KR101252694B1 - 커큐민을 포함하는 미분화 지방세포의 줄기세포능 증진용 배양 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 커큐민을 포함하는 미분화 지방세포의 줄기세포능 증진용 배양 조성물, 미분화 지방세포에 커큐민을 처리하여 줄기세포능을 증진시키는 방법, 및 상기 방법에 의해 수득한 줄기세포능이 증진된 세포와 이를 포함한 세포 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 커큐민을 이용한 줄기세포능이 증진된 세포는 줄기세포의 연구 및 다양한 질병을 치료하는데 이용할 수 있다.

Description

커큐민을 포함하는 미분화 지방세포의 줄기세포능 증진용 배양 조성물{Composition comprising curcumin for improving stem cell potency in undifferentiated adipocytes}

본 발명은 커큐민을 포함하는 미분화 지방세포의 줄기세포능 증진용 배양 조성물, 미분화 지방세포에 커큐민을 처리하여 줄기세포능을 증진시키는 방법, 및 상기 방법에 의해 수득한 줄기세포능이 증진된 세포와 이를 포함한 세포 치료용 조성물에 관한 것이다.

줄기세포는 자기 자신을 재생산할 수 있는 자기 재생능(self renewal) 및 증식 능력과 함께 적절한 환경하에서는 하나 이상의 특화된 세포로 분화될 수 있는 전분화성을 가지고 있다. 또한, 인간배아줄기세포는 인간이 가지고 있는 모든 종류의 세포로 분화할 수 있는 능력을 가지고 있다는 점에서 현존하는 다양한 질병들을 치료할 수 있는 가능성을 보여준다. 1998년 미국 톰슨 박사 연구팀에 의한 수정란 유래 인간 배아줄기세포가 세계 최초로 확립된 이래 전 세계적으로 수백 개의 인간 배아줄기세포주가 확립되어 있으며 현재에도 새로운 수정란 유래 인간 배아줄기세포주가 지속적으로 확립되고 있다. 인간 배아줄기세포 연구는 현재 지지세포 연구, 동물유래 인자를 배제한 배양조건 확립, 특정 세포로의 분화기술 등의 연구가 활발히 진행 중이다.

그러나 현재까지는 배아줄기세포가 가진 한계점 때문에 임상적인 접근이 어려운 것이 사실이다. 치료목적으로 사용시 줄기세포의 면역거부반응이 문제되며, 또한 배아 파괴가 불러온 생명윤리 논란을 피하기 어려운 문제가 있어 이에 대한 대안 마련이 필요하다. 현재 면역거부반응 문제의 해결을 위해 이른바 핵이식에 의한 맞춤형 줄기세포에 대한 연구가 이루어지고 있으나 아직 성공을 거두지 못하고 있으나, 난자 취득의 윤리적 문제의 대안으로서 이미 분화한 체세포를 역분화시켜 배아줄기세포와 유사한 세포인 유도만능세포(induced Pluripotent Stem cell, 이하, iPS라 함)를 생산하려는 연구가 세계적으로 새로이 각광을 받고 있는 추세이다. 이러한 iPS는 체세포로 복제배아줄기세포의 쓰임새를 정확하게 대체할 수 있을 뿐만 아니라, 생명윤리 논쟁과도 무관해 세계 줄기세포분야에서 비상한 관심을 받고 있는 분야이다. 2006년 일본의 Sinya Yamanaka 박사는 생쥐의 배아줄기세포에서만 특이적으로 발현하는 유전자 가운데 oct4, sox2, klf4, c-Myc 등 4개의 유전자 조합을 이용하여 체세포로부터 iPS를 생산하였으며, 이는 인간세포에도 적용된다는 사실을 확인하였고, 미국의 James Thomson 박사는 Oct4, Sox2, Nanog, Lin28 등 다른 유전자 조합을 이용하여 인간의 체세포를 역분화시킬 수 있음을 보고한 바 있다.

이러한 줄기세포의 치료 적용 가능성에 대한 많은 연구에도 불구하고, 배아줄기세포의 분화 과정 조절의 어려움 등으로 인해 현재 실용화된 치료법은 아직 많지 않다. 그러나, 줄기세포를 이용한 세포치료 가능성은 신장, 간, 심장 등 손상된 장기를 복구 또는 대체할 수 있고, 다양한 원인으로 조직이 손상되는 파킨슨씨병, 알츠하이머병 등 퇴행성 질환이나 당뇨병 등의 난치병 질환에 대하여 효과적인 대안이 될 수 있다는 점에서, 세포차원에서의 접근은 여전히 의료 분야에 있어 대혁신을 초래할 것으로 기대되고 있다. 특히, 윤리적 문제와 면역거부반응의 위험이 적은 세포 재프로그래밍 기술을 발달시켜 다양한 세포로부터 거꾸로 줄기세포를 제작하고 이러한 줄기세포를 이용한 세포 치료가 바람직할 것이다. 이를 위해서는, 세포의 줄기세포능(stem cell potency)이나 줄기세포성(stemness)을 증진 내지 촉진시킬 수 있으면서도 세포에 암을 유발하지 않을 수 있는 안전한 새로운 줄기세포성 촉진 물질을 개발하는 것이 필요하다.

한편, 커큐민 (diferuloylmethane)은 울금 (Curcuma longa )이라는 식물 유래의 자연 폴리페놀이며, 이 식물은 염증과 산화적 스트레스와 관련이 있는 질병의 치료를 위해 사용되어 왔다. 염증을 억제하고, 유리기 (free radicals)을 제거하는 능력 때문에, 커큐민은 암 화학적 예방 및 암 성장 억제를 위해서 연구되어 왔으며, 다양한 암세포에서 세포 괴사 및 세포 자살을 포함한 세포 증식 멈춤, 세포의 사멸에 대해 효율적인 유도 때문에 유망한 항암제로서 인식되어 왔다. 또한, 커큐민은 자연적으로 있는 항산화제이며, 그리고 특정 조건하에서 히스톤 낮은 아세틸레이션에 영향을 주어 산화 촉진제적 특징을 보여준다. 커큐민은 낮은 농도에서 활성산소 발생을 제거를 통하여 사람의 백혈병 세포에서 항암효과를 발휘하는데, 이것은 세포 자살, 항 염증, 항암을 포함한 다양한 약리학적 효과를 나타내고 또한 종양-유도 T 세포의 세포사멸을 방어하며, in vitro 실험 증거와 임상 실험 결과 사람 대장암의 질병 예방에 대해서 유용한 것으로 여겨지고 있다. 뿐만 아니라, 커큐민은 노화와 관련이 있는 인지능력 감소와 산화적 피해를 줄일 수 있다고 보고된 바 있으며, 동물 실험 결과 커큐민은 알츠하이머와 국소적 뇌 허혈과 같은 신경 퇴행성 상태에 효과적이라고 보고되었다. 이와 같이, 커큐민은 유용한 의약 제재로서 상업적 관심을 받아왔다. 그러나, 아직까지 커큐민이 미분화 지방세포에서 줄기세포능(stem cell potency)이나 줄기세포성(stemness)을 증진시키는 효과가 있는지 여부에 대해서는 개시된 바가 없다.

이에, 본 발명자들은 미분화 지방세포에 커큐민을 처리한 결과, 상기 세포의 증식이 증가하고, 텔로머라제의 활성이 증가하고, 줄기세포성 인자(stemness acting signals)의 발현이 증가되며, 세포 이동 활성이 증가하는 등 커큐민에 줄기세포능을 증진시키는 효능이 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 발명의 하나의 목적은 커큐민을 포함하는, 미분화 지방세포의 줄기세포능 증진용 배양 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 미분화 지방세포에 커큐민을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는 미분화 지방세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 하나의 목적은 상기 방법에 의해 수득한 줄기세포능이 증진된 세포와 이를 포함한 세포 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 커큐민을 포함하는 미분화 지방세포의 줄기세포능 증진용 배양 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 줄기세포능의 증진 대상이 되는 세포인, “미분화 지방세포(undifferentiated adipocyte)”는 지방세포로 분화되도록 위임된 세포이나 아직 분화되지 않은 세포를 의미한다. 본 발명의 미분화 지방세포는 인간(human), 원숭이(monkey), 돼지(pigs), 말(horses), 소(cows), 양(sheep), 개(dogs), 고양이(cats), 생쥐(mice), 토끼(rats) 등의 포유동물로부터 유래할 수 있으나, 바람직하게 상기 미분화 지방세포는 포유동물의 배(embryo)로부터 유래할 수 있다. 상기 미분화 지방세포의 하나의 예로서 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포를 들 수 있다. 상기 3T3-L1 섬유아세포는 마우스의 배에서 유래하고 콜라겐 및 히아루로난을 합성 및 분비하며, 인슐린 경로, 비만, 심혈관계 질환의 연구를 위해 사용되는 in vitro 지방세포 모델이다.

본 발명에서 용어, "줄기세포능(stem cell potency)의 증진" 이란 미분화 지방세포를 미분화 상태를 유지하면서 증식을 증가시키거나, 텔로머라제 활성을 증가시키거나, 줄기세포성 인자(stemness acting signals)의 발현을 증가시키거나 세포 이동 활성을 증가시키는 것을 말하며, 이들 특징 중 하나 이상이 나타나는 것을 포함하는 의미이다. 상기 줄기세포능이란 당업계에 익숙한 용어로, 예를 들면, Pittenger, M. F., Mackay, A. M., Beck, S. C., Jaiswal, R. K., Douglas, R., Mosca, J. D., Moorman, Simonetti, D. W., Craig, S., and Marshak, D. R. 1999. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 284(5411), 143-147에 개시되어 있다.

본 발명에서 용어, “증식(proliferation)”이란 세포 수의 증가를 의미하고 "성장(growth)"과 동일한 의미로 사용된다. 또한, 본 발명에서 용어, “미분화 증식(undifferentiated proliferation)"이란 미분화 지방세포가 지방 세포로 분화되지 않은 채 원래의 세포와 동일한 성질을 가지는 세포로 증식하는 것을 의미한다. 당업자는 분화되지 않은 상태와 분화된 상태를 일반적인 방법으로 확연하게 구별할 수 있다. 예들 들어, 분화되지 않은 세포는 높은 (핵 비율/세포질 비율) 값을 가지고 인이 현저하게 보이는(prominent nucleoli) 특징을 가진다.

본 발명에서 상기 미분화 지방세포의 줄기세포능의 증진 효과는 커큐민에 의해 나타난다.

본 발명에서 용어 "커큐민(curcumin)"은 디페룰로일메탄(diferuloylmethane)을 성분으로 가지며, 울금 (Curcuma longa )이라는 식물 유래의 자연 폴리페놀을 의미한다.

본 발명자는 상기 커큐민을 배지에 포함시켜 미분화 지방세포를 배양시,상기 세포가 줄기세포능을 증진시키는 것을 확인하였으며, 상기 줄기세포능의 증진 효과를 다음과 같이 확인할 수 있었다.

본 발명의 커큐민을 포함하는 배지 조성물에서 미분화 지방세포를 배양할 경우 미분화 지방세포의 세포 증식을 증진시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 세포 성장에 관한 커큐민의 포텐셜을 검사하기 위하여, 다양한 농도의 커큐민을 24시간 동안 처리한 3T3-L1 섬유아세포의 증식을 조사한 결과, 커큐민을 낮은 농도로 처리한 경우에는 세포 증식을 증가시켰고, 반면 높은 농도로 처리한 경우는 세포 증식을 감소시키는 것을 확인하였다 (도 1A 참조). 또한, 0.02 μM의 커큐민을 24시간 처리하는 것이 세포 증식을 자극하는 가장 효과적인 조건임을 알 수 있었다(도 1B 및 도 1C 참조). 또한, 커큐민 처리된 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식 효율을 평가하기 위해 군락형성 분석법 (clonogenic assay)으로 조사한 결과, 커큐민 처리된 세포는 대조군 세포에 비해 군락 형성이 약 1.5배 증가함을 알 수 있었다 (도 1D 참조).

본 발명에서는 커큐민을 미분화 지방세포에 처리하여 배양한 경우 텔로머라제의 활성이 증가할 수 있다. 발명에서 용어, "텔로머라제"는 염색체에서 특별한 정보를 담기보다는 말단에 존재하여 염색체를 보호하는 작용을 하며 세포가 한번씩 분열할 때마다 짧아지는 부분인 텔로미어의 길이를 유지하고 보호하는 기능을 하는 효소이다. 암세포나 줄기세포에서 이러한 텔로머라제가 발현되며 이것 때문에 줄기세포가 체세포보다 더 많이 분열할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서, 3T3-L1 섬유아세포에서 ROS을 제거하는 것에 대한 커큐민의 효과를 측정하기 위해, 텔로머레이즈 활성을 커큐민을 처리한 후에 측정한 결과, 커큐민이 처리된 세포는 대조군에 비해 약 1.6배의 텔로머레이즈 효소 활성 증가를 보였다 (도 2 참조).

본 발명의 커큐민을 포함하는 배지 조성물에서 배양할 경우 상기 줄기세포성 인자의 발현이 유도될 수 있다. 본 발명에서 용어, "줄기세포성 인자(stemness acting signals)"란 줄기세포적 특성을 유지하기 위해 발현되는 것을 말하며, 이에 제한되지는 않으나, 바람직하게 oct4, sox2, klf4, 또는 c-Myc를 말한다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 커큐민을 처리한 3T3-L1 섬유아세포에서 PI3K와 그것의 하위 매개체들 (p-MEK, p-ERK, p-AKT)의 유의적인 활성화를 유도하였으며, p53과 p21의 암 억제 유전자 산물의 발현 저해와 c-Myc 단백질의 과다 발현을 유도하였으며, 상기 커큐민에 의해 유도된 p-ERK와 p-AKT의 활성화는 이어서 oct4, sox2, klf4, c-Myc와 같은 줄기세포 전사 인자들의 발현을 유도하는 것을 확인할 수 있었다(도 3 참조). 이러한 결과로부터, 커큐민이 3T3-L1 섬유아세포에서 활발한 세포 증식과 줄기세포성 인자들의 발현을 증가시키는 작용을 하는 것을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명의 커큐민을 포함하는 배양 조성물에서 배양할 경우, 미분화 지방세포의 세포 이동 활성을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에서, 커큐민 처리된 3T3-L1 섬유아세포의 세포 이동 효과를 평가하기 위하여, in vitro 트랜스웰 플레이트와 스크래치 유도 세포 이동 분석법 (scratch-inducing cell migration assays)을 수행한 결과, 커큐민을 처리한 세포에서는 대조군 세포에 비해서 시간 의존적으로 세포 이동 효율을 유의적으로 증가시키는 것을 확인하였으며, 이러한 결과는 커큐민 처리 후에 TIMP1, TIMP2 그리고 TSP1의 발현 저해와 매개되어 MMP1, MMP2, MMP3, SDF1, 그리고 VEGF를 포함하는 세포 이동 전사인자들의 과다발현과 일치하는 것이었다 (도 4 참조).

상기와 같이, 줄기세포능이 증진된 세포는 지방세포로 분화되지 않고, 줄기세포능이 강화되면서 줄기 세포의 상태 즉, 복수의 유형의 세포로 전이(transfer) 또는 프로그램(program)될 수 있는 상태로의 회귀(regression)할 수 있는 잠재력을 가짐을 의미한다. 또한, 본 발명에서 줄기세포능이 증진된 세포는 다능성이 증가하는 세포로 변화할 수 있음을 의미하기도 한다. 따라서, 상기 줄기세포능이 증진된 세포는 적절한 조건을 가함에 따라 지방세포를 비롯한 다른 세포로의 분화가 가능할 수 있다. 예를 들면, 상기 다른 세포로의 분화는 골 세포, 연골 세포 및 근육 세포를 비롯한 중간엽 유래 세포, 신경 세포, 인슐린 생산 세포(이자 랑겔한스섬의 B 세포)로 분화될 수 있음을 의미한다. 따라서, 이와 같이 분화된 세포를 이용하여 암, 골다공증, 관절염, 퇴행성신경질환, 당뇨병과 같은 여러 질병을 치료할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어, “배지(culture media)"는 in vitro에서 세포 성장 및 생존을 지지할 수 있게 하는 배지를 의미하고, 세포의 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 바람직하게는 세포 배양 최소 배지(cell culture minimum medium: CCMM)로, 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 최소 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640,F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다. 또한 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.

커큐민을 이용하여 미분화 지방세포의 줄기세포능을 촉진 또는 증진시키고자 하는 본 발명의 목적상, 배지의 종류와 배양 방식에 특별히 제한 없이, 배지에 커큐민을 포함하여 사용할 수 있다. 이 때, 커큐민을 단독으로 사용하거나 기존에 알려진 하나 이상의 분화 제어 물질과의 함께 사용하는 등 다양한 응용이 가능하다.

본 발명의 커큐민은 상기 배지에 유효 농도로 포함되도록 해야 한다. 본 발명에서 용어, “유효 농도”는 커큐민이 줄기세포능을 유도할 수 있는 충분한 양을 의미하며, 유효 농도 이하에서는 활성을 나타내지 않고 유효 농도 이상에서는 세포에 독성을 나타내게 되므로 유효 농도 내에서 커큐민을 사용하도록 한다. 본 발명에서 바람직한 커큐민의 처리농도는 10μM 보다 낮은 농도가 바람직하며, 보다 바람직하게는 0.01 내지 1 μM이며, 높은 농도(50 μM)에서는 오히려 줄기세포능을 감소시킬 수 있으므로 50 μM보다 낮은 농도로 처리하는 것이 바람직하다 (도 1 참조).

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 미분화지방세포에 커큐민을 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 미분화 지방세포의 줄기세포능을 증진시키는 방법에 관한 것이다.

상기 줄기세포능의 증진은 세포 증식의 증가, 텔로머라제 활성 증가, 줄기세포성 인자(stemness acting signals)의 발현 증가, 및 세포 이동 활성 증가로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 것이며, 이에 대해서는 상기에서 상술한 바와 같다 (도 1 내지 도 4 참조). 또한, 상기 커큐민은 0.01 내지 1 μM로 12시간 내지 24시간 동안 처리하는 것이 바람직하다. 또한 상기 미분화 지방세포는 포유동물로부터 분리한 것이 바람직하며, 마우스 유래인 3T3-L1 섬유아세포가 더욱 바람직하다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 상기와 같이 줄기세포능을 증진시키는 방법을 통해 수득한 줄기세포능이 증진된 세포 및 이를 유효성분으로 포함한 동물의 세포 치료용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 줄기세포능이 증진된 세포 그 자체를 이용하여 질병을 치료할 수 있다. 상기 세포는 동물의 생체 내에 주사(injection), 주입(infusion), 이식되어서 특정한 유형의 세포 집단(population)과 직접 접촉함으로써 상기 특정 유형의 세포로 분화될 수 있다. 따라서, 상기 줄기세포능이 증진된 세포 자체를 목적한 유형의 조직으로 적용함으로써 질병을 치료할 수 있으며, 치료할 수 있는 질병의 종류는 제한적이지 않다.

이와 같이 다양한 유형의 세포로 분화될 수 있는 세포를 이용하여 조직을 생산하는 방법("조직 공학")은 당업계에 공지되어 있다. Wang X. 등은 특정한 성체 췌장 세포가 FAH (fumaroy-laceto-acetate hydrolase) 결핍 마우스에서 간세포로 전환될 수 있다는 것을 보여주었다(Wang X. et al. "Liver repopulation and correction of metabolic liver disease by transplanted adult mouse pancreatic cells" Am. J. Pathol. 158(2):571-579). Lagasse 등은 골수로부터 얻은 조혈모세포가 FAH 결핍 마우스에 생체내 이식 후에 간세포로 전환될 수 있다는 것을 보여주었다(Lagasse et al. "Purified hematopoietic stem cells can differentiate into hepatocytes in vivo" Nature Medicine, 6(11); 1229-1234).

본 발명의 줄기세포능이 증진된 세포는 세포를 보호 및 유지하고, 목적하는 조직에 주사, 주입, 이식시 사용에 용이하도록 하는 하나 이상의 희석제를 포함하는 세포 조성물의 형태가 바람직하다. 상기 희석제는 생리식염수, PBS(Phosphate Buffered Saline), HBSS(Hank's balanced salt solution) 등의 완충용액, 혈장 또는 혈액성분 등이 있을 수 있다.

본 발명의 줄기세포능이 증진된 세포는 바로 목적한 유형의 세포로 분화시키거나, 며칠 동안 배지 내에서 보관할 수도 있다. 후자의 경우에는 다분화능의 상실을 방지하기 위하여 배지에 사이토카인 또는 LIF(leukemia inhibitory factor)를 첨가하는 것이 바람직하다. 또한, 세포를 동결건조하여 보관함으로써 다분화능을 유지시킬 수 있다.

상기 줄기세포능이 증진된 세포는 골 세포, 연골 세포 및 근육 세포를 비롯한 중간엽 유래 세포, 신경 세포, 지방 세포, 인슐린 생산 세포(이자 랑겔한스섬의 B 세포)로 분화될 수 있다. 따라서, 이와 같이 분화된 세포를 이용하여 암, 골다공증, 관절염, 퇴행성신경질환, 당뇨병과 같은 여러 질병을 치료할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 분화 여부는 일례로서 다음과 같이 확인할 수 있다. 골 세포, 연골 세포 및 근육 세포로의 분화는 각 세포에 특이적으로 염색되는 염료를 이용하는 방법을 통해 확인할 수 있다. 골 세포 및 지방 세포로의 분화는 골 결절(nodule) 및 지질의 형성 정도를 측정함으로써 확인할 수 있다. 또한, 골 세포로의 분화는 osteonectin, RXR, osteopontin의 발현 정도를, 지방 세포로의 분화는 AP 및 PPAR-γ의 발현 정도를, 신경 세포로의 분화는 Tuj, GFAP, MAP2ab, NF160의 발현 정도를, 인슐린 생산 세포로의 분화는 인슐린의 발현 정도를 각각 분석함으로써 확인할 수 있다.

상기에서 상세히 설명한 바와 같이, 미분화 지방세포에 커큐민을 처리하여 배양하면, 상기 세포의 증식이 증가하고, 텔로머라제의 활성이 증가하고, 줄기세포성 인자(stemness acting signals)의 발현이 증가되며, 세포 이동 활성이 증가하는 등 커큐민에 줄기세포능을 증진시키는 효능이 있다. 이와 같이 커큐민을 이용하여 줄기세포능이 증진된 세포는 줄기세포의 연구에 이용할 수 있으며 나아가 적절한 조건에서 처리하여 다양한 세포로 분화시킬 수 있으며 이와 같이 분화된 세포를 이용하여 암, 골다공증, 관절염, 퇴행성신경질환, 당뇨병과 같은 여러 질병을 치료하는데 이용할 수 있다.

도 1은 커큐민의 3T3-L1 섬유아세포에서 활발한 세포 증식을 자극하는 효과를 나타낸 것이다. (A): 다양한 농도로 24시간 동안 처리된 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식은 트립판 블루 배제법에 의해 평가되었다. 낮은 농도 (0.01, 0.02, 0.1 및 1 μM)의 커큐민은 세포증식을 증가시켰고, 반면은 높은 농도 (50 μM 이상)는 세포 증식을 감소시켰다. (B): 낮은 농도에서 72시간 동안 세포 증식 효과가 평가되었다. 0.02 μM 커큐민을 24시간 동안 투여한 것이 가장 세포 증식 자극에 효과적이었다. (C): 커큐민 처리된 세포의 세포 증식 증가를 대조군 세포와 함께 위상차 사진을 촬영하였다. (D): 군락형성 분석의 결과는 커큐민은 활발하게 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식을 자극하였다는 것을 의미한다. 본 발명의 데이터는 Fisher's test 또는 t-test를 이용하여 분석하였다 (*P<0.05, **P<0.01).
도 2는 커큐민의 3T3-L1 섬유아세포에서 텔로머레이즈 활성의 증가와 같은 확장된 세포 성장의 특성을 유도하는 효과를 나타낸 것이다. 커큐민은 TR, TERT, 및 TEP1와 같은 텔로머레이즈 관련 전사 인자들의 과다 발현과 연계되어 텔로머레이즈 활성을 활발하게 증가시켰다. 본 발명의 데이터는 Fisher's test 또는 t-test를 이용하여 분석하였다 (*P<0.05, **P<0.01).
도 3은 커큐민이 3T3-L1 섬유아세포에서 세포 증식 관련 신호 단백질, 여러 기능성 인자들, 그리고 줄기세포성 인자들의 활발한 발현을 유도하는 것을 나타낸 것이다. (A): 커큐민은 3T3-L1 섬유아세포에서 PI3K의 활성화와 그 경로의 하위 매개체들 (p-MEK, p-ERK, 그리고 p-AKT)의 유의적인 활성화를 유도하였다. 커큐민은 SP1, CDK1, 그리고 CDK2를 포함한 다양한 세포 증식 관련 전사 인자들의 과다발현에 대해서 현저한 효과를 발휘하였다. (B): 커큐민은 세포 자살 관련 단백질, p38과 p-SAPK/JNK의 수준을 직접적으로 약화시켰다. 또한 커큐민은 p53과 p21의 암 억제 유전자 산물의 발현 저해을 유도하였다. (C): 커큐민은 줄기세포 유전자들 (oct4, sox2, klf4, c-Myc)의 과다발현과 p53과 p21의 암 억제 유전자들의 발현 저해와 매개되어, 세포 증식 관련 기능성 유전자들 (REX1, SP1, CDK1, 및 CDK2)의 활발한 발현을 유도하였다.
도 4는 커큐민이 3T3-L1 섬유아세포에서 활발한 세포 이동을 유도하는 것을 나타낸 것이다. 커큐민 처리된 3T3-L1의 세포 이동 효능을 평가하기 위하여, in vitro 트랜스웰 배양접시와 scratch-inducing cell migration assays를 수행하였다. (A): 커큐민이 대조군 세포에 비교하여 시간 의존적으로 3T3-L1 섬유아세포의 세포 이동 효능을 유의적으로 증가하는 것을 보여주는 트랜스웰 플레이트 분석. (B): 커큐민 처리 세포에서 활발한 세포 이동의 좀 더 명확한 증거를 얻기 위하여, 단순한 세포 scraped wound model assay를 수행하였다. 지정된 기준 선을 넘어 이동하는 세포들 사진은 위상차 현미경으로 사진을 촬영하였다. 커큐민 처리 세포는 대조군 세포에 비교하여 기준 선 활발하게 넘었다. (C) 커큐민은 세포 이동 관련 전사 인자들을 활발한 발현을 유도하였다. 본 발명의 데이터는 Fisher's test 또는 t-test를 이용하여 분석하였다 (*P<0.05, **P<0.01).

이하, 본 발명을 실시예를 통해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

세포 배양과 커큐민 처리

마우스 3T3-L1 섬유아세포 (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA)는 10% 소 혈청과, 1% 페니실린/스트렙토마이신이 들어간 DMEM(Dulbecco's modified Eagle medium) 배지를 이용하여 5% 이산화탄소를 가진 습한 37℃ 공기에서 배양되었다. 커큐민(Sigma Chemical Co., St Louis, MO)은 DMSO(dimethyl sulfoxide )에서 녹여서 영하 20℃에 보관하였다. 커큐민 처리를 위하여, 배양되는 3T3-L1 세포는 10cm 배양 접시에 5 X 10⁵ 개의 밀도로 깔고, 5% 소 혈청이 첨가된 DMEM에서 24시간 동안 안정화시켰다. 그리고 세포들은 지정된 시간 (24 시간과 72 시간) 동안 무혈청 DMEM 배지에서 다양한 농도의 커큐민이 처리되었다. 처리를 한 후에, 커큐민의 최적 농도는 트립판 블루 색소 배제법 (trypan blue exclusion assay)를 통하여 세포의 생존성에 기초하여 선별하였다.

트립판 블루 색소 배제법

3T3-L1 섬유아세포는 6 웰 배양 접시에 각 웰당 7 X 10⁴ 개의 세포를 5% 소 혈청이 포함된 DMEM으로 24시간 동안 배양하였다. 그런 다음, 배지는 무혈청 DMEM으로 교체되었고, 24시간과 72시간에 지정된 커큐민 농도를 처리하였다. 처리 후에, 세포는 회수되었고, 0.4% 트립판 블루(Gibco) 를 함유하는 살아있는 세포는 적혈구 계수기를 이용하여 계수하였다. 모든 세포 생존능력 분석에서, 트리플렛 웰이 사용되었고, 각 실험은 적어도 세 번 반복되었다.

군락형성 세포 분석 ( Colony - forming cell ( CFU ) assay )

3T3-L1 섬유아세포를 3.5 X 10³ 개의 밀도로 10cm 배양 접시에 배양을 하였고, 24시간 동안 5% 소 혈청이 함유된 DMEM에서 안정화시켰다. 무혈청 DMEM에서 추가적으로 24시간 동안 0.02M 커큐민으로 세포를 자극한 후, 배지는 10% 소 혈청이 함유된 배지로 교체되었다. 그 후 15일 후에, 세포를 4% 파라포름알데하이드(PFA)로 고정시키고, 1% PFA 내 0.1% 톨루이딘 블루로 염색하였다, 그런 다음, 세포 증식 효율은 육안으로 보이는 군락 (colonies)을 세어서 결정하였다.

텔로머레이즈 활성 분석( Telomerase Activity Assay )

3T3-L1 섬유아세포는 10cm 배양 접시당 5 X 10⁵ 개의 세포로 배양되었고, 24시간동안 5% 소 혈청이 함유된 DMEM으로 안정화되었다. 그런 다음, 세포를 무혈청 DMEM에서 24시간 동안 0.02 μM 커큐민으로 처리하였다. 커큐민으로 자극된 세포들을 회수하였고, 텔로머레이즈 활성은 텔로머레이즈 PCR ELISA kit(Roche Diagnostics)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 측정하였다.

세포 이동 분석 ( Cell Migration Assay )

커큐민으로 처리된 3T3-L1 섬유아세포의 세포 이동을 평가하기 위하여, 10cm 배양 접시에 5 X 10⁵ 개의 세포를 집어넣고, 37℃ 이산화탄소 배양기에서 24시간동안 5% 소 혈청이 함유된 DMEM으로 배양을 하였다. 추가적으로 24시간 동안 0.02 μM 커큐민으로 세포를 처리하였다. 그리고 나서 배양된 세포는 코스터 트랜스웰 막(Costar transwell membranes)을 통과하여 6 웰 배양 접시에 놓았다. 트랜스웰 막 아래에, 2% 소 혈청이 함유된 DMEM에 커큐민을 넣어 각 웰에 넣었다. 상위 공간에서 세포는 2% 소 혈청이 포함된 DMEM에서 37℃에서 2시간 동안 배양되었고, 그리고 그 배양 접시는 이산화탄소 배양기에서 37℃에서 밤새 배양되었고. 하위 공간에 있는 세포는 공기 중에서 건조되었고, Harris hematoxylin으로 약 20분간 교차 염색되었고, 그 후에 세척하였다. 염색된 삽입체는 object slides위에 놓고, 그리고 아래 표면 위에 있는 세포의 수는 도립식 광학현미경 (inverted bright-field microscope)으로 200 배에서 평가되었다. 각 삽입체마다 10 X 20 fields에서 그 수를 셌다. 세포 이동은 세포 바닥을 향하는 자발적인 이동의 field 마다 세포의 수로서 표현하였다. 3T3-L1 섬유아세포 이동에서 커큐민의 역할에 관한 좀 명확한 증거를 얻기 위하여, 간단한 세포 scraped wound model assay를 수행하였다. 세포들은 5 X10⁵ 개의 밀도로 10 cm 세포 배양 접시에 놓고, 5% BCS가 포함된 DMEM으로 배양되었다. 안정화 24시간 후에, 세포는 배양 접시를 가로지르는 직선을 그었고, 배지로 세번의 세정 과정을 거쳤다. 그리고 나서 세포는 0.02 μM의 커큐민으로 무혈청 DMEM으로 배양되었다. 상처가 난 부분 (wounded region)으로 이동하는 세포들은 40배 현미경으로 사진 촬영을 하였다.

RNA 추출 및 역전사 PCR

3T3-L1 섬유아세포는 상기에서 기술한 것처럼 커큐민 0.02 μM을 처리하였고, 회수하여, 전체 RNA는 제조사의 지시 (RNeasy kit, Qiagen, La Jolla, CA) 에 따라 추출하였다. 추출된 전체 RNA는 상보적 DNA (complementary DNA) 합성을 위해 AMV 역전사효소(Amersham Corp., Arlington Heights, IL)에 의한 무작위 헥사머를 적용하였다. 그런 다음, Mastercycler (Eppendorf, Hamburg, Germany) 기계를 이용하여 20 pM의 프라이머 농도를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR 조건은 1 X (94 ℃에서 3분 동안), 35 X (94 ℃에서 45초 동안; 56.5 ℃에서 45초 동안; 그리고 72 ℃에서 1분 동안), 그리고 1 X (72 ℃에서 10분 동안)이었다. 증폭된 PCR 산물은 6x 젤 로딩 염료(Bioneer)를 가지고 EtBr(ethidium bromide)이 포함된 1% 아가로스 겔에 전기 영동을 수행하였다.

단백질 추출 및 웨스턴 블랏 분석

3T3-L1 섬유아세포를 0.02 μM 커큐민으로 상기에서와 같이 처리한 후, 상기 세포를 수거하고, 용해시킨 다음, 단백질 농도를 BioRad protein assay (BioRad Lab., Hercules, CA)을 이용하여 제조사의 지시에 의하여 정량하였다. 웨스턴 블랏 분석을 위해서, 동량의 단백질을 SDS-polyacrylamide gel에 집어넣고, 전기 블랏팅에 의해서 nitrocellulose 막(Schleicher & Schuell, Keene, NH) 에 이동시켰다. 블랏은 종 특이적 항체로 탐침 (probe)되어 4℃에서 밤새 배양하였다. 희석된 엔자임 링크 2차 항체를 가지고 1시간 배양 한 후에, 블랏은 제조사의 지시에 따라 ECL에 의해서 보여졌다 (Amersham). 일차 항체는 Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz, CA) 와 Cell Signaling technology에서 구입되었고, anti-rabbit과 anti-mouse 면역항체 (immunoglobulins)는 Amersham으로부터 구입되었다.

통계분석

모든 데이터는 다섯 번 이상의 독립적인 실험으로부터 얻었으며, 평균 ± 표준편차로 표시되었다. 그룹 간의 통계적 유의성은 student's two tailed t-test를 이용하여 계산되었다.

결과

1. 커큐민은 3 T3 - L1 섬유아세포에서 증가된 텔로머레이즈 활성과 함께 세포 증식, 줄기세포 유전자 발현을 유도하였다.

세포 성장에 관한 커큐민의 포텐셜을 검사하기 위하여, 다양한 농도의 커큐민을 24시간 동안 처리한 3T3-L1 섬유아세포의 증식을 트립판 블루 배제법에 의해 평가하였다. 도 1A에서 보듯이, 커큐민 처리 24시간 후에, 낮은 농도 (0.01, 0.02, 0.1 및 1 μM)의 커큐민은 세포 증식을 증가시켰고, 반면은 높은 농도 (50 μM)는 세포 증식을 감소시켰다. 테스트된 농도 중에서, 0.02 μM 커큐민은 세포 증식을 자극하는 자장 효과적인 농도였다. 72시간 동안 처리하고 평가한 낮은 농도의 커큐민의 증식 효과에서는 24시간 처리한 경우 세포 증식을 자극하는데 더 좋은 효과를 보여주었다 (도 1B). 도 1C에서 위상차 현미경 50배 아래서 세포의 밀도 증가를 관찰함으로써 커큐민 처리 세포의 세포증식이 매우 활발한 것을 확인할 수 있었다. 따라서, 0.02 μM 커큐민을 24시간 처리하는 것이 최적 처리 조건인 것으로 나타났다. 군락형성 분석법 (clonogenic assay) 또한 커큐민 처리된 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식 효율을 평가하기 위하여 수행되었다. 군락 형성 분석법에서 0.02uM 커큐민 처리된 세포는 대조군 세포에 비해 군락 형성이 약 1.5배 증가하였다 (도 1D). 3T3-L1 섬유아세포에서 ROS을 제거하는 것에 대한 커큐민의 효과를 측정하기 위해, 텔로머레이즈 활성을 커큐민 0.02 μM 처리 24시간 후에 측정하였다 (도 2). 도 2에서 보듯이, 커큐민 처리된 세포는 약 1.6배의 텔로머레이즈 효소 활성 증가를 보였다.

대조군 세포와 커큐민 처리된 세포 양쪽에서 유전자 마커의 발현은 웨스턴 블랏과 RT-PCR 분석을 이용하여 조사하였다. 도 3에서 보듯이, 0.02 μM 커큐민에 의한 3T3-L1 섬유아세포에서 PI3K와 그것의 하위 매개체들 (p-MEK, p-ERK, p-AKT)의 유의적인 활성화를 유도하였다 (도 3A). 반면에 커큐민은 직접적으로 세포 자살 관련 단백질들, p38과 p-SAPK/JNK (도 3B)의 레벨을 약화시켰다. 이런 결과들은 커큐민은 직접적인 p38 과 p-SAPK/JNK의 억제를 가진 PI3K와 MEK신호 경로의 활성화를 통해서 3T3-L1 섬유아세포의 증식을 유도하였다는 명확히 보여주는 것이다. 커큐민은 REX1, SP1, CDK1, 그리고 CDK2를 포함하는 세포 증식 관련 전사 인자들의 과다발현에 대한 우세한 효과를 발휘하였다 (도 3A 및 3 C). 또한 커큐민은 p53과 p21의 암 억제 유전자 산물의 발현 저해와 c-Myc단백질의 과다 발현을 유도하였다 (도 3). 3T3-L1 섬유아세포에서 커큐민에 의해 유도된 p-ERK와 p-AKT의 활성화는 이어서 oct4, sox2, klf4, c-Myc와 같은 줄기세포 전사 인자들의 발현을 유도하였다 (도 3C). 이런 결과로부터 커큐민이 3T3-L1 섬유아세포에서 증가된 텔로머레이즈 활성과 함께 활발한 세포 증식과 줄기세포 신호들을 유도할 수 있음을 확인할 수 있었다.

2. 커큐민은 3 T3 - L1 섬유아세포에서 활발한 세포 이동을 유도한다.

커큐민 처리된 3T3-L1 섬유아세포의 세포 이동 효과를 평가하기 위하여, in vitro 트랜스웰 플레이트와 스크래치 유도 세포 이동 분석법 (scratch-inducing cell migration assays)을 수행하였다. 도 4A에서 보듯이, 0.02 μM 커큐민 처리는 대조군 세포에 비해서 시간 의존적으로 세포 이동 효율을 유의적으로 증가시켰다. 커큐민 처리된 세포에서 활발한 세포 이동의 좀 더 명확한 증거를 얻기 위하여, 단순한 세포 스크래치 (scratch) 상처 모델 분석법을 사용하였고, 커큐민이 처리된 세포와 대조군 모두 지정된 참조 선으로부터 한쪽으로 스크래치되었다. 그리고 나서 세포 자체의 이동을 관찰하였다. 지정된 참조 선을 넘는 세포들의 사진을 위상차 현미경으로 사진 촬영하였다. 도 4B에서 보듯이, 커큐민 처리는 대조군에 비해 기준선을 활발하게 가로지르는 것을 유도하였고, 그것은 대조군에 비해 약 2.5배 증가한 것임을 알 수 있었다. 이런 결과들은 커큐민 처리 후에 TIMP1, TIMP2 그리고 TSP1의 발현 저해와 매개되어 MMP1, MMP2, MMP3, SDF1, 그리고 VEGF를 포함하는 세포 이동 전사인자들의 과다발현과 일치하는 것이다 (도 4C 참조).

Claims (14)

1. 0.01 내지 1 uM의 농도의 커큐민을 포함하는, 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식 증진용 배양 조성물.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항에 있어서, 상기 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식능 증진은 텔로머라제 활성증가, 줄기세포성(stemness acting signals) 인자인 oct4, sox2, klf4, 및 c-Myc의 발현 증가, 및 세포 이동 활성 증가로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 특징에 의해 나타나는 것임을 특징으로 하는, 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식 증진용 배양 조성물.
5. 삭제
6. 삭제
7. 제 1항의 배양 조성물을 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포에 12시간 내지 72시간 동안 처리하여 배양하는 단계를 포함하는, 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포의 세포증식을 증진시키는 방법.
8. 삭제
9. 삭제
10. 제7항에 있어서, 상기 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식능 증진은 텔로머라제 활성증가, 줄기세포성(stemness acting signals) 인자인 oct4, sox2, klf4, 및 c-Myc의 발현 증가, 및 세포 이동 활성 증가로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택되는 특징에 의해 나타나는 것임을 특징으로 하는 마우스 유래의 3T3-L1 섬유아세포의 세포 증식을 증진시키는 방법.
11. 삭제
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