KR20230165858A - 다능성 세포로의 인간 체세포의 화학적 재프로그래밍 - Google Patents

다능성 세포로의 인간 체세포의 화학적 재프로그래밍 Download PDF

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Abstract

인간 체세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 세포로 재프로그래밍하는 것을 개선하기 위한 배양 조건의 조성물 및 단계적 방법이 개시된다. 필요한 생물학적 활성을 갖는 소분자의 조합을 사용하는 제 1 단계는 체세포 유전자 프로그램을 하향 조절하는 것을 목적으로 한다. 제 2 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택을 사용하여 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자를 상향 조절한다. 제 3 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택을 사용하여 OCT4의 발현에 의해 측정되는 초기 다능성 네트워크를 확립한다. 제 4 단계 및 최종 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택을 사용하여 재프로그래밍된 세포에서 공-발현 인자 예를 들어 OCT4, SOX2, 및 NANOG에 의해 측정되는 다능성 네트워크를 충분히 확립한다. 이렇게 하여 생성된 재프로그래밍된 세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포, hCiPSC라 한다.

Description

다능성 세포로의 인간 체세포의 화학적 재프로그래밍
본 발명은 일반적으로 다능성 줄기 세포(pluripotent stem cells)의 특성을 가진 세포로의 체세포(somatic cells)의 화학적 재프로그래밍 분야에 관한 것이다.
세포 정체성(cell identity)은 발달, 항상성, 질환의 상태 동안 미세환경으로부터 외부 신호를 받아 확립, 유지, 및 변화된다(1, 2). 식물과 일부 무척추동물에서는 외부 자극이 세포 탈분화와 재생을 충분히 촉발한다(3, 4). 그러나, 포유동물 세포, 특히 인간 체세포의 가소성 잠재력(plasticity potentials)을 재개하기 위해 외부 섭동(external perturbation)만을 이용하는 것은 커미티드 세포 정체성(committed cell identity)을 보호하는 안정적인 후성적 랜드스케프(stable epigenetic landscape) 때문에 어려운 도전적 과제로 남아 있다(5, 6). 마우스 체세포를 다능성 줄기 세포로 유도하기 위한 외부 화학적 섭동으로 소분자를 이용한 선행 연구는 세포 운명 재프로그래밍에 대한 화학물질을 입증하였다(7-10). 세포 운명을 조절하기 위한 고도로 조정 가능한 방법으로서, 소분자 조합은 다중 세포 신호전달 경로와 염색체 상태를 조절함으로써 세포 운명을 조작할 수 있다(11-12). 그러나, 인간 체세포의 효율적이고 강력한 재프로그래밍은 더욱 안정적인 인간 후성유전체(epigenome) 및 진화와 함께 발달되는 감소된 가소성으로 인해 여전히 개선이 요구된다(5-6, 13-14).
본 발명은 인간 체세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하기 위해 사용될 수 있는 소분자들의 조합을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 인간 체세포를 다능성 세포로 개선된 효율로 재프로그래밍하는 개선된 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
인간 체세포를 다능성 세포로 개선하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다. 개시된 방법은 체세포에서 생물학적 활성의 조합을 선택적으로 억제/활성화시켜 인간 체세포의 개선된 재프로그래밍을 가능하게 하는 4 단계 재프로그래밍 접근법을 채택함으로써 종래 기술의 방법의 부적절함을 극복한다. 제 1 단계는 체세포 유전자 프로그램을 하향 조절하는 것을 목표로 하는 필요한 생물학적 활성을 갖는 소분자들의 조합(단계 I 인자)을 사용한다. 제 2 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택(단계 II 인자)을 이용하여, 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자를 상향 조절한다. 제 3 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택(단계 III 인자)을 이용하여, OCT4의 발현에 의해 측정된, 초기 다능성 네트워크를 확립한다. 제 4 및 최종 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택(단계 IV 인자)을 이용하여, 재프로그래밍된 세포 내에서 공발현 인자 예를 들어 OCT4, SOX2, 및 NANOG에 의해 측정된, 다능성 네트워크를 완전히 확립한다(본원에서, 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포, hCiPSC라 함).
하기 생물학적 활성을 갖는 소분자로부터 선택된 단계 I 인자의 바람직한 조합: 글리코겐 키나제 억제제, 예를 들어 CHIR99021, TGFβ 억제제, 예를 들어 616452, 및 레티노산 수용체(retinoic acid receptor; RAR) 작용제, 예를 들어 TTNPB는, 세포를 단층 상피-유사 세포로 전환시키기에 효과적인 시간 동안 단계 I 인자로 보충된 세포 배양 배지(cell culture medium)에서 세포를 배양함으로써(단계 I 조건), 인간 체세포, 예를 들어 인간 섬유아세포를 단층 상피-유사 세포로 전환시키는 단계 I에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 하기 생물학적 활성 중의 하나 이상을 갖는 소분자는 단계 I 조건에 포함될 수 있다: Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase; ROCK)의 선택적 억제제, 예를 들어 Y27632; 수용체 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 ABT869; G 단백질-결합된 수용체 Smoothened에 대한 작용제, 예를 들어 SAG; Dot1L 억제제, 예를 들어 EPZ004777 또는 EPZ5676; Jak1/Jak2 억제제, 예를 들어 룩솔리티닙(Ruxolitinib), SAH 가수분해효소(hydrolase) 억제제, 예를 들어 DZNep, 및 메닌(Menin)-MLL 상호작용 억제제, 예를 들어 VTP50469, MI3454, 또는 WDR5-IN-4(단계 I 보충 인자).
하기 생물학적 활성을 갖는 소분자로부터 선택된 단계 II 인자의 바람직한 조합: 글리코겐 키나제 억제제, 예를 들어 CHIR99021, TGFβ 억제제, 예를 들어 616452, 레티노산 수용체(retinoic acid receptor; RAR) 작용제, 예를 들어 TTNPB, G 단백질-결합된 수용체 Smoothened에 대한 작용제, 예를 들어 SAG; 및 c-Jun 키나제 억제제 예를 들어 JNKIN8은, 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자(pluripotency-related transcriptional factors)를 상향 조절(upregulate)하기에 효과적인 시간 동안 단계 II 인자로 보충된 세포 배양 배지에서 세포를 배양함으로써(단계 II 조건), 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자를 상향 조절하는 단계 II에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 하기 생물학적 활성 중의 하나 이상을 갖는 소분자는 단계 II 조건에 포함될 수 있다: DNA 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 억제제, 예를 들어 5-아자시티딘(Azacytidine); 히스톤 탈메틸화(histone demethylation)의 억제제, 예를 들어 트라닐시프로민(Tranylcypromine); Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 예를 들어 Y27632; 수용체 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 ABT869; G9a 억제제, 예를 들어 UNC0224; BMP 수용체/AMPK 억제제, 예를 들어 도르소모르핀(Dorsomorphin); Jak1/Jak2 억제제, 예를 들어 룩솔리티닙; p38 MAPK 억제제, 예를 들어 BIRB796; CBP/p300 브로모도메인 억제제, 예를 들어 SGC-CBP30, I-CBP112, GNE272, 또는 GNE409; 및 메닌-MLL 상호작용 억제제, 예를 들어 VTP50469, MI3454, 또는 WDR5-IN-4(단계 II 보충 인자).
하기 생물학적 활성을 갖는 소분자로부터 선택된 단계 III 인자의 바람직한 조합: 히스톤 탈아세틸화효소(histone deacetylase)의 억제제, 예를 들어 발프로산(Valproic acid); MAPK 억제제, 예를 들어 PD0325901; TGFβ 억제제, 예를 들어 616452; 및 SAH 가수분해효소 억제제, 예를 들어 DZNep는, 초기 다능성 네트워크를 확립하기에 효과적인 시간 동안 단계 III 인자로 보충된 세포 배양 배지에서 세포를 배양함으로써(단계 III 조건), 예를 들어 OCT4의 발현에 의해 측정된, 초기 다능성 네트워크를 확립하는 단계에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 하기 생물학적 활성 중의 하나 이상을 갖는 소분자는 단계 III 조건에 포함될 수 있다: 글리코겐 키나제 억제제, 예를 들어 CHIR99021; Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 예를 들어 Y27632; SETD8 억제제, 예를 들어 Unc0379; 히스톤 탈메틸화의 억제제, 예를 들어 트라닐시프로민; 및 Dot1L 억제제, 예를 들어 EPZ004777(단계 III 보충 인자).
하기 생물학적 활성을 갖는 소분자로부터 선택된 단계 IV 인자의 바람직한 조합: B-Raf 억제제, 예를 들어 SB590885; 및 MAPK 억제제, 예를 들어 PD0325901은, 다능성 네트워크를 충분히 확립하기에 효과적인 시간 동안 단계 IV 인자로 보충된 세포 배양 배지에서 세포를 배양함으로써(단계 IV 조건), 예를 들어 OCT4, SOX2, 및 NANOG의 공-발현에 의해 측정된, 다능성 네트워크를 충분히 확립하는 단계 IV에서 사용된다. 일부 바람직한 구현예에서, 하기 생물학적 활성 중의 하나 이상을 갖는 소분자는 단계 IV 조건에 포함될 수 있다: Wnt 억제제, 예를 들어 IWP2; 글리코겐 키나제 억제제, 예를 들어 CHIR99021 또는 CHIR98014; Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 예를 들어 Y27632; 및 히스톤 탈아세탈화효소 억제제, 예를 들어 발프로산(단계 IV 보충 인자).
개시된 방법은 태아 또는 성체(adult) 공여체 조직(donor tissues) 예를 들어 인간 배아 섬유아세포, 성체 인간(adult human) 피부 섬유아세포 및 성체 지방-유래 중간엽 간질 세포로부터 단리된 인간 체세포를 재프로그래밍하는데 사용될 수 있다.
또한 개시된 방법에 따라 수득된 세포(예를 들어 hCiPSC)가 제공된다. 개시된 방법에 따라 수득된 세포는, 예를 들어, (i) 단계 I의 배양에 의해 얻어진 상피-유사 세포(epithelia-like cells), 초기 단계에서 MMP1, ZEB1, VIM, COL1A1, COL5A1, COL6A2, PRRX1, SNAI2, TWIST1, 및 TWIST2 중의 적어도 하나의 유전자의 하향-조절(down-regulation); 및 LIN28A 및 KRT, 예를 들어 KRT8, KRT18, KRT19, 및 LIN28A에 관한 적어도 하나의 유전자의 상항-조절(up-regulation)을 특징으로 함; (ii) 단계 I 및 단계 II의 배양에 의해 얻어진 재생 프로그램을 갖는 가소성 상태 세포, 이들은 SALL4 및 LIN28A 중의 적어도 하나를 발현하고, 증가된 수의 개방된 염색체 유전자좌 및 증가된 DNA 탈메틸화를 갖는 언로킹된 후성유전체 상태(unlocked epigenome state)를 가지는 것을 특징으로 함; (iii) 단계 I, 단계 II 및 단계 III의 배양에 의해 얻어진 XEN-유사 세포, LIN28A, SALL4, 및 OCT4 중의 적어도 하나의 유전자의 상향-조절, 및 XEN(외배아 내배엽(extraembryonic endoderm)) 관련된 마커, 예를 들어 GATA6, SOX17, FOXA2, HNF1B, APOA1, 및 APOA2 중의 적어도 하나의 발현을 특징으로 함; 및/또는 (iv) 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포, 이들은 코어 다능성 전사 인자 OCT4, SOX2, DNMT3B , DPPA4 , UTF1 , ZFP42, ZIC3 , 및 NANOG와 함께, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 SSEA-4 중의 적어도 하나의 표면 마커를 발현하는 것을 특징으로 함;을 포함한다. hCiPSC는, hESC와 유사한 배가 시간으로 증식하면서, 20회 초과의 계대, 예를 들어 최대 25회, 30회, 35회, 40회, 41회, 42회의 계대 동안 증폭할 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한, hCiPSC는, 코어 다능성 전사 인자 OCT4, SOX2, DNMT3B , DPPA4 , UTF1 , ZFP42, ZIC3 , 및 NANOG와 함께, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 SSEA-4 중의 적어도 하나의 표면 마커를 발현하는 것을 특징으로 한다. 바람직한 구현예에서, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 SSEA-4를 발현한다. 단계 IV의 말기에 유도되는 1차 hCiPSC는 여러 가지 독특한 마커, 예를 들어 발달 다능성 관련된(Developmental Pluripotency Associated) 3(DPPA3), 크루펠-유사 인자(Kruppel-Like Factor) 17(KLF17) 및 DNA 메틸전이효소 3 유사(DNMT3L)을 발현한다. 이러한 마커는 전통적인 인간 다능성 줄기 세포(hESC 및 hiPSC)에서는 발현되지 않았다. 기능적으로, 면역결핍 마우스에 hCiPSC를 주사하고 결과적으로 생식기 조직(teratomas)이 3개의 생식세포 층(내배엽, 외배엽, 및 중배엽) 모두의 조직을 포함하하는 경우; hCiPSC는 시험관 내에서 배아체를 형성하며 3층의 마커 유전자를 발현하며 다른 약속된 세포 유형, 예를 들어 간세포로 유도 분화하거나 조혈 전구 세포와 같은 전구 세포로 유도 분화할 수 있다. 가장 중요하게, hCiPSC는 바람직하게는 유전자 조작되지 않으며, 즉 세포로부터 유전적 요소를 도입하거나 제거하여 인간 체세포를 변경시키는 것, 예를 들어 다능성의 하나 이상의 마커 예를 들어 OCT4, SOX2, KLF4 , NANOG 및/또는 c- Myc를 발현하도록 체세포를 조작하는 것을 포함하는 방법에 의해 얻어지지 않으며, 따라서 개시된 방법에 따라 얻어진 hCiPSC는 외인성으로 도입된 OCT4, SOX2, KLF4 , NANOG 및/또는 c- Myc를 함유하지 않는다.
또한, 인간 체세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 세포로 재프로그래밍하기 위한(예를 들어 개시된 방법에서 사용하기 위한) 세포 배양 배지 조성물 또는 키트가 제공된다. 상기 조성물 또는 키트는 본원에 개시된 단계 I-IV 중의 하나 이상, 바람직하게는 모든 분자들의 조합의 칵테일(cocktail)을 포함할 수 있다. 이는 세포 배양 배지에 첨가하여 목적하는 농도를 생성하는 것을 용이하게 하기 위해 규정된 농도를 갖는 형태일 수 있다. 상기 조성물 또는 키트는 본원에 개시된 단계 I-IV 중의 하나 이상의 세포를 제조하는 데 사용될 수 있다.
따라서, 인간 체세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 세포로 재프로그래밍하는 것을 개선하기 위한 배양 조건의 조성물 및 단계적 방법이 개시된다. 필요한 생물학적 활성을 갖는 소분자의 조합을 사용하는 제 1 단계(단계 I)는 체세포 유전자 프로그램을 하향 조절하는 것을 목적으로 한다. 제 2 단계(단계 II)는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택을 사용하여 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자를 상향 조절한다. 제 3 단계(단계 III)는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택을 사용하여 OCT4의 발현에 의해 측정되는 초기 다능성 네트워크를 확립한다. 제 4 단계(단계 IV) 및 최종 단계는 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자의 선택을 사용하여 재프로그래밍된 세포에서 공-발현 인자 예를 들어 OCT4, SOX2, 및 NANOG에 의해 측정되는 다능성 네트워크를 충분히 확립한다. 이렇게 하여 생성된 재프로그래밍된 세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포, hCiPSC라 한다.
또한, 본원에 개시된 배양 조건의 조성물 및 단계적 방법은 목적하는 세포 유형을 생성할 수 있는 능력을 갖는 줄기 세포, 전구 세포, 탈분화된 세포 또는 가소성 잠재력 세포의 공급원을 생성할 수 있으며, 치료적 처치, 조직 공학 및 연구에 중요하다. hCiPSC, XEN-유사 세포, 가소성 상태 세포 및 상피-유사 세포를 포함한, 본원에 기재된 방법으로 얻어진 세포는 줄기 세포, 전구 세포, 탈분화된 세포 또는 가소성 잠재력 세포의 공급원으로서 용이하게 이용할 수 있으며, 이는 줄기 세포 또는 전구세포 관련 마커 예를 들어 LIN28A, SALL4, OCT4 또는 NANOG 중의 적어도 하나를 발현한다. 본 명세서에서는 간결성을 위해 줄기 세포, 전구 세포, 탈분화된 세포 또는 가소성 잠재력 세포의 공급원을 hCiPSC라 명명하였으나, 당업자는 본원에 기재된 방법에 의해 얻어진 XEN-유사 세포, 가소성 상태 세포 및 상피-유사 세포를 줄기 세포, 전구 세포, 탈분화된 세포 또는 가소성 잠재력 세포의 공급원으로 사용할 수 있음을 이해할 것이다.
또한, 본원의 소분자 조성물은 생체 외 및 생체 내에서 조직 재생, 수복(repair) 및 회춘(rejuvenation)에 사용될 수 있다. 예를 들어 단계 I 및 단계 II의 재프로그래밍 과정을 위한 소분자는 대상체, 조직 또는 세포와 투여, 전달 또는 접촉하여 생체 내 또는 생체 외/생체 내에서 탈분화, 재생, 수복 및 회춘을 촉진하기 위해 제형화될 수 있다.
도 1a 내지 도 1d 및 도 1j는 소분자 화합물에 의한 hCiPSC의 생성을 나타낸다. 도 1a는 섬유아세포에서 hCiPSC로의 화학적 재프로그래밍 과정을 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 1b는 마우스 화학적 재프로그래밍 조건의 처리 후 인간 배아 섬유아세포의 형태 변화(morphological changes)를 나타낸 도면이다. 스케일 바(scale bar), 100 μm, 적어도 3회의 독립 실험의 대표. 도 1c는 미처리 HEF의 형태를 나타낸다. 도 1d는 HEF로부터 유래된 hCiPSC(hCiPSC-1117-1#-p21)의 형태를 나타낸다. 도 1e는 hCiPSC 유도 동안 각 단계의 말미에서 세포의 대표적 이미지를 나타낸다. 스케일 바, 100 μm. 적어도 3회의 독립 실험의 대표. 도 1f 내지 도 1i는 hCiPSC 유도 동안 유전자 발현의 정량적 PCR 검증을 나타낸다. 도 1f 및 도 1g는 단계 I의 말미에서 섬유아세포-관련된 유전자, 상피-관련된 유전자 및 LIN28A의 상대적 발현을 나타낸다. 도 1h는 단계 II의 말미에서 LIN28A 및 SALL4의 상대적 발현을 나타낸다. 도 1i는 단계 III의 말미에서 LIN28A , SALL4 , 및 OCT4의 상대적 발현을 나타낸다. 에러 바(error bars), 평균(SD). 3회의 독립 실험의 대표. 도 1j는 표시된 hCiPSC 및 hESC에서 다능성 마커의 RT-qPCR 분석을 나타낸다. 스케일 바, 100 μm. 에러 바, 평균(SD); n=3.
도 2a 내지 도 2e는 성체 체세포로부터의 hCiPSC의 생성을 나타낸다. 도 2a: 성체 hADSC 및 hADSC-유래된 hCiPSC의 대표적인 이미지. 도 2b: 표시된 hCiPSC 및 hESC에서 다능성 마커의 RT-qPCR 분석. 도 2c: hCiPSC, hESC 및 성체 체세포의 글로벌 전사 프로파일의 계층적 클러스터링. 도 2d: hADSC' 및 hADSC-유래된 hCiPSC'(hCiPSC-0809-3#) OCT4 및 NANOG 프로모터 유전자좌에서 DNA CpG 메틸화 상태의 바이설파이트 염기서열 분석. 도 2e: hCiPSC-유래된 테라토마 절편(hCiPSC-0809-3# 및 hCiPSC-1003#)의 헤마톡실린 및 에오신 염색. 각각의 hCiPSC 클론별에 있어서, 외배엽, 중배엽 및 내배엽의 대표적인 조직 특징을 함유하는 단일 테라토마로부터 모든 이미지를 얻었다.
도 3a는 단계 I에서 하향 조절되고 단계 II에서 상향 조절된 유전자의 유전자 온톨로지 분석(gene ontology analyses)을 나타낸다. HEF 및 hADSC를 이용한 독립 실험의 4가지 배치(batches)를 이용하여 중복되는 차등 발현 유전자를 분석하였다. 도 3b: 섬유아세포 및 단계 II에서 sc-ATAC-seq에 의해 검출된 개방 유전자를 보여주는 히트 맵(heat map). 도 3c: 섬유아세포, 단계 I 및 단계 II에서 서로 다른 DNA CpG 메틸화 상태의 분포. 3회의 독립 실험의 대표. 도 3d: 섬유아세포, 단계 I 및 단계 II에서 메틸화 유전자 프로모터의 수를 보여주는 벤 다이어그램. 도 3e: 표시된 GO 용어에서 유전자의 유전자 발현 농축, 크로마틴 접근성 및 DNA 메틸화 상태.
도 4a 내지 도 4f는 초기 단계에서 가소성 시그니쳐를 조절하는 핵심 소분자의 데이터를 보여준다. 도 4a 내지 도 4b: 단계 I의 말기에서 LIN28A 및 섬유아세포 마커 유전자 발현, 및 단계 I로부터 개별 화학물질을 회수한 후 재프로그래밍의 말기에 hCiPSC 콜로니 수. 3회의 독립 실험의 대표. 도 4c 및 도 4d: 단계 II에서의 SALL4-양성 콜로니 수 및 단계 II로부터의 개별 화학물질을 회수한 후 재프로그래밍의 말기에서 hCiPSC 콜로니 수. 3회의 독립 실험의 대표. 도 4e: 표시된 시료에 대한 표시된 유전자 발현을 보여주는 히트 맵. 도 4f: 개별 화학물질을 회수한 후 단계 II에서의 개별 유전자좌의 신호전달 밀도. 도 4g: 단계 II로부터의 개별 화학물질을 회수한 후의 DNA 메틸화 수준. 도 4h: 단계 II로부터 개별 화학물질을 회수한 후 표시된 GO 용어의 유전자 발현 농축, 크로마틴 접근성 및 DNA 메틸화 상태. 도 4i: 초기 단계에서 재프로그래밍 과정 동안 핵심 분자 이벤트에 대한 개략도. 에러 바, 평균(SD); n=3.
도 5a는 hCiPSC 및 hESC의 계산된 배가 시간으로 예시된 hCiPSC의 특성을 나타낸다. 에러 바, 평균(SD). 도 5b 및 도 5c는 hCiPSC에서의 글로벌 유전자 발현 분석을 나타낸다. 도 5b: hCiPSC, hESC 및 HEF에서의 글로벌 유전자 발현을 비교한 스캐터 플롯(scatter plots). 3회의 독립 실험의 대표. 도 5c: hCiPSC, hESC 및 HEF의 글로벌 전사 프로파일의 계층적 클러스터링. 거리는 I-스피어맨 상관계수(I-spearman correlation coefficient)에 의해 계산되었다. 도 5d는 섬유아세포, 1차 hCiPSC 및 인간 배아 줄기 세포(hESC)에서 크루펠-유사 인자(Kruppel-Like Factor) 17(KLF17), 발달 다능성 관련된(Developmental Pluripotency Associated) 3(DPPA3), DNA 메틸트랜스퍼라제 3 유사(DNMT3L)의 발현을 나타낸다.
도 6a 내지 도 6c는 hCiPSC의 조혈 계통 세포(hematopoietic lineage cells)로의 시험관 내 지시된 분화를 나타낸다. 도 6a 및 도 6b: FACS 분석으로 계수한 CD34/CD144 이중-양성 및 CD34/CD31 이중-양성 세포의 백분율. 에러 바, 평균(SD); n=3. 도 6c: FACS 분석으로 계수한 hCiPSC-유래된 T 전구 세포의 백분율.
도 7a 내지 도 7d는 hCiPSC의 간세포로의 시험관 내 지시된 분화를 나타낸다. 도 7a: AFP 및 ALB 이중-양성 hCiPSC-유래된 간 전구 세포(HPC)의 FACS 분석. 도 7b: hCiPSC 유래 간세포(hdHep) 형태. 스케일 바, 100/lm. 도 7c: hdHep 및 1차 인간 간세포(PHH)에 의한 요소 및 ALB 분비의 정량 분석. 도 7d: hiPSC, HPC, hdHep 및 PHH에서 기능적 간세포 마커 유전자의 RT-qPCR 분석. 상대적 발현은 PHH로 정규화하였다. 에러 바, 평균(SD); n=3.
도 8은 정상 이배체 염색체 함량을 갖는 REF-유래된 hCiPSC의 핵형 분석을 나타낸다.
도 9a 내지 도 9d는 hADSC의 재프로그래밍 효율을 촉진하는 소분자에 대한 결과를 나타낸다. 도 9a: hADSC로부터의 hCiPSC 유도 동안 각 단계의 말기에서의 세포의 대표 이미지. 스케일 바, 100 flm. 도 9b 및 9c: 단계 I 및 단계 II에서 hADSC로부터 hCiPSC의 생성을 촉진하는 소분자 및 이들의 조합의 확인. EPZ, EPZ004777; 룩소(Ruxo), 룩솔리티닙(Ruxolitinib); BIRB, BIRB796; U2, UNC0224; DM, 도르소모르핀(Dorsomorphin), 에러 바, 평균(SD); n=3. 도 9d: 다른 시간 과정 하에서 hADSC로부터 생성된 hCiPSC 콜로니의 수. "8+8+8+7"은 각 단계에서 순차적인 지속시간을 나타낸다. 에러 바, 평균(SD); n=4. 상기 결과는 모두 최소 3회의 독립적인 실험의 대표이다.
도 10a 및 도 10b는 hADSC로부터 유래된 hCiPSC의 특성을 나타낸다. 도 10a: hCiPSC, hESC 및 hADSC에서 OCT4 및 NANOG 프로모터 영역의 비설파이트 게놈 염기서열 분석. 도 10b: hADSC-유래된 hCiPSC에 대한 정상 이배체 염색체 함량을 나타내는 핵형 분석.
도 11a 내지 도 11c는 인간 성체 피부 섬유아세포(hASF)로부터 유래된 hCiPSC의 특성을 나타낸다. 도 11a: 대표적인 성체 hASF 및 hASF-유래된 hCiPSC의 이미지. 도 11b: 표시된 hCiPSC 및 hESC에서 다능성 마커의 실시간 qPCR 분석; 각 그룹의 6개의 바(bar)는 좌측에서 우측으로 다음과 같이 표시된다: 1=hCiPSC-0408-1#; 2= hCiPSC-0408-2#; 3= hCiPSC-1230-4#; 4=hCiPSC-1230-11#; 5= H1; 6=H9). 도 11c: hASF-유래된 hCiPSC의 정상 이배체 염색체 함량을 나타내는 핵형 분석.
도 12a 및 도 12b는 단계 III에서 XEN-유사 상태가 유도되었음을 나타낸다. 도 12a: RT-qPCR에 의해 나타낸 바와 같은 화학적 재프로그래밍 과정 동안 XEN-관련된 마커의 동적 발현 변화. 에러 바, 평균(SD); n=3. 3회의 독립적인 실험의 대표. 도 12b: 5개 배치의 독립적인 실험에서 XEN-유사 콜로니의 내부(흑색) 및 외부(적색)에서 생성된 OCT4-양성 세포의 백분율. 각 실험 배치에 대해 3개 초과의 웰을 계수하였다.
도 13a 내지 도 13c는 단계 III의 말기에 세포의 단일 세포 RNA 염기서열 분석을 나타낸다. 도 13a: 단계 III에서 원시 내배엽(XEN이라고도 함) 관련된 마커의 발현. 도 13b: 인간 사전-이식 배아에서 원시 내배엽 관련된 유전자 및 단계 III 세포 클러스터의 발현. 도 13c: XEN-유사 세포(클러스터 2)에서 원시 내배엽 관련된 특징의 농축 점수의 GSEA 분석.
도 14는 재프로그래밍 과정에서 핵심 분자 이벤트에 대한 개략도이다.
도 15a 내지 도 15c는 단계 I 조건에서 개별 화학물질을 회수하는 효과를 나타낸다. 도 15a: 단계 I에서 표시된 처리 후 세포의 글로벌 전사 프로파일의 계층적 클러스터링, 도 15b 및 도 15c: CHIR, 616452 및 TTNPB의 제거 후 다르게 발현된 유전자의 유전자 온톨로지 분석.
도 16a 내지 내지 도 16c는 단계 II 조건에서 개별 화학물질을 회수하는 효과를 나타낸다. 도 16a 및 도 16b: 단계 II의 말기에서 표시된 화학물질을 회수한 후 SALL4 및 세포수의 발현. 에러 바, SD (n=3)을 갖는 평균, ****p < 0.0001. 도 16c: JNKIN8의 제거 후 다르게 발현된 유전자의 유전자 온톨로지 분석.
도 17은 단계 I, 단계 II, 단계 III 및 단계 IV에서 개별 소분자를 제거한 후의 재프로그래밍 효율을 나타내며, 이 데이터를 통해 핵심 소분자를 확인할 수 있다.
도 18은 단계 I에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(GSK3β 억제제; RA 경로 작용제; ROCK 억제제(Rock inhibitors); TGFβ 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 19는 단계 II에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(GSK3β 억제제; RA 경로 작용제; ROCK 억제제; TGFβ 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 20은 단계 II에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(Smoothened 작용제; 히스톤 탈메틸화 억제제; DNMT 억제제; JNK 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 21은 단계 III에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(GSK3β 억제제; TGFβ 억제제; ROCK 억제제; 히스톤 탈메틸화 억제제; ROCK 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 22는 단계 III에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(HDAC 억제제; Dot1L 억제제; S-아데노실-L-호모시스테인 가수분해효소 억제제; ERK 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 23은 단계 IV에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(GSK3β 억제제; ERK 억제제; ROCK 억제제; WNT 경로 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 24는 단계 IV에서 소분자를 동일 경로 또는 표적을 표적으로 하는 다른 소분자(BRAF 억제제 및 HDAC 억제제)로 대체한 후의 재프로그래밍 효율을 나타낸다.
도 25는 소분자 화합물에 의한 hCiPSC의 유도 과정을 예시한다.
도 26은 SGC-CBP30, I-CBP112, GNE272 및 GNE409를 포함하는 CBP/p300 억제제가 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
도 27은 메닌(Menin)-MLL 상호작용 억제제가 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
도 28은 SETD8 억제제가 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
도 29는 단계 I에서 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있는 최소 화학 조합 및 소분자를 나타낸다.
도 30은 단계 II에서 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있는 최소 화학 조합 및 소분자를 나타낸다.
도 31은 단계 III에서 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있는 최소 화학 조합 및 소분자를 나타낸다.
도 32는 단계 IV에서 재프로그래밍 효율을 향상시킬 수 있는 최소 화학 조합 및 소분자를 나타낸다.
외부 자극은 식물 및 일부 무척추동물에서 세포 탈분화 및 재생을 충분히 촉발한다. 그러나 이들의 커미티드 세포 정체성(committed cell identities) 및 안정한 후성유전체 때문에 인간 체세포는 외부 섭동에 저항하여 가소성을 무제한의 효율로 조절한다. 여기서, 외부의 화학적 섭동으로서 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자 조합은 자연 재생과 유사한 탈분화 과정을 통해 분화된 인간 체세포의 후성적 랜드스케프(epigenetic landscape)의 효과적인 재프로그래밍을 가능하게 하였다. 이러한 체세포의 화학적 재프로그래밍은 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포(hCiPSC)를 초래하여 전사체 프로파일(transcriptomic profiles), 후성적 상태 및 발달 잠재력에서 다능성 줄기 세포의 핵심적인 특징을 나타내었다. 개시된 접근법은 응용을 위한 인간 다능성 줄기 세포를 생성하기 위한 플랫폼을 제공한다. 더욱이, 본원에 개시된 연구는 또한 인간 체세포의 가소성 잠재력이 시험관내 및 생체내 모두에서 외부 자극에 의해 조절될 수 있는 치료적 재프로그래밍에 대해서도 설명한다.
I. 정의
본원에 사용되는 용어 "화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포(chemically induced pluripotent stem cells; CiPSC)"는 하나 이상의 형질감염된 유전자의 발현에 의해서가 아니라, 비-다능성 세포를 화학적 화합물과 접촉시킴으로써, 다능성이 아닌 세포, 즉 다분화능 또는 분화된 세포로부터 유래된 다능성 세포를 지칭한다.
본원에 사용되는 용어 "배양물(culture)"은 특정 배지에서 성장되고 임의로 계대된 세포 집단을 의미한다. 세포 배양물은 일차 배양물(예를 들어 계대된 적이 없는 배양물)일 수 있거나 또는 이차 또는 후속 배양물(예를 들어 1회 이상 계대되었거나 계대 배양된 적이 있는 세포 집단)일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 재프로그래밍의 효율을 "강화(enhancing)" 또는 "증가(increasing)"시키는 것은, 강화 인자(enhancing factor)(소분자)를 사용하지 않는 화학적 재프로그래밍 방법과 비교하였을 때, 다능성 인자 예를 들어 OCT4, SOX2 및 NANOG를 발현하능 세포의 능력 및 배양물 중의 계대 수(number of passages)로부터 선택된 특성의 측면에서 측정된, 총 재프로그래밍 시간을 감소시키고, 동일한 시간 동안 배양된 동일한 출발 세포 밀도로부터 얻어진 재프로그래밍된 세포의 수를 증가시키고/시키거나 재프로그래밍된 세포의 질을 개선시키는 것을 의미한다.
CiPSC를 지칭하는 경우의 용어 "단리된" 또는 "정제된"은 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 99% 이상의 오염성 세포 유형, 예를 들어 비-다능성 세포가 없는, 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포를 의미한다. 단리된 줄기 세포는 또한, 가용성의 자연 발생적 분자가 실질적으로 없을 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "다능성"은 다음 3가지 배엽 중 어느 것으로 분화될 수 있는 세포의 잠재력을 지칭한다: 내배엽(예를 들어 내부 위 내벽, 위장관, 폐), 중배엽(예를 들어 근육, 뼈, 혈액, 비뇨생식기), 또는 외배엽(예를 들어 표피 조직 및 신경계). 용어 "비-다능성"은 세포가 상기 3가지 배엽 모두로 분화될 수 있는 잠재력을 지니지 않는다는 것을 의미한다. 다분화능 줄기 세포는 덜 유연성이고 더 분화되며, 소정의 기관 내에서의 몇 가지 세포 유형 중 하나가 될 수 있다. 예를 들어 다분화능 혈액 줄기 세포는 적혈구 전구 세포, 백혈구 또는 혈소판 생성 세포로 발달될 수 있다. 성체 줄기 세포는 다분화능 줄기 세포이다. 지방 유래 줄기 세포는 다분화능이다.
본원에 사용되는 용어 "재프로그래밍"은 하나의 특이적 세포 유형이 또 다른 특이적 세포 유형으로 전환되는 것을 지칭한다. 예를 들어 다능성이 아닌 인간 체세포(human somatic cell)는 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍될 수 있다. 화학적 화합물을 이용하여 비-다능성 세포를 다능성 세포가 되도록 재프로그래밍하는 경우, 이로써 생성되는 세포는 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포이다.
용어 "소분자"는 2,000 달톤 미만, 보다 바람직하게 1,500 달톤 미만, 가장 바람직하게 1,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 분자, 예를 들어 유기 또는 유기 금속 화합물을 지칭한다.　
용어 "탈분화된(dedifferentiated)"은 보다 분화된 상태에서 덜 분화된 상태로 역으로 발달한 세포 또는 조직을 의미한다. 세포 또는 조직은 저성숙 외관, 유전자 발현, 후성적 유전 상태(epigenetic state) 또는 대사 프로파일을 획득하였다.
용어 "가소성"은 다른 세포 또는 조직의 특성을 취하는 세포 또는 조직의 능력을 의미한다. 세포 가소성은 세포가 계통간 제한 경계(cross-lineage restriction boundary)를 극복하고 다른 세포 유형을 발생시킬 가능성이 상당하다는 것을 나타낸다.
II. 조성물
A. 인간 체세포에서 다능성 유도를 향상시키기 위한 소분자
인간의 체세포를 화학적으로 유도된 다능성 세포로 재프로그래밍하는 것을 개선하는데 유용한 화학적 화합물은 단독으로 또는 단백질과 조합하여, 2,000 달톤 미만, 보다 바람직하게 1,500 달톤 미만, 가장 바람직하게 1,000 달톤 미만의 분자량을 갖는 소분자를 포함한다. 이러한 소분자는 900 달톤 이하 또는 500 달톤 이하의 분자량을 가질 수 있다.
따라서, 화학적 재프로그래밍의 4 단계 과정에서 선택된 세포 활성의 조합을 억제/활성화하고, 인간 체세포의 화학적으로 유도되는 다능성 세포로의 재프로그래밍을 (Oct4와 같은 다능성의 하나 이상의 마커를 발현하도록 유전자 조작할 필요 없이) 개선하는 소분자 칵테일이 확인되었다. 개시된 생물학적 활성의 선택적 억제/활성화의 개선은, 본원에서 개시된 생물학적 활성의 억제/활성화의 조합을 사용하지 않는 화학적 재프로그래밍 방법과 비교하였을 때, 예를 들어 세포가 단독으로 또는 적어도 하나의 표면 마커 TRA-1-60, TRA-1-81, 및 SSEA-4와 조합하여 다능성 인자 예를 들어 OCT4, SOX2 및 NANOG를 발현하는 능력, 및/또는 배양물에서의 (재프로그래밍된 세포의) 계대 수로부터 선택된 특성 측면에서 측정된, 재프로그래밍된 세포의 개선된 품질로서 결정될 수 있다.
재프로그래밍 과정의 단계 I을 위한 소분자는, 글리코겐 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 CHIR99021가 사용됨; TGFβ 억제제, 바람직한 구현예에서 616452가 사용됨; 및 레티노산 수용체(retinoic acid receptor; RAR) 작용제, 바람직한 구현예에서 TTNPB가 사용됨;의 조합을 포함한다. 일부 구현예에서, 선택적 생물학적 활성을 갖는 추가 소분자에는, 단계 I 조건에서, 예를 들어 Rho-관련된 코일드-코일 함유 단백질 키나제(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase; ROCK)의 억제제, 바람직한 구현예에서 Y27632 또는 Tzv가 사용됨; 수용체 티로신 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 ABT869가 사용됨; 및 Smoothened 수용체에 대한 작용제, 바람직한 구현예로서 SAG가 사용됨;이 포함된다.
단계 I 조건은 인간 체세포 예를 들어 인간 섬유아세포, 지방-유래 간질 세포 등을 단층 상피-유사 세포로 전환시키는 데 사용되고 선택적으로, 단계 I 보충 생물학적 활성 예를 들어 SAH 가수분해효소 억제제, 바람직한 구현예에서 DZNep가 사용됨; DOT1L 메틸트랜스퍼라제 억제제, 바람직한 구현예에서 EPZ004777가 사용됨; JAK1/JAK2 억제제, 바람직한 구현예에서 룩솔리티닙;으로 보충될 수 있다.
재프로그래밍 과정의 단계 II를 위한 소분자는 선택적 생물학적 활성(여기서 단계 II 조건)을 갖는, (i) 단계 I 인자: 글리코겐 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 CHIR99021이 사용됨; TGFβ 억제제, 바람직한 구현예에서 616452가 사용됨; Rho-관련된, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 바람직한 구현예에서 Y27632가 사용됨; 및 Smoothened 수용체에 대한 작용제, 바람직한 구현예에서 SAG가 사용됨(푸르모르파민(Purmorphamine); Hh-Ag1.5; SAG 21K 또는 인간 SHH는 Smoothened 수용체에 대한 작용제로 사용될 수 있음); 및 수용체 티로신 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 ABT869가 사용됨; (ii) 단계 I 보충 인자: JAK1/2 억제제, 바람직한 구현예에서 룩솔리티닙이 사용됨; (iii) 단계 II 인자: 히스톤 탈메틸화의 억제제, 바람직한 구현예에서 트라닐시프로민이 사용됨; DNA 메틸트랜스퍼라아제 억제제, 바람직한 구현예에서 5-아자시티딘이 사용됨(데시타빈(Decitabine) 및 RG108은 또한 후성적 조절제(epigenetic modulator)로서 사용될 수 있음); 및 c-Jun 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 JNKIN8이 사용됨(Sp600125; JNK-in-5; 또는 JNK-in-7; JNK-in-12 역시 c-Jun 키나제 억제제로 사용될 수 있음);소분자들의 조합을 포함한다.
단계 II 조건은 단계 I 조건으로 처리된 세포에 추가되어 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자를 상향 조절하며, 선택적으로 단계 II 보충 인자 예를 들어 G9a 억제제, 바람직한 구현예에서 UNC0224가 사용됨(Unc0638 및 Unc0321은 G9a 억제제로 사용될 수 있지만); JAK1/2 억제제, 바람직한 구현예에서 룩솔리티닙이 사용됨(토파시티닙(Tofacitinib); 및 AZD1480이 JAK1/2 억제제로 사용될 수 있지만); p38 MAPK 억제제, 바람직한 구현예에서 BIRB796이 사용됨; BMP 수용체/AMPK 억제제, 바람직한 구현예에서 도르소모르핀(Dorsomorphin)이 사용됨; 및 CBP/p300 브로모도메인 억제제, 바람직한 구현예에서 SGC-CBP30이 사용됨;으로 보충될 수 있다.
재프로그래밍 과정의 단계 III를 위한 소분자는, (i) 단계 I 인자: 글리코겐 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 CHIR99021이 사용됨; TGFβ 억제제, 바람직한 구현예에서 616452가 사용됨; (ii) 단계 I 보충 인자: SAH 가수분해효소 억제제, 바람직한 구현예에서 DZNep가 사용됨; DOT1L 메틸트랜스퍼라아제 억제제, 바람직한 구현예에서 EPZ004777 산이 사용됨; (iii) 단계 II 인자: 히스톤 탈메틸화의 억제제, 바람직한 구현에에서 트라닐시프로민이 사용됨; 및 (iv) 단계 III 인자: 히스톤 아세틸레이터/탈아세틸화효소 억제제, 바람직한 구현예에서 발프로산이 사용됨; Rho-관련된, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 바람직한 구현예에서 Y27632가 사용됨; 및 MAPK 억제제, 바람직한 구현예에서 PD0325901이 사용됨(AZD8330, TAK-733 및 타니티닙이 PD0325901 대신 사용될 수도 있지만); SETD8 억제제, 바람직한 구현예에서 Unc0379가 사용됨;으로부터 선택된 선택적 생물학적 활성(여기서 단계 III 조건)을 갖는 소분자들의 조합을 포함한다.
단계 III 조건은 단계 II 조건으로 처리된 세포에 추가하여 OCT 4 의 발현으로 측정되는 초기 다능성 네트워크를 확립한다.
재프로그래밍 과정의 단계 IV를 위한 소분자는, (i) 단계 I 인자: 글리코겐 키나제 억제제, 바람직한 구현예에서 CHIR99021이 사용됨; 및 Rho-관련된, 코일드 코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 바람직한 구현예에서 Y27632가 사용됨; (ii) 단계 I 보충 인자: SAH 가수분해효소 억제제, 바람직한 구현예에서 DZNep가 사용됨; DOT1L 메틸트랜스퍼라아제 억제제, 바람직한 구현예에서 EPZ004777 산이 사용됨; (iii) 단계 II 인자: 히스톤 탈메틸화의 억제제, 바람직한 구현에에서 트라닐시프로민이 사용됨; (iv) 단계 III 인자: MAPK 억제제, 바람직한 구현예에서 PD0325901이 사용됨; 히스톤 아세틸레이터/탈아세틸화효소 억제제, 바람직한 구현예에서 발프로산이 사용됨; 및 단계 IV 인자: 및 (v) B-Raf 억제제, 바람직한 구현예에서 SB590885가 사용됨; 및 Wnt 억제제, 바람직한 구현예에서 IWP2가 사용됨;으로부터 선택된 선택적 생물학적 활성(여기서 단계 IV 조건)을 갖는 소분자들의 조합을 포함한다.
일부 바람직한 구현예에서, 단계 I의 소분자들은 하기 조합으로부터 선택된다: CHIR99021 + 616452 + TTNPB, CHIR99021 + 616452 + CH55, CHIR99021 + 616452 + AM580, CHIR99021 + A8301 + TTNPB, CHIR99021 + A8301 + CH55, CHIR99021 + A8301 + AM580, CHIR99021 + SB431542 + TTNPB, CHIR99021 + SB431542 + CH55, CHIR99021 + SB431542 + AM580, CHIR99021 + LY2109761 + TTNPB, CHIR99021 + LY2109761 + CH55, CHIR99021 + LY2109761 + AM580, TD114-2 + 616452 + TTNPB, TD114-2 + 616452 + CH55, TD114-2 + 616452 + AM580, TD114-2 + A8301 + TTNPB, TD114-2 + A8301 + CH55, TD114-2 + A8301 + AM580, TD114-2 + SB431542 + TTNPB, TD114-2 + SB431542 + CH55, TD114-2 + SB431542 + AM580, TD114-2 + LY2109761 + TTNPB, TD114-2 + LY2109761 + CH55, TD114-2 + LY2109761 + AM580, CHIR98014 + 616452 + TTNPB, CHIR98014 + 616452 + CH55, CHIR98014 + 616452 + AM580, CHIR98014 + A8301 + TTNPB, CHIR98014 + A8301 + CH55, CHIR98014 + A8301 + AM580, CHIR98014 + SB431542 + TTNPB, CHIR98014 + SB431542 + CH55, CHIR98014 + SB431542 + AM580, CHIR98014 + LY2109761 + TTNPB, CHIR98014 + LY2109761 + CH55, CHIR98014 + LY2109761 + AM580, GSK3bi XV + 616452 + TTNPB, GSK3bi XV + 616452 + CH55, GSK3bi XV + 616452 + AM580, GSK3bi XV + A8301 + TTNPB, GSK3bi XV + A8301 + CH55, GSK3bi XV + A8301 + AM580, GSK3bi XV + SB431542 + TTNPB, GSK3bi XV + SB431542 + CH55, GSK3bi XV + SB431542 + AM580, GSK3bi XV + LY2109761 + TTNPB, GSK3bi XV + LY2109761 + CH55, GSK3bi XV + LY2109761 + AM580.
일부 바람직한 구현예에서, 단계 II의 소분자들은 하기 조합으로부터 선택된다: CHIR99021 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-7, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-12, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + 푸르모르파민(Purmorphamine) + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + Hh-ag-1.5 + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + CH55 + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + AM580 + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + A8301 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + SB431542 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + LY2109761 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, TD114-2 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR98014 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, GSK3bi XV + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8.
일부 바람직한 구현예에서, 단계 III의 소분자들은 하기 조합으로부터 선택된다: VPA + Dznep + PD0325901+616452, VPA + Dznep + AZD8330 + 616452, VPA + Dznep + TAK733+616452, VPA + Dznep + 트라미티닙(Tramitinib) + 616452, VPA + Adox + PD0325901+616452, VPA + Adox + AZD8330+616452, VPA + Adox + TAK733+616452, VPA + Adox + 트라미티닙+616452, VPA + Nepa + PD0325901+616452, VPA + Nepa + AZD8330+616452, VPA + Nepa + TAK733+616452, VPA + Nepa + 트라미티닙+616452, MS275 + Dznep + PD0325901+616452, MS275 + Dznep + AZD8330+616452, MS275 + Dznep + TAK733+616452, MS275 + Dznep + 트라미티닙+616452, MS275 + Adox + PD0325901+616452, MS275 + Adox + AZD8330+616452, MS275 + Adox + TAK733+616452, MS275 + Adox + 트라미티닙+616452, MS275 + Nepa + PD0325901+616452, MS275 + Nepa + AZD8330+616452, MS275 + Nepa + TAK733+616452, MS275 + Nepa + 트라미티닙+616452, LMK235 + Dznep + PD0325901+616452, LMK235 + Dznep + AZD8330+616452, LMK235 + Dznep + TAK733+616452, LMK235 + Dznep + 트라미티닙+616452, LMK235 + Adox + PD0325901+616452, LMK235 + Adox + AZD8330+616452, LMK235 + Adox + TAK733+616452, LMK235 + Adox + 트라미티닙+616452, LMK235 + Nepa + PD0325901+616452, LMK235 + Nepa + AZD8330+616452, LMK235 + Nepa + TAK733+616452, LMK235 + Nepa + 트라미티닙+616452, 부티레이트(Butyrate) + Dznep + PD0325901+616452, 부티레이트 + Dznep + AZD8330+616452, 부티레이트 + Dznep + TAK733+616452, 부티레이트 + Dznep + 트라미티닙+616452, 부티레이트 + Adox + PD0325901+616452, 부티레이트 + Adox + AZD8330+616452, 부티레이트 + Adox + TAK733+616452, 부티레이트 + Adox + 트라미티닙+616452, 부티레이트 + Nepa + PD0325901+616452, 부티레이트 + Nepa + AZD8330+616452, 부티레이트 + Nepa + TAK733+616452, 부티레이트 + Nepa + 트라미티닙+616452.
일부 바람직한 구현예에서, 단계 IV의 소분자들은 하기 조합으로부터 선택된다: PD0325901 + SB590885, PD0325901 + 소라피닙(Sorafinib), PD0325901 + GDC0879, AZD8330 + SB590885, AZD8330 + 소라피닙, AZD8330 + GDC0879, TAK733 + SB590885, TAK733 + 소라피닙, TAK733 + GDC0879, 트라미티닙 + SB590885, 트라미티닙 + 소라피닙, 트라미티닙 + GDC0879.
GSK (글리코겐 합성 키나제 ) 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포 내의 GSK의 억제를 포함한다. 바람직한 GSK 억제제는 아미노피리미딘, 화학명 [6-[[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(5-메틸-1H-이미다졸-2-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]아미노]-3-피리딘카보니트릴]을 갖는 CHIR99021이다. 다른 GSK 억제제는 또한 본원에서 개시된 방법에 사용될 수 있으며, 이들은 제한되지는 않지만, 3-12 μM의 CHIR99021와 동등한 농도로 사용된, BIO-아세톡심; GSK 3I 억제제 XV; SB-216763 [3-(2,4-디클로로페닐)-4-(1-메틸-1H-인돌-3-일)-1H-피롤-2,5-디온]; CHIR99021의 염산염인 CHIR 99021 트리하이드로클로라이드; GSK-3 억제제 IX [((2Z,3E)-6'-브로모-3-(하이드록시이미노)-[2,3'-바이인돌리닐리덴]-2'-온]; GSK 3 IX [6-브로모인디루빈-3'-옥심]; GSK-3β 억제제 XII [3-[[6-(3-아미노페닐)-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-일]옥시]페놀]; GSK-3 억제제 XVI [6-(2-(4-(2,4-디클로로페닐)-5-(4-메틸-1H-이미다졸-2-일)-피리미딘-2-일아미노)에틸-아미노)-니코티노니트릴]; SB-415286 [3-[(3-클로로-4-하이드록시페닐)아미노]-4-(2-니트로페닐)-1H-피롤-2,5-디온]; 바이오 [(2'Z,3'E)-6-브로모인디루빈-3'-옥심]; TD114-2 [6,7,9,10,12,13,15,16,18,19-데카하이드로-5,29:20,25-디메테노-26H-디벤조[n,t]피롤로[3,4-q][1,4,7,10,13,22]테트라옥사디아자사이클로테트라코신-26,28(27H)-디온]; 및 CHIR98014 [N6-[2-[[4-(2,4-디클로로페닐)-5-(1H-이미다졸-1-일)-2-피리미디닐]아미노]에틸]-3-니트로-2,6-피리딘디아민];을 포함한다.
TGFβ 수용체 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 TGFβ의 억제를 포함하며, TGFβ 억제제는 바람직하게는 일부 구현예에서 TGFβ 유형 1 수용체 작용 수용체-유사 키나제(ALK) 5를 억제하고, 추가적으로 다른 구현예에서 ALK 4 및 노달형 수용체(nodal type receptor) 1 수용체 ALK7을 억제할 수 있다.
바람직한 TGFβ 수용체 억제제는 616452 [2-(3-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-4-일)-1,5-나프티리딘]이다. 다른 TGFβ 억제제는 당업계에 공지되어 있고, 상업적으로 입수가능하다. 예는 A 83-01 [3-(6-메틸-2-피리디닐)-N-페닐-4-(4-퀴놀리닐)-1H-피라졸-1-카보티오아미드]; SB 505124 [2-[4-(1,3-벤조디옥솔-5-일)-2-(1,1-디메틸에틸)-1H-이미다졸-5-일]-6-메틸-피리딘]; GW 788388 [4-[4-[3-(2-피리디닐)-1H-피라졸-4-일]-2-피리디닐]-N-(테트라하이드로-2H-피란-4-일)-벤즈아미드]; 및 SB 525334 [6-[2-(1,1-디메틸에틸)-5-(6-메틸-2-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일]퀴녹살린] 및 도르소모르핀(dorsomorphine)을 포함한다.
히스톤 아세틸레이터 ( acetylator )/ 탈아세틸화효소 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포 내의 히스톤 탈아세틸화효소의 억제를 포함하며, 바람직한 히스톤 탈아세틸화의 억제제는 발프로산(valproic acid)이다. 그러나, 다른 히스톤 탈아세틸화의 억제제는 상업적으로 이용가능하며, 사용가능하다. 비제한적 예는 아피시딘 [사이클로(N-O-메틸-L-트립토파닐-L-이소류시닐-D-피페코리닐-L-2-아미노-8-옥소데카노일)]; LMK235 [N-[6-(하이드록시아미노)-6-옥소헥실]옥시]-3,5-디메틸벤즈아미드]; MS275 [(피리딘-3-일)메틸 4-(2-아미노페닐카바모일)벤질카바메이트]; CI 994 [N-아세틸디날린-4-(아세틸아미노)-N-(2-아미노페닐)벤즈아미드]; 데프시펩티드(Depsipeptide); KD 5170 [S-[2-[6-[[[4-[3-(디메틸아미노)프로폭시]페닐]설포닐]아미노]-3-피리디닐]-2-옥소에틸]에탄티옥산 에스테르]; 나트륨 4-페닐 부티레이트; 나트륨 부티레이트 [부타노산 나트륨염]; UF 010 [4-브로모-N'-부틸벤조하이드라지드] 및 HDACi IV 등을 포함한다.
히스톤 탈메틸화의 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 히스톤 탈메틸화의 억제를 포함한다. 히스톤 탈메틸화의 바람직한 억제제는 트라닐시프로민(tranylcypromine)이다. 트라닐시프로민은 비선택적이고 비가역적인 모노아민 산화효소 억제제(monoamine oxidase inhibitor; MAOI)이다. 히스톤 탈메틸화의 억제제인 또 다른 유용한 MAOI는 RN-1 [2-((1R,2S)-2-(4-(벤질옥시)페닐)사이클로프로필아미노)-1-(4-메틸피페라진-1-일)에타논 디하이드로클로라이드]; GSK2879 [4-{[4-({[(1R,2S)-2-페닐사이클로프로필]아미노}메틸)피페리딘-1-일]메틸}벤조산]; S2101 [(1R,2S)-2-[2-(벤질옥시)-3,5-디플루오로페닐]사이클로프로판-1-아민 하이드로클로라이드]; LSD1-C76 [(1R,2S)-N-(1-(2,3-디하이드로벤조[b][1,4]디옥신-6-일)에틸)-2-페닐사이클로프로파민] 등을 포함한다.
레티노산 수용체( RAR ) 작용제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포 내의 레티노산 수용체의 활성화를 포함하는 방법을 포함한다. 바람직한 RAR 작용제(agonist)는 TTNPB [4-[(E)-2-(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)-1-프로페닐]벤조산]이다. 사용될 수 있는 다른 것은 Ch 55 [4-[(1E)-3-[3,5-비스(1,1-디메틸에틸)페닐]-3-옥소-1-프로페닐]벤조산]; RAR-α 및 RAR-β 수용체에 대해 높은 친화성을 갖고 세포 레티노산 결합 단백질(CRABP)에 대해 낮은 친화성을 갖는 매우 강력한 합성 레티노이드; AM580 ([4-[(5,6,7,8-테트라하이드로-5,5,8,8-테트라메틸-2-나프탈레닐)카복스아미도]벤조산; 선택적 RARα 작용제로서 작용하는 레티노산의 유사체)를 포함한다;
SAH 가수분해효소( hydrolase ) 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 SAH의 억제를 포함한다. 바람직한 SAH 가수분해효소 억제제는 3-데아자네플라노신(3-deazaneplanocin) A(DZNep) [(1S,2R,5R)-5-(4-아미노-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-1-일)-3-(하이드록시메틸)-3-사이클로펜텐-1,2-디올]이다. 본원에서 개시된 CIP 조합 조성물에 포함될 수 있는 다른 유용한 SAH 가수분해효소 억제제는 (-) 네플라노신 A(Neplanocin A; NepA) [5R-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-3-(하이드록시메틸)-3-사이클로펜텐-1S,2R-디올]; 아데노진 퍼요오데이트 산화된(adenozine periodate oxidized) (Adox) [(2S)-2-[(1R)-1-(6-아미노퓨린-9-일)-2-옥소에톡시]-3-하이드록시프로파날] 및 3-데아자데노신(deazaadenosine; DZA) [1-β-D-리보푸라노실-1H-이미다조[4,5-c]피리딘-4-아민] 및 그들의 조합물을 포함한다.
DOT1L 메틸트랜스퍼라제 ( Methyltransferase ) 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포 내의 억제 DOT1L 메틸트랜스퍼라제를 포함한다. 바람직한 DOT1L 메틸트랜스퍼라제 억제제는 SGC 0946 [1-[3-[[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-아미노-5-브로모-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-7-일)-3,4-디하이드록시테트라하이드로푸란-2-일]메틸](이소프로필)아미노]프로필-3-[4-(2,2-디메틸에틸)페닐]우레아]; EPZ004777 [7-[5-데옥시-5-[[3-[[[[4-(1,1-디메틸에틸)페닐]아미노]카보닐]아미노]프로필](1-메틸에틸)아미노]-β-D-리보푸라노실]-7H-피롤로[2,3-d]피리미딘-4-아민]; EPZ5676 [(2R,3R,4S,5R)-2-(6-아미노-9H-퓨린-9-일)-5-((((1R,3S)-3-(2-(5-(tert-부틸)-1H-벤조[d]이미다졸-2-일)에틸)사이클로부틸)(이소프로필)아미노)메틸)테트라하이드로푸란-3,4-디올]을 포함한다.
수용체 티로신 키나제 억제제
바람직한 수용체 티로신 키나제 억제제는 ABT 869(리니파닙(Linifanib)) [N-4-(3-아미노-1H-인다졸-4-일)페닐]-N'-(2-플루오로-5-메틸페닐)-우레아], 혈관 내피 성장 인자(vascular endothelial growth factor; VEGF) 및 혈소판 유래 성장 인자(platelet derived growth factor; PDGF) 수용체 패밀리의 구성원들의 강력한 억제제인 ATP-경쟁적 수용체 티로신 키나제 억제제이다. 다른 티로신 키나제 억제제, 예를 들어 AG1296 [6,7-디메톡시-3-페닐퀴녹살린] 및 발라타닙(Valatanib)은 ABT 869를 대체할 수 있으며 ABT 869 대신 사용될 수 있다.
B- Raf 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 B-Raf의 억제를 포함한다. 바람직한 B-Raf 억제제는 SB590885 [5-2-[4-[2-(디메틸아미노)에톡시]페닐]-5-(4-피리디닐)-1H-이미다졸-4-일-2,3-디하이드로-1H-인덴-1-온 옥심]이다. SB590885는 무세포 분석(cell-free assay)에서 0.16 nM의 Ki를 갖는 강력한 B-Raf 억제제로서, c-Raf에 대한 선택도가 11배 더 큰 강력한 B-Raf 억제제로서, 다른 인간 키나제에 대한 억제가 없다. 다른 강력한 B-Raf 억제제는 SB590885와 동일한 활성을 위해 사용할 수 있다. 예로 베무라페닙, RAF265(CHIR-265)(Selleckhchem 카탈로그 번호 S2161) 및 PLX4720(Selleckhchem 카탈로그 번호 S11525)이 있다.
Wnt 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 Wnt의 억제를 포함한다. 바람직한 Wnt 억제제는 IWP-2 [N-(6-메틸-2-벤조티아졸릴)-2-[(3,4,6,7-테트라하이드로-4-옥소-3-페닐티에노[3,2-d]피리미딘-2-일)티오]-아세트아미드]이다. 그러나, Wnt 억제제 예를 들어 WNT-C59 [4-(2-메틸-4-피리디닐)-N-[4-(3-피리디닐)페닐]벤젠아세트아미드], XAV-939 [3,5,7,8-테트라히드로-2-[4-(트리플루오로메틸)페닐]-4H-티오피라노[4,3-d]피리미딘-4-온] 및 IWR-1(Selleckchem 카탈로그 번호 S7086)는 IWP-2를 대체할 수 있으므로 IWP-2 대신 사용될 수 있다.
Rho-관련된, 코일드 -코일 함유 단백질 키나제 (ROCK) 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 ROCK를 억제하는 것을 포함한다. 바람직한 ROCK 억제제는 Y27632([(+)-(R)-트랜스-4-(1-아미노에틸)-N-(4-피리딜)사이클로헥산카복스아미드+++ 디하이드로클로라이드) 또는 티아조비빈(thiazovivin; Tzv)이다.
CBP /p300 브로모도메인 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 CBP/p300 브로모도메인을 억제하는 것을 포함한다. 바람직한 CBP/p300 브로모도메인 억제제는 SGC-CBP30 [2-[2-(3-클로로-4-메톡시페닐)에틸]-5-(3,5-디메틸-4-이속사졸릴)-1-[(2S)-2-(4-모르폴리닐)프로필]-1H-벤즈이미다졸], I-CBP112, GNE272, 또는 GNE409이다.
메닌 - MLL 상호작용 억제제
개시된 재프로그래밍 프로토콜은 재프로그래밍되는 세포에서 메닌-MLL(Menin-MLL) 상호작용의 억제를 포함한다. 바람직한 메닌-MLL 상호작용 억제제는 VTP50469, MI3454, 또는 WDR5-IN-4이다.
B. 유도되는 세포
hCiPSC는 인간 체세포로부터 얻어진다. 당해 기술 분야의 일반적인 기술 중 하나로 이해될 수 있는 체세포는 생식 세포(gamete)(정자 또는 난자), 생식 세포(germ cell)(생식세포가 되는 세포), 생식 세포(gamete) 또는 미분화 줄기 세포를 제외한 모든 세포이다.
체세포는 골수, 태아 조직(예를 들어 태아 간 조직), 말초혈액, 제대혈, 췌장, 피부 또는 장기 또는 조직과 같은 조직에서 얻을 수 있다. 바람직한 구현예에서, hCiPSC는 섬유아세포, 지방-유래 세포, 신경 세포 또는 장 상피로부터 수득된다. 더 바람직한 구현예에서, hCiPSC는 신생아(예를 들어 포피(foreskin)) 또는 성체 섬유아세포로부터 수득된다. 그러나, hCiPSC는 혈액학적 기원의 체세포, 피부 유래 세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중간엽 기원의 세포, 실질 세포(예를 들어 간세포), 신경 세포 및 결합 조직 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 세포 유형으로부터 얻어질 수 있다.
바람직한 구현예에서, hCiPSC는 섬유아세포 및 지방-유래 체세포(예를 들어 지방세포(adipocytes))로부터 수득된다. 더욱 바람직한 구현예에서, hCiPSC는 섬유아세포로부터 수득되며, 이는 신생아(예를 들어 포피 섬유아세포) 또는 성체 섬유아세포일 수 있다.
세포는 통상의 기술자에게 공지된 기술을 이용하여 세포 공급원으로서 제공되어야 하는 적당한 기관 또는 조직을 분해함으로써 단리시킬 수 있다. 예를 들어 이러한 기관 또는 조직은 기계적으로 분해시킬 수 있고/있거나 이웃하는 세포들 간의 결합을 약화시키는 분해 효소 및/또는 킬레이트제로 처리하여, 상기 조직들이 인지 가능한 세포 붕괴 없이도 개개 세포의 현탁물을 형성하도록 분산시킬 수 있다. 효소적 해리는 상기 조직을 분쇄시키고 이와 같이 분쇄된 조직을 하나 이상의 효소, 예를 들어 트립신, 키모트립신, 콜라게나제, 엘라스타제 및/또는 히알루로니다제, DNase, 프로나제, 디스파제 등으로 처리함으로써 달성될 수 있다. 기계적 붕괴는 또한, 분쇄기, 블렌더, 체, 균질화기, 압력 셀 또는 인소네이터(insonator)의 사용을 포함하지만, 이에 제한되지 않는 수 많은 방법에 의해 달성될 수 있다.
C. hCiPSC
또한, 개시된 방법에 따라 얻어진 hCiPSC가 제공된다. 세포는 hESC와 유사한 배가 시간(doubling time)으로 20회 이상, 예를 들어 최대 25회, 30회, 35회, 40회, 41회, 42회 계대 동안 증폭시킬 수 있는 것을 특징으로 한다. 또한, hCiPSC는 코어 다능성 전사 인자 OCT4, SOX2(SRY-박스 전사 인자 2), NANOG(DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제 3 베타), DPPA4(발달 다능성-관련 4), UTF1(미분화 배아 세포 전사 인자 1), ZFP42(아연 핑거 단백질(Zinc finger protein) 42), PRDM14(PR-도메인 함유 단백질(domain containing protein) 14), ZIC3(아연 패밀리 멤버(Zic Family Member) 3)), NANOG(나노그 홈박스(Nanog Homeobox))와 함께 표면 마커 TRA-1-60, TRA-1-81, SSEA-4 중의 적어도 하나를 발현하는 것을 특징으로 한다. 이들 마커는 전통적인 다능성 줄기 세포(hESC 및 hiPSC)에서는 발현되지 않았다. 기능적으로, 면역결핍 마우스에 hCiPSC를 주입하였을 때 결과적으로 생성된 테라토마(teratomas)는 3개의 생식세포 층(germ layers)(내배엽, 외배엽 및 중배엽) 모두를 함유하고; hCiPSC는 시험관 내에서 배아체를 형성하고 3개의 생식세포 층의 마커 유전자를 발현하며, 다른 커미티드 세포 유형, 예를 들어 간세포(hepatocytes)로 직접 분화하거나 전구 세포(progenitor cells) 예를 들어 조혈 전구 세포(hematopoietic progenitor cells)로 직접 분화할 수 있다. 가장 중요하게, hCiPSC는 바람직하게는 유전적으로 조작되지 않은 것, 즉 세포에서 유전적 요소를 도입하거나 제거함으로써, 예를 들어 다능성의 하나 이상의 마커 예를 들어 Oct3/4(옥타머 결합 전사인자 3/4), KLF4, NANOG 및/또는 cMyc를 발현하도록 체세포를 조작함으로써 인간 체세포를 변경하는 것을 포함하는 방법에 의해서 얻어지지 않는 것이며, 따라서 상기 개시된 방법에 따라 얻어진 hCiPSC는 외인성으로 도입된 Oct3/4, KLF4, NANOG 및/또는 cMyc를 함유하지 않는다.
III. 제조 방법
인간 체세포를 다능성 세포로 재프로그래밍하는 개시된 방법은 4 단계 세포 배양 공정이다. 재프로그래밍되는 인간 체세포는 성체 진피 조직(adult dermis tissues), 성체 인간 지방 유래 중간엽 기질 세포(adult human adipose derived mesenchymal stromal cells) 및 인간 배아 섬유아세포와 함께 당업자에게 잘 알려져 있고 본원에 예시된 방법을 사용하여 원하는 조직으로부터 채취된다. 채취한 세포는 재프로그래밍이 완료될 때까지 배양 및 계대 상태를 유지시킨다.
단계 I에서, 체세포는 세포 배양 배지, 예를 들어 DMEM, KnockOutTM DMEM, DMEM/F12, 고급(Advanced) DMEM/F12에 시딩되고 적절한 세포 배양 배지 예를 들어 DMEM에서 단계 I 조건에 노출된 후, 즉 세포 배양 배지에 유효량으로 단계 I 인자를, 바람직하게는 다음 날에 보충한 다음, 일부 구현예에서 단계 I 조건(예를 들어 체세포가 성체 조직으로부터 얻어진 체세포인 경우, 예를 들어 hADSC 및 hASf를 갖는 것인 경우)에서 5% O2를 갖거나 또는 다른 구현예(예를 들어 체세포가 성체 조직으로부터 얻어진 체세포, 예를 들어 HEF인 경우)에서 37℃에서 21% O2 및 5% CO2를 갖는 저산소증(hypoxia)의 조건 하에 유효 시간 동안 배양하여 상기 체세포를 단층 상피-유사 세포(monolayer epithelial-like cells)로 전환시켰다. 초기 유도 단계는 세포의 초기 시딩 후 4시간에서 48시간 사이에 시작할 수 있다. 세포는 적절한 밀도로 시딩되며, 예를 들어 ADSC 및 hASF는 15% FBS DMEM 배지에서 12웰 플레이트의 웰당 1 x 104 세포의 밀도로 시딩될 수 있다. 보충된 배지는 3-4일마다 교체될 수 있다. 단층 상피-유사 세포로의 체세포의 전환에 효과적인 배양 기간은 체세포 유형에 따라 변한다. 예를 들어 hADSC에서 유도된 단층 상피-유사 세포는 4~6일째에 출현하여 8~12일째에 80%~100% 컨플런스(confluence)에 도달할 수 있다. ASF의 경우, 상피-유사 세포는 12~20일에 80%-100% 컨플런스에 도달한다. 상피-유사 세포로의 전환은, 단계 I 인자를 보충하지 않고 세포 배양 배지에서 배양된/단계 I 조건에서 배양된 상응하는 체세포와 비교했을 때, KRT8(예를 들어 최대 60배 상향 조절), KRT18(예를 들어 최대 22배 상향 조절), KRT19(예를 들어 최대 2.5배 상향 조절)와 같은 상피 세포-관련 유전자의 상향 조절을 통해 측정할 수 있다. 추가로, 단계 I의 말기에서 세포는 배양된 체세포와 비교했을 때 최대 21배까지 LIN28A의 발현이 증가된 것으로 나타났다.
단계 I 조건에 바람직한 인자의 조합은 CHIR99021(3-12 μM, 바람직하게는 10-12 μM, 예를 들어 8, 9, 10, 11, 또는 12 μM), 616452(2-50 μM, 바람직하게는 5-20 μM, 예를 들어 5, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15 또는 20 μM), TTNPB(0.5-10 μ, 바람직하게는 1-5 μM, 예를 들어 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 또는 3 μM), Y27632 또는 TZV(1-10 μM, 바람직하게는 1-5 μM, 예를 들어 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 또는 3 μ), ABT869(0.5-5 μM, 바람직하게는 1-2 μM, 예를 들어 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2 또는 1.5 μM) 및 SAG(0.2- 2 μM, 바람직하게는 0.5-1 μM, 예를 들어 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 μM)으로부터 선택된다. 체세포, 예를 들어 섬유아세포를 단층 상피-유사 세포로 전환하기 위해 단계 I 인자로 보충된 세포 배양 배지(단계 I 조건)에서 세포를 효과적인 시간 동안 배양하여 단층 상피-유사 세포로 전환시킨다. 일부 구현예에서, 상기 단계 I 조건은 Dot1L 억제제(EPZ004777 또는 EPZ5676(0.2- 10 μM, 바람직하게는 1-5 μM, 예를 들어 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 또는 3 μM), 룩솔리티닙(Ruxolitinib )(0.1-5 μM, 바람직하게는 0.5-1 μM, 예를 들어 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2 또는 1.5 μM)) 및 DZNep(0.005-0.1 μM, 바람직하게는 0.01 내지 0.05, 예를 들어 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 μM)로 구성된 군으로부터 선택된 소분자를 사용한 보충을 포함할 수 있다.
단계 II에서, 단계 I 조건으로 처리된 세포의 세포 배양 배지를, 단계 II 인자를 보충하지 않고 세포 배양 배지에서 배양된/단계 II 조건에서 배양된 상응하는 체세포와 비교했을 때, 예를 들어 다능성-관련된 전사 인자 SALL4(예를 들어 최대 24배 상향 조절)의 활성화로서 측정된, LIN28A(예를 들어 최대 24배 상향 조절)로 공-발현된, 배양된 세포에서 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자 발현을 상향 조절하기에 효과적인 시간 동안 단계 II 조건으로 변화시킨다. 단계 II 조건에 바람직한 인자들의 조합은, (i) 단계 II 인자 5- 아자시티딘(Azacytidine)(2-10 μM, 바람직하게는 5-10 μM, 예를 들어 5, 6, 7, 8, 9, 10 μM), 트라닐시프로민(Tranylcypromine)(2-50 μM, 바람직하게는 2-10 μM, 예를 들어 2, 2.5, 3, 5, 8 또는 10), 및 JNKIN8(0.2-2 μM,, 바람직하게는 0.5-1 μM, 예를 들어 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2 또는 1.5 μM); 및 (ii) 단계 I 인자: 단계 I 조건에 대해 위에서 개시된 동일한 농도로 사용된 CHIR99021, 616452, TTNPB, ABT-869 및 SAG;을 포함한다. 단계 II 조건은, 단계 I 조건에 대해 위에서 개시된 동일한 농도로 사용된 단계 I 보충 인자 룩솔리티닙, 및 단계 II 보충 인자: UNC0224(0.1-5 μM, 바람직하게는 0.5-2 μM, 예를 들어 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2 또는 1.5 μM), BIRB796(0.2-5 μM, 바람직하게는 2-5 μM, 예를 들어 2, 2.5, 3, 3.5, 4 또는 5 μ), 및 도르모르핀(Dorsormorphin)(0.2-2 μM, 바람직하게는 0.5-1 μM, 예를 들어 0.2, 0.5, 0.6, 0.8 또는 1)로 구성된 군으로부터 선택된 소분자로 배양 배지의 추가 보충을 포함한다. 단계 II 조건 하에서 배양에 효과적인 배양 기간은 세포 유형에 따라 약간씩 변한다. 단계 II 조건에서 hADSC 및 hASF를 배양한 후, 약 8~12일 처리 후 다층 콜로니가 나타나고 이러한 세포 콜로니는 계속 커진다. 총 약 16~20일의 단계 II 조건 후, 세포 배양 배지가 단계 III 조건으로 변할 수 있다.
단계 III에서, 단계 II 조건으로 처리된 세포의 세포 배양 배지를 단계 III 조건으로 변화시키고 단계 III 조건에서 OCT4의 발현으로 측정된 초기 다능성 네트워크를 확립하기에 효과적인 시간 동안 배양하였다, 세포는, OCT4의 발현(단계 III 조건)으로 측정된, 초기 다능성 네트워크를 확립하기에 효과적인 시간 동안 단계 III 인자로 보충된 세포 배양 배지에서 세포를 배양함으로써, 단계 II 조건으로 처리하였다. 단계 III 조건에 바람직한 인자들의 조합은, (i) 단계 III 인자: PD0325901(0.02-5 μM, 바람직하게는 0.5-1 μM, 예를 들어 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1, 1.2 또는 1.5 μM), 및 VPA (200-1500 μM, 바람직하게는 200-500 μM, 예를 들어 200, 300, 400 또는 500 μM); (ii) 단계 I 인자 CHIR99021(1-10 μM, 바람직하게는 1-3 μM, 예를 들어 1, 1.5, 2, 2.5 또는 3 μM); 단계 I 조건에 개시된 동일한 농도로 사용된 616452 및 Y-27632(2-50 μM, 바람직하게는 2-10 μM, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 μM ); (iii) 단계 I 보충 인자, DZNep(0.05-0.5 μM, 바람직하게는 0.1-0.3 μM, 예를 들어 0.1, 0.15, 0.2, 0.25, 또는 0.3 μM), 및 EPZ004777(0.25-20 μM, 바람직하게는 1-10 μM, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 8, 또는 10 μM); (iv) 단계 II 인자 트라닐시프로민(5-50 μM, 바람직하게는 5-20 μM, 예를 들어 5, 8, 10, 15 또는 20 μM);을 포함한다. 단계 II 조건 하에서 배양에 효과적인 배양 기간은 세포 유형에 따라 약간 변할 수 있다. 그러나 단계 III 조건에서 8-12일의 처리가 바람직하며, 일부 구현예에서는 8-10일이 사용될 수 있다.
단계 IV에서, 단계 III 조건으로 처리한 세포의 세포 배양 배지를 단계 IV 조건으로 변경시키고, 공-발현 OCT4, SOX2, 및 NANOG에 의해 측정된, 다능성 네트워크를 충분히 확립하기에 효과적인 시간 동안 단계 IV 조건에서 배양하였다. 단계 IV 조건에 바람직한 인자들의 조합은, (i) 단계 I 인자 CHIR99021(0.2-3 μM, 바람직하게는 0.2-1 μM, 예를 들어 0.2, 0.3, 0.5, 0.8 또는 1 μM); 및 Y-27632(2-20 μM, 바람직하게는 2-10 μM, 예를 들어 2, 3, 4, 5, 7, 8, 또는 10 μM); (ii) 단계 I 보충 인자 DZNep(0.02-0.2 μM, 바람직하게는 0.02-0.05 μM, 예를 들어 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 또는 0.1 μM) 및 EPZ004777(0.25-20 μM, 바람직하게는 1-10 μM, 예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 8 또는 10 μM); (iii) 단계 II 인자 트라닐시프로민(2-50 μ, 바람직하게는 2-10 μM, 예를 들어 2, 2.5, 3, 5, 8 또는 10 μM); (iv) 단계 III 인자 PD0325901(0.02-5 μM, 바람직하게는 0.1-1 μM, 예를 들어 0.1, 0.2, 0.5, 0.7, 0.8 또는 1 μM) 및 VPA(200-1500 μM, 바람직하게는 200-500 μM, 예를 들어 200, 300, 400 또는 500 μM); 및 (v) 단계 IV 인자 IWP2(0.5-4 μM, 바람직하게는 1-2 μM, 예를 들어 0.9, 1, 1.5, 2, 2.5, 또는 3 μM), 및 SB590885(0.1- 5 μM, 바람직하게는 0.2-1 μM, 예를 들어 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8 μM);로부터 선택된다. 단계 IV 유도의 경우, 단계 IV 조건의 첫 4일 동안 바람직하게는 VPA, 트라닐시프로민, DZnep 및 EPZ004777이 포함되어야 한다. 약 6~8일 처리 후 1차 hCiPSC 콜로니가 나타난다. HEF의 경우 첫 4일 동안 바람직하게는 VPA가 포함되어야 한다. 6~8일 처리 후 1차 hCiPSC 콜로니가 나타난다.
바람직한 구현예에서 특정 인자들이 개시되어 있지만, 조성물 아래에 개시된 바와 같이, 이들 인자는 동일한 생물학적 활성을 제공하는 공지된 저분자와 쉽게 상호교환될 수 있습니다. 따라서, 유사한 생물학적 활성을 갖는 대체 화합물은 특정 화합물에 대해 본원에 제공된 특정 농도에 의해 제공되는 생물학적 활성에 상응하는 양으로 사용될 수 있다. 따라서, 예를 들어 CHIR99021은 바람직한 GSK 억제제이며, 그 농도 범위는 본원에서 제공된다. 그러나, 적어도 CHIR99021에 대해 공개된 농도에서 보이는 수준까지 동일한 생물학적 활성(즉, GSK를 억제하는 능력)을 가진 저분자로 대체할 수 있다. 본원에서 예시된 농도에 기초하여, 속(genus)(공개된 생물학적 활성) 내의 종(species)(특정 화합물 나열)에 대한 대체 인자의 동등한 양을 결정하는 것은 당업자의 능력 범위 내에 있다.
B. hCiPSC의 단리
ES 세포의 미분화된 상태와 다능성을 유지시켜 줄 수 있거나 또는 분화를 유도시킬 수 있는 배지는 당해 분야에 공지되어 있다. 단리되고 유도된 다능성 줄기 세포의 분화 및 증식 능력은 ES 세포에 광범위하게 적용되어 온 확증 수단을 이용함으로써 통상의 기술자에 의해 용이하게 확증될 수 있다.
hCiPSC의 실질적으로 정제된 집단은, 예를 들어 배양 공급원으로부터 추출함으로써 (예를 들어 밀도 구배 원심 분리 및/또는 유동 세포계수법을 통하여) 수득될 수 있다. 순도는 적당한 모든 방법에 의해 측정할 수 있다. 다능성 세포는, 예를 들어 유동 세포계수법(예를 들어 FACS 분석)에 의해 99% 내지 100%로 정제될 수 있다. 인간 유도된 다능성 줄기 세포는, 예를 들어 이러한 유도된 다능성 줄기 세포 상에서 특정 마커(예를 들어 TRA-1-81, TRA-1-60 또는 마커 조합물)와 결합하는 분자(예를 들어 항체, 항체 유도체, 리간드 또는 Fc-펩티드 융합 분자)를 활용함으로써, 상기 분자와 결합하는 세포를 양성적으로 선택(즉, 양성 선택)함으로써 단리할 수 있다. 양성 선택 방법의 기타 예는 목적하는 세포 유형과 원하지 않는 세포 유형의 혼합 집단에서 목적하는 세포 유형의 성장을 우선적으로 증진시키는 방법을 포함한다. 또 다른 한편으론, 목적하는 세포 유형 상에는 존재하지 않지만, 원하지 않는 세포 유형 상에는 존재하는 마커와 결합하는 분자를 사용함으로써, 이러한 마커를 함유하는 원하지 않는 세포를 목적 세포로부터 제거할 수 있다(즉, 음성 선택). 기타 음성 선택 방법은 목적하는 세포 유형과 원하지 않는 세포 유형의 혼합 집단에서 원하지 않는 세포 유형의 성장을 우선적으로 사멸 또는 억제시키는 것을 포함한다. 따라서, 음성 선택, 양성 선택 또는 그의 조합을 이용함으로써, 강화된 줄기 세포 집단을 만들 수 있다.
분리를 위한 과정은 항체-코팅된 자기 비드를 이용하는 자기 분리, 친화 크로마토그래피, 모노클로날 항체와 연결된 세포독성제, 또는 모노클로날 항체와 연계해서 사용되는 상기 작용제, 예를 들어 보체 및 세포독소, 및 고체 매트릭스(예를 들어 판)에 부착된 항체로의 "패닝", 또는 기타 편리한 기술을 포함할 수 있다. 정확한 분리를 제공하는 기술은 다양한 수준의 복잡성을 지닐 수 있는, 예를 들어 복수 개의 색 채널, 저각 및 둔한 광산란 검출 채널, 및 임피던스(impedance) 채널을 가질 수 있는 형광 활성화 세포 분류기를 포함한다. 항체는 마커, 예를 들어 직접적인 분리를 허용해 주는 자기 비드; 특정 지지체와 결합된 아비딘 또는 스트렙타비딘을 이용하여 제거될 수 있는 바이오틴; 또는 특별한 세포 유형의 분리를 용이하게 해줄 수 있는 형광 활성화 세포 분류기와 함께 이용될 수 있는 형광색소와 접합될 수 있다. 상기 유도된 다능성 줄기 세포의 생존력에 과도하게 해롭지 않은 어떠한 기술도 이용할 수 있다. 한 구현예에서, 상기 세포는 특정 마커에 대항한 항체와 함께 인큐베이션하고, 이러한 마커에 대해 양성적으로 염색되는 세포를 수동으로 선택하며 계대 배양한다.
강화 방법을 조합하여 사용하여, 정제 또는 강화 시간 또는 효율을 개선시킬 수 있다. 예를 들어 관심 세포 유형을 표시하지 않는 마커를 갖는 세포를 제거하기 위한 강화 단계 후, 상기 세포를 형광 활성화 세포 분류기(FACS) 또는 고 특이성을 지닌 기타 방법론에 의해 추가로 분리 또는 강화시킬 수 있다. 다중-색 분석을 FACS와 함께 이용할 수 있다. 상기 세포는 특별한 항원에 대한 염색 수준 또는 그의 결핍을 기준으로 하여 분리할 수 있다. 형광색소를 이용하여 특별한 항원에 대해 특이적인 항체를 표지시킬 수 있다. 이러한 형광색소는 피코빌리단백질, 예를 들어 피코에리트린 및 알로피코시아닌, 플루오레세인, 및 텍사스 레드를 포함한다.
C. hCiPSC의 배양 및 보존
hCiPSC는 배양 하에 증폭시킬 수 있고, 나중에 검색하고 사용하기 위하여 저장할 수 있다. 일단 세포 배양물 또는 줄기 세포의 혼합 배양물이 확립되면, 세포 집단은 조직 형성을 수반하거나 수반하지 않으면서 세포 증식에 도움에 되는 조건 하에 세포 밀도에 따라서 신선한 배지로의 계대에 의해 시험관 내에서 유사분열 증폭된다. 이러한 배양 방법은, 예를 들어 분화를 유도시키는 특별한 성장 인자(예를 들어 IGF, EGF, FGF, VEGF, 및/또는 기타 성장 인자)가 결여된 배양 배지에서 상기 세포를 계대시키는 것을 포함할 수 있다. 배양된 세포가 충분한 세포 밀도에 도달하게 되면, 이 세포를 신선한 배지에 옮길 수 있다. 일부 줄기 세포 유형은 특유의 접촉 억제-아폽토시스(apoptosis)를 명확하게 보여주지 않거나 또는 이들 유형은 밀도가 최대일 때 휴지기가 된다. 따라서, 적당한 계대 기술(passaging techniques)을 이용하여 접촉 억제와 휴지기를 줄일 수 있다.
세포를 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Doyle et al., (eds.), 1995, Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester]에 기재된 방법에 따라서 저장하기 위하여 냉동보존할 수 있다. 예를 들어 세포를 "냉동 배지", 예를 들어 예를 들어 약 4 내지 10 x 106개 세포/ml의 밀도로, 5 내지 10% 글리세롤을 수반하거나 수반하지 않으면서, 15 내지 20% 태아 소 혈청(FBS) 및 10% 디메틸술폭시드(DMSO)를 함유하는 배양 배지에서 현탁시킬 수 있다. 이러한 세포를 유리 또는 플라스틱 바이알 내에 제공한 다음, 밀봉하고 이를 프로그래밍 가능하거나 수동 냉동고의 냉동 챔버에 옮긴다. 최적의 냉동 속도는 실험적으로 결정할 수 있다. 예를 들어 융합 열을 통하여 1분당 -1℃의 온도 변화를 가져다주는 냉동 프로그램을 이용할 수 있다. 일단 상기 세포를 함유하는 바이알이 -80℃에 도달하게 되면, 이 바이알을 액체 질소 저장 구역에 옮긴다. 냉동 보존된 세포는 수년 동안 저장할 수 있다.
IV. 사용 방법
줄기 세포, 전구 세포, 분화 세포 또는 원하는 세포 유형이나 형태를 생성할 수 있는 가소성 잠재력을 가진 세포를 쉽게 구할 수 있는 공급원을 식별하는 것은 치료, 조직 공학 및 연구를 위해 중요하다. hCiPSC, XEN-유사 세포, 재생 프로그램을 갖는 가소성 상태 세포, 및 상피-유사 세포를 포함하는 본원의 방법에 의해 얻어진 세포는 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 또는 줄기 세포 관련 마커 예를 들어 LIN28A, SALL4, OCT4 또는 NANOG 중 적어도 하나를 발현하는 가소성 잠재력을 가진 세포의 쉽게 이용가능한 공급원이다. 이와 관련하여, 용어 hCiPSC가 구체예로서 사용되지만, 당업자는 본원의 방법에 의해 얻어진 XEN-유사 세포, 재생 프로그램을 갖는 가소성 상태 세포 및 상피-유사 세포가 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포 또는 가소성 잠재력을 갖는 세포의 공급원으로서 유사하게 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 줄기 세포, 전구 세포, 분화된 세포, 또는 가소성 및 재생 잠재력을 가진 세포의 이용가능성은 이식, 조직 공학, 및 혈관 신생, 혈관 형성, 세포 대체 또는 세포 치료의 조절, 특정 질환의 예방에 매우 유용할 것이다. 이러한 줄기 세포 또는 전구 세포는 또한 유전자 치료 요법의 일부로 대상체에 유전자를 도입하는 데 사용될 수 있다. 또한, 단계 I, II, III, IV 중 하나 이상을 포함하는 세포, 예를 들어 상피-유사 세포, 재생 프로그램을 갖는 가소성 상태 세포 및/또는 XEN-유사 세포를 포함하는, 본원의 방법에 의해 얻어진 세포는 직접 원하는 세포 유형으로 유도하여 대상체에 이식 및 전달할 수 있으며, 즉 모든 경우에 분화 세포를 얻기 위해 먼저 hCiPSC를 얻을 필요는 없다.
A. 분화된 체세포를 제공함(재분화된 세포)
일단 확립되면, 줄기 세포 배양물을 사용하여 자손 세포, 예를 들어 신규 조직을 생산할 수 있는 섬유아세포를 생성시킬 수 있다. 상기 hCiPSC는 3가지 배엽 중 어느 것으로부터의 세포, 예를 들어 피부 및 유모 세포(상피 세포 포함), 각질 세포, 멜라닌 세포, 지방 세포, 뼈, 근육 및 결합 조직을 형성하는 세포, 예를 들어 근세포, 연골 세포, 골세포, 폐포 세포, 실질 세포, 예를 들어 간세포, 신장 세포, 부신 세포 및 섬 세포, 혈액 세포, 망막 세포 (및 감각 인식에 관여하는 기타 세포, 예를 들어 귀에 유모 세포를 형성하거나 혀 위에 미뢰(taste buds)를 형성하는 세포), 및 신경을 포함한 신경 조직으로 분화되도록 유도시킬 수 있다.
한 구현예에서, hCiPSC는 세포를 "외배엽성 분화성" 배지에 노출시킴으로써 외배엽 기원의 세포로 분화되도록 유도시킨다. 또 다른 구현예에서, hCiPSC는 세포를 "중배엽성 분화성 배지"에 노출시킴으로써 중배엽 기원의 세포로 분화되도록 유도시킨다. 또한 또 다른 구현예에서, hCiPSC는 세포를 "내배엽성 배지"에 노출시킴으로써 내배엽 기원의 세포로 분화되도록 유도시킨다. "내배엽성", "중배엽성" 및 "외배엽성" 배지의 구성분은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 공지된 세포 표면 마커를 사용하여, 세포들이 상응하는 세포 배양 배지 계통의 세포로 실제로 분화된다는 사실을 검증할 수 있다. 상기 3가지 배엽의 분화를 확증하기 위하여 가장 일반적으로 인정되는 마커는 내배엽 세포의 경우에는 알파 태아 단백질의 발현이고, 중배엽 세포의 경우에는 알파 평활근 액틴의 발현이며, 외배엽 세포의 경우에는 베타-III 투불린의 발현인데, 이들 모두는 상기 조직의 발생에 있어서 매우 초기에 정상적으로 발현된다.
줄기 세포가 섬유아세포 또는 기타 세포 유형으로 분화된 다음, 그로부터 조직이 생성되는 것은 특이적 외인성 성장 인자에 의해 촉발될 수 있거나 또는 줄기 세포 배양물의 배양 조건(예를 들어 밀도)을 변화시킴으로써 촉발될 수 있다. 세포가 목적하는 세포 유형의 특정 세포로 분화되는 것을 유도하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들어 hCiPSC는 특정 물질(예를 들어 성장 인자, 효소, 호르몬, 또는 기타 신호 전달 분자)을 세포의 환경에 부가함으로써 분화되도록 유도시킬 수 있다. 분화를 유도시키기 위해 사용될 수 있는 인자의 예는 에리트로포이에틴, 콜로니 자극 인자(colony stimulating factors), 예를 들어 GM-CSF, G-CSF, 또는 M-CSF, 인터루킨, 예를 들어 IL-1, -2, -3, -4, -5, -6, -7, -8, 백혈병 억제성 인자(LIF), 또는 스틸(Steel) 인자(Stl), 조직 커미티드 세포(tissue committed cells)와의 공배양물(coculture), 또는 줄기 세포가 특별한 계통으로 커미티드되도록 유도시키는 기타 계통 커미티드 세포 유형(lineage committed cells types )을 포함한다.
분화된 세포는 배양 하에 증폭될 수 있고, 나중에 검색하고 사용하기 위하여 저장할 수 있다.
XEN-유사 세포, 가소성 상태 세포 및 상피-유사 세포는 특정 외인성 성장 인자, 저분자, 과발현 유전자 또는 줄기 세포 배양 조건(예를 들어 밀도)의 변경에 의해 유발될 수 있는 다른 세포 유형으로 쉽게 생성할 수 있는 공급원이다. XEN-유사 세포, 가소성 상태 세포 및 상피-유사 세포로부터 유도된 세포는 혈액학적 기원의 체세포, 피부 유래 세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중간엽 기원의 세포, 실질 세포(parenchymal cells)(예를 들어 간세포, β 세포), 신경 세포 및 결합 조직 세포(connective tissue cells)를 포함하지만 이로써 제한되지 않는 다양한 세포 유형일 수 있다.
B. 세포 요법
유도된 다능성 줄기 세포의 치료적 용도는 이러한 유도된 다능성 줄기 세포, 줄기 세포 집단 또는 그의 자손을 개개인에게 이식하여, 암, 상처, 신생물, 손상, 바이러스성 감염, 당뇨병 등으로부터 비롯된 질환 및 장애를 포함한 각종 병리학적 상태를 치료하는 것을 포함한다. 치료는 현재 당해 분야에 공지되어 있거나 또는 앞으로 개발될 모든 방법에 따라서, 신규 조직을 생성시키기 위해 상기 세포를 사용하는 것과, 이로써 생성된 조직을 사용하는 것을 수반할 수 있다. 상기 세포는 조직 손상 부위에 이식하거나, 주사하거나 또는 그렇지 않으면 직접 투여하여, 이들이 생체 내에서 신규 조직을 생성하도록 할 수 있다. 한 구현예에서, 투여는 유전적으로 변형된 hCiPSC 또는 그의 자손을 투여하는 것을 포함한다.
바람직한 구현예에서, hCiPSC는 자가 세포로부터 수득되는데, 즉 공여체 세포가 자가이다. 그러나, 세포를 이종 세포로부터 수득할 수 있다. 한 구현예에서, 공여체 세포는 수용자와 유전적으로 관계된 공여체로부터 수득한다. 또 다른 구현예에서, 공여체 세포는 수용자와 유전적으로 관계가 없는 공여체로부터 수득한다.
인간 hCiPSC가 수용자 대상체와 비교해서 이종(비-자가/동종) 공급원으로부터 유래되는 경우에는, 이와 동시에 면역저해 요법을 전형적으로 투여하는데, 예를 들어 면역저해제 사이클로스포린 또는 FK506을 투여한다. 그러나, 인간 유도된 다능성 줄기 세포의 미성숙한 상태로 인해, 상기 면역저해 요법은 요구되지 않을 수 있다. 따라서, 한 구현예에서, 인간 유도된 다능성 줄기 세포는 면역조정(예를 들어 면역저해) 요법의 부재 하에 수용자에게 투여될 수 있다. 또 다른 한편으론, 세포를 막 내에 피막화하여, 유체의 교환은 허용하지만, 세포/세포 접촉은 방지시킬 수 있다. 미소피막화된 세포를 이식하는 것은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어 문헌 [Balladur et al., Surgery, 117:189-94, 1995]; 및 [Dixit et al., Cell Transplantation 1:275-79 (1992)]).
(i) 당뇨병
진성 당뇨병(DM)은 대상체의 췌장이 충분한 인슐린을 생성하지 못하기 때문에 또는 세포가 생성되는 인슐린에 반응하지 못하기 때문에, 이러한 대상체의 혈당치가 높은 일군의 대사 질환이다. 인슐린 요법에 대한 장래성 있는 대체 요법은 인슐린을 필요로 하는 환자에게 섬 세포를 제공하는 것이다. 문헌 [Shapiro et al., N Engl J Med ., 343(4):230-8 (2000)]에서는 베타 세포/섬을 이식하는 것이 당뇨병 환자에 대한 치료를 제공한다고 명확하게 보여주었다. 수많은 인슐린 유형이 시판되고 있긴 하지만, 이들 제제는 주사제로서 제공된다. 인간 유도된 다능성 줄기 세포는 당뇨병을 예방하거나 치료하기 위한 섬 세포의 또 다른 공급원을 제공한다. 예를 들어 유도된 다능성 줄기 세포를 단리하고, 이를 췌장 세포 유형으로 분화시킨 다음, 특정 대상체에게 전달할 수 있다. 또 다른 한편으론, 상기 유도된 다능성 줄기 세포를 대상체의 췌장에 전달하고, 이를 생체 내에서 섬 세포로 분화시킬 수 있다. 따라서, 상기 세포는 당뇨병의 발병을 예방 또는 치료하기 위하여 이식하는 데 유용하다. 췌장 섬 세포의 생존력과 효력에 불리한 영향을 미치지 않으면서 사이토킨 노출 후 염증을 감소시키는 방법이, 예를 들어 미국 특허 번호 8,637,494(Naziruddin, et al.)에 개시되어 있다.
(ii) 신경변성 장애
신경변성 장애는 질환, 유전성 병태 또는 손상, 예를 들어 외상성 또는 허혈성 척수 또는 뇌 손상에 따른 결과로서 뉴런이 쇠약해지는 것과 관련된 병태를 특징으로 한다. 신경변성 병태는 뉴런의 손상 또는 쇠약과 관련된 모든 질환 또는 장애 또는 증상 또는 원인 또는 그의 효과를 포함한다. 신경변성 병태는 알렉산더(Alexander) 병, 알퍼(Alper) 병, 알츠하이머(Alzheimer) 병, 근위축성 측삭 경화증, 모세혈관 확장성 운동 실조, 카나반(Canavan) 병, 코케인(Cockayne) 증후군, 대뇌피질 기저핵 변성증, 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeldt-Jakob) 병, 헌팅턴(Huntington) 병, 케네디(Kennedy) 병, 크라베(Krabbe) 병, 레비소체(Lewy Body) 치매, 마카도-조셉(Machado-Joseph) 병, 다발성 경화증, 파킨슨(Parkinson) 병, 펠리쩨우스-메르쯔바하(Pelizaeus-Merzbacher) 병, 니만-피크(Niemann-Pick) 병, 원발성 측삭 경화증, 레프섬(Refsum) 병, 샌드호프(Sandhoff) 병, 쉴더(Schilder) 병, 스틸-리차드슨-올체브스키(Steele-Richardson-Olszewski) 병, 척수 매독(Tabes Dorsalis) 또는 손상된 뉴런과 연관된 기타 모든 병태를 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다. 기타 신경변성 병태는 외상성 척수 손상, 허혈성 척수 손상, 뇌졸증, 외상성 뇌 손상, 및 유전성 병태를 포함할 수 있거나 또는 이에 의해 유발될 수 있다.
특히, 본원에 개시된 방법은 시험관 내에서 증폭시킨 NSCs, 신경 전구 세포 또는 신경 전구체를, 이를 필요로 하는 대상체 내로 이식하여, 이들 세포가 신경변성 병태를 완화시킬 수 있도록 하는 것을 포함한다. 상기 증폭된 신경 줄기 세포의 이식을 이용하여, 경직, 경축, 발작, 마비 또는 근육의 기타 모든 과잉 활동 증상을 수반하는 각종 형태의 골수증으로 인해 고통받고 있는 대상체에게서 보행 기능을 개선시킬 수 있다. 상이한 신경변성 병태를 치료하기 위하여 신경 세포 및 신경 전구 세포를 증폭 및 이식하기 위한 방법은, 예를 들어 미국 특허 번호 8,236,299(Johe, et. al.)에 개시되어 있다.
(iii) 암 요법
hCiPSC 및 그의 자손의 치료적 용도는 이러한 유도된 다능성 줄기 세포, 줄기 세포 집단 또는 그의 자손을 개개인에게 이식하여, 암과 연관된 증상을 치료 및/또는 완화시키는 것을 포함한다. 예를 들어 한 구현예에서, hCiPSC는 특정 대상체의 세포를 사멸, 감소 또는 손상시킨 화학요법을 진행한 적이 있는 암 환자에게 투여할 수 있다. 암에 대한 전형적인 줄기 세포 이식체에서는, 극히 고 용량의 화학요법을 종종 방사선 요법과 함께 사용하여, 모든 암 세포를 파괴시키고자 한다. 이러한 치료는 또한, 골수 내의 줄기 세포를 사멸시킨다. 치료 직후, 줄기 세포는 파괴된 것을 대체하기 위해 제공된다.
또 다른 구현예에서, hCiPSC는 (탈분화 인자 이외의) 하나 이상의 부가 치료 인자로 형질감염 또는 형질전환시킬 수 있다. 예를 들어 일단 hCiPSC가 단리되면, 상기 세포를 치료용 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로 형질전환시킨 다음, 이를 대상체에게 체내 이식하거나 투여할 수 있거나, 또는 목적하는 세포 유형으로 분화시킨 다음 대상체에게 체내 이식 및 전달할 수 있다. 이러한 조건 하에, 상기 폴리뉴클레오티드는 상기 폴리펩티드 생성물의 전달을 위해 대상체 내에서 발현된다.
(iii) 조직 공학
hCiPSC 및 그의 자손을 사용하여, 당해 분야에 공지된 방법을 이용하여 조직 조작된 구조물을 제조할 수 있다. 조직 조작된 구조물은 손상된 기관 또는 조직의 복구 또는 대체를 위한 보철 장치로서 사용하는 것을 포함한 각종 목적에 이용될 수 있다. 이들은 또한, 구조물의 세포에 의해 분비된 단백질 또는 기타 분자에 대한 생체내 전달 시스템으로서, 또는 일반적으로 약물 전달 시스템으로서 제공될 수 있다. 조직 조작된 구조물은 또한, 조직 기능의 시험관내 모델로서 또는 각종 치료 또는 제약의 효과를 시험하기 위한 모델로서 사용된다. 줄기 세포를 이식하기 위하여 가장 흔히 사용되는 생체 재료 스캐폴드(scaffold)는 문헌 [Willerth, S.M. 및 Sakiyama-Elbert, S.E., Combining stem cells and biomaterial scaffolds for constructing tissues and cell delivery (July 09, 2008), StemBook, ed. The Stem Cell Research Community, StemBook]에서 고찰된다. 조직 공학 기술은 종종, 조직 성장을 지속시키고 증진시키는 데 적당한 배양 기질을 선택하는 것을 포함한다. 일반적으로, 이들 기질은 3차원적이어야 하고, 관심 조직에 대한 목적하는 외형의 스캐폴드를 형성하도록 처리 가능해야 한다.
미국 특허 번호 6,962,814에는 일반적으로, 조직 조작된 구조물 및 조작된 천연 조직을 생성하는 방법이 개시되어 있다. 구체적인 예와 관련해서, 미국 특허 번호 7,914,579(Vacanti 등)는 조직 조작된 인대 및 힘줄이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 5,716,404에는 중합체성 매트릭스와 조합하여 체내 이식된 해리된 근육 세포를 이용하여 유방 조직을 재구성 또는 증대시키기 위한 방법 및 조성물이 개시되어 있다. 미국 특허 번호 8,728,495에는 자가 피부 섬유아세포를 이용하여 연골을 복구하는 것이 개시되어 있다. 미국 공개 출원 번호 20090029322(Duailibi 등)에는 치아 대체물을 제조하는 데 사용하기 위한 치아 조직을 형성하기 위하여 줄기 세포를 사용하는 것이 개시되어 있다. 미국 공개 출원 번호 2006/0019326에는 두개내 동맥류를 치료하기 위한 세포-시드 조직-조작된 중합체가 개시되어 있다. 미국 공개 출원 번호 2007/0059293(Atala)에는 손상된 기관, 예를 들어 신장, 심장, 간, 비장, 췌장, 방광, 수뇨관 및 요도를 대체하기 위해 사용될 수 있는 조직-조작된 구조물 (및 이러한 구조물의 제조 방법)이 개시되어 있다.
(iv) hCiPSC로부터 생성된 세포(자손)
hCiPSC는 3가지 배엽 중 어느 것으로부터의 세포, 예를 들어 피부 및 유모 세포(상피 세포 포함), 각질 세포, 멜라닌 세포, 지방 세포, 뼈, 근육 및 결합 조직을 형성하는 세포, 예를 들어 근세포, 연골 세포, 골세포, 폐포 세포, 실질 세포, 예를 들어 간세포, 신장 세포, 부신 세포 및 섬 세포(예를 들어 알파 세포, 델타 세포, PP 세포 및 베타 세포), 혈액 세포(예를 들어 백혈구, 적혈구, 대식세포 및 림프구), 망막 세포 (및 감각 인식에 관여하는 기타 세포, 예를 들어 귀에 유모 세포를 형성하거나 혀 위에 미뢰를 형성하는 세포), 및 신경을 포함한 신경 조직으로 분화되도록 유도시킬 수 있다.
(iii) 치료 조성물
hCiPSC는 생체내 또는 시험관내/생체외에서의 탈-분화를 증진시키기 위하여 투여하거나, 전달하거나 또는 특정 대상체, 조직 또는 세포와 접촉하기 위해 제제화할 수 있다. 부가 인자, 예를 들어 성장 인자, 분화 또는 탈분화를 유도시키는 기타 인자, 분비 생성물, 면역조절제, 소염제, 퇴행 인자, 신경지배 또는 혈관화를 증진시키거나 또는 림프계 네트워크를 증강시키는 생물학상 활성 화합물, 및 약물을 혼입시킬 수 있다.
상기 유도된 다능성 세포는 hCiPSC 또는 hCiPSC 자손 집단을 단독으로 포함하거나 또는 이를 담체 또는 지지체 구조 상에 또는 구조 내에 포함하는 조성물의 형태로 환자에게 투여할 수 있다. 많은 구현예에서, 담체가 전혀 요구되지 않을 것이다. 상기 세포는 이러한 세포를 필요로 하는 부위 상으로 또는 부위 내로 주사함으로써 투여할 수 있다. 이러한 경우, 상기 세포는 전형적으로, 세포 배양 배지를 제거하기 위해 세척될 것이고, 생리학적 완충액에 현탁될 것이다.
다른 구현예에서, 상기 세포는 지지체 구조물에 제공되거나 또는 이러한 구조물 상으로 또는 구조물 내로 혼입된다. 지지체 구조물은 메쉬, 고체 지지체, 스캐폴드, 튜브, 다공성 구조물 및/또는 하이드로겔일 수 있다. 이러한 고체 지지체 및 그 위에 세포를 배양하는 방법은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명은 바람직한 구현예로서 제시되는 다음의 비제한적 실시예의 견지에서 더욱 이해될 것입니다.
C. 소분자 조성물의 용도
소분자 조성물은 조직 재생, 조직 개조 및 수복, 노화의 회춘 또는 역전, 섬유증의 억제 또는 역전, 시험관 내 및 생체 내에서 인간 체세포에서 가소성 유도에 사용될 수 있다.
예를 들어 재프로그래밍 과정의 단계 I 및 단계 II를 위한 소분자는 생체 내 또는 시험관 내/생체 외에서 탈분화, 재생, 수복 및 회춘을 촉진하기 위해 대상체, 조직 또는 세포와 함께 투여, 전달 또는 접촉하도록 제형화될 수 있다. 추가 인자, 예를 들어 성장 인자, 탈분화 또는 재생을 유도하는 기타 인자, 분비 생성물, 면역조절제, 항염증제, 퇴행 인자, 신경 분포, 혈관화를 촉진하거나 또는 림프망(lymphatic network)을 강화시키는 생물학적 활성 화합물, 약물이 도입될 수 있다.
한 구현예에서, 소분자는 재프로그래밍 과정의 단계 I 또는 단계 II를 위한 소분자의 전부 또는 일부를 포함하는 조성물에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 소분자 조성물은 전신 투여되거나 세포가 소실되거나 조직이 손상된 부위에 주사하거나 이를 통해 투여되어 내생적 수복 능력을 증진시킬 수 있다. 일부 구현예에서, 담체는 필요하지 않을 것이다. 다른 구현예에서, 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 소분자는 또한 예를 들어 마이크로캡슐화를 사용하여 지속 방출을 위해 제형화될 수 있다. 소분자 조성물은 수용자의 생리학적 상태에 따라 원하는 생리학적 효과를 얻기 위해 단일 용량으로, 다중 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 환자에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 재프로그래밍 과정의 단계 I 및 단계 II를 위한 소분자는 원기회복(rejuvenation)을 촉진하는 개체, 조직 또는 세포와 함께 투여, 전달 또는 접촉을 위해 제형화될 수 있다. 이러한 소분자는 연령-관련된 조직학적 변화를 예방하고 조직 내에서 더 어린 상태로 세포를 유지하도록 제형화될 수 있다. 소생 효과는 후성적 생체 시계(epigenetic clock)의 역전, 또는 대사 변화, 또는 노화, 스트레스, 또는 염증 경로의 변화와 같은 전사체 변화에 의해 검출될 수 있다. 소분자 조성물은 수용자의 생리학적 상태에 따라 원하는 생리학적 효과를 얻기 위해 단일 용량으로, 다중 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 환자에게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 재프로그래밍 과정의 단계 I 및 단계 II를 위한 소분자는 대상체, 조직 또는 세포와 함께 투여, 전달 또는 접촉을 위해 제형화되어 섬유증을 억제하거나 수정할 수 있다. 섬유증은 형태학적 변화, 후성유전체(epigenome)의 변화, 대사적 변화, 또는 질환, 스트레스 또는 염증에 의해 유발된 전사체 변화에 의해 검출될 수 있다. 소분자 조성물은 환자에게 수혜자의 생리상태에 따라 섬유증을 억제하거나 수정하기 위해 단일 용량으로, 다중 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 재프로그래밍 과정의 단계 I 및 단계 II를 위한 소분자는 인간 체세포에서 세포 가소성을 유도하기 위해 대상체, 조직 또는 세포와 함께 투여, 전달 또는 접촉하도록 제형화될 수 있다. 세포 가소성은 후성유전체의 변화, 대사 변화 또는 전사체 변화에 의해 검출될 수 있다. 소분자 조성물은 세포 가소성을 유도하기 위하여 단일 용량으로, 다중 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 시험관 내 또는 생체 내에서 사용할 수 있다.
실시예
물질 및 방법
HEF의 단리 및 배양
중일우호병원(China-Japan Friendship Hospital)의 임상연구윤리위원회(윤리승인번호 2009-50)에 의한 서면 동의 및 승인을 받아 얻어진 배아 진피 조직(embryonic dermis tissues)으로부터 인간 배아 섬유모세포(Human embryonic fibroblasts; HEF)을 단리하였다. 본 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행하였다. 간략하게, 조직(0.5-1 cm2)을 2% 페니실린-스트렙토마이신(Gibco, 15140-122)을 함유하는 PBS(CORNING, 05418005)로 2회 세척하고, 가위로 1-2 mm2로 자르고(minced), 5-10 ml의 2 mg/ml 콜라게나제 IV 용액(Gibco, 1963347)으로 100-mm 접시에서 37℃에서 1시간 동안 해리(dissociate)시켰다. 다음으로, 10-20 ml의 15% FBS-DMEM 배지를 추가하고 해리를 위해 세포를 위아래로 여러 번 피펫팅하였다. 현탁액을 50 ml 튜브에 수거하고 1-2 분 동안 진탕시켜서 세포를 방출시켰다. 이어서 현탁액을 400 g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액(supernatant)을 제거한 후 15% FBS-DMEM 배지에서 세포를 재현탁시켰다. 일반적으로, 0.5-1 cm2의 진피로부터 1-3 x 106 세포를 얻을 수 있으며 100-mm 접시(P0)에 플레이팅한 후 37℃에서 5% CO2로 인큐베이션한다. 다음날, 신선한 15% FBS-DMEM 배지로 교체하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 1차 HEF는 보통 3~4일 내에 컨플런트(confluent)되어 재프로그래밍을 위해 계대할 준비가 되었다. 0.25% 트립신-EDTA(Gibco, 25200-056)를 사용하여 1차 HEF를 해리시켰다. CiPSC 유도를 위해, HEF를 15% FBS-DMEM 배지로 12-웰 플레이트의 웰 당 1.5 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 배양 및 증폭을 위해 HEF를 100-mm 접시 당 1.5 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 7개의 계대 내에서 CiPS 세포의 유도를 위해 1차 HEF를 사용하는 것이 권고된다. 15% FBS-DMEM 배지: 15% 태아소혈청(Fetal Bovine Serum; FBS)(Vistech, VIS93526487), 1% GlutaMAX™(Gibco, 35050-061), 1% MEM 비필수 아미노산 용액(NEAA)(Gibco, 11140050), 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.055 mM 2-메르캅토에탄올(Gibco, 21985-023)로 보충된 고 글루코스 DMEM(Gibco, 21985-023).
hADSC의 단리 및 배양
성체 인간 지방 유래 중간엽 간질 세포(adult human adipose derived mesenchymal stromal cells; hADSC)는 뻬이징대학의 윤리위원회(IRB 00001052-19070)에 의한 서면 동의 및 승인을 받아 얻어진 성체 지방 조직으로부터 단리되었다. 본 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행하였다. 간략하게, 조직(2-4 cm2)을 2% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 가위로 1-2 mm2로 자르고, 5-10 ml의 2 mg/ml 콜라게나제 IV 용액으로 100-mm 접시에서 37℃에서 1시간 동안 해리시켰다. 다음으로, 10-20 ml의 15% FBS-DMEM 배지를 추가하고 해리를 위해 세포를 위아래로 여러 번 피펫팅하였다. 현탁액을 2개의 50 ml 튜브에 수거하고 15% FBS-DMEM 배지로 각각 30-40 ml로 희석한 다음, 1-2 분 동안 진탕시켜서 세포를 방출시켰다. 이어서 현탁액을 400 g에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한 후 중간엽 줄기 세포 성장 배지 2(Mesenchymal Stem Cell Growth Medium 2)(Promo Cell, C-28009)에서 세포를 재현탁시켰다. 일반적으로, 2-4 cm2의 지방 조직으로부터 1-3 x 106 세포를 얻을 수 있으며 100-mm 접시(P0)에 플레이팅한 후 37℃에서 5% CO2로 인큐베이션하였다. 다음날, 신선한 중간엽 줄기 세포 성장 배지 2로 교체하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 1차 hADSC는 보통 3~5일 내에 컨플런트되어 재프로그래밍을 위해 계대할 준비가 되었다. 0.25% 트립신-EDTA를 사용하여 1차 HEF를 해리시켰다. CiPSC 유도를 위해, hADSC를 15% FBS-DMEM 배지로 12-웰 플레이트의 웰 당 1.5 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 배양 및 증폭을 위해 hADSC를 100-mm 접시 당 1.5 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 4개의 계대 내에서 CiPS 세포의 유도를 위해 1차 hADSC를 사용하는 것이 권고된다.
hASF의 단리 및 배양
인간 성체 피부 섬유아세포(human adult skin fibroblasts; hASF)는 뻬이징대학의 윤리위원회(IRB 00001052-19070)에 의한 서면 동의 및 승인을 받아 얻어진 성체 진피 조직으로부터 단리되었다. 본 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행하였다. 간략하게, 조직(0.5-1 cm2)을 2% 페니실린-스트렙토마이신을 함유하는 PBS로 2회 세척하고, 가위로 0.5-1 mm2의 조각으로 잘랐다. 이어서 조각들을 100-mm 세포 배양 접시에 넣고 각 조직에 15% FBS-DMEM 배지를 한 방울씩 떨어뜨렸다. 다음으로, 조각들을 37℃에서 5% CO2로 4-12 시간 동안 인큐베이션하였다(그 조작들이 마르지 않게 함). 3-5 ml의 중간엽 줄기 세포 성장 배지 2를 접시에 온화하게 넣었다(조각이 접시에 달라붙지 않게 함). 신선한 중간엽 줄기 세포 성장 배지 2를 2-3일 간격으로 교체하였다. 4-7일 이내에 섬유아세포의 증식이 발생한다. 1차 hASF는 보통 10-14일 이내에 컨플런트되어 재프로그래밍을 위해 계대할 준비가 되었다. HASF는 위에서 언급한 HADSC와 동일한 방식으로 재프로그래밍 및 증폭을 위해 계대되었다.
HEF로부터 hCiPSC의 생성
hCiPSC 유도를 위한 배지 준비
단계 I 유도 배지:
10% 녹아웃 혈청 대체제(Knockout Serum Replacement; KSR)(Gibco, 10828028), 10% FBS, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 μg/ml의 L-아스코르브산 2-포스페이트(Vc2P)(Sigma, A8960), 5 mM LiCl(Sigma, L4408), 1 mM 니코틴아미드(NAM)(Sigma, 72340), 2 mg/mL의 AlbuMAXTM-II(Gibco, 11021045) 및 소분자 CHIR999021(10 μM), 616452(10 μM), TTNPB(2 μM), SAG(0.5 μM), ABT-869(1 μM), ROCK 억제제(Rock inhibitor)(Y-27632(2 μM) 또는 Tzv(2 μM))로 보충된 KnockOutTM DMEM(Gibco, 10829018).
재프로그래밍 효율을 강화시키기 위해, Dot1L 억제제(EPZ004777(0.2 μM) 또는 EPZ5676(0.2 μM), 룩솔리티닙(1 μM) 및 DZNep(0.01 μM)을 단계 I 유도 배지에 도입하였다.
단계 II 유도 배지:
10% KSR, 10% FBS, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 50 μg/ml의 Vc2p, 5 mM LiCl, 1 mM NAM, 40 ng/ml의 bFGF(Origene, TP750002) 및 소분자 CHIR99021(10 μM), 616452(10 μM), TTNPB(2 μ), SAG(0.5 μM), ABT-869(1 μM), Y27632(10 μM), JNKIN8(1 μM), 트라닐시프로민(10 μM), 5-아자시티딘(5 μM)로 보충된 KnockOutTM DMEM.
재프로그래밍 효율을 강화시키기 위해, 소분자 UNC0224(1 μM), 룩솔리티닙(1 μM)(셀렉켐(Selleckchem) 카탈로그 번호 S7256) 및 CBP/p300 브로모도메인 억제제 SGC-CBP30(2 μM)을 단계 II 유도 배지에 도입할 수 있다.
단계 III 유도 배지:
1% N2 보충제(Gibco, 17502-048), 2% B27 보충제(Gibco, 17504-044), 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 5 mg/mL AlbuMAXTM-II, 20 ng/mL 재조합 인간 헤레귤린β-1(Recombinant Human Heregulinβ-1; HRG)(PEPROTECH, 100-03) 및 소분자 CHIR99021(1 μM), 616452(10 μM), Y-27632(10 μM), PD0325901(1 μM), 트라닐시프로민(10 μM), VPA(500 μM), DZNep(0.2 μM), EPZ004777(5 μM)로 보충된 KnockoutTM DMEM.
단계 IV 유도 배지:
1% N2 보충제, 2% B27 보충제, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 20 ng/mL HRG 및 소분자 CHIR99021(1 μM), Y-27632(10 μM), PD0325901(1 μM), IWP-2(2 μM), SB590885(0.5 μM)로 보충된 KnockoutTM DMEM. VPA(500 μM)는 첫 4일째에 포함되었다.
HEF로부터 hCiPSC의 유도 과정
HEF 세포의 hCiPSC 유도 과정은 21% O2 및 5% CO2로 37℃를 유지하였다. 유도 배지를 3-4일마다 교체하였다. HEF는 12-웰 플레이트의 웰당 1-1.5 x 104 세포의 밀도로 15% FBS-DMEM 배지로 시딩하였다. 다음날 배지를 단계 I 유도 배지로 교체하였다. 단계 I 유도를 위해, 4-6일에 단층 상피-유사 세포가 출현하고 8-12일에 80%-100% 컨플루언스(confluence)에 근접시킨 다음, 배지를 단계 II 유도 배지로 교체하였다. 단계 II 유도를 위해, 8-12일간 처리 후 다층 콜로니가 나타났고 이들 세포 콜로니는 지속적으로 더 크게 성장할 것이다. 총 16-20일의 단계 II 처리 후 배지를 단계 III 조건으로 변경한다. 단계 III 유도를 위해, 단계 III 배지의 8-12일간 처리가 필요하고 이어서 배지를 단계 IV 조건으로 변경한다. 단계 IV 유도를 위해, VPA(500 μM)를 최초 4일째에 포함시켰다. 1차 hCiPSC 콜로니가 6-8일간 처리 후 출현할 것이다. 단계 IV의 종료 시점에서, OCT4 및 NANOG의 공-발현에 대한 면역형광 염색(immunofluorescent staining)을 이용하여 1차 hCiPSC 콜로니의 생성을 확인하였다. 1차 hCiPSC 콜로니 수는 콤팩트 OCT4 양성 콜로니 수로 계산하였다. 재프로그래밍 효율은 1차 hCiPSC 콜로니 수를 투입 HEF 수로 나눈 값으로 계산하였다.
hADSC 및 hASF로부터 hCiPSC의 생성
hCiPSC 유도를 위한 배지 준비
단계 I 유도 배지:
10% KSR, 10% FBS, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 50 μg/ml의 Vc2p, 5mM LiCl, 1 mM NAM, 2 mg/mL의 AlbuMAXTM-II 및 소분자 CHIR999021(10 μM), 616452(10 μM), TTNPB(2 μM), SAG(0.5 μM), ABT-869(1 μM), ROCK 억제제(Y-27632(2 μM) 또는 Tzv(2 μM)), Dot1L 억제제(EPZ004777(2 μM) 또는 EPZ5676(2 μM)), DZNep(0.02 μM), 룩솔리티닙(1 μM)로 보충된 KnockOutTM DMEM(Gibco, 10829018). 재프로그래밍 효율을 강화시키기 위해, 메닌-MLL(Menin-MLL) 상호작용 억제제 VTP50469를 단계 I 유도 배지에 도입하였다.
몇몇 실험에서, 각 소분자를 제거한 후 재프로그래밍 효율을 시험하기 위해, 지시된 소분자를 칵테일에서 제거하였다. 동일한 경로 또는 표적을 조절하기 위해 사용한 소분자의 농도는 다음과 같이 나타났다: GSK3 억제제(CHIR99021: 3-15 μM; TD114-2: 0.5-2 μM; CHIR98014: 1-3 μM; GSK3βi XV: 0.05-0.2 μM); RA 경로 작용제(TTNPB: 0.5-10 μM; Ch55: 1-5 μM; AM580: 0.1-1 μM); ROCK 억제제(TZV: 2-10 μM; Y27632: 2-15 μM; 파수딜(Fasudil): 2-10 μM; HA1100: 2-10 μM); TGFβ 억제제(A8301: 0.1-5 μM; SB431542: 2-50 μM; LY364947: 0.5 μM; LY21: 0.5 μM; 616452: 10 μM).
단계 II 유도 배지:
10% KSR, 10% FBS, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 50 μg/ml의 Vc2p, 5 mM LiCl, 1 mM NAM, 100 ng/ml의 bFGF(Origene) 및 소분자 CHIR99021(10-12 μM), 616452(10 μM), TTNPB(2 μM), SAG(0.5 μM), ABT-869(1 μM), Y-27632(10 μM), JNKIN8(1 μM), 트라닐시프로민(2 μ), 5-아자시티딘(5 μM), UNC0224(1 μM), 룩솔리티닙(1 μM), BIRB796(2 μM), 도르소모르핀(0.5-1 μM)으로 보충된 KnockOutTM DMEM. 재프로그래밍 효율을 강화시키기 위해, 단계 II 유도 배지에 CBP/p300 브로모도메인 억제제 SGC-CBP30(2 μM) 및 메닌-MLL 상호작용 억제제 VTP50469를 도입하였다.
몇몇 실험에서 각 소분자를 조절한 후 재프로그래밍 효율을 시험하기 위해 지시된 소분자를 칵테일에서 제거하였다. 동일한 경로 또는 표적을 표적으로 하는 소분자의 농도는 다음과 같이 지시되었다: GSK3 억제제(CHIR99021: 3-15 μM; TD114-2: 0.5-2 μM; CHIR98014: 1-3 μM; GSK3βi XV: 0.05-0.2 μM); TGFβ 억제제(A8301: 0.2-5 μM; SB431542: 2-50 μM; 616452: 10 μM); RA 경로 작용제(TTNPB: 0.2-10 μM; Ch55: 1-10 μM; AM580: 0.1-1 μM); ROCK 억제제(Y27632: 2-15 μM; 파수딜: 2-10 μM; HA1100: 2-10 μM; TZV: 2-10 μM); Smoothened 작용제(SAG: 0.2-2 μM; 푸르모르파민: 0.5-2 μM; Hg-Ag1.5: 0.5-1 μM; 인간 shh: 20-200 μM); 히스톤 탈메틸화 억제제(트라닐시프로민: 2-50 μM; GSK2879: 0.02-2 μM; LSD-C76: 0.2-5 μM; S2101: 0.5-5 μM; LSD-2D: 0.2-5 μM; RN-1: 0.2-5 μM); DNMT 억제제(5-azaC: 2-15 μM; 데시타빈(Decitabine): 0.5-10 μM; RG108: 0.5-10 μM); JNK 억제제(JNK-in-8: 0.2-2 μM; JNK-in-5: 0.5-1 μM; JNK-in-7: 0.2-2 μM; JNK-in-12: 0.2-0.5 μM); CBP/p300 브로모도메인 억제제(SGC-CBP30: 0.5-2 μM; I-CBP112: 0.5-5 μM; GNE272: 0.5-5 μM; GNE409:0.5-5 μM); 메닌-MLL 상호작용 억제제(VTP50469: 0.5-2 μM; MI3454: 0.5-2 μM; WDR5-IN-4: 0.5-2 μM).
단계 III 유도 배지:
1% N2 보충제, 2% B27 보충제, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 5 mg/mL의 AlbuMAXTM-II, 20 ng/mL의 HRG 및 소분자 CHIR99021(1 μM), 616452(10 μM), Y-27632(10 μM), PD0325901(1 μM), 트라닐시프로민(10 μM), VPA(500 μM), Dznep(0.2 μM), EPZ004777(5 μM)로 보충된 KnockOutTM DMEM. 몇몇 실험에서 각 소분자를 제거한 후 재프로그래밍 효율을 시험하기 위해 지시된 소분자를 칵테일에서 제거하였다. 동일한 경로 또는 표적을 표적으로 하는 소분자의 농도는 다음과 같이 지시되었다: GSK3 억제제(CHIR99021: 1-10 μM; TD114-2: 0.05-0.5 μM; TD114-3: 0.2-1 μM; IM12: 0.5-2 μM; CHIR98014: 0.2-1 μM); TGFβ 억제제(616452: 2-15 μM; A8301: 0.5-5 μM; SB431542: 2-50 μM); ROCK 억제제(Y27632: 2-100 μM; TZV: 2-10 μM; 파수딜: 5-10 μM; 블렙비스타틴(Blebbistatin): 2-10 μM); 히스톤 탈메틸화 억제제(트라닐시프로민: 10-50 μM; RN-1: 1-2 μM; GSK2879: 0.5-1 μM; S2101: 0.5-2 μM; LSD-C76: 0.5-2 μM); HDAC 억제제(VPA: 200-1500 μM; MS275: 0.2-2 μM; LMK235: 0.05-0.5 μM; 부티레이트 나트륨: 200-1000 μM); Dolt1L 억제제(EPZ004777: 5 μM; EPZ5676: 1-5 μM; SGC0946: 1-5 μM); S-아데노실-L 호모시스테인 가수분해효소 억제제(DZNep: 0.1-0.5 μM; Adox: 10-70 μM); ERK 억제제(PD0325901: 0.02-5 μM); SETD8 억제제(UNC0379: 0.1-2 μM).
단계 IV 유도 배지:
1% N2 보충제, 2% B27 보충제, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 20 ng/mL HRG 및 소분자 CHIR99021(1 μM), Y-27632(10 μM), PD0325901(1 μM), IWP-2(2 μM), SB590885(0.5 μM)로 보충된 KnockOutTM DMEM. VPA(500 μM), 트라닐시프로민(10 μM), DZNep(0.05 μM), 및 EPZ004777(5 μM)이 첫 4일째에 포함되었다. 몇몇 실험에서 각 소분자를 제거한 후 재프로그래밍 효율을 시험하기 위해 지시된 소분자를 칵테일에서 제거하였다. 동일한 경로 또는 표적을 표적으로 하는 소분자의 농도는 다음과 같이 지시되었다: GSK3 억제제(CHIR99021: 0-10 μM); ERK 억제제(PD0325901: 0.02-5 μM; AZD8330: 0.2-5 μM; TAK733: 0.2-5 μM; 트라미티닙: 0.2-5 μM; U0126: 0.2-5 μM); ROCK 억제제(Y27632: 2-12 μM; TZV: 0.2-0.5 μM; 파수딜: 2-10 μM; HA-1100: 4-20 μM; 블렙비스타틴: 2-10 μM); WNT 경로 억제제(IWP2: 0.5-4 μM; IWR1: 1-10 μM; XAV939: 1-10 μM); BRAF 억제제(SB590885: 0.1-5 μM; 소라피닙(Sorafinib): 0.1-0.5 μM; GDC0879: 0.1-5 μM); HDAC 억제제(VPA: 200-1000 μM; MS275: 0.2-1 μM; 부티레이트 나트륨: 100-500 μM).
hADSC 및 hASF로부터 hCiPSC의 유도 과정
단계 I 유도는 hADSC와 hASF의 5% O2 저산소증 유도를 적용하였다. 단계 I 유도 후 세포는 21% O2로 교체되었다. 유도 배지는 3-4일마다 교체하였다. (1) ADSC 및 hASF는 15% FBS DMEM 배지에서 12-웰 플레이트의 웰당 1 x 104 세포의 밀도로 시딩하였다. 다음날 배지를 단계 I 유도 배지로 교체한다. (2) 단계 I 유도를 위해, hADSC로부터 유도된 단층 상피-유사 세포는 4-6일에 출현하고 8-12일에 80%-100% 컨플런스에 접근한다. ASF의 경우 상피-유사 세포는 12-20일에 80%-100% 컨플런스에 접근한다. 이어서 배지를 단계 II 유도 배지로 교체한다. (3) II기 유도를 위해 다층 세포 콜로니가 8-12일간 처리 후 나타나고 이들 세포 콜로니는 지속적으로 더 크게 성장할 것이다. 단계 II 배지를 총 16∼일간 처리한 후 배지를 단계 III 유도 배지로 교체한다. (4) 단계 III 유도를 위해, 단계 III 유도 배지의 10~12일간의 처리가 필요하였다. 그 후 배지를 단계 IV 조건으로 교체한다. (5) 단계 IV 유도를 위해, 단게 IV 유도 배지의 처음 4일에 VPA(500 μM), 트라닐시프로민(10 μM), DZNep(0.05 μM), 및 EPZ004777(5 μM)을 포함시켰다. 1차 hCiPSC 콜로니는 6-8일 처리 후 출현할 것이다. 이어서 배지를 단계 IV 조건으로 교체한다. (5) 단계 IV 유도를 위해, 단계 IV 유도 배지의 처음 4일에 VPA(500 μM), 트라닐시프로민(10 μM), DZNep(0.05 μM), 및 EPZ004777(5 μM)을 포함시켰다. 1차 hCiPSC 콜로니는 6-8일 처리 후 출현할 것이다.
인간 CiPS 세포주의 유도 및 배양
8-12일간 단계 IV 조건 처리 후, 세포를 Accutase(Millipore, SCR005)로 해리시키고 변형된 단계 IV 조건에서 미토신 C(Sigma-Aldrich, M4287)-처리된 MEF(2-3 x 104/cm2)의 피더층에서 1:3 내지 1:12의 비율로 반복하였다: 1% N2 보충제, 2% B27 보충제, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.055 mM 2-메르캅토에탄올, 2 mg/mL의 AlbuMAXTM-II 및 소분자 CHIR99021(1 μM), PD0325901(0.5 μM), IWP-2(2 μM), Y-27632(10 μM), HRG(20 ng/mL), 및 bFGF(100 ng/mL, Origene)로 보충된 녹아웃(Knockout) DMEM.세포를 37℃에서 21% O2, 5% CO2 하에서 인큐베이션하고 배지를 매일 교체하였다. 3-7일 후, 콤팩트 CiPS 세포 콜로니가 나타났다. 10-12일 후, 이들 콜로니를 작은 클램프로 수동으로 집어서 기계적으로 해리하여 Y-27632(10 μM)로 보충된 mTeSRTM 플러스 배지(STEMCELL, 05826)에서 마트리겔(Matrigel)(Corning, 354248) 코팅된 플레이트로 옮겼다. 사용된 배지를 Y-27632가 없는 신선한 mTeSRTM 플러스 배지로 교체하기 전 24시간 동안 콜로니가 배양 플레이트에 부착하게 둔다.
37℃에서 21% O2, 5% CO2 하에서 인간 CiPS 세포 및 hES 세포(H1 및 H9)를 mTeSRTM 플러스 배지에 유지시켰다. 매일 배지를 교체하였다. 세포가 ~85% 컨플런스에 도달하면 세포가 계대되었다. 이는 전형적으로 계대 후 3-7일에 대략 1:10 내지 1:20의 분할비로 발생했다. 계대를 위해 ReLeSRTM(STEMCELL, 05872)으로 인간 CiPS 세포를 해리하고 해리된 세포 응집체를 Y-27632(10 μM)로 보충된 mTeSRTM 플러스 배지의 마트리겔 코팅된 플레이트로 옮겼다. 사용된 배지를 Y-27632가 없는 신선한 mTeSRTM 플러스 배지로 교체하기 전 24시간 동안 콜로니가 배양 플레이트에 부착하게 둔다.
면역형광
전술한 바와 같이 면역형광이 수행되었다(Hou 등의 문헌, 2013). 실온에서 30분 동안 4% 파라포름알데히드(DingGuo, AR-0211)로 고정시킨 후, 세포를 투과시키고 0.1% TritonTM X-100(Sigma-Aldrich, T8787) 및 2% 당나귀 혈청(donkey serum)(Jackson Immuno Research, 017-000-121)을 함유하는 PBS로 37℃에서 1시간 동안 차단하였다. 적절한 희석액을 사용한 1차 항체 배양이 동일한 완충액에서 4℃에서 밤새 수행되었다. 다음날, 세포를 PBS로 3회 세척하고 2% 당나귀 혈청을 함유하는 PBS에서 2차 항체로 4℃에서 밤새 프로빙하였다. 이어서 세포를 PBS로 3회 세척하고 DNA를 DAPI 용액(Roche Life Science, 10236276001)으로 염색하였다. 항체의 상세 내역은 하기 표 1에 제공되어 있다.
항체 정보
항체 제조사 카탈로그 번호(Cat. NO.) 희석
LIN28A Invitrogen PA1-096 1:200
SALL4 Abcam ab57571 1:200
FOXA2 Cell Signaling Technology 8186S 1:200
SOX17 R&D AF1924 1:200
EpCAM Invitrogen MA5-12436 1:200
OCT4 BD Biosciences 611203 1:200
OCT4 Invitrogen MA5-14845 1:200
SOX2 R&D AF2018 1:200
NANOG Abcam ab21624 1:200
TRA-1-60 Millipore MAB4360 1:100
TRA-1-81 Millipore MAB4381 1:100
SSEA-4 Santa Cruz sc-21704 1:100
GATA4 R&D AF2606 1:400
T R&D AF2085 1:200
SOX1 R&D AF3369 1:200
TUJ1 BioLegend 801201 1:200
7-AAD BD Pharmingen 559925 1:1500
항-인간 CD144 BioLegend 348516 1:1500
항-인간 CD31 BioLegend 303106 1:1500
항-인간 CD34 BioLegend 343504 1:1500
항-인간 CD5 BioLegend 300608 1:1500
항-인간 CD4 BioLegend 300514 1:1500
CD8b 모노클론성 항체 Invitrogen SIDI8BEE 1:1500
집단 배가 시간(population doubling time)
성장률은 시간의 함수로서 혈구계(hemocytometer)를 이용하여 세포수를 계수하여 결정하였다. 성장 지수 단계의 데이터를 사용하였다. 배가 시간은 수학식 에 따라 계산하였다.
테라토마 형성
테라토마 형성을 위해, ReLeSRTM으로 hCiPS 세포를 수확하였다. 대략 2 x 106 세포를 마트리겔에 재현탁시킨 후 면역결핍 NPG 마우스에 피하 주사하였다. 테라토마를 일반적으로 6-7주간 얻었고 파라핀에 임베딩하였다. 파라핀 절편을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. 모든 동물실험은 뻬이징대학교 동물보호지침에 따라 수행하였다.
EB 형성
EB 형성 hCiPSC를 작은 덩어리로 수확하고 mTESRTM 플러스 배지에서 1일 동안 초저 부착 플레이트(ultra-low attachment plates) 상의 구형으로 시딩하여 배아체를 형성하고 20% FBS로 보충된 고 글루코스 DMEM에서 16일 동안 분화시켰다. 이어서 EB를 수거하고 동일한 배지에서 6일 동안 마트리겔 코팅된 플레이트 상에서 플레이팅하고, 고정시키고 면역염색으로 검출하였다.
지시된 분화(Directed differentiation)
hCiPSC의 조혈 및 T 세포 분화
다능성 줄기 세포로부터 중배엽 및 조혈 내피(HE) 세포 분화는 전술한 바와 같은 최적의 조건으로 유도하였다(Wang 등의 문헌, 2012). 간략하게, 다능성 줄기 세포를 분화 1일째에 6웰 플레이트에서 웰당 1 x 104 ~ 5 x 104의 저밀도로 마트리겔-코팅된 플레이트에서 배양하였다. 분화 1일째, 비타민 A가 없는 B27, 20 ng/mL의 액티빈 A, 20 ng/mL의 BMP4(StemImmune LLC, HST-B4-00), 50 μg/mL의 Vc2p, 3-5 μM CHIR99021, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 0.1 mM 1-티오글리세롤(Sigma, M6145)로 보충된 RPMI 1640(Gibco, 61870036)을 2일 동안 투여하였다. 중배엽 유도 2일 후, 분화된 EB를 비타민 A가 없는 B27, 50 μg/mL의 Vc2p, 5 ng/mL의 BMP4, 50 ng/mL의 VEGF(StemImmune LLC, HVG-VF5-00), 50 ng/mL의 bFGF(Origene, TP750002), 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10 μM SB-431542(Selleck, S1067)로 보충된 RPMI 1640으로 배양하였다. 다음으로, 조혈 유도를 위해, 6일째에 배양 배지를 비타민 A가 없는 B27, 50 μg/ml의 Vc2p, 5 ng/ml의 BMP4, 10 ng/ml의 VEGF, 20 ng/ml의 SCF(StemImmune LLC, HHM-SF-1000), 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신으로 보충된 IMDM(Gibco, 12440053)로 교체하였다. 8일째에, 조혈 전구 세포를 수거하여 MS5-DL4 세포에 옮기고 T세포 분화 배지(비타민 A가 포함된 B27, 50 μg/ml의 Vc2p, 1% GlutaMAXTM, 1% NEAA, 1% 페니실린-스트렙토마이신, 0.1mM 1-티오글리세롤, 5ng/ml의 SCF, 5 ng/ml의 FLT3(StemImmune LLC, HHM-FT-1000), 5 ng/ml의 IL7(StemImmune LLC, HCT-I7-1000)로 보충된 IMDM)에서 공-배양하였다. 배지는 2일마다 교체하였다. 표면 마커 검출을 위해, 배양된 세포를 수거하고 지시된 항체를 첨가하였다. FACSVerse(BD)를 이용하여 유세포 분석을 실시하였다. FlowJo-V10(BD)을 이용하여 데이터를 분석하였다.
hCiPSC의 간세포 분화
다능성 줄기 세포로부터의 간세포 분화는 전술한 바와 같이 유도되었다(Chen 20등의 문헌). 간략하게, hCiPSC를, B27 보충제 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 RPMI 1640 배지에서 1일 동안 100 ng/ml의 액티빈 A, 0.5 ng/ml의 BMP4, 10 ng/ml의 bFGF(PEPROTECH, 100-18B) 및 20 ng/ml의 Wnt3a의 조합으로 원시 줄무늬로 유도하고, 100 ng/ml의 액티빈 A, 0.5 ng/ml의 BMP4 및 10 ng/ml의 bFGF의 조합으로 3일 동안 완전한 내배엽 세포(definitive endoderm cells)로 유도하였다. hCiPSC-유래된 내배엽 세포를, B27 보충제 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 RPMI 164O 배지에서 2일 동안 20 ng/ml의 KGF(StemImmune, EST-KF-1000) 및 5 μM SB-431542의 조합으로 전장 내배엽 세포(foregut endoderm cells)로 추가 특정하였다. 이어서, hCiPSC-유래된 전장 내배엽 세포를, B27 보충제 및 1% 페니실린-스트렙토마이신을 갖는 RPMI 164O 배지에서 또 다른 3일 동안 20 ng/ml의 KGF, 20 ng/ml의 BMP4, 10 ng/ml의 BMP2(Stemimmune, HST-B2-1000) 및 10 ng/ml의 bFGF의 조합으로 간세포로 분화하도록 유도하였다. hCiPSC-유래된 hHPC를, hHPC 성숙 배지 - B27 보충제, 25 μM 포르스콜린(Forskolin) 및 10 μM SB-431542를 갖는 Williams' E 배지 - 로 성숙 간세포로 분화하도록 유도하였다. 지질 검출(lipid detection)은 제조업자의 지침에 따라 지질(오일 레드 O) 염색 키트(Sigma, MAK194)를 사용하여 수행하였다. 인간 알부민은 제조업자의 지침에 따라 인간 알부민 ELISA 정량 키트(Bethyl Laboratory, E80-129)를 사용하여 측정하였다. 요소 합성은 제조업자의 지침에 따라 QuantiChrom 요소 분석 키트(BioAssay System, BA_DIUR-500)를 사용하여 측정하였다.
핵형 분석
핵형 분석은 고해상도 G-밴딩(400G-500G) 표준 프로토콜을 이용하여 베이징 지난 병원에서 계약 분석하였고 CytoVision(Leica)에 위탁되었다. 각 분석을 위해 적어도 20개의 중기 이상을 조사하였다. 염색체 수뿐만 아니라 구조염색체 이상 유무를 조사하였다.
짧은 탠덤 반복(Short tandem repeat; STR ) 분석
짧은-탠덤 반복 분석은 Beijing Microread Genetics Co., Ltd.에 위탁되었다. 간략하게, 게놈 DNA는 STR 다중-증폭 키트(Multi-amplification Kit)(MicroreaderTM21 ID 시스템)를 사용한 PCR에 사용되었고, ABI 3730xl DNA 분석기(Applied Biosystems®) 및 GeneMapperID-X 소프트웨어로 분석되었다.
역전사 (RT)-정량적 PCR ( qPCR )
Direct-zol RNA MiniPrep 키트(Zymo Research, R2053)를 사용하여 총 RNA를 분리하였다. 0.5-1μg의 총 RNA로부터 Transcript First-Strand cDNA Synthesis SuperMix(TransGen Biotech, AT311-03)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. qPCR은 CFX ConnectTM 실시간 시스템(Bio-Rad)에서 KAPA SYBR FAST qPCR 키트 마스터 믹스(KAPA 바이오시스템즈, KM4101)를 사용하여 수행하였다. 데이터는 델타-델타 Ct 방법을 사용하여 분석하였다. 표적 유전자의 발현을 정상화하기 위해 GAPDH를 대조군으로 사용하였다. 이 연구에서 qPCR을 위한 프라이머 서열은 표 2에 제시된다.
qRT - PCR에 사용된 프라이머
유전자 정방향 서열 (5' -> 3') 역방향 서열 (5' -> 3')
GAPDH TGACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG (서열번호 1) GCGTCAAAGGTGGAGGAGTGGGT (서열번호 2)
OCT4 CTGGGTTGATCCTCGGACCT (서열번호 3) CCATCGGAGTTGCTCTCCA (서열번호 4)
NANOG GATTTGTGGGCCTGAAGAAA (서열번호 5) CAGATCCATGGAGGAAGGAA (서열번호 6)
SOX2 TTGCGTGAGTGTGGATGGGATTGGTG (서열번호 7) GGGAAATGGGAGGGGTGCAAAAGAGG (서열번호 8)
DNMT3B CGAAGAAGAGCCGGCCTGTACC (서열번호 9) CGGAAGCCCATGCAACGATCTC (서열번호 10)
DPPA4 GCTAACATCTGCCACCCCACCA (서열번호 11) GGATTCTGCGGTGCTGCTGACA (서열번호 12)
UTF1 CGCCGCTACAAGTTCCTTAAA (서열번호 13) GGATCTGCTCGTCGAAGGG (서열번호 14)
ZFP42 AGAAACGGGCAAAGACAAGAC (서열번호 15) GCTGACAGGTTCTATTTCCGC (서열번호 16)
PRDM14 TTGAGGAAGAGAATCAGATCCAG (서열번호 17) CGTTCTGTACGGGGTCACTC (서열번호 18)
ZIC3 CAGGAGCTGTCGTGCAAGT (서열번호 19) AGTAGCAGACGTGGTTGTTCT (서열번호 20)
LIN28A TTTCCCTCATTCCTGAACTGC (서열번호 21) CAGCAAAATCAACCATCAAATAAAC (서열번호 22)
SALL4 AGCACATCAACTCGGAGGAG (서열번호 23) CATTCCCTGGGTGGTTCACTG (서열번호 24)
KRT8 CAGAAGTCCTACAAGGTGTCCA (서열번호 25) CTCTGGTTGACCGTAACTGCG (서열번호 26)
KRT18 TCGCAAATACTGTGGACAATGC (서열번호 27) GCAGTCGTGTGATATTGGTGT (서열번호 28)
KRT19 ACCAAGTTTGAGACGGAACAG (서열번호 29) CCCTCAGCGTACTGATTTCCT (서열번호 30)
SOX17 AGGAAATCCTCAGACTCCTGGGTT (서열번호 31) CCCAAACTGTTCAAGTGGCAGACA (서열번호 32)
APOA1 CCCTGGGATCGAGTGAAGGA (서열번호 33) CTGGGACACATAGTCTCTGCC (서열번호 34)
APOA2 CTGTGCTACTCCTCACCATCT (서열번호 35) CTCTCCACACATGGCTCCTTT (서열번호 36)
FOXA2 CCTACGAACAGGTGATGCACT (서열번호 37) GATTTCTTCTCCCTTGCGTCT (서열번호 38)
GATA6 CTCAGTTCCTACGCTTCGCAT (서열번호 39) GTCGAGGTCAGTGAACAGCA (서열번호 40)
HNF1B GCACCTCTCCCAGCATCTCA (서열번호 41) GTCGGAGGATCTCTCGTTGC (서열번호 42)
MMP1 AAAATTACACGCCAGATTTGCC (서열번호 43) GGTGTGACATTACTCCAGAGTTG (서열번호 44)
PRRX1 AAGTAGCCATGGCGCTGTA (서열번호 45) GAGACGTGACTGCTGTGGAG (서열번호 46)
SNAI2 CTGAGGATCTCTGGTTGTGGT (서열번호 47) CGAACTGGACACACATACAGTG (서열번호 48)
TWIST1 CGGGAGTCCGCAGTCTTA (서열번호 50) GCTTGAGGGTCTGAATCTTG (서열번호 51)
TWIST2 CTTATGTTTGGGGGGAGGTT (서열번호 52) TAGCCAAGCAATCACGGAGA (서열번호 53)
VIM CTTTGTCGTTGGTTAGCTGGT (서열번호 54) GACGCCATCAACACCGAGTT (서열번호 55)
ZEB1 ATCAGCCTAACCATACAACTCT (서열번호 56) CAGGAACAAATTGGCACAA (서열번호 57)
ZEB2 GGGTTCTTTCATTTGTTTTGGT (서열번호 58) ACTCCAAACAGCTTCTCTTCTGA (서열번호 59)
COL1A1 CAGATCACGTCATCGCACAAC (서열번호 60) GAGGGCCAAGACGAAGACATC (서열번호 61)
COL5A1 GCCCGGATGTCGCTTACAG (서열번호 62) AAATGCAGACGCAGGGTACAG (서열번호 63)
COL6A2 GACTCCACCGAGATCGACCA (서열번호 64) CTTGTAGCACTCTCCGTAGGC (서열번호 65)
ALB GCACAGAATCCTTGGTGAACAG (서열번호 66) ATGGAAGGTGAATGTTTCAGCA (서열번호 67)
ASL CAGTGGACCCCATCATGGAGA (서열번호 68) GGCTTTGCTGCCTTGAACATC (서열번호 69)
ASS CTTGGGGCCAAAAAGGTGTTC (서열번호 70) GAGGTAGCGGTCCTCATACAG (서열번호 71)
CPS1 AATGAGGTGGGCTTAAAGCAAG (서열번호 72) AGTTCCACTCCACAGTTCAGA (서열번호 73)
OTC CGGCCCGTGTATTGTCTAGC (서열번호 74) TAGCCAGGGTGTCCAAATCTG (서열번호 75)
CYP3A4 GGTGGTGAATGAAACGCTCAG (서열번호 76) ACCCCTTTGGGAATGAACATC (서열번호 77)
F10 CACTGGTCGCCATCTTTGTA (서열번호 78) AGTGCATGGAAGAGACCTGC (서열번호 79)
FROX1 ACAGGGCTCTGAACATGCAC (서열번호 80) GGCATTGAAAAACTCCCGTA (서열번호 81)
HNF4A ACTACATCAACGACCGCCAGT (서열번호 82) ATCTGCTCGATCATCTGCCAG (서열번호 83)
RNA 염기서열 분석(sequencing)
Direct-zol RNA MiniPrep Kit를 사용하여 총 RNA를 단리하였다. RNA 염기서열 분석 라이브러리(sequencing libraries)는 일루미나(Illumina)용 NEBNext Ultra RNA 라이브러리 준비 키트(NEB England BioLabs, E7775)를 사용하여 구성하였다. 단편화되고 무작위로 프라이밍된 2 x150 bp 페어링엔드 라이브러리(pairedend librari)를 Illumina HiSeq X Ten을 사용하여 염기서열 분석하였다.
단일-세포 RNA 염기서열 분석( scRNA - seq )
단일 세포 3' 라이브러리 및 겔 비드 키트(Gel Bead Kit) V3.1(10x Genomics, 1000075) 및 크롬 단일 세포 B 칩 키트(10x Genomics, 1000074)를 사용하여, 세포 현탁액(Count Star에 의해 결정된 마이크로리터당 300-600개의 살아있는 세포)을 크롬 단일 세포 컨트롤러(10x Genomics)에 로딩하여 제조업자의 프로토콜에 따라 에멀젼 중의 단일 세포 겔 비드를 생성하였다. 간략하게, 화학적 재프로그래밍 과정 전반에 걸쳐 다른 시점에 세포를 수확하고 0.04% BSA를 갖는 1 x PBS에 1 밀리리터당 1 x 106 세포로 재현탁시켰다. 각각의 채널에 약 1 x 104 세포가 첨가되었고, 회수될 표적 세포는 약 5 x 103 세포로 평가되었다. 포획된 세포를 용해시키고 방출된 RNA를 역전사를 통해 개별 GEM에 바코드딩하였다. 역전사는 S1000TM Touch Thermal Cycler(Bio Rad) 상에서 53℃에서 45분 동안 수행한 후 85℃에서 5분 동안 수행하고 4℃에서 유지시켰다. cDNA를 생성한 다음 증폭시키고 Agilent 4200을 사용하여 품질을 평가하였다. 제조업자의 지침에 따라, 단일-세포 RNA-seq 라이브러리는 Single Cell 3' Library 및 Gel Bead Kit V3.1을 사용하여 구성되었다. 라이브러리는 최종적으로 Pair-end 150 bp(PE150) 판독 전략으로 셀당 적어도 1 x 105 판독의 염기서열 분석 깊이(sequencing depth)를 사용하여 염기서열 분석되었다(베이징 소재의 CapitalBio Technology에 의해 수행됨).
염기서열 분석( ATAC - seq )을 이용한 형질전환-접근성 크로마틴 ( transposase -accessible chromatin)에 대한 분석( ATAC - seq )
각 샘플의 대략 5 x 104 세포를 수거하고 차가운 PBS로 1회 세척한 후, 50 μL의 Lysis 완충액(10 mM 트리스-HCl PH7.4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 0.5% NP-40) 중에 재현탁시켰다. 다음 DNA 라이브러리 구성은 일루미나용 TurePrep DNA Library Prep Kit V2(Vazyme, TD501-02)에 의해 준비되었고, 일루미나용 TruePrep Index Kit V2(Vazyme, TD202 96rxn)를 사용하여 PCR로 증폭되었다. 모든 ATAC 라이브러리는 Illumina Novaseq 6000 플랫폼에서 염기서열 분석되었으며 150bp paired-end read가 생성되었다. 생물학적으로 독립적인 실험 n=3.
전-게놈 바이설파이트 염기서열 분석(whole-genome bisulfite sequencing; WGBS)
게놈 DNA는 HEF, hADSC, hCiPSC 및 hESC로부터 분리되었다. 추출된 DNA의 이바이설파이트 변환은 종래 보고된 바와 같이 수행되었다(2018, Zhao 등의 문헌). 회수된 바이설파이트 변환 DNA는 염기서열 분석 라이브러리로 구성되었고 각 라이브러리는 Illumina HiSeq X Ten에 의해 90G 원시 데이터로 염기서열 분석되었다.
바이설파이트 게놈 염기서열 분석
바이설파이트 게놈 염기서열 분석 DNA는 Quick-DNA Miniprep 키트(Zymo Research, D3024)를 이용하여 추출하였다. 단리된 DNA는 바이설파이트 처리에 의해 변형되었고, EZ DNA 메틸화 직접 키트(Methylation-Direct Kit)(Zymo Research, D5020)을 이용하여 정제하였다. 이어서, 바이설파이트-변형된 DNA는 ZymoTaq PreMix 키트(Zymo Research, E2003)를 이용하여 PCR로 증폭하였다. 프라이머는 표 2에 기재된다. 증폭된 단편을 pEASY-T1 단순 클로닝 벡터(Simple Cloning vector)(Transgen, CT111-02)로 클로닝하였다. 각 샘플로부터 무작위로 선발된 10개의 클론을 염기서열 분석하였다.
RNA- seq 분석
품질 관리는 모든 샘플에 대해 FastQC를 이용하여 수행하였다. 원시 RNA-seq 리드는 'ILLUMINACLIP:TruSeq3-PE-2.fa:2:30:7:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36' 파라미터를 갖는 트리모마틱을 이용하여 트리밍하여 검출된 어댑터를 제거하였다. 인간 참조 게놈 hg19에 대한 깨끗한 리드는 '--outSAMtype BAM Unsorted --outSAMstrandField intronMotif --outFilterIntronMotifs RemoveNoncanonical' 파라미터를 갖는 STAR를 이용하여 매핑하였다. 각 유전자에 매핑된 리드의 수는 서브리드 패키지의 프로그램 특징카운트(program featureCounts of Subread package)를 이용하여 계수하였다.
차등 발현된 유전자 분석은 R 패키지 DESeq2를 이용하여 수행하였다. 구체적으로, 최저 40%의 평균 발현량 내의 유전자를 제거하고, 디폴트 파라미터를 가지는 DESeq 함수를 이용하여 전처리를 수행하였다. 그룹 간 유전자 발현 차이는 적응형 t 사전 수축 추정기 아페그름(adaptive t prior shrinkage estimator apeglm)을 갖는 lfcShrink를 이용하여 계산하였다. 차등 발현된 유전자(DEG)는 그룹 간 log2배 변화값 > 2의 유전자로 정의하였고, p값 < 0.05로 조정하였다. DEG에 대한 GO 분석은 R 패키지 클러스터프로파일러(package clusterProfiler)의 함수 enrichGO를 이용하여 수행하였다. 정규화된 카운트는 또한 분산 안정화 변환(variance stabilizing transform)하여 히트맵(heatmap)을 플롯팅하였다. R 패키지 이를바(package irlba)를 이용하여 파라미터 'scale_=T, n=3'으로 원리 성분 분석(PCA)을 수행하였다.
WGBS 분석
바이설파이트-처리된 리드의 정렬을 정확하게 수행하기 위해 Bismark Bisulfite Mapper 파이프라인을 따랐다. 먼저, 인간 참조 게놈 hg19 및 람다 게놈은 스크립트(script) bismark_genome_preparation를 이용하여 충분히 바이설파이트-전환된 정방향(C>T) 및 역방향(정방향 스트랜드의 G>A 전환)으로 변환하였다. 염기서열 리드는 Bismark에 의해 설정된 파라미터를 갖는 Bowtie2를 이용하여 유사하게 변환하여 준비된 게놈에 매핑하였다. 이후 Bismark 매핑 출력에서 게놈 내 동일한 위치에 대한 정렬은 스크립트 deduplicate_bismark를 이용하여 제거하였다. 단일 C 마다의 메틸화 정보는 파라미터 '-p --no_overlap --ignore 5 --ignore_r2 5 --zero_based --CX --buffer_size 50%'를 갖는 스크립트 bismark_methylation_extractor를 이용하여 추출하였다. 이러한 방식으로, 메틸화를 지지하는 리드의 수를 얻었고, 이후 분석에서는 CpG 부위, 비-CpG 부위를 모두 커버하는 리드의 수를 고려하지 않았다.
메틸화의 증거를 보여주는 부위를 확인하기 위해, 각각의 부위에 대해 이항식 검정(binomial test)을 실시하여 메틸화 수가 바이설파이트 비-전환 사건을 넘어선 것인지 여부를 검정하였다. 바이설파이트 비-전환율은 라이브러리 확립 시 스파이크되는 람다 게놈의 총 메틸화 수준으로 정의하였다. 가발견률(false discovery rate; FDR)은 벤자미니 호크버그 법(Benjamini-Hochberg method)을 이용하여 계산하였다. 0.01 초과의 FDR의 부위는 비-전환 부위로 간주되고 메틸화 수준을 0으로 설정되었다. 시험을 통과한 각각의 CpG 부위에 대한 메틸화 수준은 상기 부위를 덮는 리드 중에서 메틸화를 지지하는 리드의 분율(mCpG/CpG)로 정의하였다. 다중 CpG 부위를 갖는 영역의 경우, 메틸화 수준은 가중 메틸화로 정의하였다(총 mCpG/총 CpG). 각 샘플의 평균 CpG 메틸화 수준은 CpG 부위를 덮는 리드 중에서 CpG 메틸화를 지지하는 모든 리드의 분율(모든 mCpG/모든 CpG)로 계산하였다.
서로 다른 샘플의 글로벌 유사성(global similarity)을 비교하기 위해, 게놈을 길이 50000 bp의 빈(bins)으로 커팅하여 각각의 빈의 CpG 메틸화 수준을 계산하였다. 이들 메틸화 수준은 글로벌 CpG 메틸화 특징의 추정치로 사용되었다. 계층적 클러스터링(hierarchical clustering)은 원거리 파라미터로서 1 - 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)를 갖는 함수 클러스트를 사용하여 수행되었다.
ATAC - seq 분석
모든 샘플에 대해 FastQC를 이용하여 품질 관리를 수행하였다. 원시 ATAC-seq 리드는 파라미터 'ILLUMINNACLIP:NexteraPE-PEfa:2:30:7:1:true LEADING:3 TRAILING:3 SLIDINGWINDOW:4:15 MINLEN:36'를 갖는 트릴모매틱(Trimmomatic)을 이용하여 트리밍(trimming)하여 검출된 어댑터를 제거하였다. 이어서, 깨끗한 리드(replicated reads)를 파라미터 '--very-sensitive'를 갖는 Bowtie2를 이용하여 인간 참조 게놈 hg19에 맵핑하였다. 출력된 SAM 파일은 BAM 파일로 변환하여 Samtools를 이용하여 명칭별로 분류하였다. 피카드 툴(Picard tools)의 MarkDuplicates 기능을 이용하여 복제된 리드를 제거하였다. 저품질 매핑된 리드 및 미토콘드리아에 매핑된 리드를 샘툴스(Samtools)를 이용하여 필터링하였다. Tn5 트랜스포사제 점유 피크 호출(transposase occupancy peak calling)을 설명하기 위해 프래그먼트 5bp를 전방으로 조정한 후, MACS2를 사용하여 파라미터 '-g hs --nomodel --shift -100 --extsize 200 --keep-dup all'를 사용하여 각각의 샘플에 대해 수행하였다. 동일 표본의 복제물 중에서 합의 피크(consensus peaks)만을 유지하기 위해, 각각의 쌍의 복제물 사이에서 재생불가능 발견율(Irreproducible Discovery Rate; IDR) 분석을 실시하였고, 적어도 한 번의 검사에서 점수 > 540을 갖는 피크만 보존하였다.
서로 다른 샘플에서 중첩된 피크를 병합하여 R 패키지 ChIPpeakAnno를 이용하여 샘플 특이적 피크 세트(sample specific peak sets)를 정의하였다. 이어서 R package ChIPseeker를 이용하여 각각의 피크를 최근접 유전자에 주석을 달았다. 피크 영역 또는 유전자 프로모터 영역 주변의 ATAC 신호 강도는 Deeptools를 이용하여 정량하였다.
단일-세포 RNA- seq 데이터 전처리 과정
Cellranger v3.1.0을 이용하여 깨끗한 단일 세포 RNA-seq 리드를 인간 참조 게놈 hg19에 매핑하였다. 총 유전자 수 500개 미만 또는 총 UMI 수 1000개 미만인 세포를 제거하였다. 이어서 각 세포의 미토콘드리아 유전자의 UMI 수 비율(M%)을 확인하고 로그 스케일(log scale) 후 M > 중앙값 + 2MAD(중앙값 절대 편차) 또는 M < 중앙값 - 2MAD인 세포를 제거하였다. 파라미터 'use_ranks = T'를 갖는 R package scran의 함수 quickCluster를 이용하여 스피어만 랭크 상관관계(Spearman's rank correlation)를 기반으로 세포 계대된 품질 관리를 대략적으로 클러스터화하였다. 파라미터 'downsample = T, down_prop = 0.1'을 갖는 함수 computeSumFactors 및 logNormCounts를 이용하여 세포 풀에서 크기 인자를 디컨볼루션(deconvolving)하여 다음 스케일 정규화(scaling normalization)를 수행하였다. 정규화된 데이터는 R package Seurat v3을 이용하여 Seurat 객체를 생성하는데 사용하였다. 2000개의 변수 특징 및 스케일된 정규화된 데이터를 이용하여 PCA 차원 축소(dimensionality reduction)를 수행하였다. 이후 처음 20개의 PC를 이용하여 UMAP(Uniform Manifold Approximation and Projection) 차원 축소를 수행하였다. 처음 20개의 PC를 이용하여 SNN(Shared Nearest Neighbor) 그래프를 확립하고, 0.6의 해상도를 갖는 함수 FindClusters를 이용하여 SNN 그래프를 기반으로 세포의 클러스터를 확인하였다. 함수 RunALRA에 의해 귀속 계산된 적응형-임계 저 랭크 근사치(Adaptively-thresholded Low Rank Approximation; ALRA) 귀속된 정규화된 데이터를 이용하여 유전자 발현값을 시각화하였다.
보고된 데이터세트(reported datasets )를 이용한 XEN -유사 세포의 전사체 분석
일부 표준 마커에 의해 샘플에서 XEN 유사 클러스터가 확인되었다. 이들 XEN-유사 세포와 공지의 XEN 세포를 비교하기 위해, 하기 공공 데이터세트가 참고로 사용되었다: 인간 전이식 배아 데이터(E-MTAB-3929, Petropoulos 등의 문헌, 2016). 이러한 데이터세트에 대해 유사한 방식으로 전처리를 수행하여, UMI 카운트 매트릭스(count matrix)를 TPM에 정규화하고 ALRA 귀속(imputation)을 수행하였다. 모든 세포 유형의 피어슨 상관계수(Pearson correlation coefficient)는 선행 논문(Petropoulos 등의 문헌, 2016)에서 정의한 300개의 계통 마커를 이용하여 계산하였다. 유전자 집합 농축 분석(Gene Set Enrichment Analysis; GSEA)은 R 패키지 clusterProfiler을 이용하여 수행하였다.
통계적 분석
통계적 분석을 위해, GraphPad Prism 8을 이용하여 짝을 이루지 않은 2개-테일드 스튜던트 t-시험(two-tailed Student's t-test)을 통해 p값을 계산하였다. p값은 다음과 같다: *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001; ****p < 0.0001. 결과는 도면 범례에 표시된 것과 같이 평균 ± SD로 제시된다.
결과 및 논의
소분자에 의해 인간 섬유아세포를 다능성 줄기 세포로 유도하기 위해, 마우스 다능성을 성공적으로 유도한 이전에 개시된 화학 칵테일(7-10)을 인간 배아 섬유아세포(HEF)에 대해 처음으로 시험하였다. 그러나 이들 HEF는 처리 후 잘 증식하지 못하였고 세포 사멸 표현형(apoptotic phenotypes)을 나타냈으며(도 1b), 마우스 세포에 비해 인간 세포가 외생적 신호에 더 불응한다는 이전의 연구 결과와 일치하였다(15). 외인성 신호를 사용하여 인간 체세포 운명을 변화시키는 도전에 대응하기 위해 선택적 생물학적 활성을 갖는 소분자를 포함하는 전략이 채택되었고, 이들의 조합은 체세포 프로그램을 지우고, 다능성 유전자를 활성화하고, 통합 다능성 네트워크를 확립하는 데 사용되었다. 최종적으로, 인간 체세포를 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는 단계적 접근법이 확립되었다(도 1a).
소분자에 의해 인간 배아 섬유아세포(HEF)를 다능성 줄기 세포로 유도하기 위해, 다양한 소분자 칵테일이 인간 배아 섬유아세포(HEFs)에서 먼저 시험되었다. 그러나 초기 단계에서, 다음과 같은 몇 가지 주요 장애물에 직면하였다: 1) HEF는 섬유아세포 형태를 유지하고 중간엽에서 상피로의 전이를 수행하지 않았다; 2) 또는 HEF는 처리 후에 잘 증식하지 못하였고 세포 사멸 표현형(apoptotic phenotypes)을 나타냈다; 3) 다능성 관련 유전자의 발현을 활성화하는 것도 어렵다. 이러한 현상은 안정한 에피게놈을 보유한 인간 세포(5-6)는 외인성 신호에 불응성이라는 종래 발견과 일치하였다(15). 외인성 신호를 사용하여 인간 체세포 운명을 변화시키는 도전에 대응하기 위해, 화학적 라이브러리 스크리닝과 소분자 조합을 결합하여 체세포 유전자 프로그램을 삭제하고 다능성 유전자를 활성화하며 통합 다능성 네트워크를 확립하는 전략이 채택되었다. 최종적으로, 인간 체세포를 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍하는 단계적 접근법이 확립되었다(도 1a).
원래의 세포 정체성을 파괴하고 체세포 유전자 프로그램을 하향 조절하기 위해, 인간 섬유아세포(도 1c)를 단층 상피-유사 세포(도 1e)로 전환시킬 수 있는 소분자 조합(CHIR99021, 616452, TTNPB)을 확인하는 화학적 스크리닝을 수행하였다. 추가 스크리닝은 Y27632, ABT869 및 SAG를 상기 조합에 첨가하면 상피-유사 세포의 생성이 용이해질 수 있는 것으로 밝혀졌다(단계 I 조건). 상기 처리 후, 섬유아세포 마커 유전자 패널은 하향 조절되었고(도 1f), 상피 세포-관련 유전자, 예를 들어 KRT8, KRT18, 및 KRT19는 상향 조절되었다(도 1g). 또한, 다능성 관련된 유전자 LIN28A는 처리된 세포에서 높게 발현되었다(도 1b 및 도 1g). 그러나 이 단계에서 다른 코어 다능성 유전자는 유의하게 활성화되지 않았다. 단계 I 상피-유사 세포에 관한 후속 스크리닝은 JNKIN8과 결합된 후성적 조절제 5-아자시티딘과 트라닐시프로민을 단계 I 조건(단계 II 조건)에 추가한 후, 다능성-관련된 전사 인자 SALL4가 활성화되어 LIN28A와 공-발현되었음을 확인하였다(도 1b 및 1h). 그러나, 다능성 네트워크를 확립하는 핵심인 마스터 다능성 전사 인자 OCT4는 이들 세포에서 활성화되지 않았다.
OCT4는 후성적 조절제(트라닐시프로민, 발프로산, DZNep, 및 EPZ004777) 및 신호전달 억제제(CHIR99021, 616452, Y27632, 및 PD0325901)(II단계 I 조건)을 포함한 소분자들의 조합에 의해 활성화되었다(도 1b 및 도 1i). 완전 다능성 유전자 네트워크를 더 확립하기 위해, 추가 소분자를 추가하여 인간 다능성 줄기 세포의 유지를 용이하게 하였다. CHIR99021, PD0325901, SB590885, IWP2, 및 Y27632(단계 IV 조건)로 처리한 후, OCT4, SOX2, 및 NANOG를 공-발현한 콤팩트 콜로니를 생성하였다(도 1b). 중요하게, 인간 배아 줄기 세포(hESC) 배양 배지에 옮긴 후, 촘촘하게 패킹된 고핵-대-세포질 비율 세포(high nuclear-to-cytoplasm ratio cells)로 hESC의 전형적인 형태를 나타내었다(도 1d).
이어서, 상기 확립된 OSN 세포주의 유전자 발현 및 후성적 상태가 특성화되었다. 먼저, 20회 초과의 계대를 위해 증폭할 수 있는 세포는 hESC와 유사한 배가 시간으로 증식하였다(도 5a). 또한, 그들은 표면 마커 TRA-1-60, TRA-1-81, 및 SSEA-4를 코어 다능성 전사 인자 OCT4, SOX2, 및 NANOG와 함께 발현시켰다(도 1e, 데이터 미도시).
또한, RT-qPCR 분석은 hESC(도 1j)에서의 그것과 비교할 수 있는 수준에서 다능성 유전자(OCT4(옥타머-결합 전사 인자(octamer-binding transcription factor) 4), SOX2(SRY-박스 전사 인자 2), NANOG(나노그 홈박스), DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제 3 베타), DPPA4(발달 다능성-연관된(developmental　pluripotency-associated) 4), UTF1(미분화된 배아 세포 전사 인자 1), ZFP42(아연 핑거 단백질 42), PRDM14(PR-도메인 함유 단백질 14) 및 ZIC3(Zic 패밀리 멤버 3))의 발현을 나타내었고 RNA-염기서열 분석은 그들 세포의 전사체는 hESC의 전사체와 매우 유사한 것으로 나타났다(도 5b~5c, 데이터 미도시). hCiPSC에서 고도로 발현된 유전자는: NANOG(나노그 홈박스), PRDM14(PR-도메인 함유 단백질 14), LIN28A(단백질 라인-28 동족체 A), OCT4(옥타머-결합 전사 인자 4), DPPA4(발달 다능성-연관된 4), EPCAM(상피 세포 부착 분자), DNMT3B(DNA 메틸트랜스퍼라제 3 베타), ZFP42(아연 핑거 단백질 42), SALL4(스팔트 유사 전사 계수(Spalt Like Transcription Factor) 4), ZIC3(Zic 패밀리 멤버 3), SOX2(SRY-박스 전사 인자 2), TDGF1(테라토카르시노마-유래된 성장 인자(teratocarcinoma-derived growth factor) 1), DNMT3A(DNA 메틸트랜스퍼라제 3 알파), CDH1(Cadherin 1), OTX2(오르토덴티클 홈박스(Orthodenticle Homeobox) 2), ZIC2(Zic 패밀리 멤버 2);를 포함한다. 또한, OCT4 및 NANOG 프로모터는 hESC와 유사한 탈메틸화 패턴 및 개방된 크로마틴 접근성 상태(chromatin accessibility state)를 나타냈다(데이터 미도시). 또한, 초기 계대된 hCiPSC는 여러 독특한 마커, 예를 들어 발달 다능성 관련된 3(DPPA3), 크루펠-유사 인자(Kruppel-Like Factor) 17(KLF17), DNA 메틸트랜스퍼라제 3 유사(DNMT3L)이 있다. 이들 마커는 전통적인 다능성 줄기 세포(hESC 및 hiPSC)에서 발현되지 않았다. 최종적으로, DNA 메틸화 분석을 통해 밝혀진 글로벌 변형은 hESC와 유사한 후성적 상태를 공유하는 것으로 나타났다(데이터 미기재). 아울러, 이러한 결과는 OSN-양성 세포주의 전사체 및 후성적 프로파일이 인간 다능성 줄기 세포와 유사함을 입증한다. 이후, 확립된 OSN-양성 세포주를 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포(hCiPSC)라고 한다.
다음으로, 생체 내 및 시험관 내 hCiPSC의 발달 가능성을 특성화하였다. 먼저, 면역결핍 마우스에 hCiPSC를 주입하고, 생성된 테라토마는 3개의 배엽층(내배엽, 외배엽, 및 중배엽) 모두의 조직을 함유하였다(데이터 미도시). 이러한 결과와 일치하게, hCiPSC는 시험관 내 배아체 및 3개의 배엽층의 마커 유전자(FOXA2(포크헤드박스 단백질(Forkhead box protein) A2, SOX17(SRY-박스 전사 인자 17, GATA4(GATA 결합 단백질 4), SOX1(SRY-박스 전사 인자 1, T-(brachyury) 및 TUJ1(뉴런-특이적 클래스 III 베타-튜불린(Neuron-specific class III beta-tubulin))를 형성하였다(데이터 미도시). 지시된 분화는 hCiPSC 세포주가 조혈 전구 세포(도 6a 및 도 6b)로 분화할 수 있고, T 세포 전구체로 추가 분화할 수 있음(도 6c)을 입증하였다. 또한, hCiPSC의 지시된 분화에 의해 간세포도 생성되었다(도 7a 내지 7d). 아울러, 이러한 결과는 hCiPSC의 안정적인 분화능이 3개의 배엽층 모두의 계통-커미티드 세포(lineage-committed cells)를 생성할 수 있음을 보여준다. hCiPSC의 유전체 완전성을 분석하기 위해, 고해상도 G-밴딩 분석을 이용하여 hCiPSC 라인을 핵형화(karyotype)하였고; 그 데이터는 그들 모두가 정상적인 이배체 핵형을 가졌음을 나타내었다(도 8, 표 3).
hCiPS 세포주의 핵형 분석
인간 CiPS 세포주 계대 핵형
hCiPSCs-0127-3# P5 정상, 46, XX [20/20]
hCiPSCs-0127-4# P7 정상, 46, XX [20/20]
hCiPSCs-1117-#1 P7 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#1 P21 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#1 P41 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#2 P6 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#2 P22 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#2 P42 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#3 P9 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1117-#3 P22 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-0928-1# P6 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-0928-2# P6 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-0118-1# P18 정상, 46, XX [20/20]
hCiPSCs-0118-2# P21 정상, 46, XX [20/20]
hCiPSCs-0809-1# P6 정상, 46, XX [20/20]
hCiPSCs-0809-3# P6 정상, 46, XX [20/20]
hCiPSCs-1217-1# P6 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1217-2# P6 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1003# P10 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1230-4# P6 정상, 46, XY [20/20]
hCiPSCs-1230-11# P5 정상, 46, XY [20/20]
또한 짧은 탠덤 반복 분석을 통해 hCiPSC가 부모 섬유아세포에서 유래하였으며 다른 확립된 hESC 세포주와 구별됨을 확인하였다.
이어서 성체 체세포를 hCiPSC로 화학적으로 재프로그래밍하기 위한 연구를 수행하였다. 추가 스크리닝을 거쳐 재프로그래밍 과정을 촉진하는 촉진자(facilitators)를 확인하였고(도 9a 내지 9c), 성체 지방-유래 중간엽 간질세포(hADSC)로부터 hCiPSC를 생성하였다(도 2a 및 현재 도시된 데이터, 및 도 9d). 또한, 다른 공여체로부터의 인간 성체 피부 진피 섬유아세포(hASF)를 hCiPSC로 재프로그래밍하였다(도 11a). 성체 체세포-유래된 hCiPSC의 전사체 및 후성적 프로파일은 인간 다능성 줄기 세포의 것과 유사하였다(도 2b 내지 2d, 도 10a 내지 10b, 도 11a 내지 11c, 데이터 미도시). 중요하게, 이러한 성체 체세포-유래된 hCiPSC가 생체 내 및 시험관 내 둘 다에서 3개의 배엽층 모두의 세포 유형으로도 분화될 수 있음을 의미한다(도 2e 및 데이터 미도시). 또한, 연구는 8명 초과의 독립적인 공여체의 체세포로부터 hCiPSC를 재생하는 데 100% 성공적이었다(표 4).
[표 4]
상이한 공여체로부터의 hADSCs 및 hASFs의 재프로그래밍 효율의 요약
이러한 결과는 우리의 소분자 접근법이 상이한 유형의 성체 체세포를 다능성 줄기 세포로 재프로그래밍할 수 있음을 입증한다.
인간 세포의 화학적 재프로그래밍을 더욱 구체적으로 이해하기 위해, 유전자 발현을 각 재프로그래밍 단계의 말미에 프로파일링하였다. 먼저, 재프로그래밍 과정 동안 3개의 순차적 핵심 상태(sequential key phases)가 확인되었으며, 초기 단계(단계 I 및 단계 II)에서 가소성 시그니처의 획득 후, 배아외 내배엽(extra-embryonic endoderm)(XEN) 프로그램의 활성화(단계 III), 및 최종적으로, 통합 다능성 네트워크의 확립이 뒤따랐다(도 14). 면역형광 및 단일-세포 RNA 염기서열 분석은 단계 III에서 한 세트의 XEN-관련된 마커를 나타내었다(도 12a 및 도 12b, 데이터 미도시 및 도 13a 내지 13c). 연구는 또한 OCT4-양성 세포는 XEN-유사 콜로니에서 출현하였음을 나타내었고(도 12a 및 데이터 미도시), 이것은 마우스 세포의 화학적 재프로그래밍(8∼10)에서와 마찬가지로 XEN 프로그램이 후기 단계 동안 다능성 획득을 가교하였음을 보여준다. 초기 단계에서는 체세포 유전자 프로그램의 하향조절이 관찰되었고(초기 단계에서의 하향 조절된 유전자: PRRX2, COL6A2(콜라겐 유형 VI 알파 2 사슬), VIM(비멘틴(Vimentin)), COL1A1(콜라겐 유형 I 알파 1 사슬), COL1A2(콜라겐 유형 I 알파 2 사슬), RUNX1(Runt-관련된 전사 인자 1), ZEB1 (아연 핑거 E-Box 결합 홈박스 1), PRRX1(쌍을 이룬 관련된 홈박스 1), MMP3(매트릭스 메탈로펩티다제(Matrix Metallopeptidase) 3)), 이어서 배아 발달 및 재생에 관여하는 일련의 유전자에 대한 상향 조절이 관찰되었으며(초기 단계에서 상향 조절된 유전자: FOXC1(포크헤드 박스(Forkhead Box) C1), KRT19(케라틴(Keratin) 19), KRT8(케라틴　8), KRT18(케라틴 18), CDC7(세포 분열 주기 7), KDR(키나제 삽입 도메인 수용체), VASH2(바소히빈(Vasohibin) 2), MARCKSl1(MARCKS-관련된 단백질), SOX4(MARCKS-관련된 단백질), FGF9(섬유아세포 성장 인자 9), CDKN1C(사이클린-의존성 키나제 억제제 1C), FGFR3(섬유아세포 성장 인자 수용체 3), LIN28A(lin-28 homolog A), BMP4(골 형성 단백질 4), LIFR(백혈병 억제 인자 수용체), CCND2(사이클린 D2), EFNB1(에프린 B1), LEF1(림프구 강화제 결합 인자 1), WT1(윌름스 종양 1), NOTCH1(신경성 유전자 유전자좌 동형 단백질 1), SALL4(스팔트-유사 전사 인자 4), IGFBP3(인슐린-유사 성장 인자-결합 단백질 3), HMGA2(고이동성 그룹 AT-후크 단백질 2), GATA2(GATA-결합 단백질 2), MSX1(msh 홈박스 1), EDN3(엔도텔린(endothelin) 3), TBX3(T-박스 전사 인자 3), TBX2(T-박스 전사 인자 2), HOXA1(홈박스 A1), ZAP70(T 세포 수용체 연관된 단백질 키나제의 제타 사슬 70), HOXA5(홈박스 A5), HOXB9(홈박스 B), HOXA9(홈박스 A), IGF2(인슐린-유사 성장 인자 2), PGF(태반 성장 인자), PTCH1(패치된(patched) 1), PROK1(프로키네틴(prokineticin) 1), CNTFR(섬모 신경 영양 인자 수용체), HEY2(YRPW 모티프를 갖는 hes 관련된 패밀리 bHLH 전사 인자(hes related family bHLH transcription factor with YRPW motif) 2), CDX2(꼬리형 홈박스(caudal type homeobox) 2), DLX5(원위부-없는 홈박스(distal-less homeobox) 5), IGFL4(IGF 유사 패밀리 멤버 4), PRAME(PRAME 핵 수용체 전사 조절제), GLI1(GLI 패밀리 아연 핑거 1; 또한 도 3a 및 도 3e 참조), 이들 모두는 자연 재생에서 나타나는 분화와 유사하였다(17-19). 또한, 증가하는 세포 증식(도 3a 및 내지 도 3e)은 중요한 세포 탈분화 및 재생 특징을 나타내었다(17-19). 특히, 초기 단계에서 활성화된 SALL4 및 LIN28A는 여러 유기체에서 조직 수복 및 재생 개시의 핵심적인 프로모터이다(20-23). 놀랍게도, t 크로마틴(chromatin) 접근성 분석 결과, 단계 II에서 발달 및 다능성을 조절하는 유전자를 포함하는 유전자좌가 개방된 것으로 나타났다(도 3b, 데이터 미도시, 도 3g). 또한, 세포는 단계 II에서 하이포-메틸화 후성적 상태를 획득하였으며(도 3c 및 3d), 배아 발달, 세포 주기 및 줄기 세포 증식과 관련된 유전자의 프로모터 영역은 탈메틸화되었다(도 3e). 아울러, 이러한 결과는 세포가 다능성 상태로 재프로그래밍될 수 있는 권한이 있다면 덜 분화되고 더 가소성 상태의 초기 유도를 시사한다(도 14).
화학적 재프로그래밍에서, 마우스 세포에 비해, 초기 단계에서 인간 체세포 가소성을 자유롭게 하는(liberating) 것은 보다 도전적이며, 이것은 가소성 전위가 감소된 인간 체세포(13~14)가 외부 신호 자극에 특히 내성이 있다는 보고와 일치한다(15). 본 연구에서, 단계적 화학적 재프로그래밍 전략을 이용하여, 인간 체세포 가소성 시그니처를 효과적으로 조절할 수 있었다. 단계적 화학적 재프로그래밍 전략을 이용하여 인간 체세포 가소성 시그니처를 효과적으로 조절하였다. 본 연구에서는, 단계 I에서 CHIR99021, 6161452 또는 TTNPB를 제거한 결과 LIN28A 활성화가 크게 감소하였고, 체세포 프로그램의 하향 조절이 억제되었음을 나타냈다(도 4a 및 도 15a-15c). 단계 II에서는, SALL4의 활성화(도 4c, 및 도 16a-16c) 및 가소성 시그니처의 획득(데이터 미도시, 도 4f, 도 4h, 도 19b 및 도 4c)을 위해 JNKIN8이 필요한 반면, 세포는 하이포-메틸화 상태를 발달시키기 위해 5-아자시티딘을 필요로 하였다(도 4g 및 도 4h). 또한, 크로마틴 접근성 분석에서도 단계 II에서 활성화된 유전자의 개방된 크로마틴 상태에 JNKIN8이 필수적임을 확인하였다(도 4f 및 도 4h). 또한, 이들 인자(CHIR99021, 616452, TTNPB, JNKIN8, 및 5-아자시티딘) 중 어느 하나가 제거된 경우 hCiPSC의 생성이 크게 손상되었으며(도 4b 및 도 4d), 이들은 모두 다능성 네트워크를 위한 세포 가소성 확립에 필수적임을 시사한다. 이러한 연구들은 소분자가 내인성 경로 및 후성적 표적을 충분히 상승적으로 조작하여 인간 체세포를 단단히 락킹된 분화 상태에서 세포-운명 전환을 허용하는 가소성 상태로 자유롭게 할 수 있다는 것을 보여주었다(도 4i). 이러한 발견은 인간 체세포 가소성 전위가 상대적으로 간단한 과정의 외부 자극을 통해 그리고 유전자 조작 없이 시험관 내 및 생체 외에서 재부팅될 수 있는 치료적 재프로그래밍의 새로운 가능성을 제공한다.
요약하면, 본 연구들은 질환 모델링, 약물 발견, 및 재생 의약에서 광범위한 응용성을 가지는 다능성 줄기 세포에 대한 인간 체세포의 개선된 화학적 재프로그래밍을 보고한다(24-25). 또한, 본 결과는 주요 생물학적 활성을 억제/활성화시키는 선택된 소분자 세트를 이용하여 외부 화학적 조작에 의해 인간 체세포의 제한된 후성적 랜드스케프를 언락킹(unlocking)하여 다능성 상태로 전환시킬 수 있음을 보여주었다. 중요하게, 이러한 결과는 외인성 화학적 섭동에 의한 세포 운명 재프로그래밍에 대한 새로운 개념을 밝히는 것으로, 이는 난모세포의 세포질 성분을 필요로 하는 핵 전달 과정(26)과 근본적으로 상이하고, 세포의 내부 전사 인자를 과발현시키는 방식과는 상이한 것이다(27-29). 따라서, 이러한 연구들은 인간 세포 운명을 전환시키고 세포 재프로그래밍을 탐색하기 위한 새로운 플랫폼을 제공한다. 또한, 인간 체세포의 화학적 재프로그래밍은 임상 등급 세포 제조에 가까운 환자 특이적 줄기 세포를 생산하는 새로운 방법(30) 및 재생 의학에서 상이한 용도에 대한 용이한 조정을 가능하게 하는 유연한 소분자 조합의 장점을 제공한다.
참고 문헌:
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Claims (25)

  1. 인간 체세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포(human chemically induced pluripotent cells; hCiPSC)로 재프로그래밍하는 방법으로서,
    하기 4 단계 세포 배양 공정:
    (a) 단계 I은, 상기 세포를 단층 상피-유사 세포(monolayer epithelial-like cells)로 전환하기에 효과적인 시간 동안, 하기 생물학적 활성(biological activities):
    (i) 글리코겐 키나제 억제제(glycogen kinase inhibitor),
    (ii) TGFβ 억제제, 및
    (iii) 레티노산 수용체(retinoic acid receptor; RAR) 작용제(단계 I 조건),
    를 갖는 소분자(small molecules)로 보충된 세포 배양 배지에서 상기 체세포를 배양하는 것을 포함함;
    (b) 단계 II는, 하나 이상의 다능성-관련된 전사 인자를 상향 조절하기에 효과적인 시간 동안, 하기 생물학적 활성:
    (i) 글리코겐 키나제 억제제,
    (ii) TGFβ 억제제,
    (iii) 레티노산 수용체(RAR) 작용제,
    (iv) G 단백질-결합된 수용체 스무든드(Smoothened)에 대한 작용제, 및
    (v) c-Jun 키나제 억제제(단계 II 조건),
    를 갖는 소분자로 보충된 세포 배양 배지에서 상기 단계 I로부터의 세포를 배양하는 것을 포함함;
    (c) 단계 III은, OCT4의 발현에 의해 측정된, 초기 다능성 네트워크(initial pluripotency network)를 확립하기에 효과적인 시간 동안, 하기 생물학적 활성:
    (i) 히스톤 아세틸레이터(acetylator)/탈아세틸화효소(deacetylase) 억제제,
    (ii) TGFβ 억제제,
    (iii) MAPK 억제제, 및
    (iv) SAH 가수분해효소(hydrolase) 억제제(단계 III 조건),
    를 갖는 소분자로 보충된 세포 배양 배지에서 상기 단계 II로부터의 세포를 배양하는 것을 포함함; 및
    (d) 단계 IV는, OCT4, SOX2, 및 NANOG의 공-발현(co-expression)에 의해 측정된, 다능성 네트워크를 충분히 확립하기에 효과적인 시간 동안, 하기 생물학적 활성:
    (i) B-Raf 억제제, 및
    (ii) MAPK 억제제(단계 IV 조건),
    를 갖는 소분자로 보충된 세포 배양 배지에서 상기 단계 III으로부터의 세포를 배양하는 것을 포함함;
    으로 인간 체세포를 배양하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 단계 I 조건은, 하기 생물학적 활성:
    (i) Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase; ROCK)의 선택적 억제제,
    (ii) 수용체 티로신 키나제 억제제,
    (iii) G 단백질-결합된 수용체 스무든드(Smoothened)에 대한 작용제,
    (iv) Dot1L 억제제,
    (v) Jak1/Jak2 억제제,
    (vi) SAH 가수분해효소 억제제, 및
    (vii) 메닌(Menin)-MLL 상호작용 억제제,
    를 갖는 하나 이상의 소분자로 상기 세포 배양 배지를 보충하는 것을 더 포함하고,
    선택적으로, 상기 단계 II 조건은, 하기 생물학적 활성:
    (i) DNA 메틸트랜스퍼라제(methyltransferase) 억제제,
    (ii) 히스톤 탈메틸화(histone demethylation)의 억제제,
    (iii) Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제,
    (iv) 수용체 티로신 키나제 억제제,
    (v) G9a 억제제,
    (vi) BMP 수용체/AMPK 억제제,
    (vii) Jak1/Jak2 억제제,
    (viii) p38 MAPK 억제제,
    (ix) CBP/p300 브로모도메인 억제제, 및
    (x) 메닌-MLL 상호작용 억제제,
    를 갖는 하나 이상의 소분자로 상기 세포 배양 배지를 보충하는 것을 더 포함하며,
    선택적으로, 상기 단계 III 조건은, 하기 생물학적 활성:
    (i) 글리코겐 키나제 억제제,
    (ii) Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제,
    (iii) 히스톤 탈메틸화의 억제제,
    (iv) Dot1L 억제제, 및
    (v) SETD8 억제제,
    를 갖는 하나 이상의 소분자로 상기 세포 배양 배지를 보충하는 것을 더 포함하고,
    선택적으로, 상기 단계 IV 조건은, 하기 생물학적 활성:
    (i) Wnt 억제제,
    (ii) 글리코겐 키나제 억제제,
    (iii) Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제, 및
    (iv) 히스톤 아세틸레이터/탈아세틸화효소 억제제,
    를 갖는 하나 이상의 소분자로 상기 세포 배양 배지를 보충하는 것을 더 포함하는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포는 4 내지 12일 범위의 기간 동안 단계 I 조건에서 유지되는, 방법.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포는 8 내지 20일 범위의 기간 동안 단계 II 조건에서 유지되는, 방법.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포는 8 내지 12일 범위의 기간 동안 단계 III 조건에서 유지되는, 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 세포는 6 내지 8일 범위의 기간 동안 단계 IV 조건에서 유지되는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 체세포는 성체 체세포이고 상기 단계 I 조건은 5% O2를 갖는 것을 특징으로 하는 저산소증 하에 수행되는, 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 글리코겐 키나제 억제제는 CHIR99021, SB-216763; CHIR 99021
    트리하이드로클로라이드, BIO-아세톡심, GSK-3β 억제제 XII, GSK-3 억제제 XV, TD114-2, TD114-3, IM12, CHIR98014 및 SB-415286로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 TGFβ 억제제는 616452, A 83-01, SB431542, SB 505124, GW 788388, 도르소모르핀(dorsomorphine) 및 SB 525334로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 레티노산 수용체(RAR) 작용제는 TTNPB, Ch55 및 AM580으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 Rho-관련된, 코일드-코일 함유 단백질 키나제(ROCK)의 선택적 억제제는 Y27632, 파수딜(Fasudil) 또는 티아조비빈(thiazovivin)인, 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 수용체 티로신 키나제 억제제는 ABT 869, AG1296 및 발라타닙(Valatanib)으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 G 단백질-결합된 수용체 스무든드(Smoothened)에 대한 작용제는 SAG, 푸르모르파민(Purmorphamine), Hh-Ag1.5 또는 인간 SHH인, 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우, (a) 상기 DNA 메틸트랜스퍼라제 억제제는 5-아자시티딘(Azacytidine), 데시타빈(Decitabine) 및 RG108로 구성된 군으로부터 선택되고, (b) 상기 히스톤 탈메틸화의 억제제는 트라닐시프로민(tranylcypromine), GSK2879, LSD-C76, S2101 및 RN1로 구성된 군으로부터 선택되며, (c) 상기 c-Jun 키나제 억제제는 JNKIN8, Sp600125; JNK-in-5; JNK-in-7; 및 JNK-in-12로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우, (a) 상기 Dot1L 억제제는 EPZ004777, EPZ5676 및 SGC0946로 구성된 군으로부터 선택되고, (b) 상기 SAH 가수분해효소 억제제는 DZNep, Adox 및 NepA로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  16. 제 1 항 내지 제 15 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우, (a) 상기 히스톤 아세틸레이터/탈아세틸화효소 억제제는 발프로산, MS275, LMK235, 부티레이트(Butyrate), 아피시딘(Apicidin), CI994, 뎁시펩티드(Depsipeptide), 나트륨, 4-페닐 부티레이트, 나트륨 부티레이트 및 UF010으로 구성된 군으로부터 선택되고, (b) 상기 MAPK 억제제는 PD0325901, AZD8330 및 TAK-733으로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    상기 인간 체세포는 혈액학적 기원의 체세포, 피부 유래 세포, 지방 세포, 상피 세포, 내피 세포, 중간엽 기원의 세포, 실질 세포(parenchymal cells)(예를 들어 간세포), 신경 세포 및 결합 조직 세포로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  18. 제 17 항에 있어서,
    상기 체세포는 섬유아세포 및 지방-유래 체세포(예를 들어 지방 세포(adipocytes))로 구성된 군으로부터 선택되는, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    존재하는 경우, (a) 상기 B-Raf 억제제는 SB590885, 소라피닙(Sorafinib) 및 GDC0879로 구성된 군으로부터 선택되고 (b) 상기 Wnt 억제제는 IWP-2, WNT-C59, XAV-939 및 IWR-1로 구성된 군으로부터 선택되며, 선택적으로,
    (i) 상기 단계 I의 소분자는, CHIR99021 + 616452 + TTNPB, CHIR99021 + 616452 + CH55, CHIR99021 + 616452 + AM580, CHIR99021 + A8301 + TTNPB, CHIR99021 + SB431542 + TTNPB, TD114-2 + 616452 + TTNPB, CHIR98014 + 616452 + TTNPB, GSK3bi XV + 616452 + TTNPB의 조합으로부터 선택되고;
    (ii) 상기 단계 II의 소분자는, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-7, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-12, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + 푸르모르파민 + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + TTNPB + Hh-ag-1.5 + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + CH55 + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + 616452 + AM580 + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + A8301 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + SB431542 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR99021 + LY2109761 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, TD114-2 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, CHIR98014 + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8, GSK3bi XV + 616452 + TTNPB + SAG + JNK-in-8의 조합으로부터 선택되며;
    (iii) 상기 단계 III의 소분자는, VPA + Dznep + PD0325901 + 616452, VPA + Dznep + AZD8330 + 616452, VPA + Dznep + TAK733 + 616452, VPA + Dznep + 트라미티닙(Tramitinib) + 616452, VPA + Adox + PD0325901 + 616452, VPA + Nepa + PD0325901 + 616452, MS275 + Dznep + PD0325901 + 616452, LMK235 + Dznep + PD0325901 + 616452, 부티레이트 + Dznep + PD0325901 + 616452의 조합으로부터 선택되고; 및/또는
    (iv) 상기 단계 IV의 소분자는, PD0325901 + SB590885, PD0325901 + 소라피닙, PD0325901 + GDC0879, AZD8330 + SB590885, AZD8330 + 소라피닙, AZD8330 + GDC0879, TAK733 + SB590885, TAK733 + 소라피닙, TAK733 + GDC0879, 트라미티닙 + SB590885, 트라미티닙 + 소라피닙, 트라미티닙 + GDC0879의 조합으로부터 선택되는, 방법.
  20. 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 정의된 하나 이상의 단계를 포함하는 방법에 의해서 얻어진 세포로서, 예를 들어,
    (i) 단계 I의 배양에 의해 얻어진 상피-유사 세포(epithelia-like cells), 초기 단계에서 MMP1, ZEB1, VIM, COL1A1, COL5A1, COL6A2, PRRX1, SNAI2, TWIST1, 및 TWIST2 중의 적어도 하나의 유전자의 하향-조절(down-regulation), 및 LIN28A 및 KRT, 예를 들어 KRT8, KRT18, KRT19, 및 LIN28A에 관한 적어도 하나의 유전자의 상항-조절(up-regulation)을 특징으로 함;
    (ii) 단계 I 및 단계 II의 배양에 의해 얻어진 재생 프로그램을 갖는 가소성 상태 세포, SALL4 및 LIN28A 중의 적어도 하나를 발현하고, 증가된 수의 개방된 염색체 유전자좌 및 증가된 DNA 탈메틸화를 갖는 언로킹된 후성유전체 상태(unlocked epigenome state)를 가지는 것을 특징으로 함;
    (iii) 단계 I, 단계 II 및 단계 III의 배양에 의해 얻어진 XEN-유사 세포, LIN28A, SALL4, 및 OCT4 중의 적어도 하나의 유전자의 상향-조절, 및 XEN(외배아 내배엽(extraembryonic endoderm)) 관련된 마커, 예를 들어 GATA6, SOX17, FOXA2, HNF1B, APOA1, 및 APOA2 중의 적어도 하나의 발현을 특징으로 함; 및/또는
    (iv) 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포, 코어 다능성 전사 인자 OCT4, SOX2, DNMT3B , DPPA4 , UTF1 , ZFP42, ZIC3 , 및 NANOG와 함께, TRA-1-60, TRA-1-81, 및 SSEA-4 중의 적어도 하나의 표면 마커를 발현하는 것을 특징으로 함.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포는 TRA-1-60, TRA-1-81 및/또는 SSEA-4를 더 발현하는 것인, 세포
  22. 제 20 항 또는 제 21 항에 있어서,
    상기 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포는 세포 배양에서 20회 초과 계대, 예를 들어 최대 25회, 30회, 35회, 40회, 41회, 42회 계대 동안 증폭될 수 있는 것을 특징으로 하는, 세포.
  23. 제 20 항 내지 제 22 항 중의 어느 한 항에 있어서,
    단계 SIV의 말기에 유도된 1차 인간 화학적으로 유도된 다능성 줄기 세포는 발달 다능성 관련된 3(Developmental Pluripotency Associated 3, DPPA3), 크루펠-유사 인자 17(KLF17) 및 DNA 메틸트랜스퍼라제 3 유사(DNMT3L)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 인자를 발현하는 것인, 세포.
  24. 인간 체세포를 인간 화학적으로 유도된 다능성 세포로 재프로그래밍하기 위한 세포 배양 배지 조성물 또는 키트로서,
    상기 조성물 또는 키트는 제 1 항 내지 제 19 항 중의 어느 한 항에 정의된 단계 I 내지 IV의 하나 이상의 분자들의 조합을 포함하는, 조성물 또는 키트.
  25. 제 24 항에 있어서,
    제 20 항 내지 제 23 항 중의 어느 한 항에 정의된 세포를 제조하는 데 사용하기 위한, 조성물 또는 키트.
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