(R&D)的敲除血清置换(KSR)培养基。在分化第5天时，每2天将增加量的N2培养基(25％、50％、75％)加入到KSR培养基中，同时保持500ng/mLNoggin和TGF-β抑制剂。当在BMP信号传导的调节之后使用不含KSR的条件(E6培养基(Chen等人,2011))时，可以得到类似的结果；数据未示出。对于基板诱导，在分化第3天除去Noggin。在一些实验中，加入BMP-4(R&D 50ng/ml)、Noggin(R&D 250ng/ml)、DKK-1(R&D100ng/ml)、FGF8(R&D 50ng/ml)、SU5402(Tocris 10μM)、Wnt-3a(R&D 50ng/ml)、DAPT(Tocris,10μM)、CHIR99021(Stemgent,3μM)、环巴胺(Tocris,10μM)、音猬因子(C25II-R&D100ng/ml)和Purmorphamine(Stemgent,1μM)。
实施例IXX
三叉神经感觉神经元的终末分化：在第13-17天将基板簇集物人工分离。将簇集物重新平板接种在预覆有15μg/mL多鸟氨酸、1μg/mL层粘连蛋白(Po/Lam)的培养皿上，并在补充有抗坏血酸(AA,0.2mM)和(20ng/mL)的N2培养基中保持。对于电生理学实验，在ACSF中使用NGF和ROCK抑制剂，其增加腔室内细胞的存活。
实施例XX
产生激素的细胞的分化：在基板诱导方案过程中，在PIP第7-11天加入音猬因子(C25II-R&D 100ng/ml)和Purmorphamine(Stemgent,1μM)，以促进朝向垂体基板原基的分化。将细胞不经传代保持在N2培养基中，并在分化第13天至第17天用额外的因子例如DAPT(Tocris，10μM)处理，以诱导PIT1+和GATA2+前体细胞(图39A)。
实施例XXI
定量实时PCR：使用RNeasy试剂盒(Qiagen)或Trizol提取总RNA。对于每个样品，将1μg总RNA进行DNA酶处理，并使用Quantitect RT试剂盒(Qiagen)进行逆转录。使用Taqman探针和PCR mix(ABI)在Mastercycler RealPlex2(Eppendorf)上检测扩增的材料。所有结果均归一化至HPRT管家基因对照，其基于来自至少3次独立实验的4-6次技术重复。
实施例XXII
微阵列分析：在分化第1、3、5、7、9和11天使用Trizol(Invitrogen)从对照(NSB)和PIP分离总RNA。每个时间点使用三次生物重复。所有用品均通过MSKCC Genomics CoreFacility处理，并在Illumina人-6寡核苷酸阵列上杂交。使用Partek Genomic Suite(Partek GS)进行分位数归一化和基于模型的表达测量(Downey,2006)。进行NSB和PIP之间的成对比较。经发现调节p-值<.001且倍数变化大于2的基因被视作是显著的。表达差异报道为倍数变化的log2。通过将基因列表录入注释、可视化和整合发现的数据库(DAVID；david.niaid.nih.gov)，测定基因本体论富集(Dennis等人,2003；Huang et al.,2009)。
实施例XXIII
显微术、抗体和流式细胞术：将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，用PBS洗涤，用0.3Triton X在PBS中透化处理，并用1％BSA阻断。用于显微术的一级抗体包括PAX6(Covance,DSHB)、TUJ1(Covance)、BRN3A(Chemicon)、AP2a(DSHB)、HNK1(Sigma)、PAX3(DSHB)、SIX1(ABR,Atlas)、ISL1(DSHB)、PERIPHERIN(Santa Cruz)、GSU(giftA.McNeilly)、CRYAB(Chemicon)、DACH1(Proteintech)、EYA1(gift Kawakami)、E-CADHERIN(Abcam)、FSH(gift A.McNeilly)、GATA2(Abcam)、chick GFP(Abcam)、hNCAM(Santa Cruz)、GLUTAMATE(Sigma)、KRT14(Labvision)、SIX6(Atlas)、LHX3(Abcam)、OVOL2(Aviva)、TFAP2A(DSHB)、FOXG1(gift E.Lai)、hCA(Stem Cells)和Ki67(Sigma)。显色使用适当的Alexa488、Alexa568、Alexa 647二级抗体(Molecular Probe)和/或DAPI复染色。对于流式细胞数，在25℃下暴露于accutase 20分钟之后将细胞机械解离。在FACS分析中为了除去死的细胞种群，我们根据制造商的推荐使用DAPI或7-AAD。使用FACScan(Becton Dickinson)和FlowJo软件(Tree Star,Inc.)对细胞进行分析。
实施例IVXX
电生理学：将簇集物接种在玻片上。将玻片在含有以下的人工CSF(ACSF)中恢复：119mM NaCl、2.5mM KCl、26.2mM NaHCO3、2.5mM CaCl2、1.3mM MgCl2、1mM NaH2PO4和20mM葡萄糖(pH 7.4，渗透度300mOsm)，记录之前在室温下用5％CO2/95％O2鼓泡最小1小时。记录过程中将切片不断地用ACSF灌注。由从簇集物迁移的神经元进行全细胞记录，上述神经元倾向于比簇集物中心的细胞更加成熟。将膜片电极(patch electrode)(5-8M)装有含有以下的细胞内溶液：130mM K-葡糖酸盐、16mM KCl、2mM MgCl2、10mM HEPES、0.2mM EGTA、4mMNa2-ATP和0.4mM Na3-GTP(pH 7.25，渗透度290mOsm)。在实验过程中在使膜片破裂之后迅即并且周期性地识别每个细胞的膜电位，以保证细胞健康状况没有显著劣化。以保持在-60mV的电压钳模式记录自发的微型突触电流。对细胞施加去极化和超极化电流步骤(0.2Hz；时间500ms)，以有助于表征其点生理学图谱。对于每个细胞所有参数测量最少三次，计算平均值。
实施例XXV
体内移植：所有动物实验均根据动物管理和使用委员会结构许可的方案并遵循NIH动物福利指南进行。对鼠科动物皮下注射产生激素的细胞：对于皮下移植，将0.5ml基质胶中1x106源自hESC的垂体细胞(分化第16天和第32天)或单独的基质胶(作为对照)注射到成年8周龄雄性NOD-SCID IL2Rg null系小鼠和成年8周龄雄性裸大鼠(Taconic)中。移植后1周、4周和6周遵照RARC指南进行全血采集或眶后血液采集，用于来自血浆的激素测量。将动物在移植之后2天、1周和6周处死，并进行组织学处理。将来自成年小鼠的基质胶栓在4％多聚甲醛中固定并进行冷冻超薄切片，用于免疫组织化学分析。实施例XXVI
移植到鸡三叉神经神经节原基中：对于卵内移植，将受精卵(Charles River)在37℃下在加湿孵化器中孵化。将GFP hESC-基板衍生的神经元移植到HH阶段9-10鸡胚胎的预期的三叉神经神经节中。将卵孵育直至HH阶段20。将鸡胚胎在中脑神经管水平上横向切片，以使三叉神经神经节可见。
实施例XXVII
移植到小鼠脑桥区：在分化第22天将表达GFP的源自hESC的三叉神经神经元/祖细胞通过立体定向手术移植到9只NOD-SCID IL2Rgc null系小鼠的右脑桥；坐标为Lambda：-0.77，Bregma：-4.16，D/V：4.65和M/L：+0.5(右)。对于每个动物，将200,000细胞以100K/μl的密度移植。将来自鸡胚胎和成年小鼠的组织在4％多聚甲醛中固定，并进行冷冻切片用于免疫组织化学分析。
实施例XXVIII
ACTH和GH释放的体外和体内分析：在分化第36天对产生激素的源自hESC的细胞进行分析。将细胞用HBSS漂洗，随后暴露于新鲜HBSS(500μl，37℃下10分钟)。随后收集上清液，使用ACTH LumELISA试剂盒(Calbiotech)进行ELISA。从进行ELISA的条件培养基也很溶液检测ACTH。对于体内研究，在使应激最小化的条件下在8a.m.，从移植有源自hESC的垂体前叶细胞和仅基质胶对照的小鼠和大鼠采集血液样品到K2EDTA-处理的BD MicrotainerMAP(BD)中。使用冷冻离心机以2,000g离心20分钟，分离血浆。收集上清液用于ELISA，以测量激素水平。使用人生长激素ELISA试剂盒(Calbiotech)在移植之后在体外和体内类似地测量GH水平。
实施例XXIX
使用E8/E6细胞培养基的PIP方案：E8/E6细胞培养基(Essential8TM/Essential6TM,Nat Methods.2011May；8(5):424-9)包括组分DMEM/F12、抗坏血酸、selenum、胰岛素、NaHCO3、转铁蛋白、FGF2和TGFβ。培养基与本文所述的KSR培养基的不同之处在于E8/E6不包括活性MP或Wnt成分。本实施例说明了使用BMP缺乏的E8/E6培养基的改良的PIP方案。
开发Six1敲入GFP报道基因细胞系(SIX1::H2B-GFP)，以监测细胞何时转化成基板结局。(图41A-E)。根据本文所述的方案KSR PIP在E8/E6培养基中培养报道基因系，其中细胞在包括SMAD抑制剂SB431542和LDN193189的培养基中培养，其中培养2天后取消LDN193189，培养11天后产生低水平的基板细胞。(图42A-B)。E8/E6培养基中不存在的BMP4是细胞分化成非神经外胚层和基板所必需的，如标志物AP2的表达所证实。(图43A-C)。当BMP4在培养基中以5ng/ml浓度存在时，在包括SB431542和BMP4的E8/E6中培养SIX1::H2B-GFP报道基因细胞，其中培养3天后取消BMP4，导致基板发育。但是，在20ng/ml的浓度下，或者在5ng/ml BMP4下培养多于5天，导致非神经外胚层(皮肤前体)而不是基板前体的诱导。(图44A-C)。在具有SB431542和5ng/ml BMP4的E8/E6中培养SIX1::H2B-GFP细胞，其中培养3天后取消BMP4(与培养1天或2天后取消相比较)，在E8/E6培养基中培养共计6天后，产生收率最高的基板前体。(图45A-B)。根据改良的PIP方案(PIP-E6，其中BMP4以5ng/ml的浓度存在，并且3天之后取消)培养细胞导致培养11天之后不同基板标志物的诱导。其还导致多能性(OCT4)的丧失，肌肉(MyoD)或普通中胚层(Brachyury)诱导的缺乏，以及内胚层(SOX17)或神经嵴(SOX10)诱导的缺乏。(图46和47)。尽管使用PIP-E6方案诱导的基板细胞的产率低，但与KSR PIP方案相比较，该诱导具有高度的一致性。(图48)。
实施例XXX
诱导三叉神经基板作为默认的改良的PIP-E6：与KSR不同，E8/E6不包括任何Wnt活性化合物。为了在使用PIP-E6方案培养时使三叉神经基板结局成为默认结局，通过在培养方案中加入CHIR(Wnt激活剂)，对PIP-E6进行改良。在PIP-E6方案第2-4天期间在培养基中包括CHIR导致三叉神经基板诱导为默认基板。(图49A-B)。图50说明了可以使用PIP-E6培养方案诱导的垂体、晶状体和三叉神经基板。
实施例XXXI
三叉神经基板标志物GD2和CD57(HNK1)的鉴定：根据PIP-E6方案培养Six1::GFP标志物细胞，如图49所示。培养11天之后，进行如下步骤：
·将细胞以50,000细胞/96孔的浓度重新平板接种
·在4h附着期间使细胞贴附于板
·使用BD Lyoplate进行活细胞染色
·检测242人细胞表面抗原(大多数CD蛋白质)
·在二次抗体染色之后将细胞固定
·次日使用Operetta对细胞进行成像
·对Six1::GFP+/标志物+(Alexa647+)和标志物+(Alexa647+)的％进行定量
图51显示了三叉神经基板富集的表面标志物。标志物GD2识别为三叉神经基板的标志物，随后用于在本文所述的条件下从培养的人ESC/ipSC细胞中分离三叉神经基板。GD2是在神经组织包括神经外胚层起源的肿瘤例如成神经细胞瘤上表达的双唾液酸神经节苷酯。GD2的结构显示于图52。图53A-B显示了三叉神经基板细胞中GD2和基板标志物SIX1::GFP的共表达。图54A-B显示了阳性对照细胞，其中CD24和SIX1::GFP在所有神经细胞包括三叉神经基板中均得以表达。
CD57(HNK1)也识别为可以用于识别并分离三叉神经基板的标志物(图55)。图56A-B显示了CD57(HNK1)和SIX1::GFP在基板细胞中的共表达。
图57说明了可以用于产生三叉神经基板作为默认基板结局的PIP-E6方案，其中基于其GD2标志物的表达分离和分选基板。在这些培养条件下，将细胞在补充有SB431542、BMP4和CHIR99021(Wnt)的E8/E6培养基中培养，其中在培养3天后取消BMP，从大约第1.5-3.5天培养基中包括CHIR99021(Wnt)。分选之后，将细胞在培养基中培养，以支持三叉神经分化(在补充有BDNF、GDNF、NGF和DAPT(Notch抑制剂)的NBM/B27培养基中)。图58显示了分化28天之后(GD2分选后14天)GD2阳性三叉神经细胞的形态，其与GD2阴性细胞相比较。图59显示了分化48天之后(GD2分选之后33天)的三叉神经神经元。
实施例XXXII
促进基板诱导的化合物的高通量筛选：根据PIP-E6方案培养SIX1::GFP细胞。筛选1280种测试化合物促进基板诱导的能力。在第3天向细胞培养物中加入每种测试化合物，在第6天对细胞进行成像，以测定基板诱导的水平(图60)。图61显示了筛选结果。识别出3种候选化合物促进基板诱导：BRL-54443、菲咯啉一水合物和小白菊内酯(图61和图62)。
实施例XXXIII
诱导脑垂腺前叶细胞：通过根据PIP-E6方案培养SIX1::GFP细胞，诱导垂体基板细胞，其中从第6-15天培养基中补充有垂体因子SHH、FGF8、FGF10和/或下丘脑CM(图63A)。如图63B所示，垂体基板的诱导通过标志物Pitx1、Pitx2、Lhx3和Lhx4的表达证实。垂体标志物的表达比使用没有补充物的单独的PIP-E6方案诱导的基板高10-100倍。使用改良的PIP-E6方案分化到第30天之后，垂体基板细胞分化成对应于所有三种垂体前体谱系衍生物的表达激素的细胞(图64和图65)。三种前体谱系中每一种的比例通过将细胞用Notch信号传导抑制剂(DAPT)处理来调节，通过CHIR(Wnt激活剂)调节至较小的水平(图65)。
表达激素的细胞响应于外部刺激。具体地，响应于以下刺激：生长激素释放因子，细胞释放生长激素(GH)，响应于那法瑞林，细胞释放促卵泡激素(FSH)(图66)。将根据改良的PIP-E6方案诱导的垂体细胞与BMP2和/或FGF8一起培养，以确定这些试剂是否可以操纵表达亚型特异性标志物Tbx19、Pit1、GATA2、POMC1、GH1、FDHM和LHB的垂体细胞的收率。BMP2能够增加若干亚型特异性标志物的收率(图67)。
实施例XXXIV
脑垂腺前叶细胞的诱导：根据改良的PIP-E6方案培养SIX1::GFP hPSC，其中从第6-14天培养基中包括垂体因子例如FGF8、FGF10或SHH等。将细胞基于SIX1::GFP的表达分选，以10,000细胞/cm2的浓度再平板接种在PO/L/F上，并与小分子/生长因子一起孵育2周(图68)。如图69所示，FGF2和FGF8可以增加假定垂体干细胞的数量，如Ki67和Sox2的表达所证实(图69)。
实施例XXXV
将体外分化的释放垂体激素的细胞混合物移植到大鼠中：将使用前述两个实施例中所述的改良的PIP-E6方案由人PSC体外得到的释放垂体激素的细胞的混合物移植到邻近于垂体/下丘脑位点的未受损成年大鼠脑中。在接受移植的动物中移植的细胞得以存活，并且与对照相比较，可检测ACTH的水平增加(图70)。将诱导的释放垂体激素的细胞的混合物移植到垂体切除的大鼠中时，在3只移植的动物当中有2只的ACTH水平似乎增加(图71)。
以上说明书中提及的所有出版物和专利均在此并入作为参考。在不偏离本发明范围和精神的前体下，对本发明所述的方法和***的各种改良和变更对于本领域技术人员来说将会是显而易见的。尽管已经结合特定的优选实施方式对本发明加以说明，应当理解到，要求保护的发明应当不仅仅限于这些具体实施方式。事实上，用于实施本发明的所述方式的对于细胞生物学、神经生物学、癌细胞生物学、分子生物学、生物化学、化学、有机合成或相关领域的技术人员来说显而易见的各种变化，均在所附权利要求的范围以内。

Claims (41)

1.一种培养细胞的方法，其包括：
a)在细胞培养基中提供表达可检测水平的SIX1和PAX6的多种细胞；
b)使所述多种细胞与用量为能有效地在所述多种细胞中诱导可检测水平的SIX1和PAX3表达的包括脑源性神经营养因子的组合物接触。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括在足以诱导细胞分化成三叉神经神经元的条件下培养表达SIX1和PAX3的细胞。
3.根据权利要求1所述的方法，其中表达SIX1和PAX6的细胞还表达可检测水平的TFAP2A。
4.根据权利要求1所述的方法，其中表达SIX1和PAX3的细胞是三叉神经基板细胞。
5.一种培养细胞的方法，其包括：
a)在细胞培养基中提供表达可检测水平的SIX1和PAX6的多种细胞；和
b)使所述多种细胞与用量为能有效地在所述多种细胞中诱导可检测水平的SIX1和PITX1表达的包括音猬因子、purmorphamine和γ-分泌酶抑制剂的组合物接触。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述方法还包括在足以诱导细胞分化成选自***细胞、促肾上腺皮质激素细胞和促生长激素细胞的垂体细胞的条件下孵育表达SIX1和PITX1的细胞。
7.根据权利要求5所述的方法，其中表达SIX1和PAX6的细胞还表达可检测水平的TFAP2A。
8.根据权利要求5所述的方法，其中表达SIX1和PITX1的细胞是垂体基板细胞。
9.一种培养细胞的方法，其包括：
a)在细胞培养基中提供表达可检测水平的SIX1和PAX6的多种细胞；
b)使所述多种细胞与用量为能有效地在所述多种细胞中诱导可检测水平的SIX1和PITX3表达的包括音猬因子、purmorphamine、γ-分泌酶抑制剂和FGF-抑制剂的组合物接触。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法还包括在足以诱导细胞分化成晶状体纤维的条件下培养表达SIX1和PAX3的细胞。
11.根据权利要求9所述的方法，其中表达SIX1和PAX6的细胞还表达可检测水平的TFAP2A。
12.根据权利要求5所述的方法，其中表达SIX1和PITX3的细胞是晶状体基板细胞。
13.一种治疗对其有需求的受试者的方法，其包括将表达可检测水平的SIX1和PAX3的细胞移植到表现疼痛综合征的至少一种症状的受试者中，其中移植细胞使疼痛综合征的至少一种症状减轻。
14.根据权利要求13所述的方法，其中疼痛综合征选自三叉神经麻痹、三叉神经痛和偏头痛。
15.根据权利要求13所述的方法，其中将细胞移植到受试者的脑桥组织中。
16.根据权利要求13所述的方法，其中细胞迁移至三叉神经核。
17.一种治疗对其有需求的受试者的方法，其包括将表达可检测水平的SIX1和PITX1的细胞移植到表现神经内分泌紊乱的至少一种症状的受试者中，其中移植细胞使神经内分泌紊乱的至少一种症状减轻。
18.根据权利要求17所述的方法，其中细胞表达生长激素。
19.根据权利要求17所述的方法，其中细胞表达促肾上腺皮质激素。
20.根据权利要求17所述的方法，其中将细胞移植至受试者的腿部肌肉。
21.根据权利要求17所述的方法，其中将细胞移植至受试者的下丘脑-垂体轴的组织。
22.根据权利要求17所述的方法，其中将细胞移植至受试者的下丘脑。
23.根据权利要求17所述的方法，其中将细胞移植至受试者的蝶鞍。
24.根据权利要求17所述的方法，其中神经内分泌紊乱选自糖尿病、垂体机能减退症、垂体瘤和放射疗法副作用。
25.一种治疗对其有需求的受试者的方法，其包括将表达可检测水平的SIX1和PITX3的细胞移植到表现眼睛疾病的至少一种症状的受试者中，其中移植细胞使眼睛疾病的至少一种症状减轻。
26.根据权利要求25所述的方法，其中眼睛疾病的至少一种症状选自失明、黄斑变性、白内障、散光、近视和远视。
27.根据权利要求25所述的方法，其中细胞表达多种晶状体纤维蛋白质。
28.根据权利要求27所述的方法，其中多种晶状体纤维蛋白质包括αβ-晶体晶状体纤维蛋白质。
29.根据权利要求27所述的方法，其中多种晶状体纤维蛋白质是分层的。
30.一种细胞，其根据权利要求1-12中任一项所述的方法制备。
31.一种诱导细胞分化的方法，其包括：
a)提供多种细胞；
b)使所述多种细胞与SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic)蛋白质信号传导的抑制剂接触；和
c)使所述多种细胞与骨形成蛋白(BMP)活性剂接触；
其中使所述多种细胞与用量为能有效地在所述多种细胞中诱导可检测的SIX1和PAX6表达的SMAD抑制剂和BMP活性剂接触。
32.一种表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞，其根据权利要求31所述的方法制备。
33.一种表达可检测水平的SIX1和PAX6的细胞，其通过包括以下的方法制备：
a)提供多种细胞；
b)使所述多种细胞与SMAD(Small Mothers Against Decapentaplegic)蛋白质信号传导的抑制剂接触；和
c)使所述多种细胞与第二SMAD抑制剂接触；
其中使所述多种细胞与用量为能有效地在所述多种细胞中诱导可检测的SIX1和PAX6表达的第一SMAD抑制剂和第二SMAD抑制剂接触。
34.一种表达可检测水平的SIX1和PAX3的细胞，其用途在于治疗对其有需求的受试者。
35.根据权利要求34所述的用途的表达可检测水平的SIX1和PAX3的细胞，其中受试者表现疼痛综合征的至少一种症状。
36.一种表达可检测水平的SIX1和PITX1的细胞，其用途在于治疗对其有需求的受试者。
37.根据权利要求36所述的用途的表达可检测水平的SIX1和PITX1的细胞，其中受试者表现神经内分泌紊乱的至少一种症状。
38.一种表达可检测水平的SIX1和PITX3的细胞，其用途在于治疗对其有需求的受试者。
39.根据权利要求38所述的用途的表达可检测水平的SIX1和PITX3的细胞，其中受试者表现眼睛疾病的至少一种症状。
40.一种试剂盒，其包括权利要求30和32-39中任一项所述的细胞。
41.一种试剂盒，其用于实施权利要求1-29和31中任一项所述的方法。
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WO (1) WO2015077648A1 (zh)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699528A (zh) * 2015-12-23 2018-10-23 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱系可行的基于细胞的治疗和药物开发
CN111793608A (zh) * 2017-07-28 2020-10-20 杨涛 定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基
CN113493773A (zh) * 2021-07-06 2021-10-12 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种获得人类基底板Floor Plate细胞的方法及其应用
CN115322965A (zh) * 2022-08-19 2022-11-11 同济大学 一种体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2010096496A2 (en) 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
JP6210881B2 (ja) 2011-10-31 2017-10-11 国立研究開発法人理化学研究所 幹細胞の培養方法
WO2013067362A1 (en) 2011-11-04 2013-05-10 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Midbrain dopamine (da) neurons for engraftment
EP3498824A1 (en) 2013-04-26 2019-06-19 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Cortical interneurons and other neuronal cells produced by the directed differentiation of pluripotent and multipotent cells
KR20230008892A (ko) 2013-11-21 2023-01-16 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 두개 기원판 유도체의 전문화
WO2016013669A1 (ja) * 2014-07-25 2016-01-28 国立研究開発法人理化学研究所 腺性下垂体又はその前駆組織の製造方法
EP4070803A1 (en) 2015-06-01 2022-10-12 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of in vitro differentiation of midbrain dopamine (mda) neurons
CN108368486B (zh) * 2015-10-07 2023-06-27 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 鉴定神经肌肉接头活动的调节剂的体外方法
CN108603230A (zh) 2015-10-09 2018-09-28 南安普敦大学 基因表达的调节与蛋白质表达失调的筛选
EP3390636B1 (en) 2015-12-14 2021-05-19 Cold Spring Harbor Laboratory Antisense oligomers for treatment of dravet syndrome
KR20180105236A (ko) * 2016-02-05 2018-09-27 메모리얼 슬로안-케터링 캔서 센터 줄기 세포-유래 외배엽 계통 전구체의 분화 방법
EP3464567A4 (en) 2016-05-27 2020-01-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center METHODS FOR DIFFERENTIATION OF STEM CELL-DERIVED PROPERTIES
AU2017313065B2 (en) * 2016-08-16 2021-06-24 Fujifilm Cellular Dynamics Inc. Methods for differentiating pluripotent cells
WO2018090002A1 (en) 2016-11-14 2018-05-17 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Stem cell derived schwann cells
KR102638492B1 (ko) * 2017-02-17 2024-02-19 쏘흐본느 유니베흐시테 망막 전구 세포, 망막 색소 상피 세포 및 신경 망막 세포를 얻기 위한 피더-비의존적(Feeder-free) 방법
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
PT3673080T (pt) 2017-08-25 2023-12-06 Stoke Therapeutics Inc Oligómeros anti-sentido para o tratamento de estados patológicos e outras doenças
EP3679125A4 (en) * 2017-09-07 2021-06-09 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center METHOD FOR DISTINCTIONING STEM CELL-OBTAINED PRECURSORS OF THE EECTODERMAL LINES
CA3082361A1 (en) * 2017-11-10 2019-05-16 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Derivation of somatotrophs from stem cells and uses thereof
US20200345784A1 (en) 2017-11-24 2020-11-05 Sumitomo Chemical Company, Limited Method for producing cell mass including pituitary tissue, and cell mass thereof
US20210308188A1 (en) 2018-08-24 2021-10-07 Sumitomo Chemical Company, Limited Cell cluster including olfactory neuron or precursor cell thereof, and method for producing same
KR102132914B1 (ko) 2018-12-05 2020-07-10 단국대학교 천안캠퍼스 산학협력단 광생체조절을 이용한 배아줄기세포의 귀 연계 조직으로의 분화 방법
KR102451074B1 (ko) * 2019-01-11 2022-10-05 차의과학대학교 산학협력단 Ｔｇｆ-베타 ⅰ 수용체의 저해제 및 ｂｍｐ 저해제를 포함하는 줄기 세포의 신경능선세포로의 분화용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법
KR20230022409A (ko) 2020-05-11 2023-02-15 스톡 테라퓨틱스, 인크. 병태 및 질환의 치료를 위한 opa1 안티센스 올리고머
EP4162028A1 (en) * 2020-06-08 2023-04-12 Technische Universiteit Eindhoven Methods for producing a (three dimensional) neural tissue
CN117500916A (zh) 2021-04-16 2024-02-02 博恩赛尔公司 制备、扩增和纯化中脑多巴胺能祖细胞的方法
WO2023054396A1 (ja) 2021-09-30 2023-04-06 住友化学株式会社 下垂体組織を含む細胞集団の製造方法及びその細胞集団
IL311818A (en) 2021-09-30 2024-05-01 National Univ Corporation Tokai National Higher Education And Research System A cell aggregate comprising cells that form adrenal gland hormone and a method for its preparation
WO2023104792A1 (en) 2021-12-07 2023-06-15 Vib Vzw Enhancers of neuronal maturation

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070037282A1 (en) * 2003-03-31 2007-02-15 Masayo Takahashi Method of producing lens cell and lens cell obtained by the method
AU2007224116A1 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
WO2008049225A1 (en) * 2006-10-25 2008-05-02 Chu Sainte Justine Methods for diagnosing osteoarthritis
WO2008067408A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 Cedars-Sinai Medical Center Method of isolating and propagating stem cells from benign tumors
CN101641436A (zh) * 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
WO2010096496A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
CN102165058A (zh) * 2008-07-25 2011-08-24 佐治亚大学研究基金会 中胚层来源的ISL 1+多潜能细胞(IMPs)的组合物、心外膜祖细胞(EPCs)和多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)及其使用方法
WO2013166488A1 (en) * 2012-05-04 2013-11-07 Indiana University Research & Technology Corporation Methods for generating the inner ear and other cranial placode-derived tissues using pluripotent stem cells

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1341469C (en) 1988-08-04 2004-12-28 Robert Lindsay Williams In vitro propagation of embryonic stem cells
US5340740A (en) 1992-05-15 1994-08-23 North Carolina State University Method of producing an avian embryonic stem cell culture and the avian embryonic stem cell culture produced by the process
US5589376A (en) 1992-07-27 1996-12-31 California Institute Of Technology Mammalian neural crest stem cells
US5453357A (en) 1992-10-08 1995-09-26 Vanderbilt University Pluripotential embryonic stem cells and methods of making same
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7011828B2 (en) 2000-03-14 2006-03-14 Es Cell International Pte. Ltd. Implanting neural progenitor cells derived for human embryonic stem cells
EP1263932A4 (en) 2000-03-14 2004-06-23 Es Cell Int Pte Ltd EMBRYONIC CELLS AND NEURONAL STEM CELLS DERIVED THEREFROM
WO2001088104A2 (en) 2000-05-17 2001-11-22 Geron Corporation Neural progenitor cell populations
CA2424062A1 (en) 2000-09-29 2002-04-04 Derek Van Der Kooy Primitive neural stem cells and method for differentiation of stem cells to neural cells
US6827931B1 (en) * 2000-10-20 2004-12-07 Allergan, Inc. Method for treating endocrine disorders
JP3660601B2 (ja) 2001-03-30 2005-06-15 独立行政法人科学技術振興機構 胚性幹細胞からの神経幹細胞、運動ニューロン及びｇａｂａ作動性ニューロンの製造法
SE521788C2 (sv) 2002-04-04 2003-12-09 Volvo Lastvagnar Ab Drivaggregat för motorfordon
US7252995B2 (en) 2002-12-13 2007-08-07 Yu-Show Fu Method of generating neurons from stem cells and medium for culturing stem cells
WO2005017131A2 (en) * 2003-08-14 2005-02-24 THE GOUVERNMENT OF THE UNITED STATES OF AMERICA as represented by THE SECRETARY OF THE DEPARTMENT F HEALTH AND HUMAN SERVICES Methods for the differentiation of human stem cells
CA2457296A1 (en) 2003-08-19 2005-02-19 Takahiro Ochiya Methods for inducing differentiation of pluripotent cells
US20090035385A1 (en) 2004-12-22 2009-02-05 Drugtech Corporation Compositions including iron
US20070270841A1 (en) * 2006-01-31 2007-11-22 Madison Surgical Designs, Llc Implantable devices
US20100105098A1 (en) * 2006-06-29 2010-04-29 Peter Frederiske Methods of Identifying Disease Biomarkers in the Lense of the Eye
JP6083559B2 (ja) * 2009-07-31 2017-02-22 クロモセル コーポレーション 細胞運命の修飾因子を同定および検証するための方法および組成物
FR3010381B1 (fr) 2013-09-09 2017-05-05 Plastic Omnium Cie Becquet pour hayon de vehicule automobile
KR20230008892A (ko) * 2013-11-21 2023-01-16 메모리얼 슬로안 케터링 캔서 센터 인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 두개 기원판 유도체의 전문화

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070037282A1 (en) * 2003-03-31 2007-02-15 Masayo Takahashi Method of producing lens cell and lens cell obtained by the method
AU2007224116A1 (en) * 2006-03-02 2007-09-13 Viacyte, Inc. Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
WO2008049225A1 (en) * 2006-10-25 2008-05-02 Chu Sainte Justine Methods for diagnosing osteoarthritis
WO2008067408A2 (en) * 2006-11-28 2008-06-05 Cedars-Sinai Medical Center Method of isolating and propagating stem cells from benign tumors
CN101641436A (zh) * 2007-01-30 2010-02-03 佐治亚大学研究基金会 用于产生内胚层和中胚层细胞系及多能游走细胞（mmc）的早期中胚层细胞即稳定的中内胚层细胞群
CN102165058A (zh) * 2008-07-25 2011-08-24 佐治亚大学研究基金会 中胚层来源的ISL 1+多潜能细胞(IMPs)的组合物、心外膜祖细胞(EPCs)和多潜能CXCR4+CD56+细胞(C56Cs)及其使用方法
WO2010096496A2 (en) * 2009-02-17 2010-08-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Methods of neural conversion of human embryonic stem cells
WO2013166488A1 (en) * 2012-05-04 2013-11-07 Indiana University Research & Technology Corporation Methods for generating the inner ear and other cranial placode-derived tissues using pluripotent stem cells

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108699528A (zh) * 2015-12-23 2018-10-23 纪念斯隆-凯特琳癌症中心 在先天性巨结肠症中通过衍生自多能干细胞的人肠神经嵴谱系可行的基于细胞的治疗和药物开发
CN111793608A (zh) * 2017-07-28 2020-10-20 杨涛 定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基
CN111793608B (zh) * 2017-07-28 2022-05-17 杨涛 定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基
CN113493773A (zh) * 2021-07-06 2021-10-12 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种获得人类基底板Floor Plate细胞的方法及其应用
CN113493773B (zh) * 2021-07-06 2023-06-09 上海市东方医院（同济大学附属东方医院） 一种获得人类基底板Floor Plate细胞的方法及其应用
CN115322965A (zh) * 2022-08-19 2022-11-11 同济大学 一种体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用
CN115322965B (zh) * 2022-08-19 2024-01-30 同济大学 一种体外获得后脑底板细胞的方法、成套培养基及应用

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