CN111308007A - 一种蒿板青颗粒的质量控制方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蒿板青颗粒的质量控制方法，修订了一枝蒿酮酸、(R,S)‑告依春和靛玉红的薄层色谱鉴别法，增订了一枝蒿特征活性成分一枝蒿酮酸含量的高效液相色谱测定法，能够更科学有效地控制产品质量，确保疗效。本发明采用薄层色谱鉴别药物中三味药材的特征活性成分，样品处理方法简便，分离度好，斑点清晰；高效液相色谱法测定药物中一枝蒿酮酸的含量，操作简便，专属性强，重复性好，准确度高。本发明蒿板青颗粒的质量控制方法，是一种检测项目更全面完善，质量控制指标更科学合理，操作更简便，能进一步提升产品质量水平，确保疗效的质量控制方法。
Description
技术领域
本发明属于兽医用中药制剂质量控制技术领域，具体涉及一种蒿板青颗粒的质量控制方法。
背景技术
蒿板青颗粒处方来源于国家药品监督管理局《国家中成药标准汇编内科肺系》的“复方一枝蒿颗粒”，标准编号为WS-11137(ZD-1137)-2002]。本品处方组成为：一枝蒿240g、板蓝根240g、大青叶240g；制备工艺为：以上三味药材，加水煎煮2次，每次2小时，滤过，合并滤液，滤液浓缩为清膏，加等体积乙醇，静置24小时，倾取上清液，回收乙醇并浓缩为稠膏，加入适量蔗糖和糊精，混匀，湿法制粒，干燥，制成1000g，即得。
处方组成中的一枝蒿(Artemisia rupestris L.)系菊科蒿属植物，全草入药，目前已收入《***药品标准·中药材》第一册。该药材最早记载于我国清代赵学敏的《本草纲目拾遗》，在我国独产于新疆，民间用药历史悠久。板蓝根(Radix Isatidis)为十字花科(Cruciferae)植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥根，始载于《神农本草经》。大青叶(Folium Isatidis)为十字花科(Cruciferae)植物菘蓝(Isatis indigotica Fort.)的干燥叶。板蓝根与大青叶均收载于《中国兽药典》2015年版二部。
原编号为WS-11137(ZD-1137)-2002的质量标准对处方中板蓝根和大青叶的成分——靛蓝和靛玉红进行了薄层色谱鉴别，但其色谱图中斑点不清晰，甚至靛蓝鉴别色谱的相应位置无斑点显示；原质量标准还对处方中一枝蒿进行了薄层色谱鉴别，但其选用的鉴别对照品是一枝蒿对照药材，对照药材相比对照品受产地、采收时间等影响，无法保证批次的均一性，且对照药材提取处理程序繁杂，其鉴别图谱干扰多，鉴别效果差；原质量标准没有含量测定项，也未对板蓝根的特征活性成分告依春进行鉴别，不利于其质量控制。目前，也有多篇文献公开了蒿板青颗粒处方中一枝蒿的鉴别和一枝蒿特征活性成分——一枝蒿酮酸的含量测定方法，但公开的方法中供试品溶液提取纯化度不够深入，测定时色谱杂质峰多，干扰强，分离度差，出峰时间不稳定。文献《新疆一枝蒿的质量标准研究》(热依木古丽·阿布都拉等，医药导报，第30卷第9期，2011年)和《高效液相色谱法测定新疆一枝蒿中一枝蒿酮酸的含量》(马成等，时珍国医国药，第19卷第4期，2008年)分别公开了一枝蒿中一枝蒿酮酸的鉴别和含量测定，但其方法仅适用于药材一枝蒿的测定，不适宜于成分复杂的中药制剂；文献《复方一枝蒿颗粒质量标准的研究》(李革等，中医药学刊，第21卷第11期，2003年)公开了复方一枝蒿颗粒的质量控制方法，但其鉴别方法与原标准无显著差别，仅增加了处方中辅药大青叶和板蓝根的含量测定，未增加处方中主药一枝蒿的含量测定；文献《高效液相色谱法测定复方一枝蒿胶囊中一枝蒿酮酸的含量》(张雪峰等，兵团医学，第34卷第4期，2012年)公开了复方一枝蒿胶囊中的一枝蒿酮酸的高效液相色谱测定法，但发现温度对测定有着十分大的影响，保留时间极不稳定，重复性不良。
综上所述，现有制剂质量控制方法仅对处方中的药材建立了部分鉴别方法，没有对主药的特征活性成分建立鉴别方法，尤其没有含量测定方法，检验项目缺少全面性，方法效果亦不理想。因此，为保证蒿板青颗粒的临床使用安全有效、质量稳定，需要建立一个更全面更完善的质量控制方法。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种蒿板青颗粒的质量控制方法，该方法是在原质量标准的基础上进行的改进，修订了一枝蒿酮酸、(R,S)-告依春和靛玉红的薄层色谱鉴别法，增订了一枝蒿特征活性成分一枝蒿酮酸含量的高效液相色谱测定法，能够更科学有效地控制产品质量，确保疗效。
本发明中所述附录均是指中国兽药典2015年版二部相应附录。。
具体技术方案如下：
一种蒿板青颗粒的质量控制方法，包括一枝蒿酮酸、R,S-告依春和靛玉红的鉴别；还包括一枝蒿酮酸的含量测定；
其中，一枝蒿酮酸、R,S-告依春和靛玉红的鉴别采用薄层色谱法；一枝蒿酮酸的含量测定采用高效液相色谱法。
进一步，在一枝蒿酮酸的鉴别中：以甲醇或乙醇为溶剂，分别将供试品溶液和对照品溶液点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂；
进一步，在R,S-告依春的鉴别中：供试品以二氯甲烷或三氯甲烷为溶剂，对照品以甲醇或乙醇为溶剂；分别将供试品溶液和对照品溶液点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂；
进一步，在靛玉红的鉴别中：以三氯甲烷为溶剂，分别将供试品溶液和对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮为展开剂。
上述三种供试品与对照品展开后，将硅胶GF254薄层板取出晾干，置紫外光灯下检视；硅胶G薄层板取出晾干并检视。如果检视结果为：供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，硅胶GF254薄层板显示出荧光斑点，硅胶G薄层板显示出与对照品相同颜色的斑点，则说明蒿板青颗粒待测样品中分别含有一枝蒿酮酸、R,S-告依春或靛玉红。
其中，在一枝蒿酮酸的鉴别中：展开剂油醚-乙酸乙酯-冰醋酸的体积比为(10～30)：(5～15)：1，石油醚的温度为30～90℃；
其中，在R,S-告依春的鉴别中：展开剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为(1～5)：1，石油醚的温度为30～90℃；
其中，在靛玉红的鉴别中：展开剂苯-三氯甲烷-丙酮的体积比为(2～9)：(1～8)：1。
其中，在一枝蒿酮酸的鉴别中，供试品溶液的制备方法如下：取蒿板青颗粒研成粉末，加入溶剂，蒿板青颗粒粉末与溶剂的用量比为1g：(4～16)mL；超声处理10～60min，过滤，取滤液蒸干，再次添加溶剂使蒸干物溶解，蒿板青颗粒粉末与再次添加的溶剂的比例为1g：(0.2～1)mL，得供试品溶液；
其中，在R,S-告依春的鉴别中，供试品溶液的制备方法如下：取蒿板青颗粒研成粉末，加水使溶解后加入溶剂振摇提取1～4次，蒿板青颗粒粉末与水的用量比为1g：(2～10)mL，蒿板青颗粒粉末与每次提取使用的溶剂的用量比为1g：(2～10)mL；将溶剂层离心，合并溶剂澄清液，浓缩至蒿板青颗粒粉末与浓缩液的比例为1g：(0.1～0.5)mL，得供试品溶液；
其中，在靛玉红的鉴别中，供试品溶液制备的方法如下：取蒿板青颗粒研成粉末，加水使溶解后加入三氯甲烷振摇提取1～4次，蒿板青颗粒粉末与水的用量比为2g：(3～10)mL，蒿板青颗粒粉末与每次提取使用的三氯甲烷的用量比为1g：(2～10)mL；将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，蒸干，蒸干物再次添加加三氯甲烷使溶解，蒿板青颗粒粉末与再次添加的三氯甲烷的比例为1g：(0.05～0.25)mL，得供试品溶液。
其中，在一枝蒿酮酸的鉴别中，对照品溶液的浓度为0.05～0.15mg·mL-1，点样量为5μl；
其中，在R,S-告依春的鉴别中，对照品溶液的浓度为0.3～0.9mg·mL-1，点样量为10μl；
其中，在靛玉红的鉴别中，对照品溶液的浓度为0.05～0.15mg·mL-1，点样量为10μl。
进一步，一枝蒿酮酸的含量测定中，以一枝蒿酮酸为对照品；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为221～265nm。
其中，所述的流动相中，甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液的体积比为(11～68)：(5～45)：(16～92)。
其中，一枝蒿酮酸的含量测定中，供试品的制备方法如下：
取蒿板青颗粒研成粉末，加入甲醇或乙醇作为溶剂，超声处理10～50min，蒿板青颗粒粉末与溶剂的用量比为6g：(20～80)mL；用甲醇或乙醇补足减失重量，摇匀，滤过，取滤液，即得供试品溶液。
优选的，超声处理后，将反应体系冷却至25℃以下后，再用甲醇或乙醇补足减失重量。
其中，一枝蒿酮酸的含量测定中，所述的对照品为浓度为13～74μg·mL-1的甲醇或乙醇溶液。
在未说明浓度的情况下，本发明中所述甲醇的浓度为100％(无水甲醇)，乙醇的浓度为95％(体积浓度)。
本发明的有益效果如下：
本法明采用薄层色谱鉴别药物中三味药材的特征活性成分，样品处理方法简便，分离度好，斑点清晰；高效液相色谱法测定药物中一枝蒿酮酸的含量，操作简便，专属性强，重复性好，准确度高。本发明蒿板青颗粒的质量控制方法，是一种检测项目更全面完善，质量控制指标更科学合理，操作更简便，能进一步提升产品质量水平，确保疗效的质量控制方法。
附图说明
图1为实施例1中一枝蒿酮酸鉴别薄层色谱图；
图2为实施例1中R,S-告依春鉴别薄层色谱图；
图3为实施例1中靛玉红鉴别薄层色谱图
图4为实施例1中对照品液相色谱图；
图5为实施例1中阴性样品液相色谱图；
图6为实施例1中待测样品液相色谱图。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
实施例中的试剂与物料均为市售普通，在未说明浓度的情况下，实施例中所述甲醇的浓度为100％(无水甲醇)，乙醇的浓度为95％(体积浓度)。
实施例1
一种蒿板青颗粒的质量控制方法，包括如下步骤：
(1)用薄层色谱法对药物中的一枝蒿特征活性成分——一枝蒿酮酸进行定性鉴别：取蒿板青颗粒研细的粉末5g，加乙醇40mL，超声处理20min，过滤，取滤液蒸干，再次添加乙醇3mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。另取一枝蒿酮酸对照品，加乙醇制成每1mL含0.08mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比为15：8：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示出荧光斑点，结果如图1所示。
(2)用薄层色谱法对药物中板蓝根的特征活性成分——(R,S)-告依春进行定性鉴别：取蒿板青颗粒研细的粉末10g，加水80mL使溶解，加二氯甲烷振摇提取3次，每次使用二氯甲烷80mL；将二氯甲烷层离心，合并二氯甲烷澄清液，浓缩至3mL，作为供试品溶液。另取(R,S)-告依春对照品，加乙醇制成每1mL含0.6mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(体积比为2：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示出荧光斑点，结果如图2所示。
(3)用薄层色谱法对药物中的大青叶特征活性成分——靛玉红进行定性鉴别：取本品研细的粉末20g，加水50mL使溶解，加三氯甲烷振摇提取3次，每次使用三氯甲烷50mL，将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，蒸干，添加三氯甲烷3mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.08mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(体积比为6：3：1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显与对照品相同颜色的斑点。
结果如图3所示，供试品与对照品在色谱相应位置上均出现颜色相同的斑点，为粉红色。需要注意的是，由于专利申请文件无法提交彩色附图，具体色彩无法显示，如有必要，申请人可提供彩色原图作为证据。
(4)检查：照附录0106颗粒剂项下有关要求，性状、粒度、水分、溶化性、装量应符合规定。
(5)高效液相色谱法测定一枝蒿酮酸的含量(附录0512)：
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液(体积比为47：15：30)为流动相；检测波长为254nm。
对照品溶液的制备：取一枝蒿酮酸对照品，精密称定，加乙醇制成每1mL含39μg的溶液，即制得。
供试品溶液的制备：取蒿板青颗粒适量，研细，取细粉6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇60mL，密塞，称定重量，超声处理20min，冷却至25℃以下，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1g含一枝蒿以一枝蒿酮酸(C15H20O3)计，不得少于0.14mg。对照品液相色谱图见图4，阴性样品液相色谱图见图5，待测样品液相色谱图见图6。
实施例2
一种蒿板青颗粒的质量控制方法，包括如下步骤：
(1)用薄层色谱法对药物中的一枝蒿特征活性成分——一枝蒿酮酸进行定性鉴别：取蒿板青颗粒研细的粉末5g，加甲醇20mL，超声处理60min，过滤，取滤液蒸干，再次添加甲醇1mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。另取一枝蒿酮酸对照品，加甲醇制成每1mL含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比为30：5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示出荧光斑点。
(2)用薄层色谱法对药物中板蓝根的特征活性成分——(R,S)-告依春进行定性鉴别：取蒿板青颗粒研细的粉末10g，加水20mL使溶解，加二氯甲烷振摇提取4次，每次使用二氯甲烷20mL；将二氯甲烷层离心，合并二氯甲烷澄清液，浓缩至1mL，作为供试品溶液。另取(R,S)-告依春对照品，加甲醇制成每1mL含0.3mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(体积比为1：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示出荧光斑点。
(3)用薄层色谱法对药物中的大青叶特征活性成分——靛玉红进行定性鉴别：取本品研细的粉末20g，加水30mL使溶解，加三氯甲烷振摇提取4次，每次使用三氯甲烷30mL，将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，蒸干，添加三氯甲烷1mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.05mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(体积比为2：8：1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显与对照品相同颜色的斑点。
(4)检查：照附录0106颗粒剂项下有关要求，性状、粒度、水分、溶化性、装量应符合规定。
(5)高效液相色谱法测定一枝蒿酮酸的含量(附录0512)：
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液(体积比为11：45：16)为流动相；检测波长为221nm。对照品溶液的制备：取一枝蒿酮酸对照品，精密称定，加甲醇制成每1mL含13μg的溶液，即制得。
供试品溶液的制备：取蒿板青颗粒适量，研细，取细粉6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇80mL，密塞，称定重量，超声处理10min，冷却至25℃以下，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1g含一枝蒿以一枝蒿酮酸(C15H20O3)计，不得少于0.05mg。
实施例3
(1)用薄层色谱法对药物中的一枝蒿特征活性成分——一枝蒿酮酸进行定性鉴别：取蒿板青颗粒研细的粉末5g，加乙醇80mL，超声处理10min，过滤，取滤液蒸干，再次添加乙醇5mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。另取一枝蒿酮酸对照品，加乙醇制成每1mL含0.15mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各5μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比为10：15：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示出荧光斑点。
(2)用薄层色谱法对药物中板蓝根的特征活性成分——(R,S)-告依春进行定性鉴别：取蒿板青颗粒研细的粉末10g，加水100mL使溶解，加二氯甲烷振摇提取4次，每次使用二氯甲烷100mL；将二氯甲烷层离心，合并二氯甲烷澄清液，浓缩至5mL，作为供试品溶液。另取(R,S)-告依春对照品，加乙醇制成每1mL含0.9mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(体积比为5：1)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯下检视。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示出荧光斑点。
(3)用薄层色谱法对药物中的大青叶特征活性成分——靛玉红进行定性鉴别：取本品研细的粉末20g，加水100mL使溶解，加三氯甲烷振摇提取1次，使用三氯甲烷100mL，将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，蒸干，添加三氯甲烷5mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。另取靛玉红对照品，加三氯甲烷制成每1mL含0.15mg的溶液，作为对照品溶液。
照薄层色谱法(附录0502)试验，吸取上述两种溶液各10μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮(体积比为9：1：1)为展开剂，展开，取出，晾干。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显与对照品相同颜色的斑点。
(4)检查：照附录0106颗粒剂项下有关要求，性状、粒度、水分、溶化性、装量应符合规定。
(5)高效液相色谱法测定一枝蒿酮酸的含量(附录0512)：
色谱条件与***适用性试验：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液(体积比为68：5：92)为流动相；检测波长为265nm。
对照品溶液的制备：取一枝蒿酮酸对照品，精密称定，加乙醇制成每1mL含74μg的溶液，即制得。
供试品溶液的制备：取蒿板青颗粒适量，研细，取细粉6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇20mL，密塞，称定重量，超声处理50min，冷却至25℃以下，再称定重量，用乙醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。
测定法：分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，测定，即得。本品每1g含一枝蒿以一枝蒿酮酸(C15H20O3)计，不得少于0.25mg。
实验
本发明的质量控制方法是经过大量试验研究，筛选得到的最佳方案，以下为本发明的试验研究过程。
实验1一枝蒿特征活性成分——一枝蒿酮酸的薄层色谱鉴别方法筛选
1.1供试品溶液的制备方法筛选：
方法一：取本品研细的粉末5g，加甲醇80mL，超声处理10分钟，过滤，取滤液蒸干，再次添加甲醇5mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法二：取本品研细的粉末5g，加乙醇40mL，超声处理20分钟，过滤，取滤液蒸干，再次添加乙醇3mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法三：取本品研细的粉末5g，加甲醇20mL，超声处理60分钟，滤过，取滤液蒸干，再次添加甲醇1mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法四：取本品研细的粉末5g，加乙醇80mL，加热回流40分钟，滤过，取滤液蒸干，再次添加乙醇2mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法五：取本品研细的粉末5g，加乙醇50mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液蒸干，再次添加乙醇2mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法六：取本品研细的粉末5g，加乙醇20mL，超声处理30分钟，滤过，取滤液蒸干，再次添加乙醇2mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
结果：方法一、三、六斑点模糊、杂质多，方法四无斑点，方法二、五斑点清晰，但方法二斑点无拖尾、最清晰，因此最佳选择为方法二。
1.2展开***筛选：
1)醋酸乙酯-甲醇-浓氨试液(体积比17：2：1)；
2)醋酸乙酯-甲醇-水(体积比40：5：1)；
3)甲苯-甲醇-甲酸(体积比18：3：1)；
4)石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比20：10：1)；
5)石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比15:8:1)；
6)石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯-冰醋酸(体积比10：5：1)。
结果：***1)、2)、3)的Rf值偏高，***4)、6)的Rf值偏低，斑点圆整度低，***5)的Rf值适中，斑点圆整，因此最佳选择为***5)。
实验2板蓝根特征活性成分——(R,S)-告依春的薄层色谱鉴别方法筛选
2.1供试品溶液的制备方法筛选：
方法一：取本品研细的粉末10g，加水100mL使溶解，用三氯甲烷100mL振摇提取1次，将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，浓缩至5mL，作为供试品溶液。
方法二：取本品研细的粉末10g，加水20mL使溶解，用二氯甲烷振摇提取4次，每次使用二氯甲烷20mL，合并二氯甲烷液，蒸干，残渣加二氯甲烷2mL使溶解，作为供试品溶液。
方法三：取本品研细的粉末10g，加水80mL使溶解，用二氯甲烷振摇提取3次，每次使用二氯甲烷80mL，将二氯甲烷层离心，合并二氯甲烷澄清液，浓缩至3mL，作为供试品溶液。
结果：方法一斑点拖尾严重，方法二提取液乳化严重，无法分离纯化，方法三分离效率高，斑点清晰，因此最佳选择为方法三。
2.2展开***筛选：
1)石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(体积比2：1)；
2)苯-氯仿-丙酮(体积比5：4：1)；
3)石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(体积比5:1)。
结果：***2)拖尾严重，***3)斑点圆整度低，***1)最好，因此最佳选择为***1)。
实验3大青叶特征活性成分——靛玉红的薄层色谱鉴别方法筛选
3.1供试品溶液的制备方法筛选：
方法一：取本品10g，加水30mL使溶解，用三氯甲烷30mL振摇提取1次，合并三氯甲烷液，蒸干，添加加三氯甲烷1mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法二：取本品研细的粉末20g，加水50mL使溶解，加三氯甲烷振摇提取3次，每次使用三氯甲烷50mL，将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，蒸干，添加三氯甲烷3mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
方法三：取本品10g，加水100mL使溶解，加三氯甲烷振摇提取4次，每次使用三氯甲烷100mL，合并三氯甲烷液，蒸干，添加三氯甲烷5mL使蒸干物溶解，作为供试品溶液。
结果：方法一、三提取液乳化严重，无法分离纯化，方法二分离效率高，斑点清晰，因此最佳选择为方法二。
3.2展开***筛选：
1)石油醚(60～90℃)-乙酸乙酯(体积比1：1)；
2)苯-氯仿-丙酮(体积比6：3：1)；
3)石油醚(30～60℃)-乙酸乙酯(体积比2:1)。
结果：***1)、3)拖尾严重，***2)最好，因此最佳选择为***2)。
实验4一枝蒿特征活性成分——一枝蒿酮酸的含量测定方法筛选
4.1仪器和试药
仪器：Agilent 1100高效液相色谱***；SUPELCO ODS C18色谱柱(4.6mm×250mm，5μm)；岛津UV-2550型紫外可见分光光度计。
试药：一枝蒿酮酸对照品；甲醇、乙醇、乙腈(色谱纯)；其他试剂均为分析纯。
样品：蒿板青颗粒(批号190202)及缺一枝蒿的阴性对照品。
4.2供试品溶液制备方法的筛选
方法一：取本品适量，研细，取细粉6g，精密称定，置20mL量瓶中，加甲醇适量，超声处理10分钟，冷却至25℃以下，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法二：取本品适量，研细，取细粉3g，精密称定，置80mL量瓶中，加50％乙醇适量，超声处理40分钟，冷却至25℃以下，加50％乙醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
方法三：取本品适量，研细，取细粉6g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入乙醇60mL，密塞，称定重量，超声处理20分钟，冷却至25℃以下，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。
试验发现方法一和二出峰时间不稳定，杂质峰多，分离度不好，故选择方法三作为供试品溶液制备方法。
4.3色谱条件的筛选
以甲醇或乙醇作溶剂配制适当浓度的一枝蒿酮酸对照品溶液，置于紫外分光光度计内扫描，设定区间为200～400nm，扫描结果显示，一枝蒿酮酸在波长254nm处的吸收度值最大。因此，选择254nm为检测波长。
流动相比较：
1)甲醇-0.4％磷酸溶液(体积比50：50)，该条件一枝蒿酮酸峰保留时间较合适，但色谱图中主峰与前后杂质峰，分离情况较差，无法准确测定，尝试前后调整流动相比例，在尝试多个不同甲醇-0.4％磷酸溶液流动相比例后，主峰与杂质峰始终难以分开；
2)甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液(体积比47：15：30)，该条件进行测定时，保留时间增加，样品主峰与杂质峰分离效果较好，故选择甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液(体积比47：15：30)作为流动相。
4.4***适用性和专属性试验
分别取空白溶液、对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，进样，结果在该色谱条件下，一枝蒿酮酸的分离度达到1.5以上，阴性样品在相应位置附近无吸收峰，表明该方法能满足检测要求。
4.5线性考察
精密量取一枝蒿酮酸对照品，加甲醇稀释，分别制成7.5、15、30、45、60、75μg/mL的一枝蒿酮酸对照品溶液，过滤，取续滤液，按上述色谱条件进样，测定，以峰面积(y)为纵坐标，对照品浓度(x)为横坐标作线性回归，得回归方程为：y＝96.558x-136.322，R2＝0.9997，结果见表1，表明一枝蒿酮酸进样量在0.15～1.5μg范围内，线性关系良好。
表1线性关系试验数据
4.6精密度试验
取对照品溶液，依法注入液相色谱仪，重复进样6次，以峰面积计算RSD，结果见表2，表明精密度良好。
表2精密度试验数据
4.7稳定性试验
制备同一供试品(批号190202)溶液，分别在第0、2、4、6、8、10、12h进样，测定峰面积，计算RSD。结果见表3，显示样品在12h内稳定。
表3稳定性试验数据
4.8重复性试验
制备同一供试品(批号190202)溶液6份，分别进样，测定含量，计算RSD。结果见表4，表明该方法重现性良好。
表4重复性试验数据
4.9加样回收率试验
精密称取已知含量的供试品(批号190202)6份，置于容量瓶中，分别精密加入对照品(μg·mL-1)溶液10mL，按上述方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率。结果见表5，表明该方法回收率良好。
表5加样回收率试验数据
4.10样品测定
以上述条件和方法测定三批样品(190201、190202、190203)，以峰面积计算样品中一枝蒿酮酸含量，结果见表6。
表6样品测定结果(n＝3)
上述试验过程并不需要按照步骤先后顺序进行，同时还可以进行常规项目检测，如样品性状为棕色或棕褐色颗粒；味甜、微苦。而且样品还应符合中国兽药典2015年版二部附录0106颗粒剂项下有关的各项规定。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蒿板青颗粒的质量控制方法，其特征在于，包括一枝蒿酮酸、R,S-告依春和靛玉红的鉴别；还包括一枝蒿酮酸的含量测定；
其中，一枝蒿酮酸、R,S-告依春和靛玉红的鉴别采用薄层色谱法；一枝蒿酮酸的含量测定采用高效液相色谱法。
2.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，
在一枝蒿酮酸的鉴别中：以甲醇或乙醇为溶剂，分别将供试品溶液和对照品溶液点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯-冰醋酸为展开剂；
在R,S-告依春的鉴别中：供试品以二氯甲烷或三氯甲烷为溶剂，对照品以甲醇或乙醇为溶剂；分别将供试品溶液和对照品溶液点于同一硅胶GF254薄层板上，以石油醚-乙酸乙酯为展开剂；
在靛玉红的鉴别中：以三氯甲烷为溶剂，分别将供试品溶液和对照品溶液点于同一硅胶G薄层板上，以苯-三氯甲烷-丙酮为展开剂。
3.根据权利要求2所述的质量控制方法，其特征在于，
在一枝蒿酮酸的鉴别中：展开剂油醚-乙酸乙酯-冰醋酸的体积比为(10～30)：(5～15)：1，石油醚的温度为30～90℃；
在R,S-告依春的鉴别中：展开剂石油醚-乙酸乙酯的体积比为(1～5)：1，石油醚的温度为30～90℃；
在靛玉红的鉴别中：展开剂苯-三氯甲烷-丙酮的体积比为(2～9)：(1～8)：1。
4.根据权利要求2或3所述的质量控制方法，其特征在于，
在一枝蒿酮酸的鉴别中，供试品溶液的制备方法如下：取蒿板青颗粒研成粉末，加入溶剂，蒿板青颗粒粉末与溶剂的用量比为1g：(4～16)mL；超声处理10～60min，过滤，取滤液蒸干，再次添加溶剂使蒸干物溶解，蒿板青颗粒粉末与再次添加的溶剂的比例为1g：(0.2～1)mL，得供试品溶液；
在R,S-告依春的鉴别中，供试品溶液的制备方法如下：取蒿板青颗粒研成粉末，加水使溶解后加入溶剂振摇提取1～4次，蒿板青颗粒粉末与水的用量比为1g：(2～10)mL，蒿板青颗粒粉末与每次使用的溶剂的用量比为1g：(2～10)mL；将溶剂层离心，合并溶剂澄清液，浓缩至蒿板青颗粒粉末与浓缩液的比例为1g：(0.1～0.5)mL，得供试品溶液；
在靛玉红的鉴别中，供试品溶液的制备方法如下：取蒿板青颗粒研成粉末，加水使溶解后加入三氯甲烷振摇提取1～4次，蒿板青颗粒粉末与水的用量比为2g：(3～10)mL，蒿板青颗粒粉末与每次使用的三氯甲烷的用量比为2g：(3～10)mL；将三氯甲烷层离心，合并三氯甲烷澄清液，蒸干，蒸干物再次添加加三氯甲烷使溶解，蒿板青颗粒粉末与再次添加的三氯甲烷的比例为1g：(0.05～0.25)mL，得供试品溶液。
5.根据权利要求2或3所述的质量控制方法，其特征在于，
在一枝蒿酮酸的鉴别中，对照品溶液的浓度为0.05～0.15mg·mL-1，点样量为5μl；
在R,S-告依春的鉴别中，对照品溶液的浓度为0.3～0.9mg·mL-1，点样量为10μl；
在靛玉红的鉴别中，对照品溶液的浓度为0.05～0.15mg·mL-1，点样量为10μl。
6.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，在薄层色谱法检测中，在紫外光灯下，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显示荧光斑点或与对照品相同颜色的斑点，则判定蒿板青颗粒中含有一枝蒿酮酸、R,S-告依春或靛玉红。
7.根据权利要求1所述的质量控制方法，其特征在于，一枝蒿酮酸的含量测定中，以一枝蒿酮酸为对照品；采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液为流动相；检测波长为221～265nm。
8.根据权利要求7所述的质量控制方法，其特征在于，所述的流动相中，甲醇-乙腈-0.4％磷酸溶液的体积比为(11～68)：(5～45)：(16～92)。
9.根据权利要求7所述的质量控制方法，其特征在于，一枝蒿酮酸的含量测定中，供试品的制备方法如下：
取蒿板青颗粒研成粉末，加入甲醇或乙醇作为溶剂，超声处理10～50min，蒿板青颗粒粉末与溶剂的用量比为6g：(20～80)mL；用甲醇或乙醇补足减失重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。
10.根据权利要求7所述的质量控制方法，其特征在于，一枝蒿酮酸的含量测定中，所述的对照品为浓度为13～74μg·mL-1的甲醇或乙醇溶液。
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