CN115015452B - 一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法 - Google Patents
一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本申请公开了一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，包括以下步骤：(1)供试品溶液的制备：取山药片打粉后，过筛，精密称定，加入甲醇水溶液，密封后超声提取，摇匀，取部分提取液离心，离心后吸取上清液过滤后即得；(2)对照品溶液的制备：取腺苷和尿囊素对照品适量，精密称定，加适量甲醇溶解，制成混合对照溶液；(3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中尿囊素和腺苷的含量。本申请的方法方便快捷成本低，特异性强、灵敏度高，便于普及应用，能够为山药饮片的质量评价提供有效参考，能够用于中成药、中药配方颗粒生产用原料的检验和质量控制。
Description
技术领域
本申请涉及一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，属于中药成分检测技术领域。
背景技术
山药具有健脾补胃，生津益肺等多种功效，是一种常用的中药，同时也是广为接受的保健食品。现如今山药的产地众多，2020年版《中国药典》一部中仅收载了性状、鉴别、检查和浸出物等项目，缺乏含量测定项，不利于山药饮片质量的评价。尿囊素和腺苷是山药所含有的主要活性成分，尿囊素具有促进细胞生长，加速伤口愈合的作用，对消化道溃疡和炎症、糖尿病、骨髓炎等疾病有较好的治疗作用。腺苷进入人体后可以参与心肌细胞的能量代谢，还可以扩张冠脉血管，增加血流量，对心血管***有明显的保护作用。
高效液相色谱法是目前较为准确高效的山药中有效成分含量的检测方法，但文献中报道的多是分别采用不同的色谱条件进行分开检测，不仅耗时，也造成更多的资源浪费。国内也有应用液质联用技术同时检测山药中腺苷和尿囊素的方法，但设备价格昂贵，该方法不利于普及和应用。
发明内容
为了解决上述问题，提供了一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，方便快捷成本低，特异性强、灵敏度高，便于普及应用，为山药饮片的质量评价提供有效参考，能够用于中成药、中药配方颗粒生产用原料的检验和质量控制。
根据本申请的一个方面，提供了一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，包括以下步骤：
(1)供试品溶液的制备：取山药片打粉后，过筛，精密称定，加入甲醇水溶液，密封后超声提取，摇匀，取部分提取液离心，离心后吸取上清液过滤后即得；
(2)对照品溶液的制备：取腺苷和尿囊素对照品适量，精密称定，加适量甲醇溶解，制成混合对照溶液；
(3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中尿囊素和腺苷的含量。
可选地，步骤(1)为取山药片打粉后，过5号筛，精密称取过筛后的粉末2g，置于量瓶中，加入体积分数为10％的甲醇水溶液，用封口膜密封后，超声提取50-70min，摇匀，取部分提取液至离心管，离心后吸取上清液经微孔滤膜过滤即得。
可选地，步骤(1)中离心转速为4000-6000r/min，离心时间为8-12min，微孔滤膜的孔径为0.45um。
优选地，步骤(1)中离心转速为5000r/min，离心时间为10min。
可选地，步骤(2)为取腺苷和尿囊素对照品适量，精密称定，加10％甲醇水溶液溶解，制成每1ml含腺苷80ug和尿囊素200ug的混合对照溶液。
可选地，色谱柱条件为：色谱柱为cosmosil hilic(250mm×4.6mm，5um)，柱温为25℃。
可选地，以水为流动相A，乙腈为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱，流速1.0ml/min，检测波长212nm，进样量10ul，理论塔板数不低于7000。
可选地，洗脱程序为：0～15min，流动相A为10％～20％，流动相B为90％～80％；15～20min，流动相A为20％～10％，流动相B为80％～90％。
本申请的有益效果包括但不限于：
1.根据本申请的采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，检测时间只需20min，操作简单、时间短，且本方法使尿囊素和腺苷成分在色谱柱中的保留能力相对增强，延长尿囊素和腺苷的保留时间，避免山药饮片中其他大极性成分的出峰对目标成分色谱峰的干扰，专属性好。
2.根据本申请的采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，通过限定离心转速和时间，使山药中的淀粉等大分子充分沉淀，提高了待测样品的抗干扰性。
3.根据本申请的采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，尿囊素的定量限为31.25ug/ml，腺苷的定量限为5.66ug/ml，满足山药饮片的含量检测需求。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：
图1为本申请实施例中专属性谱图；
图2为本申请实施例中尿囊素线性图谱；
图3为本申请实施例中腺苷线性图谱。
具体实施方式
下面结合实施例详述本申请，但本申请并不局限于这些实施例。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。本专利中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1
1.仪器与材料
Waters高效液相色谱仪(Waters公司，型号:Waters 2695)、安捷伦高效液相色谱仪(型号：Agilent 1260Infinity II)、色谱柱(cosmosil hilic(250mm×4.6mm，5um))、腺苷对照品(批号：8179，上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度：98.0％)、尿囊素对照品(批号：5702，上海诗丹德标准技术服务有限公司，纯度：98.8％)、尿囊素对照品(批号：111501-200202，中国食品药品检定研究所，纯度：100.0％)、山药片(产地鲜切，河南焦作温县豫香堂中药材有限公司)；
试剂：乙腈色谱纯，甲醇为分析纯，水为屈臣氏纯化水。
2.色谱条件与***适用性试验：柱温：25℃；检测波长：212nm；流动相：以水为流动相A，乙腈为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱，洗脱条件见表1，流速1.0ml/min，检测波长212nm，进样量10ul，理论塔板数不低于7000。
表1洗脱条件
3.实验方法与结果
3.1测定方法
(1)供试品溶液的制备：取山药片打粉后，过5号筛，精密称取过筛后的粉末2g，精密称定，置于100ml量瓶中，加入50ml体积分数为10％的甲醇水溶液，用封口膜密封后，超声提取60min，摇匀，取部分提取液至离心管，离心转速为5000r/min，离心时间为10min，吸取上清液经0.45um微孔滤膜过滤即得。
(2)对照品溶液的制备：取腺苷和尿囊素对照品适量，精密称定，加10％甲醇水溶液溶解，制成每1ml含腺苷80ug和尿囊素200ug的混合对照溶液。
(3)分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中尿囊素和腺苷的含量。
3.2供试品浓度的考察
分别配制2.17mg/ml、5.05mg/ml、10.01mg/ml、20.15mg/ml、40.10mg/ml的供试品溶液，注入液相色谱仪，计算各浓度条件下，尿囊素和腺苷的含量和信噪比，确定供试品的浓度为40mg/ml时最佳，结果详见表2。
表2供试品浓度的考察
3.3样品提取方法的考察
精密称取山药片粉末1000mg至锥形瓶中，再精密移入10％甲醇稀释液50ml，平行配制3份，样1和样2超声60分钟，样3超声30min，超声提取后分别离心取上清液，样1离心5000转10分钟，样2和样3离心8000转10分钟，上清液过滤取续滤液进样，比较峰面积与质量的比值，确定供试品的超声时间为60分钟，离心转速为5000rpm。结果详见表3。
表3样品提取方法的考察
3.4方法学验证
1)专属性
为考察稀释剂和供试品中其他杂质是否对含量测定结果有干扰，分别测定空白溶剂、供试品溶液和对照品溶液，结果见图1。
结果表明，空白溶剂在与供试品中尿囊素和腺苷相应的保留时间处无色谱峰，表明空白溶剂对山药饮片中尿囊素和腺苷的含量测定无干扰。
2)重复性
按3.1中的方法平行配制6份供试品溶液，计算供试品中尿囊素和腺苷的含量，考察该方法的重复性。结果详见表4。
表4重复性试验结果
| 样品 | 尿囊素峰面积 | 尿囊素含量％ | 腺苷峰面积 | 腺苷含量％ |
| 供试品溶液1-1 | 3104.522 | 1.08 | 578.826 | 0.038 |
| 供试品溶液1-2 | 3087.099 | 1.08 | 596.372 | 0.039 |
| 供试品溶液2-1 | 3187.464 | 1.11 | 594.487 | 0.039 |
| 供试品溶液2-2 | 3183.199 | 1.11 | 590.590 | 0.039 |
| 供试品溶液3-1 | 3188.606 | 1.11 | 591.203 | 0.039 |
| 供试品溶液3-2 | 3192.803 | 1.11 | 586.233 | 0.039 |
| 供试品溶液4-1 | 3193.354 | 1.11 | 584.773 | 0.038 |
| 供试品溶液4-2 | 3187.080 | 1.11 | 592.128 | 0.039 |
| 供试品溶液5-1 | 3204.351 | 1.11 | 587.676 | 0.038 |
| 供试品溶液5-2 | 3206.022 | 1.11 | 567.699 | 0.037 |
| 供试品溶液6-1 | 3204.216 | 1.11 | 589.981 | 0.039 |
| 供试品溶液6-2 | 3209.481 | 1.11 | 569.794 | 0.037 |
| 均值 | - | 1.10 | - | 0.039 |
| RSD％ | - | 1.02 | - | 1.76 |
结果表明，两种成分含量的RSD均小于2％，重复性符合要求。
3)线性
分别精密吸取尿囊素对照品母液和腺苷对照品母液适量，以10％的甲醇稀释制成6个系列浓度的供试品溶液，以对照品峰面积及其对应的浓度进行线性回归。结果见表5，线性图谱见图2、图3。
表5
| 成分 | 回归方程 | 线性范围/(ug/ml) | r |
| 尿囊素 | y＝7.0809x+9.4448 | 31.25～1000 | 1.0000 |
| 腺苷 | y＝38,364.7496x+45,973.1208 | 2.83～362.404 | 1.0000 |
结果表明，尿囊素在31.25ug/ml～1000ug/ml范围内线性关系良好，定量限为31.25ug/ml，腺苷在11.33～362.404ug/ml范围内线性关系良好，定量限为5.66ug/ml，符合含量检测的需求。
4)回收率
取已知山药成分含量的同一批供试品6份，每份200mg，分别精密加入一定量的腺苷对照品和尿囊素对照品，制备供试品溶液，按该色谱条件进行测定，计算平均加样回收率和RSD％值，结果见表6。
表6回收率实验结果
结果表明尿囊素的回收率在94.40％～98.61％，平均回收率为96.24％。腺苷的回收率在89.66％～103.84％范围内，平均回收率为96.93％，均符合药典中规定的标准。
5)溶液稳定性
结果表明室温放置24h，对照品的峰面积没有明显变化，供试品的含量也基本不变，满足日常检测需求。结果见表7。
表7溶液稳定性实验结果
6)耐用性
结果表明当柱温在±2℃，波长在±2nm，流速在±0.1ml/min范围内变化时，数据结果未发生明显变化，该方法的耐用性良好。结果见表8。
表8耐用性实验结果
以上所述，仅为本申请的实施例而已，本申请的保护范围并不受这些具体实施例的限制，而是由本申请的权利要求书来确定。对于本领域技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的技术思想和原理之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）供试品溶液的制备：取山药片打粉后，过筛，精密称定，加入甲醇水溶液，密封后超声提取，摇匀，取部分提取液离心，离心后吸取上清液过滤后即得；
（2）对照品溶液的制备：取腺苷和尿囊素对照品适量，精密称定，加适量甲醇水溶液溶解，制成混合对照溶液；
（3）分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液，注入液相色谱仪，按外标法以峰面积计算供试品中尿囊素和腺苷的含量；
其中，步骤（1）为取山药片打粉后，过5号筛，精密称取过筛后的粉末2g，置于量瓶中，加入体积分数为10%的甲醇水溶液，用封口膜密封后，超声提取50-70min，摇匀，取部分提取液至离心管，离心后吸取上清液经微孔滤膜过滤即得；
步骤（1）中离心转速为4000-6000r/min，离心时间为8-12min，微孔滤膜的孔径为0.45μm；
以水为流动相A，乙腈为流动相B组成的梯度洗脱液进行梯度洗脱；洗脱程序为：0～15min，流动相A为10%～20%，流动相B为90%～80%；15～20min，流动相A为20%～10%，流动相B为80%～90%；
色谱柱条件为：色谱柱为Cosmosil HILIC，250mm×4.6mm，5μm，柱温为25℃；检测波长212nm。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）为取腺苷和尿囊素对照品适量，精密称定，加10%甲醇水溶液溶解，制成每1ml含腺苷80μg和尿囊素200μg的混合对照溶液。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，流速1.0ml/min，进样量10μl，理论塔板数不低于7000。
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|---|---|---|---|
| CN202210633942.8A CN115015452B (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法 |
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| CN202210633942.8A CN115015452B (zh) | 2022-06-07 | 2022-06-07 | 一种采用一测多评法测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法 |
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|---|---|
| CN115015452A CN115015452A (zh) | 2022-09-06 |
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| CN (1) | CN115015452B (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| CN103954705A (zh) * | 2014-05-04 | 2014-07-30 | 赵栋磊 | 一种中药山药及含山药制剂中尿囊素含量的测定方法 |
| CN104330516A (zh) * | 2014-11-26 | 2015-02-04 | 广西壮族自治区药用植物园 | 一种同时测定山药中尿囊素和腺苷含量的方法 |
| KR20210063595A (ko) * | 2019-11-25 | 2021-06-02 | 연세대학교 산학협력단 | 비결핵 항산균에 의한 감염 또는 감염 질환의 진단용 바이오마커 |
-
2022
- 2022-06-07 CN CN202210633942.8A patent/CN115015452B/zh active Active
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| 杨雅蛟.不同品种山药中多糖及小分子有效 成分的含量比较.食品科技.2020,第45卷(第45期),181-187. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115015452A (zh) | 2022-09-06 |
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