WO2023127824A1 - 神経堤細胞の培養方法及び製造方法 - Google Patents
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- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
Definitions
- the present invention relates to a method for culturing and producing neural crest cells.
- Neural crest cells are cells derived from the neural crest and differentiate into various cell types such as nerve cells of the peripheral nervous system, Schwann cells, melanocytes, endocrine cells, smooth muscle, head skeleton, cornea, and iris. For this reason, it is also called the "fourth germ layer" acquired during the evolution of vertebrates.
- Non-Patent Documents 1 to 4 methods have been proposed for inducing differentiation of pluripotent stem cells such as iPS cells into neural crest cells, and further inducing differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells.
- Patent Documents 1 to 4 methods have been proposed for inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells, and further inducing differentiation of neural crest cells into mesenchymal stem cells.
- Patent Documents 1 to 4 in order to purify the target neural crest cells.
- an operation to select neural crest cell marker-positive cells by sorting by FACS or the like. has been proposed (for example, Non-Patent Document 1).
- establishment of a method for producing neural crest cells that can eliminate contamination in the production process and is safer is required.
- Patent Document 3 it has been reported that fibronectin, which is an extracellular matrix, and integrin, which is a receptor for laminin, are essential for the interaction between neural crest cells and the extracellular matrix (Non-Patent Document 3).
- Patent document 5 also shows a method of controlling differentiation into neural crest cells in the presence of laminin-211 or E8 fragment of laminin-211.
- Non-Patent Document 4 reports that iPS cells are induced to neural crest cells by using a culture vessel coated with laminin 211 when inducing eye cells.
- Patent Document 6 discloses a method for purifying neural crest cells, which includes a step of expanding culture using laminin-211 as a cell scaffold.
- Makoto Fukuta et al. “Derivation of Mesenchymal Stromal Cells from Pluripotent Stem Cells through a Neural Crest Lineage using Small Molecule Compounds with Defined Media”, PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112291 Alan W. Leung et al., “WNT/ ⁇ -catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate”, Development, 143:398-410, 2016 Laura S. Gammill et al., “Division of labor during trunk neural crest development”, Dev Biol.
- the present invention provides a method for culturing and producing a cell population containing neural crest cells, which can stably mass-produce neural crest cells from pluripotent stem cells with a quality that can be used for cell therapy, and a method for producing the same.
- An object of the present invention is to provide a method for producing mesenchymal stem cells using neural crest cells.
- neural crest cells can differentiate into various cells, neural crest cells are selected so that they have characteristics that allow them to differentiate into target cells, and neural crest cells in the desired cellular state are selected. It is also an object of the invention to obtain cells.
- the present inventors cultured a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells differentiated from pluripotent stem cells using a specific laminin or a fragment thereof as a scaffold to obtain highly purified neural crest cells.
- a specific laminin or a fragment thereof as a scaffold to obtain highly purified neural crest cells.
- the present invention relates to each of the following inventions.
- extracellular matrices containing the integrin-binding sites of these laminins A method for selectively culturing neural crest cells in a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells, comprising a culturing step of adherently culturing a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells.
- [9] (1) a step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells to obtain a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells; (2) A method for producing a cell population containing neural crest cells, comprising the step of adherently culturing the cell population obtained in step (1) by the culture method according to any one of [1] to [8]. [10] The production method according to [9], wherein the cell population obtained in step (1) is subjected to step (2) without screening using a neural crest cell marker.
- step (1) comprises culturing the cell population comprising the pluripotent stem cells in a medium comprising at least one SMAD signaling inhibitor and at least one Wnt signaling activator ] The manufacturing method as described in.
- step (1) comprises culturing the cell population comprising the pluripotent stem cells in a medium comprising at least one SMAD signaling inhibitor and at least one Wnt signaling activator ] The manufacturing method as described in.
- step (1) comprises culturing the cell population comprising the pluripotent stem cells in a medium comprising at least one SMAD signaling inhibitor and at least one Wnt signaling activator ]
- [12] The production method of [11], wherein the SMAD signaling inhibitor is a TGF ⁇ inhibitor.
- the Wnt signaling activator is a GSK3 ⁇ inhibitor.
- step (1) is performed for 7 to 18 days.
- [15] The production method according to any one of [9] to [14], wherein the medium in step (1) is a serum substitute or serum-free synthetic medium.
- [17] A cell population containing mesenchymal stem cells produced by the production method of [16].
- graft-versus-host disease GvHD
- acute respiratory distress syndrome ARDS
- asthma severe heart failure
- myocardial infarction cerebral infarction
- trauma containing as an active ingredient the cell population containing the mesenchymal stem cells of [17] brain injury, brain tumor, spinal cord injury, severe leg ischemia, diabetic leg ulcer, liver cirrhosis, acute liver failure, chronic liver failure, Crohn's disease, sepsis, viral infection, epidermolysis bullosa, diabetes, diabetic organ damage, atopy Dermatitis, hypersensitivity, severe combined immunodeficiency syndrome, multiple myeloma, Kawasaki disease, scleroderma, alopecia, autoimmune hepatitis, lupus nephritis, aplastic anemia, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, Sjögren's syndrome , psoriasis, hip osteoarthritis, knee osteoarth
- a pharmaceutical composition for [19] A method for determining the state of differentiation progress of pluripotent stem cells when inducing differentiation from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells, comprising: (I) harvesting a portion of the cell population in culture at a desired time point; (II) measuring the expression level of a predetermined gene in the collected cell population; (III) a step of comparing the measured expression level of the gene with a threshold; (IV) determining that the cultured cell population at the desired time point can differentiate into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells when the measured expression level of the gene is equal to or greater than the threshold; A method, including [20] The method according to [19], wherein the predetermined genes include one or more genes whose expression is enhanced after induction of differentiation and/or one or more genes whose expression is enhanced during the expansion culture period.
- the gene whose expression is enhanced after one or more inductions of differentiation includes one or more selected from the group consisting of SOX10, RHOB, FOXD3, and NOTCH1, and the gene whose expression is enhanced during the one or more expansion culture periods. comprises one or more selected from the group consisting of SOX9, TFAP2A, NGFR, TWIST1, and EDN3.
- the desired time point is any time point during the process of inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells to obtain a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells.
- Laminin ⁇ chain is ⁇ 1 chain and ⁇ chain is ⁇ 1 chain, ⁇ chain is ⁇ 2 chain and ⁇ in selective culture of neural crest cells in a cell population comprising neural crest cells and/or neural crest progenitor cells
- Laminin in which the chain is the ⁇ 1 chain, laminin in which the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain, and laminin in which the ⁇ chain is the ⁇ 5 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain, and these laminins Use of one or more extracellular matrices selected from the group consisting of extracellular matrices containing integrin binding sites.
- neural crest cells need not be sorted from a cell population containing neural crest cells after induction of differentiation by flow cytometry or the like. , can provide a cell population containing highly pure neural crest cells. Furthermore, by inducing differentiation of the obtained cell population into mesenchymal stem cells, a cell population containing highly purified mesenchymal stem cells can be provided.
- the neural crest The state of differentiation into cells and/or neural crest progenitor cells can be determined. Moreover, according to the present invention, it is possible to select neural crest cells and obtain neural crest cells in a desired cell state.
- FIG. 1 shows the results of temporal observation by flow cytometry of the expression of the neural crest cell marker p75 at the time of induction of differentiation from iPS cells to neural crest cells and at the time of expansion culture of differentiated neural crest cells in Example 1.
- FIG. 1 is a diagram showing the results of observation by flow cytometry of the expression of mesenchymal stem cell markers at the time when neural crest cells were induced to differentiate into mesenchymal stem cells in Example 1.
- FIG. FIG. 2 is an image of neural crest cells expanded and cultured on laminin-211 or laminin-221 after induction of differentiation in Examples 1 and 2, observed with an optical microscope.
- FIG. 10 is an image of the state of cell adhesion of differentiation-induced neural crest cells to various extracellular matrices observed with an optical microscope in Example 3.
- Differentiation-induced neural crest cells (P0) and NGFR (A) and TFAP2A (B) of P1, P2, P3, P4, and P5 cell populations expanded and cultured using various extracellular matrices in Example 3 , and TWIST1 (C) relative to iPS cells before seeding (Day 0), measured by real-time PCR.
- Differentiation-induced neural crest cells (P0) and SOX10 (A) and SOX9 (B) of P1, P2, P3, P4, and P5 cell populations expanded and cultured using various extracellular matrices in Example 3 is a diagram showing the results of measuring the relative expression level of iPS cells before seeding (Day 0) by real-time PCR.
- Example 4 microarray analysis was performed on the cell population at each passage that was expanded using various extracellular matrices, and cluster analysis was performed based on the expression levels of all genes obtained. gram. Microarray analysis was performed on the differentiation-induced neural crest cells (P0) and the cell populations at each passage that were expanded and cultured using two types of extracellular matrices in Example 6, and all genes obtained 1 is a dendrogram showing the results of cluster analysis based on the expression levels of .
- a method for producing a cell population containing neural crest cells of one embodiment comprises at least the following steps (1) and (2). (1) step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells to obtain a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells; a step of adherently culturing a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells in the presence of a predetermined extracellular matrix
- Step (1) is a differentiation-inducing step from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells
- step (2) is a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells. This is a selective culture process for neural crest cells to increase (purify) the proportion of neural crest cells.
- Step (1) Differentiation induction from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells>
- stem cell means an undifferentiated cell having differentiation potential and proliferation potential (especially self-renewal potential) while maintaining differentiation potential.
- Stem cells include subpopulations such as pluripotent stem cells, multipotent stem cells, and unipotent stem cells, depending on their differentiation potential.
- Pluripotent stem cells can be derived from fertilized eggs, cloned embryos, germ stem cells, tissue stem cells, somatic cells, etc.
- pluripotent stem cells include embryonic stem cells (ES cells: Embryonic stem cells), EG cells (Embryonic germ cells), induced pluripotent stem cells (iPS cells: induced pluripotent stem cells), and the like.
- ES cells were first established in 1981 and have been applied to the production of knockout mice since 1989. Human ES cells were established in 1998 and are being used in regenerative medicine. ES cells can be produced by culturing the inner cell mass on feeder cells. Instead of feeder cells, it can also be produced by culturing in a medium containing LIF (leukemia inhibitory factor) for mice and bFGF (fibroblast growth factor) for humans. Methods for producing ES cells are described, for example, in WO96/22362, WO02/101057, US5,843,780, US6,200,806, US6,280,718 and the like. ES cells can be obtained from designated institutions or purchased commercially.
- LIF leukemia inhibitory factor
- bFGF fibroblast growth factor
- ES cells are ES cells established from embryos within 14 days of fertilization.
- ntES cells Nuclear transfer embryonic stem cells
- ES cells which are one type of ES cells, can be established from cloned embryos created by transplanting the nucleus of a somatic cell into an egg whose nucleus has been removed.
- EG cells can be produced by culturing primordial germ cells in a medium containing mSCF, LIF and bFGF (Cell, 70:841-847, 1992).
- induced pluripotent stem cells refers to somatic cells by reprogramming (reprogramming) by a known method or the like, thereby inducing pluripotency.
- fibroblasts or differentiated somatic cells such as peripheral blood mononuclear cells, Oct3/4, Sox2, Klf4, Myc (c-Myc, N-Myc, L-Myc), Glis1, Nanog
- Examples include cells reprogrammed by expression of any combination of a plurality of genes selected from a reprogramming gene group including Sall4, Lin28, Esrrb and the like to induce pluripotency.
- Preferred combinations of reprogramming factors include (1) Oct3/4, Sox2, Klf4 and Myc (eg c-Myc or L-Myc), (2) Oct3/4, Sox2, Klf4, Lin28 and L-Myc ( Stem Cells, 2013; 31: 458-466).
- iPS cells were established in mouse cells by Yamanaka et al. in 2006 (Cell, 2006, 126(4), pp.663-676). iPS cells were also established in human fibroblasts in 2007, and have pluripotency and self-renewal ability like ES cells (Cell, 2007, 131 (5), pp. 861-872; Science, 2007, 318 (5858), pp. 1917-1920; Nat. Biotechnol., 2008, 26(1), pp. 101-106).
- iPS cells can be produced by a method of inducing iPS cells from somatic cells by adding compounds, etc., in addition to the method of producing by direct reprogramming by gene expression (Science, 2013, 341, pp. 651-654 ).
- iPS cells for example, 201B7 cells, 201B7-Ff cells, 253G1 cells, 253G4 cells, 1201C1 cells, 1205D1 cells, 1210B2 cells, 1231A3 cells established at Kyoto University.
- Human iPS cell lines such as are available from Kyoto University.
- As established clinical iPS cells for example, Ff-I01, Ff-I14, QHJI01 and QHJI14 established at Kyoto University are available from Kyoto University.
- iPS cells can be produced using, for example, somatic cells.
- Somatic cells used in producing iPS cells are not particularly limited, but tissue-derived fibroblasts, blood cells (e.g., peripheral blood mononuclear cells (PBMC), T cells), hepatocytes, pancreas cells, intestinal epithelial cells, smooth muscle cells, dental pulp cells, and the like.
- blood cells e.g., peripheral blood mononuclear cells (PBMC), T cells
- hepatocytes e.g., hepatocytes
- pancreas cells hepatocytes
- intestinal epithelial cells e.g., smooth muscle cells, dental pulp cells, and the like.
- somatic cells used for producing iPS cells include peripheral blood and umbilical cord blood collected from human blood vessels, skin tissue, teeth, and the like.
- the means for expressing the genes is not particularly limited.
- the means include infection methods using viral vectors (e.g., retroviral vectors, lentiviral vectors, Sendai viral vectors, adenoviral vectors, or adeno-associated viral vectors), plasmid vectors (e.g., plasmid vectors, or episomal vectors).
- viral vectors e.g., retroviral vectors, lentiviral vectors, Sendai viral vectors, adenoviral vectors, or adeno-associated viral vectors
- plasmid vectors e.g., plasmid vectors, or episomal vectors.
- gene transfer method e.g., calcium phosphate method, lipofection method, retronectin method, or electroporation method
- gene transfer method using RNA vector e.g., calcium phosphate method, lipofection method, or electroporation method
- Direct injection of protein for example, needle-based method, lipofection method, or electroporation method
- iPS cell production kit e.g, iPS cell production kit CytoTuneTM-iPS using Sendai virus vector
- iPS cell production kit eg, iPS cell production kit CytoTuneTM-iPS using Sendai virus vector
- iPS cells can be produced in the presence of feeder cells or in the absence of feeder cells (feeder-free). When iPS cells are produced in the presence of feeder cells, iPS cells can be produced in the presence of factors for maintaining undifferentiation by a known method.
- the medium used to produce feeder-free iPS cells is not particularly limited, but a known maintenance medium for ES cells and/or iPS cells, or a medium for establishing feeder-free iPS cells may be used. can be done.
- Media for establishing feeder-free iPS cells include feeder-free culture such as Essential 8 medium (E8 medium), Essential 6 medium, TeSR medium, mTeSR medium, mTeSR-E8 medium, Stabilized Essential 8 medium, StemFit medium, etc.
- iPS cells for example, four factors of Oct3/4, Sox2, Klf4, and Myc (eg, c-Myc or L-Myc) are introduced into feeder-free somatic cells using a Sendai virus vector.
- iPS cells can be produced.
- Pluripotent stem cells in the present invention are preferably mammalian pluripotent stem cells, more preferably rodent (eg, mouse or rat) or primate (eg, human or monkey) pluripotent stem cells. More preferably, primate pluripotent stem cells, particularly preferably human iPS cells or human ES cells.
- the medium used for culturing pluripotent stem cells herein that is, the medium capable of maintaining the pluripotency of pluripotent stem cells, can be prepared using a medium commonly used for culturing animal cells as a basal medium. .
- Basic media for culturing pluripotent stem cells include, for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Examples include Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal medium and mixed media thereof.
- BME medium BME medium
- BGJb medium Glasgow's Minimal Essential Medium (GMEM) medium
- GMEM Zinc Option medium Improved MEM Zinc Option medium
- IMDM medium Medium 199 medium
- Examples include Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F-12 medium, DMEM/F12 medium, IMDM/F12 medium, Ham's medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, Neurobasal medium and mixed media thereof.
- the medium capable of maintaining the pluripotency of pluripotent stem cells is a medium containing an undifferentiation maintenance factor (undifferentiation maintenance medium) to maintain the undifferentiated state of pluripotent stem cells.
- the medium can be commercially available, and can be prepared, for example, by adding an undifferentiated maintenance factor, a serum substitute, an appropriate nutrient source, and the like to a basal medium. Specifically, it can be prepared by adding bFGF, KSR, non-essential amino acid (NEAA), L-glutamine and 2-mercaptoethanol to DMEM/F12 medium.
- Feeder-free media such as the above-mentioned Essential 8 medium (E8 medium), Essential 6 medium, TeSR medium, mTeSR medium, mTeSR-E8 medium, Stabilized Essential 8 medium, and StemFit medium can also be used.
- the medium used for culturing pluripotent stem cells is preferably a xeno-free medium, more preferably a chemical free medium containing no animal-derived components. Chemically defined media are preferred. Therefore, the medium used for culturing pluripotent stem cells is desirably a feeder-free medium or a serum-free medium.
- Neural crest cells are a group of cells that migrate extensively within the developing embryo after de-epithelializing from the neural crest and undergoing an epithelial-to-mesenchymal transition. By being distributed to specific regions within the embryo, they differentiate into various cell types characteristic of the region, such as peripheral nerves, cartilage, and smooth muscle. Since neural crest cells are a transient cell population, it has been difficult to recover them from embryos during development. Due to the development being reported, it became available. Neural crest progenitor cells are a general term for a group of cells destined to differentiate into neural crest cells.
- neural crest cells and “neural crest progenitor cells” refer to neural crest cells and neural crest progenitor cells obtained from embryos during development, and neural crest cells and neural crest progenitor cells obtained by a differentiation induction method. and can be identified by markers expressed in neural crest cells and/or neural crest progenitor cells.
- Neural crest cell markers include TFAP2A, NGFR (synonymous with p75), TWIST (TWIST1 or TWIST2), EDN3 and the like, and neural crest progenitor cell markers include FOXD3, PAX3, ZIC1 and the like.
- the "cell population containing neural crest cells” may include neural crest progenitor cells.
- the "cell population containing neural crest cells” may contain neural crest stem cells.
- Neural crest cells and/or neural crest progenitor cells can be obtained from pluripotent stem cells by differentiation induction.
- the method of inducing differentiation is not particularly limited, for example, the methods described in Patent Documents 1-4 and Non-Patent Documents 1-2 can be used. Also, considering the efficiency of differentiation induction, it is preferable to culture a cell population containing pluripotent stem cells in a medium containing at least one SMAD signaling inhibitor and at least one Wnt signaling activator.
- the SMAD signaling inhibitor is, for example, a TGF ⁇ superfamily inhibitor capable of inhibiting SMAD signaling by inhibiting phosphorylation of SMAD upstream of the SMAD signal.
- TGF ⁇ inhibitors and BMP inhibitors are included.
- SMAD signaling inhibitors may be used in appropriate combination of one or more TGF ⁇ inhibitors and one or more BMP inhibitors. It is preferred to include at least one TGF ⁇ inhibitor as SMAD signaling inhibitor.
- the TGF ⁇ inhibitor is not particularly limited as long as it can suppress signal transduction mediated by TGF ⁇ , and may be any of nucleic acids, proteins, and low-molecular-weight organic compounds.
- TGF ⁇ inhibitors include substances that directly act on TGF ⁇ (e.g., proteins, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding TGF ⁇ (e.g., antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), TGF ⁇ receptors and TGF ⁇ . and substances that inhibit physiological activity caused by signal transduction by TGF ⁇ receptors (eg, TGF ⁇ receptor inhibitors, etc.).
- TGF ⁇ inhibitors include substances that inhibit binding to the ALK family of receptors or substances that inhibit the phosphorylation of SMAD by the ALK family.
- TGF ⁇ inhibitors include, for example, SB431542, SB202190 (RK Lindemann et al., Mol. Cancer 2:20 (2003)), SB505124 (GlaxoSmithKline), NPC30345, SD093, SD908, SD208 (Scios), LY2109761, LY364947, LY580276 (Lilly Research Laboratories), A-83-01 (WO2009146408), Galunisertib (LY2157299), LY3200882, SB52533 4, GW788388, RepSox, Lefty-1 (as NCBI Accession No.
- TGF ⁇ inhibitor is preferably one or more selected from the group consisting of SB431542 and A83-01, which are known as TGF ⁇ receptor (ALK5) and activin receptor (ALK4/7) inhibitors. preferable.
- the concentration of the TGF ⁇ inhibitor in the medium can be appropriately set within a range where signal transduction mediated by TGF ⁇ can be suppressed.
- the concentration of SB431542 is not particularly limited as long as it can inhibit ALK5, and is, for example, 100 nM to 100 ⁇ M, preferably 500 nM to 30 ⁇ M, more preferably 1 ⁇ M to 20 ⁇ M.
- a concentration that exhibits ALK inhibitory activity or TGF ⁇ inhibitory activity equivalent to that of SB431542 at the concentration described above can be appropriately set.
- the BMP inhibitor is not particularly limited as long as it is an inhibitor involved in the inhibition of BMP signaling through the binding of BMP (bone morphogenetic protein) and BMP receptor (type I or type II). , proteins, and low-molecular-weight organic compounds.
- BMP inhibitors include substances that act directly on BMP (e.g., proteins, antibodies, aptamers, etc.), substances that suppress the expression of genes encoding BMPs (e.g., antisense oligonucleotides, siRNA, etc.), and BMP receptors.
- Substances that have biological activity that inhibits the above BMP signaling by inhibiting BMP binding substances that inhibit physiological activity caused by signaling by BMP receptors (e.g., inhibitors of BMP receptors, etc.), BMPI type receptor kinase inhibitors and the like are included.
- substances having the biological activity of inhibiting the above-mentioned BMP signaling by inhibiting the binding of BMPs to BMP receptors include Dorsomorphin, Noggin and derivatives thereof.
- specific examples of BMP type I receptor kinase inhibitors include LDN-193189 (that is, 4-(6-(4-(piperazin-1-yl)phenyl)pyrazolo[1,5-a]pyrimidine-3 -yl)quinoline) and its derivatives (eg LDN-212854).
- Other BMP inhibitors include K02288, Chordin and Follistatin.
- the BMP inhibitor is preferably one or more selected from the group consisting of Noggin, LDN-193189, Dorsomorphin and K02288 (PLoS One. 2013; 8(4): e62721.).
- the concentration of the BMP inhibitor in the medium can be appropriately set, for example, within a range where signal transduction mediated by BMP can be suppressed.
- the concentration of LDN-193189 is not particularly limited as long as it is a concentration capable of inhibiting BMP type I receptor kinase. Preferably between 50 nM and 3 ⁇ M, even more preferably between 50 nM and 1 ⁇ M.
- the concentration that exhibits BMP type I receptor kinase inhibitory activity or BMP inhibitory activity equivalent to LDN-193189 at the concentration described above can be appropriately set.
- the Wnt signaling activator is not particularly limited as long as it can activate signaling mediated by Wnt.
- Wnt signaling activators include Wnt proteins (Wnt3a, etc.), Wnt agonists, Dkk (inhibitors of Wnt signaling inhibitory proteins), GSK3 ⁇ (Glycogen Synthase Kinase 3 ⁇ ) inhibitors, R-Spondin, and the like.
- a GSK3 ⁇ inhibitor is defined as a substance that inhibits the kinase activity of Glycogen Synthase Kinase (GSK) 3 ⁇ protein, and specific examples thereof include BIO (also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin- 3′-oxime), indirubin derivatives such as SB216763, maleimide derivatives such as SB216763, ⁇ -bromomethylketone compounds such as GSK-3 ⁇ inhibitor VII, cell membrane permeable phosphorylated peptides such as CHIR99021, Kenpaullone, L803-mts, and Derivatives thereof are included.
- BIO also known as GSK-3 ⁇ inhibitor IX; 6-bromoindirubin- 3′-oxime
- indirubin derivatives such as SB216763, maleimide derivatives such as SB216763, ⁇ -bromomethylketone compounds
- GSK-3 ⁇ inhibitor VII cell membrane permeable phosphorylated peptides such as CHIR99021, Kenp
- the Wnt signaling activator is preferably a GSK3 ⁇ inhibitor, and one or more selected from the group consisting of GSK3 ⁇ inhibitors CHIR99021, BIO, Kenpaullone, SB216763 and L803-mts is preferably
- the concentration of the Wnt signal transduction activator in the medium can be appropriately set within a range that can enhance signal transduction mediated by, for example, Wnt proteins (Wnt3a, etc.).
- Wnt3a Wnt proteins
- the concentration of CHIR99021 is not particularly limited as long as it is a concentration capable of inhibiting GSK3 ⁇ .
- a concentration that exhibits GSK3 ⁇ inhibitory activity equivalent to the aforementioned concentration of CHIR99021 or enhancement of signal transduction mediated by Wnt proteins (Wnt3a, etc.) can be appropriately set.
- pluripotent stem cells are cultured in the absence of feeder cells. Absence of feeder cells can be paraphrased as feeder-free, and indicates a state in which no feeder cells are present in the medium. Examples of culture conditions in the absence of feeder cells include culture conditions in which feeder cells such as fibroblasts, SNL cells, and STO cells are not added.
- neural crest cell differentiation-inducing medium includes a differentiation-inducing factor from pluripotent stem cells to neural crest cells, and by culturing pluripotent stem cells in the medium, neural crest cells and/or nerves It is a medium capable of inducing differentiation into ridge progenitor cells.
- the neural crest cell differentiation-inducing medium may be a feeder-free medium suitable for inducing differentiation of neural crest cells and suitable for feeder-free culture of pluripotent stem cells.
- a neural crest cell differentiation-inducing medium can be suitably prepared, for example, by adding additive factors such as serum substitutes and nutrient sources, and further differentiation-inducing factors to the basal medium as required.
- step (1) of the present invention pluripotent stem cells are cultured in a neural crest cell differentiation-inducing medium to induce differentiation into neural crest cells, and cell populations containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells are generated.
- a neural crest cell differentiation-inducing medium to induce differentiation into neural crest cells
- cell populations containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells are generated.
- step (1) is composed of a plurality of subdivided substeps. may be configured.
- step (1) may consist of 2 to 5 substeps, preferably 2 to 3 substeps.
- the neural crest cell differentiation-inducing medium used in each substep has the same composition, and the substeps may consist of a plurality of substeps with different culture conditions such as culture temperature and oxygen partial pressure. (ii) may consist of a plurality of substeps in which the types and/or concentrations of one or more differentiation-inducing factors are different, or (iii) the above (i) and (ii) may be combined.
- the timing of treating the pluripotent stem cells with the differentiation-inducing factors necessary for inducing differentiation into neural crest cells may be set as appropriate. , may be separate.
- the concentration of the differentiation-inducing factor may be appropriately set, and may be constant, or may be increased or decreased stepwise.
- the basal medium used in step (1) is not particularly limited as long as the cells can be cultured, and a basal medium commercially available as a basal medium for cell growth can be used as appropriate.
- a basal medium for cell growth for example, BME medium, BGJb medium, CMRL 1066 medium, Glasgow MEM (GMEM) medium, Improved MEM Zinc Option medium, IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle MEM medium, ⁇ MEM medium, DMEM medium, F -12 medium, DMEM/F-12 medium, IMDM/F12 medium, Ham medium, RPMI 1640 medium, Fischer's medium, CDM medium, or mixed medium of these, etc., which can be used for culturing animal cells can be done.
- CDM medium means a medium consisting only of components identified as chemical substances.
- basal media appropriately contain components necessary for the survival and growth of cells, such as carbon sources such as carbohydrates and amino acids, vitamins, inorganic salts, serum or serum substitutes. Moreover, it is preferably a serum substitute or a serum-free synthetic medium.
- a CDM medium is preferably used as the basal medium used in step (1).
- exemplary CDM media include media containing IMDM/Ham's F-12 1:1 (GIBCO, USA) and 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO).
- a neural crest cell differentiation-inducing medium for example, a medium for maintaining and culturing pluripotent stem cells in an undifferentiated state (undifferentiated maintenance medium), a factor necessary for maintaining undifferentiation (undifferentiation maintenance factor), It is also possible to use a medium from which some or all of the undifferentiated maintenance factors have been removed, or a medium from which the concentrations of some or all of the undifferentiated maintenance factors have been reduced to an effective concentration or less, as described below.
- Such a medium can be prepared, for example, by formulating so as to contain components equivalent to those of the medium.
- a medium obtained by adding nutritional factors such as serum substitutes and hormones to a basal medium such as DMEM can also be used.
- the undifferentiation maintenance medium may be sold as a kit so that a plurality of liquids can be appropriately mixed and used. It is also possible to prepare a differentiation-inducing medium. For example, in the case of Stem Fit AK03N (manufactured by Ajinomoto Healthy Supply Co., Ltd.), since it is divided into A, B, and C solutions, only A and B solutions, excluding FGF2 (also called bFGF), can be used to replenish the neural crest. A cell differentiation inducing medium can be prepared and used.
- the neural crest cell differentiation-inducing medium contains differentiation-inducing factors such as SMAD signaling inhibitors and Wnt signaling activators, and components that inhibit or antagonize their actions are included in the step (1) It is preferably contained in a concentration that does not affect, for example, does not affect, or is not contained.
- Neural crest cell differentiation-inducing medium used in step (1) a medium in which the induction of neural crest cells into neural cells is suppressed.
- Neural crest cell differentiation-inducing media used in step (1) include basal media (eg, CDM media) containing SMAD signaling inhibitors and/or Wnt signaling activators.
- the neural crest cell differentiation-inducing medium used in step (1) include CDM medium (IMDM/Ham's F-12 1:1 (GIBCO, USA), 1 ⁇ Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO), Optiferrin (InVitria, USA) (0.1-1000 ⁇ g/ml, or 1-100 ⁇ g/ml, preferably 10-30 ⁇ g/ml), Insulin (Sigma, USA) (0.1-100 ⁇ g/ml) 1000 ⁇ g/ml, or 1-100 ⁇ g/ml, preferably 2-20 ⁇ g/ml), monothioglycerol (0.01-10 mM, or 0.1-1 mM).
- CDM medium IMDM/Ham's F-12 1:1 (GIBCO, USA)
- Optiferrin InVitria, USA
- Insulin Insulin
- monothioglycerol 0.01-10 mM, or 0.1-1 mM.
- the CDM medium is a medium that suppresses the induction of neural crest cells into nerve cells, and thus is a medium suitable for maintaining neural crest cells.
- the culture surface of the culture vessel is preferably coated with an extracellular matrix suitable for inducing differentiation of neural crest cells.
- an extracellular matrix is not particularly limited as long as it allows differentiation-induced neural crest cells to easily adhere, and examples thereof include laminin and fibronectin.
- laminin 511 and fibronectin are preferably used.
- the coating amount may be 0.001 to 30 ⁇ g/cm 2 , 0.01 to 10 ⁇ g/cm 2 , or 0.1 to 1 ⁇ g/cm 2 with respect to the area of the culture surface. is preferably
- culture vessels commercially available culture vessels, for example, flat-bottomed 6-well plate (bottom area of about 9.5 cm 2 , inner diameter of about 35 mm), 12-well plate (bottom area of about 3.8 cm 2 , inner diameter of 23 mm). 24-well plate (bottom area about 1.88 cm2 , inner diameter about 16 mm), 48-well plate (bottom area about 1.0 cm2 , inner diameter about 11 mm), 96-well plate (bottom area about 0.35 cm2) , inner diameter of about 6 to 8 mm), 384-well plate (bottom area of about 0.1 cm 2 , inner diameter of about 3 to 4 mm).
- it is a flat-bottomed 6-well plate.
- an equal volume of cell suspension having a uniform cell density is dispensed into each well of the culture vessel.
- the cell density may be from 0.1 ⁇ 10 5 cells/well to 5.0 ⁇ 10 5 cells/well, preferably from 0.2 ⁇ 10 5 cells/well to 2.0 ⁇ 10 5 cells/well.
- the culture in step (1) may be carried out for approximately 6 to 20 days, preferably approximately 7 to 18 days, more preferably 10 to 18 days.
- the culture period may be determined by the desired degree of cell differentiation.
- the degree of cell differentiation which indicates how differentiated the induced cells have differentiated, can also be determined by measuring differentiation markers. This can be done by increasing the expression level of at least one. An increase in the expression level indicates a case where the expression level increases within the error range or more after a certain period of time has elapsed from a specific time point.
- the culture conditions for the culture in step (1) are not particularly limited, but for example, a temperature of 35° C. to 37° C., preferably 37° C., a humidity of 90% to 95%, preferably 95%, and a humidity of 3% to 5%, preferably A condition of 5% CO 2 concentration is sufficient, and a hypoxic culture condition is preferable.
- the term “hypoxic culture conditions” means conditions under which cells are cultured at an oxygen concentration lower than that in the atmosphere (approximately 21%).
- the oxygen concentration means the concentration of oxygen in the air in contact with the culture medium containing cells in the culture apparatus.
- the oxygen concentration is not particularly limited as long as it is 20% or less, preferably in the range of 3% to 10%, more preferably in the range of 4% to 6%, most preferably 5%.
- pluripotent stem cells Before differentiation, that is, before step (1), pluripotent stem cells may be maintained and cultured in an undifferentiated maintenance medium.
- the undifferentiated maintenance medium is a medium that contains factors necessary for maintaining an undifferentiated state (undifferentiated maintenance factors) and can maintain pluripotency.
- Undifferentiated maintenance factors include fibroblast growth factor, transforming growth factor beta (TGF ⁇ family) factor, activin A and the like.
- TGF ⁇ family transforming growth factor beta
- FGF Fibroblast Growth Factors
- FGFs include, for example, FGF2 (also referred to as bFGF), FGF4 and FGF8.
- the undifferentiated maintenance medium is as described above.
- the cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells obtained in step (1) expresses at least one neural crest cell marker and neural crest progenitor cell marker at a higher level than iPS cells. ing.
- the cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells obtained in step (1) is a cell positive for at least one of neural crest cell markers and neural crest progenitor cell markers in the total number of cells. is about 1% or more, preferably 10% or more, more preferably 30% or more, and more preferably 40% or more.
- the cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells obtained in step (1) is a cell population containing neural crest cells.
- the proportion of p75-positive cells (i.e., neural crest cells) in the total number of cells is approximately 1% or more, preferably 10% or more, more preferably 30% or more, and more preferably 40% or more. .
- Step (2) Selective culture of neural crest cells>
- Laminin with ⁇ 1 chain, laminin with ⁇ chain being ⁇ 2 chain and ⁇ chain being ⁇ 2 chain, and laminin having ⁇ chain being ⁇ 5 chain and ⁇ chain being ⁇ 1 chain, and integrin binding of these laminins A culturing step of adherently culturing a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells in the presence of one or more extracellular matrices selected from the group consisting of extracellular matrices containing sites. In this specification, this step (2) is sometimes referred to as expansion culture.
- the subject of culture in step (2) is the cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells obtained in step (1).
- the cells can be directly subjected to step (2) without selection using a neural crest cell marker. This is because step (2) can selectively culture and proliferate neural crest cells.
- step (2) can selectively culture and proliferate neural crest cells.
- cell state with a certain tendency means that the gene expression state has a certain tendency.
- a certain tendency of the gene expression state can be confirmed by performing microarray, RNA sequencing, etc. on multiple independent cell population samples containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells obtained by the same culture method. and the similarity of gene profiling can be analyzed by cluster analysis or the like.
- Laminin in the present specification is a protein that constitutes the basement membrane of the extracellular matrix, and has a heterotrimeric structure with one ⁇ -chain, one ⁇ -chain, and one ⁇ -chain.
- ⁇ chains there are three types: ⁇ 1 chain, ⁇ 2 chain, and ⁇ 3 chain;
- These combinations form various laminins.
- laminin 511 is composed of ⁇ 5, ⁇ 1 and ⁇ 1 chains.
- Laminin is a cell adhesion molecule and binds to cell surface receptors. Integrins are laminin receptors.
- Laminin has a site that binds to an integrin, and a fragment of laminin that has this binding site is known as an E8 fragment.
- the extracellular matrix in step (2) is composed of laminin (i.e., laminin 111, laminin 112) where the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain, the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain.
- a laminin i.e., laminin 211, laminin 212
- a laminin in which the ⁇ chain is an ⁇ 2 chain and the ⁇ chain is a ⁇ 2 chain i.e., laminin 221, laminin 222
- an ⁇ chain is an ⁇ 5 chain and a ⁇ chain is ⁇ 1.
- It may be one or more laminins selected from the group consisting of laminins (i.e.
- laminin 511, laminin 512 which are chains, and preferably the ⁇ -chain of these laminins is a ⁇ 1 chain, for example laminin 221 , laminin-211, laminin-111, laminin-511, and laminin-221 is particularly preferred.
- the extracellular matrix in step (2) may also be an extracellular matrix containing the integrin binding site of laminin as described above, preferably the integrin binding site of laminin is an E8 fragment containing the integrin binding site, especially laminin 221 is preferably the E8 fragment of
- the extracellular matrix containing the integrin binding site of laminin may be a laminin fragment (e.g., E8 fragment) containing the integrin binding site, or may not affect integrin binding ability or may enhance integrin binding ability.
- step (2) by using the predetermined extracellular matrix, neural crest cells in a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells can be selectively engrafted and proliferated, and further, It is possible to selectively engraft neural crest progenitor cells, which are likely to be induced to differentiate into neural crest cells, and promote proliferation and differentiation induction. As a result, the ratio of neural crest cells to the total number of cells in the cell population increases, and neural crest cells can be enriched and purified.
- a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells is adherently cultured in the presence of the predetermined extracellular matrix.
- the presence of a predetermined extracellular matrix may be present in a state in which the culture surface to which the cell population adheres is coated with the predetermined extracellular matrix, or the predetermined extracellular matrix is added to the medium. It may exist in both states. Among these, it is preferable that the cell population exists in a state where the culture surface is coated with a predetermined extracellular matrix.
- the coating amount may be 0.001 to 30 ⁇ g/cm 2 with respect to the area of the culture surface, It is preferably 0.01 to 10 ⁇ g/cm 2 , or 0.1 to 2 ⁇ g/cm 2 .
- the coating amount is 0.1 to 1000 ng/cm 2 with respect to the area of the culture surface, for example, in the case of laminin 221, laminin 211, laminin 111, laminin 511 and E8 fragments thereof. preferably between 1 and 100 ng/cm 2 , or between 2 and 20 ng/cm 2 .
- the medium used in step (2) is not particularly limited as long as it is a medium suitable for maintaining neural crest cells so as not to differentiate the neural crest cells, but a medium suitable for maintaining and growing neural crest cells.
- the "medium suitable for maintaining neural crest cells” is a medium obtained by adding components necessary for maintaining neural crest cells without causing cell death or further differentiation to the basal medium in step (1) above. If it is Moreover, in order to reduce stimulation to cells, it is preferable to use the same basal medium used in step (1) as the basal medium in step (2).
- serum replacement and appropriate nutrient sources may be added to the basal medium in step (1).
- factors EGF, bFGF, etc.
- One aspect includes a CDM medium supplemented with one or more components selected from albumin, BSA, HSA, FBS and KSR, a TGF ⁇ inhibitor, and a growth factor (EGF, bFGF, etc.).
- the culture conditions and culture vessel in step (2) conform to step (1).
- the number of days of culture in step (2) that is, the number of days of expansion culture, is not particularly limited, but may be carried out for approximately 12 to 28 days, preferably approximately 14 to 22 days, more preferably approximately 16 to 20 days. .
- During expansion it may be passaged, for example, at intervals of 3-5 days/time, or at intervals of 3-7 days/time, or 2-12 days/time.
- Both the total number of cells and the ratio of neural crest cells to the total number of cells in the cell population after expansion culture in step (2) increase compared to the cell population before culture.
- the total cell number increases, eg, 4-30 fold
- the ratio of neural crest cells to the total cell number increases, eg, 1.2-5 fold.
- a cell population containing neural crest cells of one embodiment is a cell population obtained by the above-described method for producing neural crest cells.
- the cell population containing neural crest cells has a ratio of p75-positive cells (i.e., neural crest cells) to the total number of cells of 70% or more (e.g., 80% or more, 85% or more, 90% or more, 95% or more).
- the ratio of neural crest progenitor cells to the total number of cells is 30% or less (eg, 20% or less, 15% or less, 10% or less, or 5% or less).
- the cell population cultured in step (2) expresses at least one gene selected from TFAP2A, NGFR, EDN3 and TWIST1.
- TFAP2A TFAP2A
- NGFR NGFR
- EDN3 thelial growth factor receptor 3
- TWIST1 tumor necrosis factor 3
- a method of inducing neural crest cells from pluripotent stem cells was used, but the method of obtaining neural crest cells is not limited to this. may be used for
- laminin where the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain laminin where the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain, the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain and 1 selected from the group consisting of laminin in which the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain, laminin in which the ⁇ chain is the ⁇ 5 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain, and the extracellular matrix containing the integrin binding site of these laminins
- a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells comprising a culturing step of adherently culturing a cell population containing biologically-derived neural crest cells and/or neural crest progenitor cells in the presence of the above extracellular matrix.
- a method of culturing is also provided. The culturing step in the culturing method is the same as the step (2) described above.
- the cell population containing the biologically-derived neural crest cells and/or neural crest progenitor cells is, for example, recovered from a developing embryo.
- a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells collected from developing embryos is collected by sorting the cell population containing neural crest cells using neural crest cell markers (SOX10, p75). be able to.
- the developing embryo is an embryo within 15 days of development if it is a human embryo.
- a method for producing mesenchymal stem cells of one embodiment comprises the following steps (3) and (4).
- the cell population obtained in step (3) is cultured in the presence of bFGF to differentiate into mesenchymal stem cells. Inducing process
- Step (3) comprises the steps (1) and (2) described above.
- Step (4) is a step of inducing differentiation of mesenchymal stem cells.
- Mesenchymal stem cell as used herein is one of the stem cells present in the adult body, and has the ability to differentiate into mesoderm-derived tissues such as bone, cartilage, blood vessels, and cardiomyocytes. cell.
- Mesenchymal cell markers include positive markers such as CD73, CD105, CD44, and negative markers such as CD45.
- the medium in step (4) may be prepared by adding bFGF to the basal medium mentioned in the explanation of step (1) above, and the basal medium is preferably DMEM, RPMI-1640 or ⁇ MEM, especially ⁇ MEM. can be preferably used.
- the amount of bFGF to be added may be 0.01 to 1000 ng/ml, preferably 0.1 to 100 ng/ml or 1 to 30 ng/ml.
- Components optionally added to the medium include FBS, BSA, and the like.
- the culture conditions and culture vessel in step (4) conform to steps (1) and (2).
- the culture surface may be coated with an extracellular matrix to promote cell engraftment.
- extracellular matrices include RetroNectin (Recombinant Human Fibronectin Fragment), fibronectin and the like, and fibronectin is particularly preferably used.
- the coating amount may be 0.01 to 1000 ⁇ g/cm 2 , preferably 0.1 to 100 ⁇ g/cm 2 or 1 to 30 ⁇ g/cm 2 with respect to the area of the culture surface.
- the culture in step (4) may be performed for about 4 to 20 days, preferably about 8 to 16 days.
- the culture period may be determined by the desired degree of cell differentiation.
- the degree of cell differentiation can be determined by measuring the expression levels of differentiation markers. For example, increasing the expression level of CD73, CD105, or CD44 by FACS, or decreasing the expression level of CD45, or increasing the expression level of any one of CD73, CD105, or CD44 by PCR or decreasing the expression level of CD45 can be done.
- a method for producing mesenchymal stem cells comprises the following steps (3') and (4').
- the cell population obtained in step (3′) is cultured in the presence of bFGF, mesenchymal Step of inducing differentiation into lineage stem cells
- a cell population containing mesenchymal stem cells of one embodiment is a cell population obtained by the above-described method for producing mesenchymal stem cells.
- a cell population containing mesenchymal stem cells has a ratio of CD45-negative, CD73-, CD105-, and CD44-positive cells to the total number of cells of 90% or more.
- the therapeutic agent or pharmaceutical composition of one embodiment is a therapeutic agent and pharmaceutical composition containing, as an active ingredient, the cell population of mesenchymal stem cells or the cell population obtained by the method for producing mesenchymal stem cells. .
- graft-versus-host disease GvHD
- acute respiratory distress syndrome ARDS
- asthma severe heart failure
- myocardial infarction cerebral infarction
- traumatic brain injury brain tumor
- spinal cord injury severe lower extremity ischemia
- Diabetic leg ulcer liver cirrhosis
- acute liver failure chronic liver failure
- Crohn's disease sepsis
- viral infection epidermolysis bullosa
- diabetes diabetic organ disorder
- atopic dermatitis hypersensitivity
- severe combined immunodeficiency syndrome multiple myeloma
- Kawasaki disease scleroderma
- alopecia autoimmune hepatitis
- lupus nephritis aplastic anemia
- rheumatoid arthritis systemic lupus erythematosus
- Sjögren's syndrome psoriasis
- hip osteoarthritis knee osteoarthritis
- OA intervertebral disc degeneration
- the effective amount of the active ingredient in the therapeutic drug or pharmaceutical composition varies depending on the purpose of administration, administration method, and conditions of the administration subject (sex, age, body weight, medical condition, etc.). It is preferable to use 1.0 ⁇ 10 8 cells or more based on the number of mesenchymal stem cells.
- the therapeutic agent or pharmaceutical composition of one embodiment may contain a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the effective amount of the above active ingredients.
- a pharmaceutically acceptable carrier a physiological aqueous solvent (physiological saline, buffer solution, serum-free medium, etc.) can be used.
- the therapeutic agent or pharmaceutical composition may optionally contain preservatives, stabilizers, reducing agents, tonicity agents and the like that are commonly used in medicines containing tissues or cells to be transplanted in transplantation medicine.
- a cell population can be produced as a cell suspension by suspending it in a suitable physiological aqueous solvent. If necessary, the cell population may be cryopreserved with the addition of a cryopreservation agent, thawed at the time of use, washed with a buffer, and used for transplantation medicine.
- the cell population of the active ingredient is produced from established pluripotent stem cells, it is possible to produce a large amount of cell population with stable quality and use it for transplantation by identifying it with a marker or the like and conducting quality control. can. Moreover, since the cell population can be preserved, the cell population can be prepared according to the time of transplantation for the patient.
- the method for determining the differentiation progress state of the pluripotent stem cells when inducing the differentiation of the pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells includes the following steps (I) to including (IV).
- Step II Step of collecting a portion of the cultured cell population at a desired time point
- Step II Step of measuring the expression level of a predetermined gene in the collected cell population
- the measured expression level of the gene is Step (IV) of comparing with the step of determining that the cultured cell population at the desired time point can differentiate into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells when the measured expression level of the gene is equal to or greater than the threshold value
- the “desired time point” means any time point in the culture for inducing the differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells.
- the culture for inducing the differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells includes steps (1) and (2) in the above-described method for producing a cell population containing neural crest cells. obtain.
- Desired time points in step (I) include, for example, a step of inducing differentiation of pluripotent stem cells into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells to obtain a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells. may be at any point within (within the step of step (1)), and within the step of selectively culturing neural crest cells from a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells (step (2 ) may be at any point in the process of ).
- the cell population in culture in step (I) may be a cell population in culture for inducing differentiation from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells, for example, step (1) It may be the cell population in culture of step (2) or the cell population in culture in step (2). Part of the cell population can be collected by conventional methods such as centrifugation, and the number of cells to be collected is not particularly limited. Just do it.
- the predetermined gene may be any gene that can confirm differentiation from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells, and can be used to confirm the differentiation of pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells. It may be a gene whose expression level increases in a cell population after induction of differentiation, preferably a gene that is hardly expressed in pluripotent stem cells and specifically expressed in neural crest cells and/or neural crest progenitor cells. .
- a gene whose expression level is increased in a cell population after differentiation induction (step) from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells is a gene whose expression is enhanced after differentiation induction (step). Alternatively, it may be a gene whose expression is enhanced during the expansion culture period.
- “gene whose expression is enhanced after differentiation induction (step)” means a gene whose expression is enhanced compared to pluripotent stem cells at the end of differentiation induction (step), and is expressed as differentiation induction progresses. contains genes that are gradually upregulated.
- the “gene whose expression is enhanced after induction of differentiation (step)” includes genes whose expression is further enhanced during the expansion culture period.
- the predetermined gene may include, for example, one or more genes whose expression is enhanced after differentiation induction (step) and/or genes whose expression is enhanced during one or more expansion culture periods.
- a given gene may be combined with an undifferentiated marker gene.
- the expression level of a gene as used herein means the amount of the expression product of the gene.
- the expression product of a gene may be, for example, the mRNA of the gene, or the protein or polypeptide encoded by the gene.
- the method for measuring the gene expression level is not particularly limited, it can be carried out by methods known to those skilled in the art. Such methods include, for example, reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR), real-time RT-PCR, Northern blots, RNA sequencing, microarrays, Western blotting, radioimmunoassays, ELISA, and the like.
- RT-PCR reverse transcription polymerase chain reaction
- real-time RT-PCR Northern blots
- RNA sequencing RNA sequencing
- microarrays microarrays
- Western blotting radioimmunoassays
- ELISA and the like.
- SOX10, RHOB, FOXD3, and NOTCH1 may be the genes whose expression is enhanced after one or more of the differentiation inductions (steps).
- the gene whose expression is enhanced during one or more expansion culture periods may include, for example, one or more selected from the group consisting of SOX9, TFAP2A, NGFR, TWIST1, and EDN3, and is TWIST1 and/or NGFR. is preferred.
- Genes whose expression is enhanced after differentiation induction (step) include the SOX9, TFAP2A, NGFR, TWIST1, and EDN3.
- neural crest cell-related genes genes specifically expressed in neural crest cells and/or neural crest progenitor cells (neural crest cell-related genes) in the experiments of the present inventors (Examples 4 to 6). It is Examples of the undifferentiated marker gene include NANOG and Oct3/4.
- Step (III) Step of comparing the measured expression level of the gene with a threshold value>
- the gene expression level measured in step (II) is compared with a preset threshold value.
- the threshold in step (III) may be set, for example, based on the expression level of the predetermined gene in the pluripotent cells before differentiation induction, or the above in the cultured cell population that has not reached the desired state of differentiation You may set based on the expression level of a predetermined gene.
- the threshold may differ depending on the gene expression product (mRNA or polypeptide).
- the predetermined gene is a gene whose expression level increases in a cell population after induction of differentiation from pluripotent stem cells to neural crest cells and/or neural crest progenitor cells (a gene whose expression is enhanced after induction of differentiation (step), and / Or a gene whose expression is enhanced during the expansion culture period), and the threshold is an indicator of a cultured cell population that has not reached the desired state of differentiation. Therefore, when the expression level of the gene is higher than the threshold can determine that a cultured cell population at a desired time point can differentiate into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells.
- the method for determining the differentiation progress state of pluripotent stem cells can also be regarded as a screening method for a substance capable of differentiating a pluripotent stem cell population into a neural crest cell and/or a neural crest progenitor cell population. .
- a cell population determined by the above method to be capable of differentiating into neural crest cells and/or neural crest progenitor cells may be collected, and neural crest cells in the cell population may be selectively cultured. Furthermore, a cell population containing mesenchymal stem cells may be produced by culturing the obtained cell population containing neural crest cells according to the method for producing a cell population containing mesenchymal stem cells.
- laminin ⁇ -chain, ⁇ -chain is ⁇ 1-chain and ⁇ -chain is ⁇ -1-chain, in selective culture of neural crest cells in a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells is the ⁇ 2 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain, laminin wherein the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 2 chain, and laminin where the ⁇ chain is the ⁇ 5 chain and the ⁇ chain is the ⁇ 1 chain and the use of one or more extracellular matrices selected from the group consisting of extracellular matrices containing these laminin integrin binding sites.
- iPS cells SMCB004 established from adult peripheral blood mononuclear cells using CytoTuneTM-2.0 (ID Pharma) were used.
- iMatrix-511 Nippi Co., Ltd., Japan
- iMatrix-511 which is an E8 fragment of laminin 511
- iPS cells suspended in StemFit® AK03N (Ajinomoto Co., Japan) medium were seeded at 8000 cells/well and cultured in an incubator at 37° C., 5% CO 2 for 5 days.
- the day on which the iPS cells were inoculated is Day 0, and subsequent experimental days are indicated by the number of days counted from this day. For example, 5 days after culturing the iPS cells is referred to as Day5.
- ⁇ Induction of differentiation from iPS cells to neural crest cells > 5 days after iPS cell seeding (Day 5), CDM medium (IMDM/Ham's F-12 1:1 (GIBCO, USA), 1x Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO), 15 ⁇ g/ml Optiferrin (InVitria, USA), 7 ⁇ g /mL insulin (Sigma, USA), 450 ⁇ M monothioglycerol (Wako, Japan)) replaced with neural crest cell induction medium supplemented with 20% KSR (GIBCO), 10 ⁇ M SB431542 (Wako) and 1 ⁇ M CHIR99021 (Wako) Then, the cells were cultured in an incubator at 37° C. and 5% CO 2 for 9 days to induce differentiation into neural crest cells. In this example, this differentiation induction time point is called passage 0 (P0).
- iMatrix-221 (Nippi Co., Ltd.), which is an E8 fragment of laminin 221, was added to a 6-well plate at 0.5 ⁇ g/cm 2 and allowed to stand in an incubator at 37° C. for 1 hour. The supernatant was removed by aspiration and then washed with PBS to obtain iMatrix-221 coated plates.
- the cells cultured for 9 days with differentiation induction of neural crest cells were detached and collected using a trypsin/EDTA solution, converted to single cells, and cultured for neural crest cell expansion (5 mg/mL in CDM medium).
- Cells suspended in BSA (Proliant Biologicals, USA), 10 ⁇ M SB431542, 10 ng/mL bFGF (Wako) and 20 ng/mL EGF (R & D systems, Minneapolis, USA) were added to the iMatrix-221-coated plate.
- Cells/well were seeded and cultured in an incubator at 37° C., 5% CO 2 for 10 days.
- this expansion culture that is, the expansion culture after one passage is called passage 1 (P1).
- iPS cells undifferentiated iPS cells
- NCC neural crest cells
- expansion culture P1 Day24
- P2 Day32
- P3 Day35
- a p75-positive cell rate of 98% or more can be obtained only by the expansion culture method of the present invention without sorting p75-positive cells for the cell population after differentiation induction into neural crest cells (P0). rice field. Also, by subculturing another iPS cell (201B7 strain), a p75-positive cell rate of 98% or more could be obtained.
- Fibronectin (Sigma) was added to the plate at 10 ⁇ g/cm 2 and allowed to stand in a 37° C. incubator for 1 hour to obtain a fibronectin-coated plate.
- the expanded cultured neural crest cells were detached and collected using a trypsin/EDTA solution to form single cells, and the cells suspended in a neural crest cell expansion culture medium were placed on a fibronectin-coated plate. and cultured in an incubator at 37°C, 5% CO2 .
- the medium for mesenchymal stem cells ⁇ -MEM (Nacalai Tesque, Japan) medium supplemented with 10% FBS (GIBCO) and 10 ng/mL bFGF (Wako) was substituted and placed at 37°C and 5% CO 2 . They were cultured in an incubator and induced to differentiate into mesenchymal stem cells.
- Example 2 Expansion culture using laminin 211
- iPS cells were induced to differentiate into neural crest cells.
- Cell populations after induction of differentiation were expanded by the following method.
- Laminin-211 (BioLamina) was added to a 6-well plate at 0.45 ⁇ g/cm 2 , allowed to stand in an incubator at 37° C. for 1 hour, and the supernatant was removed by aspiration after adding a small amount of medium, followed by PBS. to obtain a Laminin-211 coated plate.
- the cells that had been cultured for 9 days to induce differentiation of neural crest cells were detached and collected using a trypsin/EDTA solution, converted into single cells, and seeded in a neural crest cell expansion culture medium. Cultured for 10 days in an incubator with % CO2 .
- Example 1 and Example 2 ⁇ Comparison of results between Example 1 and Example 2>
- the cells of Examples 1 and 2 after 10 days of expansion culture (P1) were observed with an optical microscope, and the results are shown in FIG. 3A and 3B are images of cells after 10-day expansion culture in Example 2, and (C) and (D) are images of cells after 10-day expansion culture in Example 1. .
- FIG. 3 the cells of Example 2 were dense, whereas the cells of Example 1 spread and proliferated. It was suggested that the expansion culture method of Example 1 is more suitable for proliferation of neural crest cells.
- the different morphologies of cell densities suggest the possibility that laminin-221 and laminin-211 have different roles in cell engraftment.
- Example 3 Expansion culture using various extracellular matrices
- iPS cells were induced to differentiate into neural crest cells.
- Fibronectin (Sigma) was added to the plate at 10 ⁇ g/cm 2 and allowed to stand in a 37° C. incubator for 1 hour to obtain a fibronectin-coated plate.
- Laminin-111 (BioLamina), Laminin-211 (BioLamina), and Laminin-521 (BioLamina) were added to the 6-well plate at 0.5 ⁇ g/cm 2 each. , left standing in an incubator at 37 ° C. for 1 hour, aspirating off the supernatant after adding a small amount of medium, then washing with PBS, Laminin-111 coated plate, Laminin-211 coated plate, and Laminin-521 coated plate obtained respectively.
- E8 fragments iMatrix-511 (Nippi Co., Ltd.) and iMatrix-221 (Nippi Co., Ltd.) were added to a 6-well plate at 0.5 ⁇ g/cm 2 and incubated for 1 hour in a 37° C. incubator. After allowing to stand and adding a small amount of medium, the supernatant was removed by aspiration, followed by washing with PBS to obtain iMatrix-511-coated plates and iMatrix-221-coated plates, respectively.
- the cells cultured for 9 days to induce differentiation of neural crest cells were detached and collected using a trypsin/EDTA solution, converted into single cells, and the above-mentioned various coated plates were added with media for neural crest cell expansion culture. 50000 cells/well were seeded at 37° C. and 5% CO 2 in an incubator for expansion. On the day after seeding, the state of adhesion of cells to various extracellular matrices was observed with an optical microscope, and the results are shown in FIG. From FIG. 4, it was found that the state of adhesion to different extracellular matrices was different despite the same cell population.
- FIG. 5 shows the ratio of p75-expressing cells (p75-positive cells) to the total number of cells (p75-positive cell ratio).
- Laminin-521 coating experiments only had results up to P4. From FIG.
- the p75-positive cell rate increased with continued expansion culture in the cell population expanded on Laminin-111, iMatrix-211, iMatrix-511, and iMatrix-221 coding. It is recognized that It was also confirmed that the expansion culture using these extracellular matrices yielded a p75-positive cell rate of 90% or more. That is, the cell population obtained by expansion culture using these extracellular matrices can be used as it is for induction of differentiation into mesenchymal stem cells without sorting p75-positive cells (i.e., neural crest cells). can.
- iPS cells before seeding Day 0
- differentiation-induced neural crest cells P0
- P1, P2, P3, P4, and P5 cell populations expanded and cultured using various extracellular matrices NGFR and TFAP2A , TWIST1, SOX10 and SOX9 gene expression was confirmed by real-time PCR (ThermoFisher).
- the primer sequences used were as follows. Also, ⁇ -actin was used as an internal standard.
- the cell population containing neural crest cells obtained by the above culture step contains at least one of TFAP2A, NGFR, and TWIST1 genes. were expressed more than the differentiation-induced neural crest cells (P0). From this, it was confirmed from the gene expression profile that the cells obtained by the expansion culture using the extracellular matrix were neural crest cells.
- the expression level of the SOX9 gene which is important for adherent culture, is increased in the cell population expanded and cultured on the extracellular matrix.
- the state of expression of the SOX9 gene suggested that it was suitable as an expansion culture method using adherent culture (Fig. 7).
- the cell population containing neural crest cells selectively cultured has a decreased SOX10 gene expression level and a high SOX9 expression level. Conditions tend to show a profile of down-regulating the SOX10 gene and up-regulating the SOX9 gene.
- the cell population after culturing in the culture step of adherently culturing a cell population containing neural crest cells and/or neural crest progenitor cells has characteristics of decreasing the expression of the SOX10 gene and increasing the expression of the SOX9 gene.
- a cell population in which the SOX10 gene expression level is decreased and the SOX9 gene expression level is increased compared to the cell population at the start of the expansion culture is one aspect of the present invention.
- Example 4 Cluster analysis based on gene expression levels during expansion culture using various extracellular matrices.
- Gene expression levels of P1 to P5 cells prepared by expansion culture using various extracellular matrices in Example 3 were obtained by microarray analysis. Microarray analysis was performed by using the GeneChip® Human Genome U133 Plus 2.0 Array (Applied Biosystems). Next, based on comparison of signal intensity at each passage (P1 to P5) from the total gene expression level obtained by microarray analysis, cluster analysis of each cell was performed by Ward's method using R. Ward's method is one of hierarchical clustering methods, and is a method for extracting the hierarchical structure of clusters from data. Ward's method combines and clusters data to minimize variance. FIG. 8 shows the results of cluster analysis by Ward's method.
- the results of cluster analysis showed that cells were clearly classified according to the gene expression status due to differences in the extracellular matrix, similar to the difference in p75 expression status in flow cytometry shown in Figure 5. From the above results, it was found that the neural crest cell-related gene and undifferentiated marker gene expression states were different. In addition, since the cells were clearly classified according to the gene expression state due to the difference in extracellular matrix, neural crest cells with a certain tendency of gene expression state (neurons with a certain tendency of cell state) in the same extracellular matrix group crest cells). A trended gene expression state is one in which cells obtained by culture exhibit a trend in gene expression (a measurable pattern of gene expression).
- Example 5 Comparison of expression of each gene during expansion culture using various extracellular matrices
- Undifferentiated gene markers and neural crest cell-related gene data were extracted from the gene expression levels obtained in Example 4 in Tables 2 and 3.
- the relative expression level of each of the extracted undifferentiated marker gene and neural crest cell-related gene shows the results of comparing the signal intensity between iPS cells and P0 or P5.
- neural crest cell-related genes are expressed in a group of genes (SOX10, RHOB, FOXD3, NOTCH1) whose expression is enhanced after neural crest cell induction (up to P0) and in the late induction period (P1 to P5).
- SOX9, TFAP2A, NGFR, TWIST1, EDN3 are expressed in which is enhanced, and showed similar behavior even when the extracellular matrix was different.
- Example 6 Comparison of gene expression states when differentiation into neural crest cells is induced using extracellular matrices that differ only in ⁇ chain. From the results of the cluster analysis in Example 4, it became clear that the expression states of neural crest cell-related genes and undifferentiated marker genes, in particular, were changed by culturing with a changed extracellular matrix from P0. For further investigation, cluster analysis of cells from P0 to P5 based on total gene expression obtained by microarray analysis was performed using extracellular matrices that differed only in the ⁇ chain. Cluster analysis was performed in the same manner as in Example 4, except that Laminin-211 and iMatirx-221 were used as extracellular matrices differing only in the ⁇ chain. The results are shown in FIG.
- the method for producing neural crest cells of the present invention it is possible to stably mass-produce neural crest cells from pluripotent stem cells, and as a result, stably mass-produce mesenchymal stem cells from pluripotent stem cells. can do.
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Abstract
本発明は、多能性幹細胞から神経堤細胞を、細胞を用いた治療に用いることが可能な品質で安定的に大量生産できる、神経堤細胞を含む細胞集団の培養方法及び製造方法、並びに当該神経堤細胞を用いる間葉系幹細胞等の製造方法を提供することを目的とする。本発明の神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養方法は、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える。
Description
本発明は、神経堤細胞の培養方法及び製造方法に関する。
神経堤細胞は、神経堤に由来する細胞であり、末梢神経系の神経細胞、シュワン細胞、メラノサイト、内分泌細胞、平滑筋、頭部骨格、角膜、虹彩などの多様な細胞種へ分化する。そのため、脊椎動物が進化した過程で獲得した「第四の胚葉」とも呼ばれる。
近年、iPS細胞などの多能性幹細胞を神経堤細胞へ分化誘導し、さらに神経堤細胞を間葉系幹細胞へ分化誘導する方法が提案されている(特許文献1~4、非特許文献1~2)。また、目的の神経堤細胞を純化するため、当該方法の工程の中で、iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導後に、FACS等によるソーティングにより神経堤細胞マーカー陽性細胞を選別する操作を行うことが提案されている(例えば、非特許文献1)。しかしながら、臨床応用に際して、製造工程におけるコンタミネーションを排除することができ、より安全性の高い、神経堤細胞の製造方法の確立が求められている。
一方、細胞外マトリクスであるフィブロネクチン及びラミニンの受容体であるインテグリンは、神経堤細胞と細胞外マトリクスとの相互作用に必須であると報告されている(非特許文献3)。また、特許文献5は、ラミニン211又はラミニン211のE8フラグメントの存在下で神経堤細胞への分化を制御する方法を示している。また、非特許文献4は、iPS細胞から目の細胞に誘導する際、ラミニン211でコーティングした培養容器を用いると神経堤細胞に誘導されることを報告している。さらに、特許文献6は、ラミニン211を細胞の足場として用いて拡大培養する工程を含む神経堤細胞の純化方法を開示している。
間葉系幹細胞の培養に関しては、例えば特許文献7に開示の間葉系幹細胞用培地が知られている。
Makoto Fukuta et al., "Derivation of Mesenchymal Stromal Cells from Pluripotent Stem Cells through a Neural Crest Lineage using Small Molecule Compounds with Defined Media", PLoS One. 2014 Dec 2;9(12):e112291
Alan W. Leung et al., "WNT/β-catenin signaling mediates human neural crest induction via a pre-neural border intermediate", Development, 143:398-410, 2016
Laura S. Gammill et al., "Division of labor during trunk neural crest development", Dev Biol. 2010 Aug 15; 344(2): 555-565
Shun Shibata et al., "Selective Laminin-Directed Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Distinct Ocular Lineages", Cell Reports, 2018, 25(6):1668-1679
細胞を用いた治療に際しては、目的細胞を適切に選別し増殖させること、及び、培養工程において細菌等のコンタミネーションが発生する危険性を排除することが重要な課題である。
本発明は、多能性幹細胞から神経堤細胞を、細胞を用いた治療に用いることが可能な品質で安定的に大量生産できる、神経堤細胞を含む細胞集団の培養方法及び製造方法、並びに当該神経堤細胞を用いる間葉系幹細胞等の製造方法を提供することを目的とする。
また、神経堤細胞は、様々な細胞に分化することができるため、神経堤細胞が目的の細胞へ分化することができる特徴を備えるよう、神経堤細胞を選別し、所望の細胞状態の神経堤細胞を得ることも本発明の目的である。
本発明者らは、多能性幹細胞から分化誘導した神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を、特定のラミニン又はその断片を足場として培養することで、神経堤細胞を高純度で含有する細胞集団を得られることを見出し、臨床応用上望ましい品質を有する神経堤細胞を安定的に効率よく製造する方法を完成させた。
すなわち、本発明は以下の各発明に関する。
[1]
α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養方法。
[2]
上記ラミニンのγ鎖がγ1鎖である、[1]に記載の培養方法。
[3]
上記ラミニンが、ラミニン221である、[1]又は[2]に記載の培養方法。
[4]
上記ラミニンのインテグリン結合部位が、ラミニンのE8フラグメントである、[1]~[3]のいずれかに記載の培養方法。
[5]
上記培養工程にて培養後の細胞集団が、EDN3、TFAP2A、NGFR及びTWIST1から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する、[1]~[4]のいずれかに記載の培養方法。
[6]
上記培養工程において、上記細胞集団が接着する培養面の少なくとも一部が上記細胞外マトリクスでコーティングされており、上記細胞集団が培地中にて接着培養される、[1]~[5]のいずれかに記載の培養方法。
[7]
上記培地は、神経堤細胞の維持に適する培地である、[6]に記載の培養方法。
[8]
培養前の細胞集団に比べて、培養後の細胞集団における全細胞数及び全細胞数に対する神経堤細胞の割合の両方が増加する、[1]~[7]のいずれかに記載の培養方法。
[9]
(1)多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程と、
(2)工程(1)で得られた細胞集団を[1]~[8]のいずれかに記載の培養方法で接着培養する工程と
を備える、神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法。
[10]
工程(1)で得られ得られた細胞集団を、神経堤細胞マーカーにより選別することなく、工程(2)に供する、[9]に記載の製造方法。
[11]
工程(1)が、多能性幹細胞を含む細胞集団を、少なくとも1つのSMADシグナル伝達阻害剤及び少なくとも1つのWntシグナル伝達活性化剤を含む培地で培養することを含む、[9]又は[10]に記載の製造方法。
[12]
上記SMADシグナル伝達阻害剤が、TGFβ阻害剤である、[11]に記載の製造方法。
[13]
上記Wntシグナル伝達活性化剤が、GSK3β阻害剤である、[11]又は[12]に記載の製造方法。
[14]
工程(1)が、7日間~18日間行われる、[9]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15]
工程(1)における培地が、血清代替物又は血清を含まない合成培地である、[9]~[14]のいずれかに記載の製造方法。
[16]
(3)[9]~[15]のいずれかに記載の製造方法で神経堤細胞を含む細胞集団を製造する工程と、
(4)工程(3)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程と
を備える、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
[17]
[16]に記載の製造方法で製造された、間葉系幹細胞を含む細胞集団。
[18]
[17]に記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団を有効成分として含有する、移植片対宿主病(GvHD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、喘息、重症心不全、心筋梗塞、脳梗塞、外傷性脳損傷、脳腫瘍、脊髄損傷、重症下肢虚血、糖尿病性下肢潰瘍、肝硬変、急性肝不全、慢性肝不全、クローン病、敗血症、ウイルス感染症、表皮水疱症、糖尿病、糖尿病性臓器障害、アトピー性皮膚炎、過敏症、重度複合免疫不全症候群、多発性骨髄腫、川崎病、強皮症、脱毛症、自己免疫性肝炎、ループス腎炎、再生不良性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、変形性股関節症、変形性膝関節症(OA)、椎間板変性、皮膚軟部組織感染症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、緑膿菌感染症、後天性免疫不全症候群、狂犬病、インフルエンザ、骨壊死、骨減少症、歯槽骨喪失、骨損傷、骨形成不全症、脊椎癒着、筋萎縮、腱損傷、膝部損傷、筋損傷、筋骨格損傷、骨粗鬆症、運動障害疾患、多発性硬化症、脳性麻痺、認知症、視神経炎、手根管症候群、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、トゥレット症候群、顔面萎縮症、脳室周囲白質軟化症、脊髄小脳変性症、統合失調症、双極性障害、大うつ病性障害、不安障害、適応障害、アルコール依存症、先天性自律神経失調症、脳炎、癲癇、二分脊椎、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、ファブリー病、ハンチントン病、ムコ多糖症I型、シャルコー・マリー・トゥース病、神経因性疼痛、末梢神経障害、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、坐骨神経痛、脊柱管狭窄症、低酸素性虚血性脳症、脳出血、乳がん、転移性膵臓がん、膵管腺がん、消化器がん、頭頸部がん、口腔がん、中皮腫、転移性非小細胞肺がん、黒色腫、皮膚がん、膠芽腫、固形がん、腺がん、神経膠腫、髄芽腫、ブドウ膜黒色腫、気管支拡張症、慢性気管支炎、呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、肺奇形、肺気腫、塵肺症、呼吸不全、急性肺損傷、肺損傷、子癇前症、うっ血性心不全、狭心症、心筋炎、先天性心疾患、拡張型心筋症、多臓器不全、冠動脈疾患、虚血、静脈瘤潰瘍、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、肺狭窄、動静脈瘻、末梢血管疾患、血管新生障害、アテローム性動脈硬化、角膜損傷、角膜炎、角膜変性症、角膜潰瘍、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性症、萎縮型加齢黄斑変性、眼球乾燥症、角膜浮腫、滲出型加齢黄斑変性、瘻孔、創傷治癒、肥満、ピット・ホプキンス症候群、褥瘡、下肢潰瘍、皮膚潰瘍、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、難聴、肛門周囲瘻、直腸瘻、痔瘻、直腸膣瘻、アルコール性肝障害、膵炎、胆道閉鎖症、消化管出血、原発性硬化性胆管炎、直腸炎、食道損傷、肝損傷、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、早期卵巣機能不全、卵巣がん、***減少症、精巣疾患、***不全、陰茎硬結、子宮損傷、腎不全、糖尿病性腎症、腎損傷、腎線維症、間質性膀胱炎、IgA腎症、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、C3糸球体症、サラセミア、白血病、全身性炎症反応症候群、放射線宿酔、皮膚の火傷、再灌流障害、シンドロームX、代謝疾患、口腔粘膜炎、歯周病、歯肉病、及び自閉スペクトラム症から選択される疾患の治療薬、又は、再生医療における移植に伴う拒絶反応の抑制、移植(臓器移植、造血幹細胞移植、骨髄移植、角膜移植、膵島移植)の補助、老化の改善、及びワクチンへの利用から選択される応用的な利用のための医薬組成物。
[19]
多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導する際に、上記多能性幹細胞の分化進行状態を判定するための方法であって、
(I)所望の時点で培養中の細胞集団の一部を採取する工程と、
(II)採取した細胞集団の所定の遺伝子の発現量を測定する工程と、
(III)測定した上記遺伝子の発現量を、閾値と比較する工程と、
(IV)測定した上記遺伝子の発現量が上記閾値以上であるとき、上記所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含む、方法。
[20]
上記所定の遺伝子は、1つ以上の分化誘導後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子を含む、[19]に記載の方法。
[21]
上記1つ以上の分化誘導後に発現が亢進する遺伝子が、SOX10、RHOB、FOXD3、及びNOTCH1からなる群より選択される1つ以上を含み、上記1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子が、SOX9、TFAP2A、NGFR、TWIST1、及びEDN3からなる群より選択される1つ以上を含む、[20]に記載の方法。
[22]
上記所望の時点は、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程内の任意の時点である、又は
前記所望の時点は、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を選択的に培養する工程内の任意の時点である、[19]~[21]のいずれかに記載の方法。
[23]
神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養における、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの使用。
[1]
α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養方法。
[2]
上記ラミニンのγ鎖がγ1鎖である、[1]に記載の培養方法。
[3]
上記ラミニンが、ラミニン221である、[1]又は[2]に記載の培養方法。
[4]
上記ラミニンのインテグリン結合部位が、ラミニンのE8フラグメントである、[1]~[3]のいずれかに記載の培養方法。
[5]
上記培養工程にて培養後の細胞集団が、EDN3、TFAP2A、NGFR及びTWIST1から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する、[1]~[4]のいずれかに記載の培養方法。
[6]
上記培養工程において、上記細胞集団が接着する培養面の少なくとも一部が上記細胞外マトリクスでコーティングされており、上記細胞集団が培地中にて接着培養される、[1]~[5]のいずれかに記載の培養方法。
[7]
上記培地は、神経堤細胞の維持に適する培地である、[6]に記載の培養方法。
[8]
培養前の細胞集団に比べて、培養後の細胞集団における全細胞数及び全細胞数に対する神経堤細胞の割合の両方が増加する、[1]~[7]のいずれかに記載の培養方法。
[9]
(1)多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程と、
(2)工程(1)で得られた細胞集団を[1]~[8]のいずれかに記載の培養方法で接着培養する工程と
を備える、神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法。
[10]
工程(1)で得られ得られた細胞集団を、神経堤細胞マーカーにより選別することなく、工程(2)に供する、[9]に記載の製造方法。
[11]
工程(1)が、多能性幹細胞を含む細胞集団を、少なくとも1つのSMADシグナル伝達阻害剤及び少なくとも1つのWntシグナル伝達活性化剤を含む培地で培養することを含む、[9]又は[10]に記載の製造方法。
[12]
上記SMADシグナル伝達阻害剤が、TGFβ阻害剤である、[11]に記載の製造方法。
[13]
上記Wntシグナル伝達活性化剤が、GSK3β阻害剤である、[11]又は[12]に記載の製造方法。
[14]
工程(1)が、7日間~18日間行われる、[9]~[13]のいずれかに記載の製造方法。
[15]
工程(1)における培地が、血清代替物又は血清を含まない合成培地である、[9]~[14]のいずれかに記載の製造方法。
[16]
(3)[9]~[15]のいずれかに記載の製造方法で神経堤細胞を含む細胞集団を製造する工程と、
(4)工程(3)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程と
を備える、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。
[17]
[16]に記載の製造方法で製造された、間葉系幹細胞を含む細胞集団。
[18]
[17]に記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団を有効成分として含有する、移植片対宿主病(GvHD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、喘息、重症心不全、心筋梗塞、脳梗塞、外傷性脳損傷、脳腫瘍、脊髄損傷、重症下肢虚血、糖尿病性下肢潰瘍、肝硬変、急性肝不全、慢性肝不全、クローン病、敗血症、ウイルス感染症、表皮水疱症、糖尿病、糖尿病性臓器障害、アトピー性皮膚炎、過敏症、重度複合免疫不全症候群、多発性骨髄腫、川崎病、強皮症、脱毛症、自己免疫性肝炎、ループス腎炎、再生不良性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、変形性股関節症、変形性膝関節症(OA)、椎間板変性、皮膚軟部組織感染症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、緑膿菌感染症、後天性免疫不全症候群、狂犬病、インフルエンザ、骨壊死、骨減少症、歯槽骨喪失、骨損傷、骨形成不全症、脊椎癒着、筋萎縮、腱損傷、膝部損傷、筋損傷、筋骨格損傷、骨粗鬆症、運動障害疾患、多発性硬化症、脳性麻痺、認知症、視神経炎、手根管症候群、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、トゥレット症候群、顔面萎縮症、脳室周囲白質軟化症、脊髄小脳変性症、統合失調症、双極性障害、大うつ病性障害、不安障害、適応障害、アルコール依存症、先天性自律神経失調症、脳炎、癲癇、二分脊椎、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、ファブリー病、ハンチントン病、ムコ多糖症I型、シャルコー・マリー・トゥース病、神経因性疼痛、末梢神経障害、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、坐骨神経痛、脊柱管狭窄症、低酸素性虚血性脳症、脳出血、乳がん、転移性膵臓がん、膵管腺がん、消化器がん、頭頸部がん、口腔がん、中皮腫、転移性非小細胞肺がん、黒色腫、皮膚がん、膠芽腫、固形がん、腺がん、神経膠腫、髄芽腫、ブドウ膜黒色腫、気管支拡張症、慢性気管支炎、呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、肺奇形、肺気腫、塵肺症、呼吸不全、急性肺損傷、肺損傷、子癇前症、うっ血性心不全、狭心症、心筋炎、先天性心疾患、拡張型心筋症、多臓器不全、冠動脈疾患、虚血、静脈瘤潰瘍、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、肺狭窄、動静脈瘻、末梢血管疾患、血管新生障害、アテローム性動脈硬化、角膜損傷、角膜炎、角膜変性症、角膜潰瘍、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性症、萎縮型加齢黄斑変性、眼球乾燥症、角膜浮腫、滲出型加齢黄斑変性、瘻孔、創傷治癒、肥満、ピット・ホプキンス症候群、褥瘡、下肢潰瘍、皮膚潰瘍、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、難聴、肛門周囲瘻、直腸瘻、痔瘻、直腸膣瘻、アルコール性肝障害、膵炎、胆道閉鎖症、消化管出血、原発性硬化性胆管炎、直腸炎、食道損傷、肝損傷、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、早期卵巣機能不全、卵巣がん、***減少症、精巣疾患、***不全、陰茎硬結、子宮損傷、腎不全、糖尿病性腎症、腎損傷、腎線維症、間質性膀胱炎、IgA腎症、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、C3糸球体症、サラセミア、白血病、全身性炎症反応症候群、放射線宿酔、皮膚の火傷、再灌流障害、シンドロームX、代謝疾患、口腔粘膜炎、歯周病、歯肉病、及び自閉スペクトラム症から選択される疾患の治療薬、又は、再生医療における移植に伴う拒絶反応の抑制、移植(臓器移植、造血幹細胞移植、骨髄移植、角膜移植、膵島移植)の補助、老化の改善、及びワクチンへの利用から選択される応用的な利用のための医薬組成物。
[19]
多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導する際に、上記多能性幹細胞の分化進行状態を判定するための方法であって、
(I)所望の時点で培養中の細胞集団の一部を採取する工程と、
(II)採取した細胞集団の所定の遺伝子の発現量を測定する工程と、
(III)測定した上記遺伝子の発現量を、閾値と比較する工程と、
(IV)測定した上記遺伝子の発現量が上記閾値以上であるとき、上記所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含む、方法。
[20]
上記所定の遺伝子は、1つ以上の分化誘導後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子を含む、[19]に記載の方法。
[21]
上記1つ以上の分化誘導後に発現が亢進する遺伝子が、SOX10、RHOB、FOXD3、及びNOTCH1からなる群より選択される1つ以上を含み、上記1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子が、SOX9、TFAP2A、NGFR、TWIST1、及びEDN3からなる群より選択される1つ以上を含む、[20]に記載の方法。
[22]
上記所望の時点は、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程内の任意の時点である、又は
前記所望の時点は、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を選択的に培養する工程内の任意の時点である、[19]~[21]のいずれかに記載の方法。
[23]
神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養における、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの使用。
本発明の神経堤細胞の培養方法及び神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法によれば、フローサイトメトリーなどによって分化誘導後の神経堤細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を選別しなくても、高純度の神経堤細胞を含む細胞集団を提供することができる。さらに、得られた該細胞集団を間葉系幹細胞へ分化誘導することで、高純度の間葉系幹細胞を含む細胞集団を提供することができる。
本発明の多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化進行状態の判定方法によれば、とりわけ所定の遺伝子の発現量によって、所望の時点における培養細胞集団の、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化進行状態を判定することができる。また、本発明によれば、神経堤細胞を選別し、所望の細胞状態の神経堤細胞を得ることが可能となる。
〔神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法〕
一実施形態の神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法は、少なくとも下記の工程(1)及び工程(2)を備える。
(1)多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
(2)工程(1)で得られた神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を、所定の細胞外マトリクスの存在下で接着培養する工程
一実施形態の神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法は、少なくとも下記の工程(1)及び工程(2)を備える。
(1)多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程
(2)工程(1)で得られた神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を、所定の細胞外マトリクスの存在下で接着培養する工程
工程(1)は、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導工程であり、工程(2)は、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の割合を高める(純化)ための神経堤細胞の選択的培養工程である。
<工程(1) 多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導>
[多能性幹細胞]
本明細書において「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。
[多能性幹細胞]
本明細書において「幹細胞」とは、分化能及び分化能を維持した増殖能(特に自己複製能)を有する未分化細胞を意味する。幹細胞には、分化能力に応じて、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)、複能性幹細胞(multipotent stem cell)、単能性幹細胞(unipotent stem cell)等の亜集団が含まれる。
多能性幹細胞は、受精卵、クローン胚、生殖幹細胞、組織内幹細胞、体細胞などから誘導することができる。多能性幹細胞としては、胚性幹細胞(ES細胞:Embryonic stem cell)、EG細胞(Embryonic germ cell)、人工多能性幹細胞(iPS細胞:induced pluripotent stem cell)などを挙げることができる。
ES細胞は、1981年に初めて樹立され、1989年以降ノックアウトマウス作製にも応用されている。1998年にはヒトES細胞が樹立されており、再生医療にも利用されつつある。ES細胞は、内部細胞塊をフィーダー細胞上で培養することによって製造可能である。フィーダー細胞に代えて、マウスの場合はLIF(白血病抑制因子)、ヒトの場合はbFGF(線維芽細胞増殖因子)を含む培地中で培養することによって製造することもできる。ES細胞の製造方法は、例えば、WO96/22362、WO02/101057、US5,843,780、US6,200,806、US6,280,718などに記載されている。ES細胞は、所定の機関から入手でき、また、市販品を購入することもできる。例えば、ヒトES細胞であるKhES-1、KhES-2及びKhES-3は、京都大学再生医科学研究所から入手可能である。マウスES細胞であるEB5細胞株及びD3細胞株は、それぞれ国立研究開発法人理化学研究所及びATCCから入手可能である。なお、ES細胞は受精14日以内の胚から樹立したES細胞である。
ES細胞の一つである核移植胚性幹細胞(ntES細胞)は、核を取り除いた卵子に体細胞の核を移植して作ったクローン胚から樹立することができる。
EG細胞は、始原生殖細胞をmSCF、LIF及びbFGFを含む培地中で培養することによって製造することができる(Cell,70:841-847,1992)。
本明細書における「人工多能性幹細胞(iPS細胞;induced pluripotent stem cell)」とは、体細胞を、公知の方法などによって初期化(reprogramming)することで、多能性を誘導した細胞である。具体的には、線維芽細胞、又は末梢血単核球などの分化した体細胞を、Oct3/4、Sox2、Klf4、Myc(c-Myc、N-Myc、L-Myc)、Glis1、Nanog、Sall4、Lin28、Esrrbなどを含む初期化遺伝子群から選ばれる複数の遺伝子の組合せのいずれかの発現によって初期化して、多分化能を誘導した細胞が挙げられる。好ましい初期化因子の組み合わせとしては、(1)Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(例えばc-Myc又はL-Myc)、(2)Oct3/4、Sox2、Klf4、Lin28及びL-Myc(Stem Cells,2013;31:458-466)を挙げることが出来る。
iPS細胞は、2006年、山中らによってマウス細胞で樹立された(Cell,2006,126(4),pp.663-676)。iPS細胞は、2007年にヒト線維芽細胞でも樹立され、ES細胞と同様に多能性と自己複製能を有する(Cell,2007,131(5),pp.861-872;Science,2007,318(5858),pp.1917-1920;Nat. Biotechnol.,2008,26(1),pp.101-106)。
iPS細胞は、遺伝子発現による直接初期化で製造する方法以外に、化合物の添加などによって体細胞からiPS細胞を誘導する方法によっても製造することができる(Science,2013,341,pp.651-654)。
また、株化されたiPS細胞を入手することも可能であり、例えば、京都大学で樹立された201B7細胞、201B7-Ff細胞、253G1細胞、253G4細胞、1201C1細胞、1205D1細胞、1210B2細胞、1231A3細胞などのヒトiPS細胞株が、京都大学から入手可能である。株化された臨床用のiPS細胞として、例えば、京都大学で樹立されたFf-I01、Ff-I14、QHJI01及びQHJI14が京都大学から入手可能である。また、iPS細胞は例えば体細胞を用いて製造することが可能である。
iPS細胞を製造する際に用いられる体細胞としては、特に限定は無いが、組織由来の線維芽細胞、血球系細胞(例えば、末梢血単核球(PBMC)、T細胞)、肝細胞、膵臓細胞、腸上皮細胞、平滑筋細胞、歯髄細胞などが挙げられる。iPS細胞を製造する際に用いられる体細胞の由来としては、ヒト血管から採取した末梢血や臍帯血、皮膚組織、歯等が挙げられる。
iPS細胞を製造する際に、数種類の遺伝子の発現によって初期化する場合、遺伝子を発現させるための手段は特に限定されない。上記手段としては、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、センダイウイルスベクター、アデノウイルスベクター、又はアデノ随伴ウイルスベクター)を用いた感染法、プラスミドベクター(例えば、プラスミドベクター、又はエピソーマルベクター)を用いた遺伝子導入法(例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、レトロネクチン法、又はエレクトロポレーション法)、RNAベクターを用いた遺伝子導入法(例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法)、タンパク質の直接注入法(例えば、針を用いた方法、リポフェクション法、又はエレクトロポレーション法)などが挙げられる。また、市販のiPS細胞作製キット(例えば、センダイウイルスベクターを用いたiPS細胞作製キットCytoTune(商標)-iPS)を用いてもよい。
iPS細胞は、フィーダー細胞存在下又はフィーダー細胞非存在下(フィーダーフリー)で製造できる。フィーダー細胞存在下でiPS細胞を製造する際には、公知の方法で、未分化維持因子存在下でiPS細胞を製造できる。フィーダーフリーでiPS細胞を製造する際に用いられる培地としては、特に限定は無いが、公知のES細胞及び/又はiPS細胞の維持培地、又はフィーダーフリーでiPS細胞を樹立するための培地を用いることができる。フィーダーフリーでiPS細胞を樹立するための培地としては、例えばEssential 8培地(E8培地)、Essential 6培地、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、Stabilized Essential 8培地、StemFit培地などのフィーダーフリー培養用培地を挙げることができ、いずれも市販されている培地を入手可能である。iPS細胞を製造する際、例えば、フィーダーフリーで体細胞に、センダイウイルスベクターを用いて、Oct3/4、Sox2、Klf4、及びMyc(例えばc-Myc又はL-Myc)の4因子を遺伝子導入することで、iPS細胞を製造することができる。
本発明における多能性幹細胞は、好ましくは哺乳動物の多能性幹細胞であり、より好ましくはげっ歯類(例、マウス又はラット)又は霊長類(例、ヒト又はサル)の多能性幹細胞であり、さらに好ましくは霊長類の多能性幹細胞、特に好ましくはヒトiPS細胞またはヒトES細胞である。
[多能性幹細胞の未分化維持培地]
本明細書おいて多能性幹細胞の培養に用いられる培地、すなわち多能性幹細胞の多能性を維持可能な培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。多能性幹細胞の培養のための基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地及びこれらの混合培地を挙げることができる。
本明細書おいて多能性幹細胞の培養に用いられる培地、すなわち多能性幹細胞の多能性を維持可能な培地は、動物細胞の培養に通常用いられる培地を基礎培地として調製することができる。多能性幹細胞の培養のための基礎培地としては、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow’s Minimal Essential Medium(GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、Neurobasal培地及びこれらの混合培地を挙げることができる。
本明細書において、多能性幹細胞の多能性を維持可能な培地は、多能性幹細胞の未分化状態を維持すべく、未分化維持因子を含む培地(未分化維持培地)であることが望ましい。当該培地は、市販品を利用することができ、例えば、基礎培地に未分化維持因子、血清代替物及び適宜栄養源などを添加することにより、調製することができる。具体的には、DMEM/F12培地にbFGF、KSR、非必須アミノ酸(non-essential amino acid;NEAA)、L-グルタミン及び2-メルカプトエタノールを添加することにより、調製することができる。また、上述したEssential 8培地(E8培地)、Essential 6培地、TeSR培地、mTeSR培地、mTeSR-E8培地、Stabilized Essential 8培地、StemFit培地などのフィーダーフリー培地を用いることもできる。
安全性を確保し、ロット間差を少なくするなどの好適な品質を確保する観点から、多能性幹細胞の培養に用いる培地は、好ましくはゼノフリー培地、さらに好ましくは動物由来成分を含まず化学的に既知組成である培地が好ましい。従って、多能性幹細胞の培養に用いられる培地は、フィーダーフリー培地、無血清培地であることが望ましい。
[神経堤細胞への分化誘導方法]
神経堤(Neural Crest)は、脊椎動物の初期発生において表皮外胚葉と神経板の間に一過性に形成される構造であり、様々な細胞種に分化するため「第四の胚葉」とも呼ばれている。神経堤細胞(Neural Crest Cell; NCC)は神経堤から脱上皮化し、上皮から間葉への転換を行った後に、発生中の胚内で広範囲に遊走する細胞群である。胚内で特異的な領域に分布することにより、領域に特徴的な様々な細胞種、例えば、末梢神経、軟骨、平滑筋等に分化する。神経堤細胞は一過性に発生する細胞集団であるため、発生中の胚から回収するのは困難であったが、近年、マウスやヒトの多能性幹細胞から神経堤への分化誘導法の開発が報告されたことにより、入手することが可能となった。神経堤前駆細胞とは、神経堤細胞に分化することが運命づけられた細胞群の総称である。
神経堤(Neural Crest)は、脊椎動物の初期発生において表皮外胚葉と神経板の間に一過性に形成される構造であり、様々な細胞種に分化するため「第四の胚葉」とも呼ばれている。神経堤細胞(Neural Crest Cell; NCC)は神経堤から脱上皮化し、上皮から間葉への転換を行った後に、発生中の胚内で広範囲に遊走する細胞群である。胚内で特異的な領域に分布することにより、領域に特徴的な様々な細胞種、例えば、末梢神経、軟骨、平滑筋等に分化する。神経堤細胞は一過性に発生する細胞集団であるため、発生中の胚から回収するのは困難であったが、近年、マウスやヒトの多能性幹細胞から神経堤への分化誘導法の開発が報告されたことにより、入手することが可能となった。神経堤前駆細胞とは、神経堤細胞に分化することが運命づけられた細胞群の総称である。
本明細書における「神経堤細胞」及び「神経堤前駆細胞」は、発生中に胚から得られる神経堤細胞及び神経堤前駆細胞、分化誘導法により得られた神経堤細胞及び神経堤前駆細胞を指し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞に発現するマーカーにより同定することができる。神経堤細胞マーカーとしては、TFAP2A、NGFR(p75と同義)、TWIST(TWIST1又はTWIST2)、EDN3などが挙げられ、神経堤前駆細胞マーカーとしては、FOXD3、PAX3、ZIC1などが挙げられる。
本明細書において、「神経堤細胞を含む細胞集団」には、神経堤前駆細胞が含まれていてもよい。また、「神経堤細胞を含む細胞集団」は神経堤幹細胞を含有する可能性がある。
神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞は、多能性幹細胞から分化誘導によって得ることができる。分化誘導の方法は特に限定されないが、例えば、特許文献1~4、非特許文献1~2に記載の方法を用いることができる。また、分化誘導の効率を考慮すれば、多能性幹細胞を含む細胞集団を、少なくとも1つのSMADシグナル伝達阻害剤及び少なくとも1つのWntシグナル伝達活性化剤を含む培地で培養するのが好ましい。
SMADシグナル伝達阻害剤としては、例えば、SMADシグナルの上流において、SMADのリン酸化を阻害することでSMADシグナル伝達を阻害し得るTGFβスーパーファミリーの阻害剤であり、具体的には、TGFβ阻害剤及びBMP阻害剤が挙げられる。SMADシグナル伝達阻害剤は、1以上のTGFβ阻害剤と、1以上のBMP阻害剤とを適宜組合せて使用してもよい。SMADシグナル伝達阻害剤として、少なくとも1つのTGFβ阻害剤を含むことが好ましい。
本明細書において、TGFβ阻害剤は、TGFβにより媒介されるシグナル伝達を抑制し得るものである限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。TGFβ阻害剤として、例えばTGFβに直接作用する物質(例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等)、TGFβをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、TGFβ受容体とTGFβの結合を阻害する物質、TGFβ受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質(例えば、TGFβ受容体の阻害剤等)を挙げることができる。TGFβ阻害剤として、受容体であるALKファミリーへの結合を阻害する物質、又はALKファミリーによるSMADのリン酸化を阻害する物質が挙げられる。
本明細書において、具体的なTGFβ阻害剤としては、例えばSB431542、SB202190(R.K.Lindemann et al., Mol. Cancer 2:20(2003))、SB505124(GlaxoSmithKline)、NPC30345、SD093、SD908、SD208(Scios)、LY2109761、LY364947、LY580276(Lilly Research Laboratories)、A-83-01(WO2009146408)、Galunisertib(LY2157299)、LY3200882、SB525334、GW788388、RepSox、Lefty-1(NCBI Accession No.として、マウス:NM_010094、ヒト:NM_020997が例示される)、Lefty-2(NCBI Accession No.として、マウス:NM_177099、ヒト:NM_003240及びNM_001172425が例示される)、及びこれらの誘導体等が挙げられ、少なくとも1つのTGFβ阻害剤を使用することができる。TGFβ阻害剤として、好ましくは、TGFβ受容体(ALK5)及びアクチビン受容体(ALK4/7)の阻害剤として知られている、SB431542及びA83-01からなる群から選択される1以上であることが好ましい。
培地中におけるTGFβ阻害剤の濃度は、TGFβにより媒介されるシグナル伝達を抑制可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、SB431542の濃度は、ALK5を阻害可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば、100nM~100μM、好ましくは500nM~30μM、更に好ましくは1μM~20μMである。他のTGFβ阻害剤の場合、前述の濃度のSB431542に相当するALK阻害活性若しくはTGFβ阻害活性を示す濃度を、適宜設定することができる。
BMP阻害剤は、BMP(bone morphogenetic protein)とBMP受容体(I型又はII型)との結合を介するBMPシグナル伝達(BMP signaling)の阻害に関与する阻害剤である限り特に限定されず、核酸、タンパク質、低分子有機化合物のいずれであってもよい。BMP阻害剤としては、BMPに直接作用する物質(例えば、タンパク質、抗体、アプタマー等)、BMPをコードする遺伝子の発現を抑制する物質(例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA等)、BMP受容体へのBMPの結合を阻害することによって上記のBMPシグナル伝達を阻害する生物活性を有する物質、BMP受容体によるシグナル伝達に起因する生理活性を阻害する物質(例えば、BMP受容体の阻害剤等)や、BMPI型受容体キナーゼ阻害剤等が含まれる。
BMP受容体へのBMPの結合を阻害することによって上記のBMPシグナル伝達を阻害する生物活性を有するものの具体例には、Dorsomorphin、Noggin及びこれらの誘導体が挙げられる。また、BMP I型受容体キナーゼ阻害剤の具体例には、LDN-193189(すなわち、4-(6-(4-(ピペラジン-1-イル)フェニル)ピラゾロ[1,5-a]ピリミジン-3-イル)キノリン)及びその誘導体(例えば、LDN-212854)が挙げられる。その他BMP阻害剤として、K02288、Chordin及びFollistatinが挙げられる。
BMP阻害剤としては、好ましくはNoggin、LDN-193189、Dorsomorphin及びK02288(PLoS One. 2013; 8(4): e62721.)からなる群から選択される1又は複数である。
培地中におけるBMP阻害剤の濃度は、例えばBMPにより媒介されるシグナル伝達を抑制可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、LDN-193189の濃度は、BMP I型受容体キナーゼを阻害可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば、0.1nM~10μM、又は0.5nM~10μM、好ましくは10nM~5μM、更に好ましくは50nM~3μM、更により好ましくは50nM~1μMである。他のBMP阻害剤の場合、前述の濃度のLDN-193189に相当するBMP I型受容体キナーゼ阻害活性若しくはBMP阻害活性を示す濃度を、適宜設定することができる。
Wntシグナル伝達活性化剤は、Wntにより媒介されるシグナル伝達を活性化し得るものである限り特に限定されない。Wntシグナル伝達活性化剤としては、例えばWntタンパク質(Wnt3a等)、Wntアゴニスト、Dkk(Wntシグナル伝達阻害タンパク質の阻害剤)、GSK3β(Glycogen Synthase Kinase 3β)阻害剤、R-Spondin等が挙げられる。
本明細書において、GSK3β阻害剤は、Glycogen Synthase Kinase(GSK)3βタンパク質のキナーゼ活性を阻害する物質として定義され、その具体例として、BIO(別称:GSK-3βインヒビターIX;6-ブロモインジルビン-3’-オキシム)等のインジルビン(indirubin)誘導体、SB216763等のマレイミド誘導体、GSK-3βインヒビターVII等のα-ブロモメチルケトン化合物、CHIR99021、Kenpaullone、L803-mts等の細胞膜透過性リン酸化ペプチド、及びそれらの誘導体が挙げられる。
本明細書において、Wntシグナル伝達活性化剤は、GSK3β阻害剤であることが好ましく、また、GSK3β阻害剤である、CHIR99021、BIO、Kenpaullone、SB216763及びL803-mtsからなる群から選択される1以上であることが好ましい。
培地中におけるWntシグナル伝達活性化剤の濃度は、例えばWntタンパク質(Wnt3a等)により媒介されるシグナル伝達を亢進可能な範囲で適宜設定することが可能である。例えば、CHIR99021の濃度は、GSK3βを阻害可能な濃度であれば特に限定されないが、例えば、100nM~100μM、好ましくは500nM~30μM、更に好ましくは1μM~10μMである。他のWntシグナル伝達活性化剤の場合、前述の濃度のCHIR99021に相当するGSK3β阻害活性若しくはWntタンパク質(Wnt3a等)により媒介されるシグナル伝達の亢進を示す濃度を、適宜設定することができる。
工程(1)において、多能性幹細胞はフィーダー細胞非存在下で培養される。フィーダー細胞非存在下とは、フィーダーフリーと言い換えられることができ、培地中にフィーダー細胞が存在しない状態のことを示す。フィーダー細胞非存在下の培養条件としては、例えば、線維芽細胞、SNL細胞、STO細胞等のフィーダー細胞を添加していない培養条件が挙げられる。
本明細書において「神経堤細胞分化誘導培地」とは、多能性幹細胞から神経堤細胞への分化誘導因子を含み、当該培地で多能性幹細胞を培養することによって神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へと分化誘導することができる培地である。神経堤細胞分化誘導培地としては、神経堤細胞の分化誘導に適し、かつ、多能性幹細胞のフィーダーフリー培養に適した、フィーダーフリー培地であってもよい。神経堤細胞分化誘導培地は、例えば基礎培地に必要に応じて血清代替物及び栄養源等の添加因子、さらに、分化誘導因子を添加することにより好適に調製することができる。
本発明の工程(1)は、多能性幹細胞を神経堤細胞分化誘導培地中で培養することにより、神経堤細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得ることができる。すなわち、工程(1)全体で神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を得ることができれば、1つの工程から構成されることに限定されず、工程(1)は複数の細分化した小工程から構成されてもよい。例えば、工程(1)は、2~5の小工程、好ましくは2~3の小工程から構成されていてもよい。より具体的には(i)各小工程で使用する神経堤細胞分化誘導培地は同じ組成であって、培養温度、酸素分圧等の培養条件が異なっている複数の小工程から構成されてもよく、(ii)1又は複数の分化誘導因子の種類、及び/又は濃度が異なる複数の小工程から構成されてもよく、(iii)上記(i)及び(ii)を組み合わせる構成でもよい。
言い換えると、多能性幹細胞を、神経堤細胞へ分化誘導するために必要な分化誘導因子で処理するタイミングは、適宜設定すればよく、複数の分化誘導因子を使用する場合、同時であっても、別々であってもよい。また、当該分化誘導因子の濃度は、適宜設定すればよく、一定であっても、段階的に増加もしくは減少させてもよい。
工程(1)において用いられる基礎培地としては、細胞の培養が可能な限り特に限定はなく、細胞増殖用基礎培地として市販されている基礎培地を適宜使用することができる。細胞増殖用基礎培地として、例えば、BME培地、BGJb培地、CMRL 1066培地、Glasgow MEM (GMEM)培地、Improved MEM Zinc Option培地、IMDM培地、Medium 199培地、Eagle MEM培地、αMEM培地、DMEM培地、F-12培地、DMEM/F-12培地、IMDM/F12培地、ハム培地、RPMI 1640培地、Fischer’s培地、CDM培地又はこれらの混合培地等、動物細胞の培養に用いることのできる培地を挙げることができる。ここでCDM培地とは、化学物質として同定された成分のみからなる培地を意味する。
これらの基礎培地には、糖質やアミノ酸等の炭素源やビタミン、無機塩類、血清もしくは血清代替え物等細胞の生存・増殖に必要な成分が適宜含まれる。また、血清代替物又は血清を含まない合成培地であることが好ましい。
工程(1)において用いられる基礎培地として、例えば、CDM培地が好ましく用いられる。具体的なCDM培地として、IMDM/Ham’s F-12 1:1(GIBCO、米国)及び1× Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO)を含む培地が挙げられる。
神経堤細胞分化誘導培地として、例えば、多能性幹細胞を未分化のままに維持培養するための培地(未分化維持培地)から、未分化維持のために必要な因子(未分化維持因子)の一部又は全てを除いた培地、又は、後述のとおり一部若しくは全ての未分化維持因子の濃度を有効濃度以下に低下させた培地を使用することもできる。このような培地は、例えば、当該培地と同等の成分を含むように配合することによって調製することができる。または、例えば、DMEM等の基礎培地に血清代替物やホルモン等の栄養因子を添加した培地を使用することもできる。或いは、未分化維持培地は複数の液体を適宜混合して使用できるようキットとして販売されている場合があり、その場合、未分化維持因子を含む液体を入れないで配合することで、神経堤細胞分化誘導培地を調製することも可能である。例えばStem Fit AK03N(味の素ヘルシーサプライ社製)の場合、A液、B液及びC液に分かれているので、FGF2(bFGFともいう)を含むC液を除いてA液及びB液のみで神経堤細胞分化誘導培地を調製して使用することができる。
一態様として、神経堤細胞分化誘導培地には、SMADシグナル伝達阻害剤及びWntシグナル伝達活性化剤等の分化誘導因子が含まれるが、それらの作用を阻害又は拮抗する成分が、工程(1)に影響を与えない程度、例えば作用しない程度の濃度で含まれるか、又は含まれないことが好ましい。
工程(1)に用いられる神経堤細胞分化誘導培地として、神経堤細胞から神経細胞(neural cell)への誘導が抑制されている培地が挙げられる。工程(1)に用いられる神経堤細胞分化誘導培地として、SMADシグナル伝達阻害剤及び/又はWntシグナル伝達活性化剤を含む基礎培地(例えばCDM培地)が挙げられる。
工程(1)に用いられる神経堤細胞分化誘導培地の具体例としては、CDM培地(IMDM/Ham’s F-12 1:1(GIBCO、米国)、1× Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO)に、Optiferrin(InVitria、米国)(0.1~1000μg/mlであってよく、又は1~100μg/mlであってよく、好ましくは10~30μg/ml)、インスリン(Sigma、米国) (0.1~1000μg/mlであってよく、又は1~100μg/mlであってよく、好ましくは2~20μg/ml)、モノチオグリセロール(0.01~10mMであってよく、又は0.1~1mMであってよく、好ましくは0.3~0.6mM)(Wako、日本))に、KSR(GIBCO)(1~60体積%であってよく、好ましくは10~30体積%)、SB431542(Wako)(0.1~1000μMであってよく、又は1~500μMであってよく、好ましくは2~20μM)、及び、CHIR99021(Wako)(0.01~100μMであってよく、又は0.01~50μMであってよく、好ましくは0.1~3μM)を添加した培地が挙げられる。なお、本発明の製造方法において、CDM培地は、神経堤細胞から神経細胞への誘導が抑制される培地であるため、神経堤細胞の維持に適する培地である。
工程(1)において、培養容器の培養面、すなわち、細胞集団が接着する面が神経堤細胞の分化誘導に適した細胞外マトリクスによってコーティングされていることが好ましい。このような細胞外マトリクスは、分化誘導された神経堤細胞が接着しやすいものであればよく、特に限定されないが、例えば、ラミニン、フィブロネクチンが挙げられる。そのうち、ラミニン511、フィブロネクチンが好ましく用いられる。コーティング量としては、例えばラミニン511の場合、培養面の面積に対して、0.001~30μg/cm2であってよく、0.01~10μg/cm2、又は0.1~1μg/cm2であることが好ましい。
培養容器として、通常市販で入手できる培養容器、例えば、平底の、6ウェルプレート(底面積が9.5cm2程度、内径35mm程度)、12ウェルプレート(底面積が3.8cm2程度、内径23mm程度)24ウェルプレート(底面積が1.88cm2程度、内径16mm程度)、48ウェルプレート(底面積が1.0cm2程度、内径11mm程度)、96ウェルプレート(底面積が0.35cm2程度、内径6~8mm程度)、384ウェルプレート(底面積が0.1cm2程度、内径3~4mm程度)が挙げられる。好ましくは、平底の6ウェルプレートである。
6ウェルプレートを用いて培養する場合、均一な細胞密度を有する細胞懸濁液を、培養容器の各孔に等量ずつ分注する。細胞密度は0.1×105細胞/ウェル~5.0×105細胞/ウェルであってよく、好ましくは0.2×105細胞/ウェル~2.0x105細胞/ウェルである。
工程(1)における培養は、凡そ6日間~20日間、好ましくは凡そ7日間~18日間、更に好ましくは10日間~18日間行ってもよい。培養期間は、所望の細胞分化度によって決めてもよい。分化誘導した細胞がどのくらい分化したかを示す細胞分化度は、分化マーカーの測定によって決定することもでき、例えば、FACSによるp75発現量の上昇、或いは、PCRによるTFAP2A、NGFR、EDN3及びTWIST1のうち少なくとも1つの発現量の上昇によって行うことができる。発現量の上昇とは、特定の時点から一定時間経過後に誤差範囲内以上の発現量の上昇を示した場合を示す。
工程(1)における培養の培養条件は特に限定されないが、例えば、35℃~37℃、好ましくは37℃の温度、90%~95%、好ましくは95%の湿度、3%~5%、好ましくは5%のCO2濃度の条件であればよく、さらに低酸素培養条件であることが好ましい。「低酸素培養条件」とは、大気中の酸素濃度(約21%)より低い酸素濃度において、細胞を培養する条件のことを意味する。ここで、酸素濃度とは、培養装置中、細胞を含む培地が接する空気中の酸素の濃度を意味する。酸素濃度は、20%以下であれば特に限定されないが、好ましくは3%~10%の範囲であり、より好ましくは4%~6%の範囲であり、最も好ましくは5%である。
なお、分化させる前に、すなわち、工程(1)の前に、多能性幹細胞を未分化維持培地で維持培養してもよい。未分化維持培地は、未分化状態を維持するために必要な因子(未分化維持因子)を含み、多能性を維持できる培地である。未分化維持因子としては、線維芽細胞増殖因子、形質転換増殖因子ベータ(TGFβファミリー)因子、アクチビンA等が挙げられる。本明細書における「線維芽細胞増殖因子(Fibroblast Growth Factors、FGF)」とは、線維芽細胞増殖因子受容体に作用してFGFシグナルを活性化する因子を意味する。FGFとして、例えば、FGF2(bFGFともいう)、FGF4及びFGF8が挙げられる。なお、未分化維持培地は、上述のとおりである。
一態様として、工程(1)によって、得られる神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団は、神経堤細胞マーカー及び神経堤前駆細胞マーカーの少なくとも1以上がiPS細胞よりも高く発現している。
一態様として、工程(1)によって得られる神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団は、全細胞数における、神経堤細胞マーカー及び神経堤前駆細胞マーカーの少なくとも1以上が陽性の細胞の割合が、凡そ1%以上であり、好ましくは10%以上、更に好ましくは30%以上、より好ましくは40%以上である。
一態様として、工程(1)によって得られる神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団は、神経堤細胞を含む細胞集団である。この場合において、全細胞数におけるp75陽性細胞(すなわち、神経堤細胞)の割合が、凡そ1%以上であり、好ましくは10%以上、更に好ましくは30%以上、より好ましくは40%以上である。
<工程(2) 神経堤細胞の選択的培養>
一実施形態の神経堤細胞の選択的培養方法、すなわち、上記工程(2)は、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える。本明細書では、この工程(2)を拡大培養と呼ぶことがある。
一実施形態の神経堤細胞の選択的培養方法、すなわち、上記工程(2)は、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える。本明細書では、この工程(2)を拡大培養と呼ぶことがある。
工程(2)の培養対象は、工程(1)で得られた神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団であり、この際には、工程(1)で得られた細胞集団に対して神経堤細胞マーカーにより選別することなく、そのまま工程(2)に供することができる。工程(2)は選択的に神経堤細胞を培養し、増殖させることが可能であるからである。後述の実施例に示すとおり、上記所定の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養することにより、一定の傾向の細胞状態の神経堤細胞を得ることもできる。
ここで、本明細書において「一定の傾向の細胞状態」とは、遺伝子発現状態が一定の傾向であることを意味する。遺伝子発現状態が一定の傾向であることは、独立した複数の、同じ培養方法により得た神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団サンプル間に対して、マイクロアレイ、RNAシーケンス等を実施し、遺伝子プロファイリングの類似性をクラスター解析すること等によって分析できる。
本明細書におけるラミニン(Laminin)とは、細胞外マトリクスの基底膜を構成するタンパク質であり、α鎖、β鎖、γ鎖をそれぞれ1本ずつ持つヘテロ三量体構造を有する。α鎖にはα1鎖、α2鎖、α3鎖、α4鎖及びα5鎖の5種類があり、β鎖にはβ1鎖、β2鎖及びβ3鎖の3種類があり、γ鎖にはγ1鎖、γ2鎖及びγ3鎖の3種類がある。これらの組合せで各種ラミニンを形成する。例えば、ラミニン511は、α5鎖、β1鎖及びγ1鎖から構成される。ラミニンは細胞接着分子であり、細胞表面のレセプターと結合する。ラミニンのレセプターとして、インテグリンがある。ラミニンには、インテグリンに結合する部位が存在し、この結合部位が存在するラミニンの断片はE8フラグメントとして知られている。
工程(2)における細胞外マトリクスは、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン(すなわち、ラミニン111、ラミニン112)、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン(すなわち、ラミニン211、ラミニン212)、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン(すなわち、ラミニン221、ラミニン222)、及び、α鎖がα5鎖且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン(すなわち、ラミニン511、ラミニン512)からなる群から選択される1以上のラミニンであってよく、また、これらのラミニンのγ鎖がγ1鎖であることが好ましく、例えば、ラミニン221、ラミニン211、ラミニン111、ラミニン511であってよく、特にラミニン221であることが好ましい。
工程(2)における細胞外マトリクスはまた上記のラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスであってよく、ラミニンのインテグリン結合部位は、インテグリン結合部位を含むE8フラグメントであることが好ましく、特にラミニン221のE8フラグメントであることが好ましい。ラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスは、インテグリン結合部位を含むラミニン断片(例えば、E8フラグメント)であってもよく、また、インテグリン結合能に影響し得ない又はインテグリン結合能を増強し得る他のアミノ酸残基又はペプチドが、ラミニンのインテグリン結合部位(例えば、E8フラグメント)に結合して得られたペプチド又はタンパク質であってよい。
工程(2)において、上記所定の細胞外マトリクスを用いることで、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞を選択的に生着させ増殖させることができ、さらに、神経堤細胞に分化誘導されやすい神経堤前駆細胞を選択的に生着させ増殖・分化誘導を促進することができる。この結果、細胞集団の全細胞数に対する神経堤細胞の割合が高くなり、神経堤細胞を濃縮し純化することができる。
工程(2)の接着培養は、上記所定の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する。所定の細胞外マトリクスの存在下とは、所定の細胞外マトリクスで細胞集団が接着する培養面をコーティングしている状態で存在していてもよく、また、所定の細胞外マトリクスを培地に添加している状態で存在していてもよく、さらにその両方の状態で存在していてもよい。これらのうち、好ましくは、所定の細胞外マトリクスで細胞集団が培養面をコーティングしている状態で存在することである。コーティングの場合は、培養面の少なくとも一部(例えば、培養面の50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上)が上記細胞外マトリクスでコーティングされていればよく、コーティング量としては、例えばラミニン221、ラミニン211、ラミニン111、ラミニン511及びこれらのE8フラグメントの場合、培養面の面積に対して、0.001~30μg/cm2であってよく、0.01~10μg/cm2、又は0.1~2μg/cm2であることが好ましい。培地に添加する場合は、コーティング量としては、例えばラミニン221、ラミニン211、ラミニン111、ラミニン511及びこれらのE8フラグメントの場合、培養面の面積に対して、0.1~1000ng/cm2であってよく、1~100ng/cm2、又は2~20ng/cm2あることが好ましい。
工程(2)に使用される培地は、神経堤細胞を分化させないように、神経堤細胞の維持に適した培地であれば、特に限定されないが、神経堤細胞の維持及び増殖に適した培地であることが好ましい。「神経堤細胞の維持に適する培地」としては、上記の工程(1)における基礎培地に、神経堤細胞を細胞死させたりさらに分化させたりすることなく維持するために必要な成分を添加した培地であればよい。また、細胞への刺激を低減するために、工程(2)の基礎培地は工程(1)で使用した基礎培地と同じものを使用することが好ましい。例えば、工程(1)における基礎培地に血清代替物及び適宜栄養源などを添加してもよく、このような成分として、アルブミン、BSA、HSA、FBS、KSR、TGFβ阻害剤(SB431542など)、成長因子(EGF、bFGFなど)などが挙げられる。一態様として、CDM培地に、アルブミン、BSA、HSA、FBS及びKSRから選択される1以上の成分、TGFβ阻害剤、及び成長因子(EGF、bFGFなど)を添加した培地が挙げられる。
工程(2)の培養条件及び培養容器は工程(1)に準じる。工程(2)の培養日数、すなわち、拡大培養の日数は、特に限定されないが、凡そ12日間~28日間、好ましくは凡そ14日間~22日間、より好ましくは凡そ16日間~20日間行ってもよい。拡大培養の間に、例えば、3日~5日/1回の間隔で継代してもよく、3日~7日/1回、または2日~12日/1回の間隔で継代してもよい。
培養前の細胞集団に比べて、工程(2)の拡大培養後の細胞集団における全細胞数及び全細胞数に対する神経堤細胞の割合の両方が増加する。全細胞数は、例えば4~30倍増加し、全細胞数に対する神経堤細胞の割合は、例えば、1.2~5倍増加する。
<神経堤細胞を含む細胞集団>
一実施形態の神経堤細胞を含む細胞集団は、上記神経堤細胞の製造方法によって得られる細胞集団である。神経堤細胞を含む細胞集団は、全細胞数に対するp75陽性細胞(すなわち、神経堤細胞)の割合が70%以上(例えば、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上)であり、全細胞数に対する神経堤前駆細胞の割合が30%以下(例えば、20%以下、15%以下、10%以下又は5%以下)である。
一実施形態の神経堤細胞を含む細胞集団は、上記神経堤細胞の製造方法によって得られる細胞集団である。神経堤細胞を含む細胞集団は、全細胞数に対するp75陽性細胞(すなわち、神経堤細胞)の割合が70%以上(例えば、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上)であり、全細胞数に対する神経堤前駆細胞の割合が30%以下(例えば、20%以下、15%以下、10%以下又は5%以下)である。
また、工程(2)にて培養後の細胞集団が、TFAP2A、NGFR、EDN3及びTWIST1から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する。これらの遺伝子は、神経堤細胞マーカーであり、これらの遺伝子の発現はPCR等当業者にとって一般的な手法で測定することができる。
上記では、神経堤細胞は多能性幹細胞から誘導する方法を用いたが、神経堤細胞を得る方法はこれに限られず、例えば、生体内から分離したものを、神経堤細胞の選択的培養方法に用いてもよい。
本発明の一実施形態として、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、生体由来の神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団の培養方法も提供される。当該培養方法における培養工程は、上述の工程(2)と同様である。
上記生体由来の神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団は、例えば発生中の胚から回収されたものである。発生中の胚から回収された神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団は、神経堤細胞マーカー(SOX10、p75)を用いて神経堤細胞を含む細胞集団をソーティングすることにより回収することができる。上記発生中の胚は、ヒトの胚である場合、発生15日以内の胚である。
〔間葉系幹細胞の製造方法〕
一実施形態の間葉系幹細胞の製造方法は、下記の工程(3)及び工程(4)を備える。
(3)上記神経堤細胞の製造方法で神経堤細胞を含む細胞集団を製造する工程
(4)工程(3)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程
一実施形態の間葉系幹細胞の製造方法は、下記の工程(3)及び工程(4)を備える。
(3)上記神経堤細胞の製造方法で神経堤細胞を含む細胞集団を製造する工程
(4)工程(3)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程
工程(3)は、上述の工程(1)及び工程(2)を備える。工程(4)は、間葉系幹細胞の分化誘導工程である。
本明細書における間葉系幹細胞(Mesenchymal Stem Cell;MSC)とは、成体内に存在する幹細胞の一つで、中胚葉由来の組織である骨や軟骨、血管、心筋細胞に分化できる能力をもつ細胞。間葉系細胞マーカーとしては、CD73、CD105、CD44などの陽性マーカー、及びCD45などの陰性マーカーが挙げられる。
工程(4)の培地は、上記工程(1)の説明において挙げられた基礎培地に、bFGFを添加して調製すればよく、基礎培地としては、DMEM、RPMI-1640、αMEMが好ましく、特にαMEMが好ましく使用できる。bFGFの添加量としては、0.01~1000ng/mlであればよく、0.1~100ng/ml、又は1~30ng/mlであることが好ましい。培地に任意に添加する成分としては、FBS、BSAなどが挙げられる。
工程(4)の培養条件及び培養容器は、工程(1)及び(2)に準じる。また、細胞の生着を促進するために、培養面を細胞外マトリクスでコーティングしてもよい。このような細胞外マトリクスとしては、RetroNectin(Recombinant Human Fibronectin Fragment)、フィブロネクチン等が挙げられ、特にフィブロネクチンが好ましく使用される。コーティング量としては、培養面の面積に対して、0.01~1000μg/cm2であってよく、0.1~100μg/cm2、又は1~30μg/cm2であることが好ましい。
工程(4)の培養は、凡そ4日間~20日間、好ましくは凡そ8日間~16日間行ってもよい。培養期間は、所望の細胞分化度によって決めてもよい。細胞分化度は、分化マーカーの発現量の測定によって決定することができる。例えば、FACSによるCD73、CD105、CD44発現量の上昇、又はCD45発現量の減少、或いは、PCRによるCD73、CD105、CD44のいずれか1つの所定の発現量の上昇又はCD45発現量の減少によって行うことができる。
一実施形態に係る間葉系幹細胞の製造方法は、下記の工程(3’)及び工程(4’)を備える。
(3’)神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を胚から回収する工程
(4’)工程(3’)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程
(3’)神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を胚から回収する工程
(4’)工程(3’)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程
上記工程(3’)及び工程(4’)を備える間葉系幹細胞の製造方法は、上記工程(3)及び工程(4)を備える間葉系幹細胞の製造方法と同様の態様を適用できる。
<間葉系幹細胞を含む細胞集団>
一実施形態の間葉系幹細胞を含む細胞集団は、上記間葉系幹細胞の製造方法によって得られる細胞集団である。間葉系幹細胞を含む細胞集団は、全細胞数に対するCD45陰性かつCD73、CD105、CD44陽性細胞の割合が90%以上である。
一実施形態の間葉系幹細胞を含む細胞集団は、上記間葉系幹細胞の製造方法によって得られる細胞集団である。間葉系幹細胞を含む細胞集団は、全細胞数に対するCD45陰性かつCD73、CD105、CD44陽性細胞の割合が90%以上である。
〔治療薬及び医薬組成物〕
一実施形態の治療薬又は医薬組成物は、上記間葉系幹細胞の細胞集団又は、上記間葉系幹細胞の製造方法によって得られる細胞集団を有効成分として含有する、治療薬及び医薬組成物である。具体的には、例えば、移植片対宿主病(GvHD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、喘息、重症心不全、心筋梗塞、脳梗塞、外傷性脳損傷、脳腫瘍、脊髄損傷、重症下肢虚血、糖尿病性下肢潰瘍、肝硬変、急性肝不全、慢性肝不全、クローン病、敗血症、ウイルス感染症、表皮水疱症、糖尿病、糖尿病性臓器障害、アトピー性皮膚炎、過敏症、重度複合免疫不全症候群、多発性骨髄腫、川崎病、強皮症、脱毛症、自己免疫性肝炎、ループス腎炎、再生不良性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、変形性股関節症、変形性膝関節症(OA)、椎間板変性、皮膚軟部組織感染症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、緑膿菌感染症、後天性免疫不全症候群、狂犬病、インフルエンザ、骨壊死、骨減少症、歯槽骨喪失、骨損傷、骨形成不全症、脊椎癒着、筋萎縮、腱損傷、膝部損傷、筋損傷、筋骨格損傷、骨粗鬆症、運動障害疾患、多発性硬化症、脳性麻痺、認知症、視神経炎、手根管症候群、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、トゥレット症候群、顔面萎縮症、脳室周囲白質軟化症、脊髄小脳変性症、統合失調症、双極性障害、大うつ病性障害、不安障害、適応障害、アルコール依存症、先天性自律神経失調症、脳炎、癲癇、二分脊椎、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、ファブリー病、ハンチントン病、ムコ多糖症I型、シャルコー・マリー・トゥース病、神経因性疼痛、末梢神経障害、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、坐骨神経痛、脊柱管狭窄症、低酸素性虚血性脳症、脳出血、乳がん、転移性膵臓がん、膵管腺がん、消化器がん、頭頸部がん、口腔がん、中皮腫、転移性非小細胞肺がん、黒色腫、皮膚がん、膠芽腫、固形がん、腺がん、神経膠腫、髄芽腫、ブドウ膜黒色腫、気管支拡張症、慢性気管支炎、呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、肺奇形、肺気腫、塵肺症、呼吸不全、急性肺損傷、肺損傷、子癇前症、うっ血性心不全、狭心症、心筋炎、先天性心疾患、拡張型心筋症、多臓器不全、冠動脈疾患、虚血、静脈瘤潰瘍、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、肺狭窄、動静脈瘻、末梢血管疾患、血管新生障害、アテローム性動脈硬化、角膜損傷、角膜炎、角膜変性症、角膜潰瘍、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性症、萎縮型加齢黄斑変性、眼球乾燥症、角膜浮腫、滲出型加齢黄斑変性、瘻孔、創傷治癒、肥満、ピット・ホプキンス症候群、褥瘡、下肢潰瘍、皮膚潰瘍、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、難聴、肛門周囲瘻、直腸瘻、痔瘻、直腸膣瘻、アルコール性肝障害、膵炎、胆道閉鎖症、消化管出血、原発性硬化性胆管炎、直腸炎、食道損傷、肝損傷、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、早期卵巣機能不全、卵巣がん、***減少症、精巣疾患、***不全、陰茎硬結、子宮損傷、腎不全、糖尿病性腎症、腎損傷、腎線維症、間質性膀胱炎、IgA腎症、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、C3糸球体症、サラセミア、白血病、全身性炎症反応症候群、放射線宿酔、皮膚の火傷、再灌流障害、シンドロームX、代謝疾患、口腔粘膜炎、歯周病、歯肉病、及び自閉スペクトラム症から選択される疾患の治療薬、又は、再生医療における移植に伴う拒絶反応の抑制、移植(臓器移植、造血幹細胞移植、骨髄移植、角膜移植、膵島移植)の補助、老化の改善、及びワクチンへの利用から選択される応用的な利用等のための医薬組成物である。
一実施形態の治療薬又は医薬組成物は、上記間葉系幹細胞の細胞集団又は、上記間葉系幹細胞の製造方法によって得られる細胞集団を有効成分として含有する、治療薬及び医薬組成物である。具体的には、例えば、移植片対宿主病(GvHD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、喘息、重症心不全、心筋梗塞、脳梗塞、外傷性脳損傷、脳腫瘍、脊髄損傷、重症下肢虚血、糖尿病性下肢潰瘍、肝硬変、急性肝不全、慢性肝不全、クローン病、敗血症、ウイルス感染症、表皮水疱症、糖尿病、糖尿病性臓器障害、アトピー性皮膚炎、過敏症、重度複合免疫不全症候群、多発性骨髄腫、川崎病、強皮症、脱毛症、自己免疫性肝炎、ループス腎炎、再生不良性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、変形性股関節症、変形性膝関節症(OA)、椎間板変性、皮膚軟部組織感染症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、緑膿菌感染症、後天性免疫不全症候群、狂犬病、インフルエンザ、骨壊死、骨減少症、歯槽骨喪失、骨損傷、骨形成不全症、脊椎癒着、筋萎縮、腱損傷、膝部損傷、筋損傷、筋骨格損傷、骨粗鬆症、運動障害疾患、多発性硬化症、脳性麻痺、認知症、視神経炎、手根管症候群、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、トゥレット症候群、顔面萎縮症、脳室周囲白質軟化症、脊髄小脳変性症、統合失調症、双極性障害、大うつ病性障害、不安障害、適応障害、アルコール依存症、先天性自律神経失調症、脳炎、癲癇、二分脊椎、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、ファブリー病、ハンチントン病、ムコ多糖症I型、シャルコー・マリー・トゥース病、神経因性疼痛、末梢神経障害、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、坐骨神経痛、脊柱管狭窄症、低酸素性虚血性脳症、脳出血、乳がん、転移性膵臓がん、膵管腺がん、消化器がん、頭頸部がん、口腔がん、中皮腫、転移性非小細胞肺がん、黒色腫、皮膚がん、膠芽腫、固形がん、腺がん、神経膠腫、髄芽腫、ブドウ膜黒色腫、気管支拡張症、慢性気管支炎、呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、肺奇形、肺気腫、塵肺症、呼吸不全、急性肺損傷、肺損傷、子癇前症、うっ血性心不全、狭心症、心筋炎、先天性心疾患、拡張型心筋症、多臓器不全、冠動脈疾患、虚血、静脈瘤潰瘍、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、肺狭窄、動静脈瘻、末梢血管疾患、血管新生障害、アテローム性動脈硬化、角膜損傷、角膜炎、角膜変性症、角膜潰瘍、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性症、萎縮型加齢黄斑変性、眼球乾燥症、角膜浮腫、滲出型加齢黄斑変性、瘻孔、創傷治癒、肥満、ピット・ホプキンス症候群、褥瘡、下肢潰瘍、皮膚潰瘍、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、難聴、肛門周囲瘻、直腸瘻、痔瘻、直腸膣瘻、アルコール性肝障害、膵炎、胆道閉鎖症、消化管出血、原発性硬化性胆管炎、直腸炎、食道損傷、肝損傷、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、早期卵巣機能不全、卵巣がん、***減少症、精巣疾患、***不全、陰茎硬結、子宮損傷、腎不全、糖尿病性腎症、腎損傷、腎線維症、間質性膀胱炎、IgA腎症、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、C3糸球体症、サラセミア、白血病、全身性炎症反応症候群、放射線宿酔、皮膚の火傷、再灌流障害、シンドロームX、代謝疾患、口腔粘膜炎、歯周病、歯肉病、及び自閉スペクトラム症から選択される疾患の治療薬、又は、再生医療における移植に伴う拒絶反応の抑制、移植(臓器移植、造血幹細胞移植、骨髄移植、角膜移植、膵島移植)の補助、老化の改善、及びワクチンへの利用から選択される応用的な利用等のための医薬組成物である。
治療薬又は医薬組成物における、当該有効成分の有効量は、投与目的、投与方法、及び投与対象の状況(性別、年齢、体重、病状等)によって異なるが、例えば、細胞集団の有効量としては、間葉系幹細胞の細胞数を基準に1.0×108細胞以上を用いることが好ましい。
一実施形態の治療薬又は医薬組成物は、上記有効成分の有効量のほか、薬学的に許容される担体を含んでもよい。薬学的に許容される担体としては、生理的な水性溶媒(生理食塩水、緩衝液、無血清培地等)を用いることができる。治療薬又は医薬組成物は、必要に応じて移植医療において、移植する組織又は細胞を含む医薬に、通常使用される保存剤、安定剤、還元剤、等張化剤等を含んでもよい。
細胞集団を、適切な生理的な水性溶媒で懸濁することによって、細胞懸濁液として製造することができる。必要であれば、凍結保存剤を添加して上記細胞集団を凍結保存し、使用時に解凍し、緩衝液で洗浄し、移植医療に用いてもよい。
有効成分の細胞集団は、株化された多能性幹細胞から製造される場合、マーカー等により特定され品質管理されることにより、安定した品質の細胞集団を大量に製造し、移植に用いることができる。また、細胞集団を保存することができるため、患者の移植の時期にあわせて細胞集団を準備することができる。
〔多能性幹細胞の分化進行状態の判定方法〕
一実施形態の多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導する際に、上記多能性幹細胞の分化進行状態を判定するための方法は、下記の工程(I)~(IV)を含む。
(I)所望の時点で培養中の細胞集団の一部を採取する工程
(II)採取した細胞集団の所定の遺伝子の発現量を測定する工程
(III)測定した上記遺伝子の発現量を、閾値と比較する工程
(IV)測定した上記遺伝子の発現量が上記閾値以上であるとき、上記所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定する工程
一実施形態の多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導する際に、上記多能性幹細胞の分化進行状態を判定するための方法は、下記の工程(I)~(IV)を含む。
(I)所望の時点で培養中の細胞集団の一部を採取する工程
(II)採取した細胞集団の所定の遺伝子の発現量を測定する工程
(III)測定した上記遺伝子の発現量を、閾値と比較する工程
(IV)測定した上記遺伝子の発現量が上記閾値以上であるとき、上記所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定する工程
<工程(I) 細胞集団の一部の採取工程>
工程(I)において、「所望の時点」とは、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導するための培養における任意の時点を意味する。ここで、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導するための培養は、上記の神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法における工程(1)及び(2)を含み得る。工程(I)における所望の時点としては、例えば、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程内(工程(1)の工程内)の任意の時点であってもよく、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を選択的に培養する工程内(工程(2)の工程内)の任意の時点であってもよい。
工程(I)において、「所望の時点」とは、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導するための培養における任意の時点を意味する。ここで、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導するための培養は、上記の神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法における工程(1)及び(2)を含み得る。工程(I)における所望の時点としては、例えば、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程内(工程(1)の工程内)の任意の時点であってもよく、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を選択的に培養する工程内(工程(2)の工程内)の任意の時点であってもよい。
工程(I)における培養中の細胞集団は、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導するための培養における培養中の細胞集団であればよく、例えば工程(1)の培養中の細胞集団であってもよく、工程(2)の培養中の細胞集団であってもよい。細胞集団から一部を採取することは、通常の方法、遠心分離等によって行うことができ、また、採取される細胞数も特に限定されず、後述の遺伝子の発現量を測定できる細胞数であればよい。
<工程(II) 所定の遺伝子の発現量の測定工程>
所定の遺伝子とは、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化が確認できる遺伝子であればよく、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導後の細胞集団において発現量が増加する遺伝子であってよく、多能性幹細胞では殆ど発現せず、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞で特異的に発現する遺伝子であることが好ましい。多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導(工程)後の細胞集団において発現量が増加する遺伝子とは、分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子であってもよく、又は拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子であってもよい。ここで「分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子」は、分化誘導(工程)の終了時に、多能性幹細胞と比較して発現が亢進する遺伝子を意味し、分化誘導の進行に伴い発現が徐々に亢進する遺伝子を含む。また、「分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子は」拡大培養期間に更に発現が亢進する遺伝子を含む。上記所定の遺伝子は、例えば、1つ以上の分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子を含んでよい。所定の遺伝子は、未分化マーカー遺伝子と組み合わせたものであってもよい。本願明細書における遺伝子の発現量とは、遺伝子の発現産物の量を意味する。遺伝子の発現産物は、例えば、遺伝子のmRNAであってもよく、遺伝子がコードするタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
所定の遺伝子とは、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化が確認できる遺伝子であればよく、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導後の細胞集団において発現量が増加する遺伝子であってよく、多能性幹細胞では殆ど発現せず、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞で特異的に発現する遺伝子であることが好ましい。多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導(工程)後の細胞集団において発現量が増加する遺伝子とは、分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子であってもよく、又は拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子であってもよい。ここで「分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子」は、分化誘導(工程)の終了時に、多能性幹細胞と比較して発現が亢進する遺伝子を意味し、分化誘導の進行に伴い発現が徐々に亢進する遺伝子を含む。また、「分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子は」拡大培養期間に更に発現が亢進する遺伝子を含む。上記所定の遺伝子は、例えば、1つ以上の分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子を含んでよい。所定の遺伝子は、未分化マーカー遺伝子と組み合わせたものであってもよい。本願明細書における遺伝子の発現量とは、遺伝子の発現産物の量を意味する。遺伝子の発現産物は、例えば、遺伝子のmRNAであってもよく、遺伝子がコードするタンパク質又はポリペプチドであってもよい。
遺伝子の発現量を測定する方法は特に限定されないが、当業者にとって公知の方法により実施することができる。そのような方法としては、例えば、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、リアルタイムRT-PCR、ノーザンブロット、RNAシーケンス、マイクロアレイ、ウエスタンブロッティング、ラジオイムノアッセイ、ELISA等が挙げられる。
上記1つ以上の分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子は、例えば、SOX10、RHOB、FOXD3、及びNOTCH1であってもよい。上記1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子は、例えばSOX9、TFAP2A、NGFR、TWIST1、及びEDN3からなる群より選択される1つ以上を含んでもよくTWIST1、及び/又はNGFRであることが好ましい。尚、分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子には、前記SOX9、TFAP2A、NGFR、TWIST1、及びEDN3が含まれる。これらの遺伝子は、本発明者らの実験(実施例4~6)にて、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞に特異的に発現する遺伝子(神経堤細胞関連遺伝子)であることが示唆されている。上記未分化マーカー遺伝子としては、例えばNANOG、Oct3/4が挙げられる。
<工程(III) 測定した上記遺伝子の発現量を閾値と比較する工程>
工程(III)では、上記工程(II)で測定した遺伝子の発現量を、予め設定した閾値と比較する。工程(III)における閾値は、例えば、分化誘導前の多能性細胞における上記所定の遺伝子の発現量に基づいて設定してもよく、又は所望の分化進行状態に達していない培養細胞集団における上記所定の遺伝子の発現量に基づいて設定してもよい。ここで、閾値は遺伝子の発現産物(mRNAかポリペプチド)によって異なり得る。
工程(III)では、上記工程(II)で測定した遺伝子の発現量を、予め設定した閾値と比較する。工程(III)における閾値は、例えば、分化誘導前の多能性細胞における上記所定の遺伝子の発現量に基づいて設定してもよく、又は所望の分化進行状態に達していない培養細胞集団における上記所定の遺伝子の発現量に基づいて設定してもよい。ここで、閾値は遺伝子の発現産物(mRNAかポリペプチド)によって異なり得る。
<工程(IV) 上記細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞集団へ分化しうるかどうかの判定工程>
上記所定の遺伝子は、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導後の細胞集団において発現量が増加する遺伝子(分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子)であり、上記閾値は所望の分化進行状態に達していない培養細胞集団の指標であるため、当該遺伝子の発現量が上記閾値よりも高い場合には、所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定することができる。
上記所定の遺伝子は、多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞への分化誘導後の細胞集団において発現量が増加する遺伝子(分化誘導(工程)後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子)であり、上記閾値は所望の分化進行状態に達していない培養細胞集団の指標であるため、当該遺伝子の発現量が上記閾値よりも高い場合には、所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定することができる。
一実施形態に係る多能性幹細胞の分化進行状態の判定方法は、多能性幹細胞集団から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞集団へ分化させることのできる物質のスクリーニング方法と捉えることもできる。
上記方法によって、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定された細胞集団を回収し、さらに該細胞集団における神経堤細胞を選択的に培養してもよい。さらに得られた神経堤細胞を含む細胞集団を、上記間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法にしたがって培養することで、間葉系幹細胞を含む細胞集団を製造してもよい。
〔神経堤細胞の細胞外マトリクスの使用〕
本発明の一態様として、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養における、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの使用を提供する。
本発明の一態様として、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養における、α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの使用を提供する。
以下に実施例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明は何らこれらに限定されるものではない。
〔実施例1 神経堤細胞への分化誘導及びiMatrix-221を用いた拡大培養〕
<iPS細胞の培養>
iPS細胞として、成人末梢血単核球から、CytoTune(商標)-2.0(IDファーマ)を用いて樹立したiPS細胞(SMCB004)を使用した。ラミニン511のE8フラグメントであるiMatrix-511(株式会社ニッピ、日本)を0.5μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、iMatrix-511でコーディングしたプレートを得た。次いで、StemFit(登録商標)AK03N(味の素株式会社、日本)培地で懸濁したiPS細胞を8000細胞/ウェル播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで5日間培養した。なお、本実施例では、iPS細胞を播種した日をDay0とし、その後の実験日は、この日から数えた日数で表記する。例えば、iPS細胞を培養した5日後をDay5と表記する。
<iPS細胞の培養>
iPS細胞として、成人末梢血単核球から、CytoTune(商標)-2.0(IDファーマ)を用いて樹立したiPS細胞(SMCB004)を使用した。ラミニン511のE8フラグメントであるiMatrix-511(株式会社ニッピ、日本)を0.5μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、iMatrix-511でコーディングしたプレートを得た。次いで、StemFit(登録商標)AK03N(味の素株式会社、日本)培地で懸濁したiPS細胞を8000細胞/ウェル播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで5日間培養した。なお、本実施例では、iPS細胞を播種した日をDay0とし、その後の実験日は、この日から数えた日数で表記する。例えば、iPS細胞を培養した5日後をDay5と表記する。
<iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導>
iPS細胞播種5日後(Day5)、CDM培地(IMDM/Ham’s F-12 1:1(GIBCO、米国)、1× Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO)、15μg/ml Optiferrin (InVitria、米国)、7μg/mLインスリン(Sigma、米国)、450μMモノチオグリセロール(Wako、日本))に、20%のKSR(GIBCO)、10μM SB431542(Wako)及び1μM CHIR99021(Wako)を添加した神経堤細胞誘導培地に置換し、37℃、5%CO2でインキュベーターで9日間培養し、神経堤細胞への分化誘導を行った。本実施例において、この分化誘導時点をパッセージ0(P0)と呼ぶ。
iPS細胞播種5日後(Day5)、CDM培地(IMDM/Ham’s F-12 1:1(GIBCO、米国)、1× Chemically Defined Lipid Concentrate (GIBCO)、15μg/ml Optiferrin (InVitria、米国)、7μg/mLインスリン(Sigma、米国)、450μMモノチオグリセロール(Wako、日本))に、20%のKSR(GIBCO)、10μM SB431542(Wako)及び1μM CHIR99021(Wako)を添加した神経堤細胞誘導培地に置換し、37℃、5%CO2でインキュベーターで9日間培養し、神経堤細胞への分化誘導を行った。本実施例において、この分化誘導時点をパッセージ0(P0)と呼ぶ。
<神経堤細胞の拡大(選択)培養>
ラミニン221のE8フラグメントであるiMatrix-221(株式会社ニッピ)を0.5μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、iMatrix-221コーティングプレートを得た。
ラミニン221のE8フラグメントであるiMatrix-221(株式会社ニッピ)を0.5μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、iMatrix-221コーティングプレートを得た。
次いで、Day14に、神経堤細胞の分化誘導にて9日間培養した細胞をトリプシン/EDTA溶液を用いて剥離回収し、シングルセル化して、神経堤細胞拡大培養用培地(CDM培地に、5mg/mL BSA(Proliant Biologicals、米国)、10μM SB431542、10ng/mL bFGF(Wako)及び20ng/mL EGF(R&D systems、Minneapolis、米国)を添加した培地)で懸濁した細胞を上記iMatrix-221コーティングプレートに50000細胞/ウェル播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで10日間培養した。本実施例において、この拡大培養、すなわち、1回継代後の拡大培養をパッセージ1(P1)と呼ぶ。
播種後10日目(Day24)に、初回の継代を実施した。細胞をトリプシン/EDTA溶液を用いて剥離回収し、神経堤細胞拡大培養用培地で懸濁した細胞をiMatrix-221でコーティングしたプレートに50000細胞/ウェル播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで培養した。本実施例において、この拡大培養、すなわち、2回継代後の拡大培養をパッセージ2(P2)と呼ぶ。その後、3~7日毎に継代し(P3、P4など)、さらに数度継代操作を実施した。
<フローサイトメトリーによる分化誘導及び拡大培養の結果の確認>
上記の播種前(Day0)のiPS細胞(未分化iPS細胞)、並びに、神経堤細胞(NCC)への分化誘導にて9日間培養した細胞(P0:Day14)、拡大培養P1(Day24)、P2(Day32)、及びP3(Day35)後の細胞を剥離回収し、シングルセル化してから、神経堤細胞マーカーp75を抗原とする抗体であるCD271FACS用抗体(BD bioscience)で染色し、FACS(BD Accuri(BD bioscience、米国))にて確認した。
上記の播種前(Day0)のiPS細胞(未分化iPS細胞)、並びに、神経堤細胞(NCC)への分化誘導にて9日間培養した細胞(P0:Day14)、拡大培養P1(Day24)、P2(Day32)、及びP3(Day35)後の細胞を剥離回収し、シングルセル化してから、神経堤細胞マーカーp75を抗原とする抗体であるCD271FACS用抗体(BD bioscience)で染色し、FACS(BD Accuri(BD bioscience、米国))にて確認した。
結果を図1に示す。図1から、神経堤細胞へ分化誘導後(P0)の細胞集団におけるp75陽性細胞の割合(p75陽性細胞率)が52.5%であったが、1回継代後の拡大培養(P1)後のp75陽性細胞率が71.4%となり、2回継代後の拡大培養(P2)後のp75陽性細胞率が97.9%となり、さらに、3回継代後の拡大培養(P3)後のp75陽性細胞率が98.3%となった。このことから、上記拡大培養によって、p75陽性細胞(すなわち、神経堤細胞)が選択培養され、濃縮されたことが分かった。神経堤細胞へ分化誘導後(P0)の細胞集団に対して、p75陽性細胞をソーティングすることなく、本発明の拡大培養方法のみで98%以上のp75陽性細胞率を得ることができることを確認できた。また、別のiPS細胞(201B7株)を継代することにより98%以上のp75陽性細胞率を得ることができた。
<間葉系幹細胞への分化誘導>
フィブロネクチン(Sigma)を10μg/cm2になるようにプレートに添加し、1時間、37℃インキュベーターで静置し、フィブロネクチンでコーティングしたプレートを得た。
フィブロネクチン(Sigma)を10μg/cm2になるようにプレートに添加し、1時間、37℃インキュベーターで静置し、フィブロネクチンでコーティングしたプレートを得た。
次いで、Day32(P2)に、上記の拡大培養された神経堤細胞をトリプシン/EDTA溶液を用いて剥離回収し、シングルセル化して、神経堤細胞拡大培養用培地で懸濁した細胞をフィブロネクチンコーティングプレートに播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで培養した。翌日、間葉系幹細胞用培地(α-MEM(Nacalai Tesque、日本)に10%FBS(GIBCO)及び10ng/mL bFGF (Wako)を添加した培地)に置換し、37℃、5%CO2でインキュベーターで培養し、間葉系幹細胞への分化誘導を行った。
間葉系幹細胞への分化誘導開始3日後(Day34)、細胞をトリプシン/EDTA溶液を用いて剥離回収し、シングルセル化して、間葉系幹細胞用培地で、37℃、5%CO2でインキュベーターで培養し、その後、コンフルエントになったら継代した。
さらに、間葉系幹細胞への分化誘導後、9日間継代培養した後(Day40)の細胞集団については、剥離回収し、シングルセル化してから、間葉系幹細胞のマーカーであるCD73、CD105、CD44及びCD45のFACS用抗体(BD bioscience)で染色し、上記と同様にFACSにて確認した。結果を図2に示す。図2から、間葉系幹細胞への分化が成功したことを確認できた。なお、同様の方法で別のiPS細胞株から分化誘導して得られた間葉系幹細胞から、少なくとも骨芽細胞、軟骨細胞及び脂肪細胞へ分化することが確認できた。
〔実施例2 ラミニン211を用いた拡大培養〕
実施例1と同様な方法によって、iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導を行った。分化誘導後の細胞集団を以下の方法によって拡大培養した。
実施例1と同様な方法によって、iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導を行った。分化誘導後の細胞集団を以下の方法によって拡大培養した。
Laminin-211(BioLamina)を0.45μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、Laminin-211コーティングプレートを得た。
次いで、Day14に、神経堤細胞の分化誘導にて9日間培養した細胞をトリプシン/EDTA溶液を用いて剥離回収し、シングルセル化して、神経堤細胞拡大培養用培地で播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで10日間培養した。
<実施例1と実施例2との結果の比較>
実施例1及び実施例2の10日間拡大培養後(P1)の細胞を、光学顕微鏡で観察し、その結果を図3に示す。図3の(A)及び(B)は実施例2の10日間拡大培養後の細胞の画像であり、(C)及び(D)は実施例1の10日間拡大培養後の細胞の画像である。図3から、実施例2の細胞が密集していたのに対して、実施例1の細胞は全体的に広がって増えていた。実施例1の拡大培養方法が、より神経堤細胞の増殖に適していることが示唆された。また、細胞の密集形態が異なることから、ラミニン221とラミニン211とは細胞生着に関して異なる役割を持っている可能性も示唆された。
実施例1及び実施例2の10日間拡大培養後(P1)の細胞を、光学顕微鏡で観察し、その結果を図3に示す。図3の(A)及び(B)は実施例2の10日間拡大培養後の細胞の画像であり、(C)及び(D)は実施例1の10日間拡大培養後の細胞の画像である。図3から、実施例2の細胞が密集していたのに対して、実施例1の細胞は全体的に広がって増えていた。実施例1の拡大培養方法が、より神経堤細胞の増殖に適していることが示唆された。また、細胞の密集形態が異なることから、ラミニン221とラミニン211とは細胞生着に関して異なる役割を持っている可能性も示唆された。
〔実施例3 各種細胞外マトリクスを用いた拡大培養〕
実施例1と同様な方法によって、iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導を行った。
実施例1と同様な方法によって、iPS細胞から神経堤細胞への分化誘導を行った。
フィブロネクチン(Fibronectin;Sigma)を10μg/cm2になるようにプレートに添加し、1時間、37℃インキュベーターで静置し、フィブロネクチンでコーティングしたプレートを得た。また、実施例1の記載に準じて、Laminin-111(BioLamina)、Laminin-211(BioLamina)、及びLaminin-521(BioLamina)をそれぞれ0.5μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、Laminin-111コーティングプレート、Laminin-211コーティングプレート、及びLaminin-521コーティングプレートをそれぞれ得た。さらに、E8フラグメントであるiMatrix-511(株式会社ニッピ)、及びiMatrix-221(株式会社ニッピ)を0.5μg/cm2になるように6ウェルプレートに添加し、1時間、37℃のインキュベーターで静置し、培地を少量添加後に上清を吸引除去し、その後PBSにて洗浄し、iMatrix-511コーディングプレート及びiMatrix-221コーティングプレートをそれぞれ得た。
次いで、Day14(P0)に、神経堤細胞の分化誘導にて9日間培養した細胞をトリプシン/EDTA溶液を用いて剥離回収し、シングルセル化して、神経堤細胞拡大培養用培地で上記各種コーティングプレートに50000細胞/ウェル播種し、37℃、5%CO2でインキュベーターで拡大培養を行った。播種翌日、各種細胞外マトリクスに対する細胞の接着状態を光学顕微鏡で観察し、その結果を図4に示す。図4から、同じ細胞集団にもかかわらず、異なる細胞外マトリクスに対する接着状態が異なっていたことが分かった。
その後、Day23、Day26、Day29、Day32及びDay35に上記と同様に継代し、それぞれ、P1、P2、P3、P4、及びP5の拡大培養を行った。実施例1と同様の方法で、P0、P1、P2、P3、P4、及びP5の細胞を剥離回収し、シングルセル化してから、フローサイトメトリーにて神経堤細胞マーカーp75の発現を確認した。全細胞数に対するp75を発現する細胞(p75陽性細胞)の割合(p75陽性細胞率)の結果を図5に示す。ただし、Laminin-521コーティング実験にはP4までの結果しかなかった。図5から、各種細胞外マトリクスのうち、Laminin-111、iMatrix-211、iMatrix-511、及びiMatrix―221のコーディング上で拡大培養した細胞集団において、p75陽性細胞率が拡大培養の継続によって上昇したことが認められる。また、これらの細胞外マトリクスを用いた拡大培養によって、90%以上のp75陽性細胞率を得たことを確認できた。すなわち、これらの細胞外マトリクスを用いた拡大培養で得られた細胞集団は、p75陽性細胞(すなわち、神経堤細胞)をソーティングすることなく、そのまま間葉系幹細胞への分化誘導などに用いることができる。
また、播種前(Day0)のiPS細胞、分化誘導した神経堤細胞(P0)、並びに、各種細胞外マトリクスを用いて拡大培養したP1、P2、P3、P4、及びP5の細胞集団におけるNGFR、TFAP2A、TWIST1、SOX10及びSOX9の遺伝子発現をリアルタイムPCR(ThermoFisher)により確認した。使用したプライマー配列は以下のとおりであった。また、内部標準としてβアクチンを用いた。
リアルタイムPCRにて測定した各種遺伝子発現量をβアクチンの発現量にて補正し、さらに、Day0のiPS細胞の発現量を「1」とした各種遺伝子の相対発現量を図6及び図7に示す。各グラフにおいて、左からDay0、P0、P1、P2、P3、P4、及びP5の順に示されている。ただし、Laminin521コーティング実験には、P4までの結果しかなかった。フローサイトメトリー解析によって90%以上のp75陽性細胞率を得ることができたLaminin-111、iMatrix-211、iMatrix-511、及びiMatrix221上で培養した細胞集団にて、P0時点と比較し、神経堤細胞マーカーであるNGFR、TFAP2A、TWIST1の発現が拡大培養の継続によりP1以降増加していることが確認できた(図6)。
図6及び図7に示すように、上記培養工程(特に複数回継代を含む拡大培養)によって得られた、神経堤細胞を含む細胞集団は、TFAP2A、NGFR、及びTWIST1の遺伝子のうち少なくとも1つが分化誘導した神経堤細胞(P0)よりも多く発現していた。このことから、上記細胞外マトリクスを用いた拡大培養によって得られた細胞は神経堤細胞であることが遺伝子発現プロファイル面からも確認できた。
また、接着培養に重要であるSOX9遺伝子の発現量が上記細胞外マトリクスで拡大培養した細胞集団では増加していることが確認できた。また、SOX9遺伝子の発現状態から、接着培養による拡大培養法として、適していることが示唆された(図7)。実施例3において、選択的に培養された神経堤細胞を含む細胞集団は、SOX10遺伝子の発現量が減少し、SOX9が高発現している細胞集団であることから、本実施例で用いた培養条件では、SOX10遺伝子の発現を下げ、SOX9遺伝子の発現を上げるプロファイルを示す傾向を有する。すなわち、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程にて培養後の細胞集団は、SOX10遺伝子の発現を下げ、SOX9遺伝子の発現を上げる特徴を有する。具体的には、拡大培養開始時点の細胞集団と比較して、SOX10遺伝子の発現量が減少し、SOX9遺伝子の発現量が増加している細胞集団は、本発明の一態様である。
〔実施例4 各種細胞外マトリクスを用いた拡大培養時の遺伝子発現量に基づくクラスター分析〕
実施例3で各種細胞外マトリクスを用いて拡大培養して作製したP1~P5の細胞の遺伝子発現量を、マイクロアレイ解析によって取得した。マイクロアレイ解析は、GeneChip(登録商標) Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Applied Biosystems)を用いることによって実施した。次に、マイクロアレイ解析により得られた全遺伝子発現量より、各継代毎(P1~P5)のシグナル強度の比較に基づき、Rを用いてウォード法により上記各細胞のクラスター分析を実施した。ウォード法は階層型クラスタリングの手法の1つであり、データからクラスターの階層構造を抽出する手法となる。ウォード法は分散が最小になるようにデータを結合し、クラスタリングする。ウォード法でクラスター解析した結果を図8に示す。
実施例3で各種細胞外マトリクスを用いて拡大培養して作製したP1~P5の細胞の遺伝子発現量を、マイクロアレイ解析によって取得した。マイクロアレイ解析は、GeneChip(登録商標) Human Genome U133 Plus 2.0 Array(Applied Biosystems)を用いることによって実施した。次に、マイクロアレイ解析により得られた全遺伝子発現量より、各継代毎(P1~P5)のシグナル強度の比較に基づき、Rを用いてウォード法により上記各細胞のクラスター分析を実施した。ウォード法は階層型クラスタリングの手法の1つであり、データからクラスターの階層構造を抽出する手法となる。ウォード法は分散が最小になるようにデータを結合し、クラスタリングする。ウォード法でクラスター解析した結果を図8に示す。
図8に示すように、クラスター分析の結果は、図5に示すフローサイトメトリーでのp75の発現状態の違いと同様に、細胞外マトリクスの違いで細胞が遺伝子発現状態により明確に分類された。以上の結果より、p75の発現状態の違うiMatrix-221、iMatrix-511、Laminin-211、Laminin-111の細胞外マトリクス群とLaminin-521、Fibronectinの細胞外マトリクス群とでは、神経堤細胞関連遺伝子及び未分化マーカー遺伝子発現状態が異なることが明らかとなった。また、細胞外マトリクスの違いで細胞が遺伝子発現状態により明確に分類されたことから、同じ種類の細胞外マトリクス群で一定の傾向の遺伝子発現状態の神経堤細胞(一定の傾向の細胞状態の神経堤細胞)が得られることが示唆された。一定の傾向の遺伝子発現状態とは、培養により得られた細胞が遺伝子発現においてある傾向(測定可能な遺伝子発現のパターン)を示すことである。
〔実施例5 各種細胞外マトリクスを用いた拡大培養時の各遺伝子の発現の比較〕
表2~3に、実施例4で得られた遺伝子発現量より未分化遺伝子マーカー及び神経堤細胞関連遺伝子データを抽出した。抽出した未分化マーカー遺伝子及び神経堤細胞関連遺伝子の各遺伝子の相対発現量について、iPS細胞とP0又はP5でのシグナル強度を比較した結果を示す。
表2~3に、実施例4で得られた遺伝子発現量より未分化遺伝子マーカー及び神経堤細胞関連遺伝子データを抽出した。抽出した未分化マーカー遺伝子及び神経堤細胞関連遺伝子の各遺伝子の相対発現量について、iPS細胞とP0又はP5でのシグナル強度を比較した結果を示す。
表2に示すように、未分化マーカー遺伝子(NANOG、Oct3/4)はiPS細胞では高発現していたが、P1以降発現はほぼなくなり、神経堤細胞への誘導において未分化のiPS細胞の残留が最小限であったことがわかる。また、表3に示すように、神経堤細胞関連遺伝子は神経堤細胞誘導後(P0まで)に発現が亢進する遺伝子群(SOX10、RHOB、FOXD3、NOTCH1)と誘導後期(P1~P5)に発現が亢進する遺伝子群(SOX9、TFAP2A、NGFR、TWIST1、EDN3)があり、細胞外マトリクスが異なっていても同様な挙動を示した。
〔実施例6 β鎖のみが異なる細胞外マトリクスを用いて神経堤細胞への分化誘導を行った場合における遺伝子発現状態の比較〕
実施例4のクラスター分析の結果より、P0から細胞外マトリクスを変更し培養したことで、特に神経堤細胞関連遺伝子及び未分化マーカー遺伝子の発現状態が変化していたことが明らかとなった。さらに詳細を調べる目的で、β鎖のみが異なる細胞外マトリクスを用いて、マイクロアレイ解析によって得られた全遺伝子発現に基づくP0~P5の細胞のクラスター分析を行った。クラスター分析はβ鎖のみが異なる細胞外マトリクスとしてLaminin-211、iMatirx-221を用いたこと以外は実施例4と同様にして実施した。その結果を図9に示す。
実施例4のクラスター分析の結果より、P0から細胞外マトリクスを変更し培養したことで、特に神経堤細胞関連遺伝子及び未分化マーカー遺伝子の発現状態が変化していたことが明らかとなった。さらに詳細を調べる目的で、β鎖のみが異なる細胞外マトリクスを用いて、マイクロアレイ解析によって得られた全遺伝子発現に基づくP0~P5の細胞のクラスター分析を行った。クラスター分析はβ鎖のみが異なる細胞外マトリクスとしてLaminin-211、iMatirx-221を用いたこと以外は実施例4と同様にして実施した。その結果を図9に示す。
図9に示すように、β鎖のみが異なるLaimin-211とiMatrix-221上でiPS細胞を神経堤細胞に分化誘導した結果、神経堤細胞ではあるが遺伝子的発現状態は違い、神経堤細胞の細胞状態が異なっていることが示唆された。
本発明の神経堤細胞の製造方法によれば、多能性幹細胞から神経堤細胞を安定的に大量生産することができ、その結果、多能性幹細胞から間葉系幹細胞を安定的に大量生産することができる。
Claims (22)
- α鎖がα1鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、α鎖がα2鎖であり且つβ鎖がβ2鎖であるラミニン、及び、α鎖がα5鎖であり且つβ鎖がβ1鎖であるラミニン、並びに、これらのラミニンのインテグリン結合部位を含む細胞外マトリクスからなる群より選択される1以上の細胞外マトリクスの存在下で、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を接着培養する培養工程を備える、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団における神経堤細胞の選択的培養方法。
- 前記ラミニンのγ鎖がγ1鎖である、請求項1に記載の培養方法。
- 前記ラミニンが、ラミニン221である、請求項1又は2に記載の培養方法。
- 前記ラミニンのインテグリン結合部位が、ラミニンのE8フラグメントである、請求項1~3のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養工程にて培養後の細胞集団が、EDN3、TFAP2A、NGFR及びTWIST1から選択される少なくとも1つの遺伝子を発現する、請求項1~4のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培養工程において、前記細胞集団が接着する培養面の少なくとも一部が前記細胞外マトリクスでコーティングされており、前記細胞集団が培地中にて接着培養される、請求項1~5のいずれか一項に記載の培養方法。
- 前記培地は、神経堤細胞の維持に適する培地である、請求項6に記載の培養方法。
- 培養前の細胞集団に比べて、培養後の細胞集団における全細胞数及び全細胞数に対する神経堤細胞の割合の両方が増加する、請求項1~7のいずれか一項に記載の培養方法。
- (1)多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程と、
(2)工程(1)で得られた細胞集団を請求項1~8のいずれか一項に記載の培養方法で接着培養する工程と
を備える、神経堤細胞を含む細胞集団の製造方法。 - 工程(1)で得られ得られた細胞集団を、神経堤細胞マーカーにより選別することなく、工程(2)に供する、請求項9に記載の製造方法。
- 工程(1)が、多能性幹細胞を含む細胞集団を、少なくとも1つのSMADシグナル伝達阻害剤及び少なくとも1つのWntシグナル伝達活性化剤を含む培地で培養することを含む、請求項9又は10に記載の製造方法。
- 前記SMADシグナル伝達阻害剤が、TGFβ阻害剤である、請求項11に記載の製造方法。
- 前記Wntシグナル伝達活性化剤が、GSK3β阻害剤である、請求項11又は12に記載の製造方法。
- 工程(1)が、7日間~18日間行われる、請求項9~13のいずれか一項に記載の製造方法。
- 工程(1)における培地が、血清代替物又は血清を含まない合成培地である、請求項9~14のいずれか一項に記載の製造方法。
- (3)請求項9~15のいずれか一項に記載の製造方法で神経堤細胞を含む細胞集団を製造する工程と、
(4)工程(3)で得られた細胞集団をbFGFの存在下で培養し、間葉系幹細胞へ分化誘導する工程と
を備える、間葉系幹細胞を含む細胞集団の製造方法。 - 請求項16に記載の製造方法で製造された、間葉系幹細胞を含む細胞集団。
- 請求項17に記載の間葉系幹細胞を含む細胞集団を有効成分として含有する、移植片対宿主病(GvHD)、急性呼吸窮迫症候群(ARDS)、喘息、重症心不全、心筋梗塞、脳梗塞、外傷性脳損傷、脳腫瘍、脊髄損傷、重症下肢虚血、糖尿病性下肢潰瘍、肝硬変、急性肝不全、慢性肝不全、クローン病、敗血症、ウイルス感染症、表皮水疱症、糖尿病、糖尿病性臓器障害、アトピー性皮膚炎、過敏症、重度複合免疫不全症候群、多発性骨髄腫、川崎病、強皮症、脱毛症、自己免疫性肝炎、ループス腎炎、再生不良性貧血、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、シェーグレン症候群、乾癬、変形性股関節症、変形性膝関節症(OA)、椎間板変性、皮膚軟部組織感染症、細菌性肺炎、ウイルス性肺炎、緑膿菌感染症、後天性免疫不全症候群、狂犬病、インフルエンザ、骨壊死、骨減少症、歯槽骨喪失、骨損傷、骨形成不全症、脊椎癒着、筋萎縮、腱損傷、膝部損傷、筋損傷、筋骨格損傷、骨粗鬆症、運動障害疾患、多発性硬化症、脳性麻痺、認知症、視神経炎、手根管症候群、線条体黒質変性症、オリーブ橋小脳萎縮症、トゥレット症候群、顔面萎縮症、脳室周囲白質軟化症、脊髄小脳変性症、統合失調症、双極性障害、大うつ病性障害、不安障害、適応障害、アルコール依存症、先天性自律神経失調症、脳炎、癲癇、二分脊椎、筋萎縮性側索硬化症、脊髄性筋萎縮症、原発性側索硬化症、筋ジストロフィー、アルツハイマー型認知症、パーキンソン病、ファブリー病、ハンチントン病、ムコ多糖症I型、シャルコー・マリー・トゥース病、神経因性疼痛、末梢神経障害、三叉神経痛、糖尿病性神経障害、坐骨神経痛、脊柱管狭窄症、低酸素性虚血性脳症、脳出血、乳がん、転移性膵臓がん、膵管腺がん、消化器がん、頭頸部がん、口腔がん、中皮腫、転移性非小細胞肺がん、黒色腫、皮膚がん、膠芽腫、固形がん、腺がん、神経膠腫、髄芽腫、ブドウ膜黒色腫、気管支拡張症、慢性気管支炎、呼吸窮迫症候群、特発性肺線維症、肺奇形、肺気腫、塵肺症、呼吸不全、急性肺損傷、肺損傷、子癇前症、うっ血性心不全、狭心症、心筋炎、先天性心疾患、拡張型心筋症、多臓器不全、冠動脈疾患、虚血、静脈瘤潰瘍、閉塞性血栓血管炎、末梢動脈閉塞症、間欠性跛行、肺狭窄、動静脈瘻、末梢血管疾患、血管新生障害、アテローム性動脈硬化、角膜損傷、角膜炎、角膜変性症、角膜潰瘍、糖尿病性網膜症、緑内障、網膜色素変性症、萎縮型加齢黄斑変性、眼球乾燥症、角膜浮腫、滲出型加齢黄斑変性、瘻孔、創傷治癒、肥満、ピット・ホプキンス症候群、褥瘡、下肢潰瘍、皮膚潰瘍、インスリン依存性糖尿病、インスリン非依存性糖尿病、難聴、肛門周囲瘻、直腸瘻、痔瘻、直腸膣瘻、アルコール性肝障害、膵炎、胆道閉鎖症、消化管出血、原発性硬化性胆管炎、直腸炎、食道損傷、肝損傷、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、早期卵巣機能不全、卵巣がん、***減少症、精巣疾患、***不全、陰茎硬結、子宮損傷、腎不全、糖尿病性腎症、腎損傷、腎線維症、間質性膀胱炎、IgA腎症、腹圧性尿失禁、切迫性尿失禁、C3糸球体症、サラセミア、白血病、全身性炎症反応症候群、放射線宿酔、皮膚の火傷、再灌流障害、シンドロームX、代謝疾患、口腔粘膜炎、歯周病、歯肉病、及び自閉スペクトラム症から選択される疾患の治療薬、又は、再生医療における移植に伴う拒絶反応の抑制、移植(臓器移植、造血幹細胞移植、骨髄移植、角膜移植、膵島移植)の補助、老化の改善、及びワクチンへの利用から選択される応用的な利用のための医薬組成物。
- 多能性幹細胞から神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導する際に、前記多能性幹細胞の分化進行状態を判定するための方法であって、
(I)所望の時点で培養中の細胞集団の一部を採取する工程と、
(II)採取した細胞集団の所定の遺伝子の発現量を測定する工程と、
(III)測定した前記遺伝子の発現量を、閾値と比較する工程と、
(IV)測定した前記遺伝子の発現量が前記閾値以上であるとき、上記所望の時点における培養細胞集団が神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化しうると判定する工程と、
を含む、方法。 - 前記所定の遺伝子は、1つ以上の分化誘導後に発現が亢進する遺伝子、及び/又は、1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子を含む、請求項19に記載の方法。
- 前記1つ以上の分化誘導後に発現が亢進する遺伝子が、SOX10、RHOB、FOXD3、及びNOTCH1からなる群より選択される1つ以上を含み、前記1つ以上の拡大培養期間に発現が亢進する遺伝子が、SOX9、TFAP2A、NGFR、TWIST1、及びEDN3からなる群より選択される1つ以上を含む、請求項20に記載の方法。
- 前記所望の時点は、多能性幹細胞を神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞へ分化誘導し、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団を得る工程内の任意の時点である、又は
前記所望の時点は、神経堤細胞及び/又は神経堤前駆細胞を含む細胞集団から神経堤細胞を選択的に培養する工程内の任意の時点である、請求項19~21のいずれか一項に記載の方法。
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