KR20230005830A - 줄기세포용 배지 및 줄기세포의 배양 방법 - Google Patents

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요시야 토미모리
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Abstract

본 발명의 줄기세포용 배지는 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것이다. 배지에서의 카르복시메틸셀룰로오스의 첨가량은 최종 농도 0.001㎍/㎖~1㎎/㎖인 것이 바람직하다. 또한, 배지에서의 폴리비닐피롤리돈의 첨가량은 최종 농도 0.05㎍/㎖~2㎎/㎖인 것이 바람직하다.

Description

줄기세포용 배지 및 줄기세포의 배양 방법
본 발명은 줄기세포용 배지 및 줄기세포의 배양 방법에 관한 것이다.
다분화능성 줄기세포로 대표되는 줄기세포는 자기 복제능을 가지는 미(未)분화 세포이며, 다양한 세포로 분화가 가능한 세포이다. 최근에 환자의 손상된 조직에 다분화능성 줄기세포나 다분화능성 줄기세포로부터 분화 유도시킨 세포를 이식하고, 그 기능의 재생을 도모하는 재생 의료가 활발히 연구되고 있다. 재생 의료에서는 다분화능성 줄기세포나 간엽계 줄기세포 등의 줄기세포나 그 분화 세포를 대량으로 준비할 필요가 있기 때문에, 이들 줄기세포를 효율적으로 증식시키는 방법이나, 효율적으로 분화시키는 방법에 대해 검토되고 있다.
통상, 줄기세포의 배양에는 줄기세포용 기초 배지의 mTeSR1 배지(비특허문헌 2)나 Essential-8 배지(비특허문헌 3), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM)/F12 배지에 다양한 사이토카인, 혈청이나 그 대체물(예를 들면 알부민 등) 등의 첨가제가 사용되고 있다.
특허문헌 1에는 상기 첨가제로서 사용되는 7종의 비필수 아미노산이 저감된 배지가 개시되어 있다. 특허문헌 2에는 알부민과 폴리비닐알코올을 배지에 첨가하는 것이 개시되어 있다. 또한, 특허문헌 3에는 줄기세포 중 간엽계 줄기세포의 배양에, 복수의 사이토카인과 함께, 인지질이나 지방산을 함유하는 무혈청 배지를 사용하는 것이 개시되어 있다.
미국 특허출원공개공보 US2017/0198258 미국 특허출원공개공보 US2017/0009200 미국 특허출원공개공보 US2012/0329087
Ludwig, et al., Nat. Methods, 2006, vol. 3(8), p.637-46 Chen, et al., Nat. Methods, 2011, vol. 8(5), p.424-9
그러나 특허문헌 1~3 그리고 비특허문헌 1 및 2에 기재된 기술은 줄기세포의 증식성 등의 효과가 충분하지 않았으므로, 추가적인 개량 기술의 개발이 요구되고 있었다. 따라서 본 발명은 줄기세포의 분화능을 유지하면서 증식 성능이 양호한 줄기세포용 배지 및 상기 배지를 사용하는 줄기세포의 배양 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 예의 연구한 결과, 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 배지에 함유시킴으로써, 줄기세포의 분화능을 유지하면서도 양호한 증식 성능이 있는 것을 지견하고, 본 발명을 완성시켰다.
본 발명은 상기의 지견에 기초하여 이루어진 것이며, 이하의 줄기세포용 배지 및 상기 배지를 사용하는 줄기세포의 배양 방법을 제공하는 것이다.
[1] 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유하는, 줄기세포용 배지.
[2] 상기 [1]에 있어서, 배지에서의 카르복시메틸셀룰로오스의 첨가량이 최종 농도 0.001㎍/㎖~1㎎/㎖인, 줄기세포용 배지.
[3] 상기 [1]에 있어서, 배지에서의 폴리비닐피롤리돈의 첨가량이 최종 농도 0.05㎍/㎖~2㎎/㎖인, 줄기세포용 배지.
[4] 상기 [1]~[3] 중 어느 하나에 있어서, 배지에서의 재조합 알부민의 첨가량이 최종 농도 0.05~1㎎/㎖로 함유되는, 줄기세포용 배지.
[5] 상기 [1]~[4] 중 어느 하나에 있어서, 추가로 β-니코틴아미드모노뉴클레오티드를 함유하는, 줄기세포용 배지.
[6] 상기 [1]~[5] 중 어느 하나에 기재된 줄기세포용 배지를 사용하는, 줄기세포의 배양 방법.
도 1은 실시예 1~7 및 비교예 1에서의 증식 성능 시험I의 크리스탈 바이올렛 염색법에 의한 흡광도의 측정 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 실시예 11 및 비교예 1에서의 증식 성능 시험I의 크리스탈 바이올렛 염색법에 의한 흡광도의 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3의 (a)는 실시예 8 및 비교예 1에서의 증식 성능 시험II의 누적 분열 횟수의 추이를 나타낸 그래프이며, 도 3의 (b)는 실시예 13 및 비교예 1에서의 증식 성능 시험II의 누적 분열 횟수의 추이를 나타낸 그래프이다.
도 4는 실시예 8, 실시예 13 및 비교예 1에서의 분화 능력 시험I의 플로우 사이토메트리(flow cytometry)의 결과를 나타낸 그래프이다.
도 5는 실시예 8, 실시예 13 및 비교예 1에서의 분화 능력 시험II의 분화 유도를 실시한 줄기세포의 상태를 나타내는 화상이다.
이하, 본 발명을 그 바람직한 실시형태(양태)에 기초하여 설명한다.
본 발명의 줄기세포용 배지는 줄기세포의 배양에 사용된다. "줄기세포"란, 자기 복제능을 가지며, 또한 다양한 세포종으로 분화가 가능한 분화능을 포함하는 미분화 세포이다. 줄기 세포로는 예를 들면 ES세포(배성줄기세포), iPS세포(인공다능성 줄기세포) 등의 다능성 줄기세포 외에, 간엽계 줄기세포, 조혈 줄기세포, 신경 줄기세포, 피부 줄기세포 등의 체성 줄기세포를 들 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지를 사용하여 배양하는 줄기세포로는 동물 유래의 줄기세포가 바람직하고, 포유류에서 유래하는 줄기세포가 보다 바람직하며, 인간에게서 유래하는 줄기세포가 더 바람직하다.
분화능을 유지하면서 보다 양호한 증식 성능이 얻어지는 관점에서, 본 발명의 줄기세포용 배지를 사용하여 배양되는 줄기세포는 외배엽, 중배엽, 및 내배엽 중 어느 하나의 세포로 분화될 수 있는 줄기세포인 것이 바람직하고, 중배엽 세포로 분화될 수 있는 줄기세포인 것이 보다 바람직하다. 이러한 줄기세포로는 간엽계 줄기세포 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지는 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유하는 것을 특징으로 한다. 이들 수용성 고분자 화합물 중 어느 하나를 줄기세포용 배지 중에 함유시킴으로써, 줄기세포의 분화능을 유지하면서도 양호한 증식 성능을 얻을 수 있다.
카르복시메틸셀룰로오스(이하 "CMC"라고도 함; CAS 등록번호 9000-11-7)란, 셀룰로오스 유도체의 하나이며, 셀룰로오스를 구성하는 글루코피라노오스의 하이드록시기의 일부를 카르복시메틸기로 치환한 셀룰로오스에테르이다.
본 발명에 사용되는 CMC는 세포배양의 배지에 종래 사용되고 있는 것 등을 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 또한, 카르복시메틸셀룰로오스염을 사용해도 된다.
증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서, CMC는 무수 글루코오스 단위당 카르복시메틸에테르기의 치환도(에테르화도)가 0.6~0.8인 것이 바람직하다. 그와 같은 CMC는 시판되고 있고, 예를 들면 나칼라이테스크사 제품, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨(cat.no.07326-95)이나 후지 필름 와코 준야쿠사 제품, 카르복시메틸셀룰로오스(cat.no.11676-85) 등의 시판품을 사용할 수 있다.
폴리비닐피롤리돈(이하 "PVP"라고도 함; CAS 등록번호 9003-39-8)은 N-비닐-2-피롤리돈이 중합된 수용성 고분자 화합물이다.
본 발명에 사용되는 PVP는 세포배양의 배지에 종래 사용되고 있는 것 등을 특별히 제한 없이 사용할 수 있다. 증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서, PVP의 중량 평균 분자량이 40,000에서 1,200,000인 것이 바람직하다. 그와 같은 PVP는 시판되고 있고, 예를 들면 나칼라이테스크사 제품, 폴리비닐피롤리돈 K-30(cat.no.06306-72)이나 나칼라이테스크사 제품, 폴리비닐피롤리돈 K-90(cat.no.28315-72) 등의 시판품을 사용할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지에는 CMC 및 PVP 중 적어도 어느 하나가 첨가되어 있다. 상기 줄기세포용 배지에는 CMC 및 PVP 중 어느 하나가 첨가되어 있어도 되고, CMC 및 PVP 쌍방이 첨가되어 있어도 된다.
줄기세포의 분화능을 유지하면서 증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서, 본 발명에 따른 줄기세포용 배지에서의 카르복시메틸셀룰로오스의 첨가량은 최종 농도 0.001㎍/㎖~1㎎/㎖인 것이 바람직하고, 최종 농도 0.02㎍/㎖~0.5㎎/㎖인 것이 보다 바람직하다.
상기와 동일한 관점에서, 본 발명에 따른 줄기세포용 배지에서의 폴리비닐피롤리돈의 첨가량은 최종 농도 0.05㎍/㎖~2㎎/㎖인 것이 바람직하고, 최종 농도 0.1㎍/㎖~1㎎/㎖인 것이 보다 바람직하다.
통상, 줄기세포의 배양에 사용되는 배지는 혈청 알부민 등의 알부민(알부민 단백질)을 함유하고 있다.
증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서 본 발명의 줄기세포용 배지는 알부민을 함유하고 있는 것이 바람직하고, 포유 동물의 알부민을 함유하고 있는 것이 보다 바람직하며, 배양하는 줄기세포와 같은 종의 알부민인 것이 더 바람직하다. 또한, 상기 알부민은 재조합 알부민인 것이 바람직하다. 예를 들면, 인간 유래의 줄기세포를 배양하기 위해서는 인간 유래의 재조합 알부민을 사용하는 것이 알맞다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지는 전술한 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유시킴으로써, 비용이 드는 알부민의 함유량을 우위로 저감할 수 있다. 이 때문에, 본 발명에 따른 줄기세포용 배지에서의 알부민의 첨가량을 최종 농도 0.05~1㎎/㎖의 범위로 할 수 있고, 바람직하게는 최종 농도 0.05~1㎎/㎖, 보다 바람직하게는 0.1~0.5㎎/㎖의 범위로 할 수 있다.
증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서, 알부민은 담지하는 지방산이 저감된 것이 바람직하다. 이러한 알부민으로서, 활성탄 처리 등의 탈지방산 처리가 실시된 것을 적절히 사용할 수 있다. 탈지방산 처리는 예를 들면 국제공개공보 WO2014-192938에 기재된 방법에 의해 실시할 수 있다.
줄기세포의 분화능을 유지하면서 증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서, 본 발명에 따른 줄기세포용 배지는 추가로 β-니코틴아미드모노뉴클레오티드를 함유하는 것이 바람직하다. 니코틴아미드모노뉴클레오티드(이하, "NMN"이라고도 함. 화학식: C11H15N2O8P)에는 광학 이성체로서 α체 및 β체의 2종류가 존재하는데, 본 발명에 따른 줄기세포용 배지에서는 β-NMN(CAS번호: 1094-61-7)을 사용하는 것이 바람직하다. β-NMN의 구조를 하기에 나타낸다.
[화학식 1]
Figure pct00001
β-NMN으로는 임의의 방법으로 조제된 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 화학 합성법, 효소법, 발효법 등에 의해, 인공적으로 합성하여 정제한 β-NMN을 유효성분으로서 사용할 수 있다. β-NMN을 합성하는 화학합성법으로는 예를 들면, NAM과 L-리보스테트라아세테이트를 반응시키고, 얻어진 니코틴아미드모노뉴클레오시드를 인산화함으로써 β-NMN을 제조할 수 있다. 효소법으로는 예를 들면, NAM과 5'-포스포리보실-1'-피로인산(PRPP)으로부터, 니코틴아미드포스포리보실트랜스퍼라아제(NAMPT)에 의해 β-NMN을 제조할 수 있다. 발효법으로는 예를 들면, NAMPT를 발현하는 미생물의 대사 시스템을 이용하여, NAM으로부터 β-NMN을 제조할 수 있다.
또한, β-NMN은 널리 생체에 존재하는 성분이기 때문에, 동물이나, 식물, 미생물 등의 천연원료로부터 추출·정제함으로써 얻어진 β-NMN을 유효성분으로서 사용할 수도 있다. 또한, 시판의 정제된 β-NMN을 사용해도 된다.
줄기세포의 분화능을 유지하면서 증식 성능을 보다 향상시키는 관점에서 본 발명에 따른 줄기세포용 배지에서의 β-NMN의 첨가량은 최종 농도 0.01~5mM인 것이 바람직하고, 최종 농도 0.05~2mM인 것이 보다 바람직하며, 최종 농도 0.1~1mM인 것이 더 바람직하다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지에 사용되는 기초배지로는 줄기세포의 다능성(미분화의 상태)의 유지 또는 증식을 위해 사용되는 배지나, 동물세포의 배양에 사용되는 배지 등의 일반적인 기초 배지를 사용할 수 있다. 이러한 기초 배지는 시판되고 있는 각종의 줄기세포를 위한 배양 배지를 사용할 수도 있다. 기초 배지로는 예를 들면, 이글 최소 필수 배지(MEM), 둘베코 변형 이글 배지(DMEM), α이글 최소 필수 배지(αMEM), Iscove 변형 둘베코 배지(IMDM), F-12 배지, F-10 배지, DMEM/F12 배지, RPMI-1640 배지, 간엽계 세포 기초 배지(MSCBM), E8(Essential 8) 배지, TeSR-E8 배지, mTeSR1 배지, 및 이들의 혼합 배지 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지는 상술한 성분 이외에, 필요에 따라, 아미노산, 무기염류, 비타민류, 항생 물질 등의 유효성분을 함유하고 있어도 되고, 이들 유효성분을 1종류만 또는 2종류 이상을 조합하여 함유해도 된다. 본 발명에 따른 줄기세포용 배지에 함유할 수 있는 유효성분은 줄기세포의 생존 효율이나 증식 효율을 높이는 것이 알려져 있는 성분이나, 분화 효율을 높이는 것이 알려져 있는 성분 등이다. 예를 들면, 각종 아미노산이나, 아스코르브산, α-토코페롤 등의 비타민류, 인슐린, 트랜스페린 등의 성장 인자, 아셀렌산나트륨 등의 미네랄, 에탄올아민, Rock 저해제, 발프로산, 디메틸술폭시드, 덱사메타손, 부티르산, 트리코스타틴A, GSK3 저해제, BMP 저해제, Wnt 저해제 등의 생리활성 물질, PDGF-BB, EGF, VEGF, TGF-β, FGF2 액티빈, 노긴 등의 사이토카인류 중에서 적절히 선택하여 사용할 수 있다.
상기의 유효성분은 줄기세포의 생존 효율이나 증식 효율을 높이는 것이나, 줄기세포의 미분화 상태를 유지하는 작용을 높이는 것이 알려져 있다.
본 발명에 따른 줄기세포의 배양 방법은 줄기세포가 가지는 분화능을 유지하면서 상기 줄기세포를 효율적으로 증식시키기 위한 배양 방법이다. 즉, 줄기세포를 안정적이고 효율적으로 배양하기 위한 배양 방법이다.
본 발명에 따른 줄기세포의 배양 방법은 본 발명에 따른 줄기세포용 배지를 알맞게 사용할 수 있다. 상기 줄기세포의 배양 방법은 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유시키는 점 이외에는 상법의 줄기세포의 배양 방법과 동일한 방법에 의해 실시할 수 있다.
또한, 배양 조건은 일반적으로 동물세포를 배양하는 배양 조건으로 할 수 있고, 필요에 따라 적절히 개변해도 된다. 예를 들면, 배양 온도 30~40℃, CO2 농도 1~10체적%, O2 농도 0.1~25체적%로 배양할 수 있다.
실시예
다음으로, 실시예를 나타내서 본 발명을 더 상세하게 설명하겠지만, 본 발명은 이하의 실시예에 의해 하등 한정되는 것은 아니다.
〔줄기세포용 배지의 제작〕
줄기세포용 배지를 준비했다. 이러한 배지는 폴리비닐알코올(PVA) 대신에 수용성 화합물인 CMC 또는 PVP를 첨가한 점 이외에는 일본 특허공보 특허제5804385호에 기재된 무혈청 배지A와 같은 조성의 것을 사용했다. 상기 무혈청 배지A는 DEME(Sigma사, cat.no.D6046) 및 MCDB201(Sigma사, cat.no.M6770)을 1:1로 혼합한 기초 배지에 FGF, PDGF, TGF-β, HGF, EGF, 인지질, 지방산, PVA 등의 유효성분을 첨가한 것이다(일본 특허공보 특허제5804385호의 표 1 참조). 무혈청 배지A에서의 알부민의 첨가량은 최종 농도 0.2㎎/㎖로 했다. 상세하게는 무혈청 배지A에서의 PVA 대신에 CMC(나칼라이테스크사, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 에테르화도 0.59~0.85, cat.no.07326-95)를 첨가한 것을 실시예 1~10의 줄기세포용 배지로 하고, 무혈청 배지A에서의 PVA 대신에 PVP(나칼라이테스크사, 폴리비닐피롤리돈 K-90, 중량평균 분자량 360,000, cat.no.28315-72)를 첨가한 것을 실시예 11~14의 줄기세포용 배지로 했다. 또한, 실시예 8~10 및 실시예 12~14의 줄기세포용 배지에는 추가로 β-NMN을 첨가했다. 상기 무혈청 배지A로만 이루어지는 배지를 비교예 1의 배지로 했다.
각 실시예 및 비교예의 줄기세포용 배지에서의 CMC, PVP, 및 β-NMN의 각 첨가량(배지 중의 최종 농도)은 하기 표와 같다.
Figure pct00002
〔증식 성능 시험I〕
세포배양용 96 웰플레이트를 2.5㎍/㎠의 피브로넥틴(코닝사, 제품번호: 356008)으로 코팅했다. 이 96 웰플레이트에, 줄기세포를 800cells/웰이 되도록 또한 실시예 1~7 또는 비교예 1의 줄기세포용 배지를 사용하여 100㎕ 스케일로 파종하고, 37℃, 5% CO2 조건하에서 정치(靜置) 배양했다. 사용한 줄기세포는 인간 지방조직 유래 간엽계 줄기세포(Lonza사, 제품번호: PT-5006, 1도너)이었다. 파종 1일 후 및 4일 후에 배지 교환하고, 배양 개시로부터 6일간 배양을 계속했다. 이 배양에는 상술한 CMC 함유량의 줄기세포용 배지(실시예 1~7 또는 비교예 1의 줄기세포용 배지)를 사용했다.
이어서, 크리스탈 바이올렛 염색법에 의해, 줄기세포의 증식 성능을 평가했다. 우선, 96 웰플레이트에서의 배양 상청을 제거하고, 각 웰에 0.99% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 4℃에 1시간 이상 정치했다. 그 후, 각 웰에 대해, PFA를 제거하고, 초순수 및 100% 에탄올 각각으로 세정했다. 초순수로는 MilliQ수를 사용했다. MilliQ수는 밀리포아사의 초순수 제조 장치 MilliQ로 제조한 초순수이다. 세정 후, 2.5% 크리스탈 바이올렛을 각 웰에 첨가하고, 실온에서 10분간 정치했다. 이어서, 각 웰을 추가로 3회씩 수돗물로 세정한 후, 웰을 건조시키고, 마이크로 플레이트 리더로 595㎚ 파장의 흡광도를 측정했다. 이상의 측정을 독립적인 6웰로 실시하고, 그 유의성을 T검정에 의해 해석했다. 측정 결과를 도 1에 나타낸다.
또한, 2.5㎍/㎠의 피브로넥틴으로 코팅한 배양용 디시(60㎜ 디시)에 줄기세포를 5×103cells/㎠가 되도록 또한 실시예 11 또는 비교예 1의 줄기세포용 배지를 사용하여 3㎖ 스케일로 파종한 점 이외에는 상기 실시예 1~7과 동일한 방법으로 줄기세포를 배양하여 줄기세포의 증식 성능을 평가했다. 측정 결과를 도 2에 나타낸다.
〔증식 성능 시험II〕
2.5㎍/㎠의 피브로넥틴으로 코팅한 배양용 디시(60㎜ 디시)에 증식 성능 시험I에서 사용한 줄기세포와 동일한 것을 5×103cells/㎠가 되도록 또한 실시예 8~10 또는 비교예 1의 줄기세포용 배지를 사용하여 3㎖ 스케일로 파종하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 정치 배양했다. 파종 1일 후에 배지 교환하고, 이후 2일 또는 3일에 한번, 각 줄기세포용 배지를 사용하여 배지 교환을 실시했다. 이 배양용 디시 내의 세포밀도가 약 80~90%인 서브컨플루언트가 된 시점에서 계대를 실시했다. 보다 구체적으로는 배양용 디시의 배양상청을 제거하고, 인산 완충 식염수〔1×PBS(-)〕로 세정한 후, 1×Tryple select(Thermo Fisher사, 제품번호: 12563011)를 첨가하여, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 4분 정치시켰다. 이어서, 피펫팅(pipetting)에 의해 현탁하고, 배양용 디시로부터 박리된 세포를 싱글화했다. 이어서, 각 줄기세포용 배지를 첨가하여 원심분리하고(1500rpm, 5min), 상청을 제거한 후, 침전된 세포에 상기 각 배지를 첨가하여 현탁했다. 이 현탁액에 대해 셀 카운트를 실시하고, 미리 상기 피브로넥틴으로 코팅한 배양용 디시(60㎜ 디시)에 5×103cells/㎠가 되도록 파종했다. 이와 같이 계대를 실시한 배양용 디시에 대하여, 각 줄기세포용 배지를 사용하여, 2일 또는 3일에 한번의 빈도로 배지 교환을 실시했다. 상기의 계대를 8회 반복했다.
이어서, 상기의 계대를 거쳐 얻어진 줄기세포에 대해 누적 분열 횟수를 구하고, 이것을 그래프화했다. 누적 분열 횟수는 줄기세포의 첫회의 파종 수 및 계대마다 카운트한 세포 수에 기초하여 줄기세포의 분열 횟수를 누적하여 산출했다. 그리고 비교예 1의 누적 분열 횟수와의 대비에 의해, 각 실시예에서의 줄기세포의 증식 성능을 이하의 평가 기준으로 평가했다. 이하의 평가 기준에서는 누적 분열 횟수가 비교예 1보다도 1회 이상 많은 경우를, "비교예 1보다도 높은 증식 성능"으로 평가하고, 누적 분열 횟수가 비교예 1과 동일한 횟수 또는 -(마이너스)1회인 경우를 "비교예 1과 동등한 증식 성능"으로 평가했다.
+: 비교예 1과 동등한 증식 성능이 나타났다.
++: 비교예 1보다도 높은 증식 성능이 나타났다.
실시예 8~10 및 비교예 1의 각 줄기세포용 배지를 사용한 본 증식 성능 시험II의 평가 결과를 표 2에 나타낸다. 또한, 실시예 8 및 비교예 1에서의 줄기세포의 누적 분열 횟수의 측정 결과를 도 3의 (a)에 나타낸다.
실시예 12~14 및 비교예 1의 각 줄기세포용 배지를 사용하여 상술한 본 증식 성능 시험II를 실시했다. 평가 결과를 표 3에 나타낸다. 또한, 실시예 13 및 비교예 1에서의 줄기세포의 누적 분열 횟수의 측정 결과를 도 3의 (b)에 나타낸다.
Figure pct00003
Figure pct00004
〔분화능 시험I〕
2.5㎍/㎠의 피브로넥틴으로 코팅한 배양용 디시(60㎜ 디시)에, 증식 성능 시험I에서 사용한 줄기세포와 동일한 것을 5×103cells/㎠가 되도록 또한 실시예 8, 실시예 13 또는 비교예 1의 줄기세포용 배지를 사용하여 3㎖ 스케일로 파종하고 37℃, 5% CO2 조건하에서 정치 배양했다. 배양용 디시 내의 세포밀도가 약 80~90%인 서브 컨플루언트가 된 시점에서, 상기 계대와 동일한 조작을 실시하고 줄기세포를 배양용 디시로부터 박리하여, 1×105cells씩 1.5㎖ 튜브에 회수했다. 회수한 줄기세포를 1×PBS로 세정하고, 하기에 나타내는 각 항체를 첨가하여 4℃에서 30분 이상 반응시켰다. 그 후, 1×PBS로 다시 세정하고, 플로우 사이토미터(벡톤 디킨슨사, 기종: FACS Calibur)를 이용하여 플로우 사이토메트리 분석을 실시하고, 회수한 줄기세포의 세포 표면 항원의 발현을 확인했다. 플로우 사이토메트리 분석은 상기 플로우 사이토미터의 취급 설명서에 따라 실시했다.
본 분화능 시험I에서는 이하의 항체를 사용했다.
·FITC Mouse IgG1, κ isotype Ctrl(BIOLEGEND사, 제품번호: 400108)
·PE Mouse IgG1, κ isotype Ctrl(BIOLEGEND사, 제품번호: 400112)
·PerCP/Cyanine5.5 Mouse IgG1, κ isotype Ctrl(BIOLEGEND사, 제품번호: 400150)
·FITC anti-human CD90(Thy1)(BIOLEGEND사, 제품번호: 328108)
·PE anti-human CD105(BIOLEGEND사, 제품번호: 323206)
·PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD73(Ecto-5'-nucleotidase)(BIOLEGEND사, 제품번호: 344014)
·FITC anti-human CD235a(BIOLEGEND사, 제품번호: 349105)
·PE anti-human CD45(BIOLEGEND사, 제품번호: 304008)
·PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD31(BIOLEGEND사, 제품번호: 303131)
상기의 항체가 결합하는 단백질 중 세포 표면에 발현되는 CD90, CD105, 및 CD73이 간엽계 줄기세포의 마커 단백질이며, CD235a, CD45, 및 CD31이 간엽계 줄기세포의 네거티브 마커 단백질이다.
〔분화능 시험II〕
실시예 8, 실시예 13 또는 비교예 1의 줄기세포용 배지를 사용하여 증식 성능 시험II의 계대를 4회 반복한 줄기세포에 대해, 세포배양용 48 웰플레이트에 2×104cells/웰로 파종하고, 세포 밀도가 약 100% 컨플루언트가 될 때까지 배양시켰다. 이어서, 골아세포, 연골세포 및 지방세포의 각 세포로 분화시키기 위한 분화 배지를 사용하여 배지 교환하고, 약 3주간의 분화 유도를 실시했다. 분화 유도하의 줄기세포는 37℃, 5% CO2 조건하에서 정치 배양했다.
본 분화능 시험II에서는 이하의 분화 유도용 배지를 사용했다.
· 골분화 유도용 배지
α-MEM 배지에, 소태아혈청을 최종 농도 10%, 덱사메타손을 최종 농도 10nM, β글리세로인산을 최종 농도 10mM, 아스코르브산을 최종 농도 50㎍/㎖, 및 페니실린-스트렙토마이신을 최종 농도 0.1%가 되도록 첨가.
· 연골분화 유도용 배지
α-MEM 배지에, 소태아혈청을 최종 농도 10%, 덱사메타손을 최종 농도 100nM, 아스코르브산을 최종 농도 25㎍/㎖, 및 피루브산을 최종 농도 1mM이 되도록 첨가.
· 지방분화 유도용 배지
DMEM-High Glucose 배지에 소태아혈청을 최종 농도 10%, IBMX를 최종 농도 0.5mM, 덱사메타손을 최종 농도 1μM, 인도메타신을 최종 농도 200μM, 및 페니실린-스트렙토마이신을 최종 농도 0.1%가 되도록 첨가.
상기의 각 분화 배지를 사용한 분화 유도 후, 세포배양용 48 웰플레이트의 상청을 제거하고, 0.99% PFA를 첨가하여 30분간 정치시키고, 세포를 고정했다. 그 후, PFA를 제거하여 물로 세정하고, 세포염색액을 첨가하여 20분 정치하여, 세포염색을 실시했다. 세포 염색 후, MilliQ수로 3회 이상 세정하고, 현미경으로 세포염색의 상태를 관찰했다. 관찰 화상을 도 5에 나타낸다.
본 분화능 시험II에서는 세포 염색에 이하의 염색액을 사용했다.
· 알리자린S 염색액(머크 밀리포아사, 제품번호: TMS_008_C)
알리자린S 염색액은 칼슘과 결합하는 색소를 포함하고 있으므로, 상기 염색액의 염색 정도에 기초하여 골아세포로의 분화를 평가할 수 있다.
· 알시안블루(나칼라이테스크사, 제품번호: 37154-44)
알시안블루는 아그레칸이나 글리코스아미노글리칸 등의 연골세포의 세포 외 매트릭스를 염색할 수 있으므로, 그 염색의 정도에 기초하여 연골세포에 대한 분화를 평가할 수 있다.
· 오일레드O(나칼라이테스크사, 제품번호: 25633-92)
오일레드O는 지방방울을 염색할 수 있으므로, 그 염색의 정도에 기초하여 지방 세포로의 분화를 평가할 수 있다.
증식 성능 시험I의 결과로부터 분명한 바와 같이, 비교예 1의 배지보다도, CMC가 첨가된 실시예 1~7 및 PVP가 첨가된 실시예 11의 각 줄기세포용 배지를 사용하는 편이 줄기세포의 증식 성능이 높은 결과가 되었다(도 1 및 도 2 참조). 이러한 증식 성능은 증식 성능 시험II에서 줄기세포를 계대 배양한 경우에도 나타났다(표 2 및 표 3 참조). 또한, CMC가 첨가된 실시예 1~7 및 PVP가 첨가된 실시예 11의 각 줄기세포용 배지를 사용하는 편이 CMC 또는 PVP가 첨가되지 않은 비교예 1의 배지보다도 줄기세포의 누적 분열 횟수가 많은 결과가 되었다〔도 3의 (a) 및 (b) 참조〕.
분화능 시험I의 결과로부터 분명한 바와 같이, CMC가 첨가된 실시예 8 및 PVP가 첨가된 실시예 13의 각 줄기세포용 배지에서 배양된 줄기세포는 CMC도 PVP도 첨가되지 않은 비교예 1의 배지에서 배양된 줄기세포와 마찬가지로, 미분화의 상태가 양호하게 유지되었다(도 4 참조).
또한, 분화능 시험II에서는 CMC가 첨가된 실시예 8 및 PVP가 첨가된 실시예 13의 각 줄기세포용 배지에서 배양된 줄기세포는 CMC도 PVP도 첨가되지 않은 비교예 1의 배지에서 배양된 줄기세포와 마찬가지로, 골아세포, 연골세포 또는 지방세포로 분화될 수 있었다(도 5 참조). 즉, CMC 또는 PVP에 의해, 줄기세포가 가지는 분화능은 변화되지 않는 것이 나타났다.
상기 증식 성능 시험I 및 II 그리고 상기 분화능 시험I 및 II의 결과로부터, 본 발명에 따른 CMC 또는 PVP가 첨가된 줄기세포용 배지는 줄기세포의 유지나 증식에 악영향을 주는 경우가 없는 것이 나타남과 함께, 줄기세포의 분화능을 유지하면서 증식성을 향상시킬 수 있는 것이 나타났다. 이로써, 줄기세포를 보다 안정적이고 보다 효율적으로 배양할 수 있다.
본 발명에 따른 줄기세포용 배지는 줄기세포의 배양에 필요한 기초 배지에 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유함으로써 줄기세포의 분화능을 유지하면서 양호한 증식 성능을 가진다. 이 때문에, 상기 줄기세포용 배지를 사용함으로써, 줄기세포를 보다 안정적이고 보다 효율적으로 배양할 수 있다.

Claims (6)

  1. 수용성 고분자 화합물로서 카르복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리돈 중 적어도 어느 하나를 함유하는, 줄기세포용 배지.
  2. 제1항에 있어서,
    배지에서의 카르복시메틸셀룰로오스의 첨가량이 최종 농도 0.001㎍/㎖~1㎎/㎖인, 줄기세포용 배지.
  3. 제1항에 있어서,
    배지에서의 폴리비닐피롤리돈의 첨가량이 최종 농도 0.05㎍/㎖~2㎎/㎖인, 줄기세포용 배지.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    배지에서의 재조합 알부민의 첨가량이 최종 농도 0.05~1㎎/㎖인, 줄기세포용 배지.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가로 β-니코틴아미드모노뉴클레오티드를 함유하는, 줄기세포용 배지.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 줄기세포용 배지를 사용하는, 줄기세포의 배양 방법.
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