CN114791468B - 一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，包括：采用高效液相色谱法检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中的异槲皮苷的含量；所述高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以水、0.1～0.4％醋酸、0.1～0.4％磷酸和0.1～0.4％甲酸中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。本发明以异槲皮苷作为山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的一个新的指标成分进行测定，本方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握，可以对山枝仁药材、饮片、提取物及制剂进行更为正规、全面、有效地的质量控制，保证药物的疗效。
Description
技术领域
本发明属于药物分析领域，具体涉及一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法。
背景技术
山枝仁为海桐花科海桐花属植物海金子(Pittosporum illioides Mak.)或皱叶海桐(Pittosporum crispulum Gagnep.)的干燥种子，具有清热利咽，涩肠固精，收敛止泻的功效，用于治疗咽痛，痢疾，肠炎，白带，滑精等。
目前关于海桐花属植物成分的研究，多以挥发油成分为主。现有技术测定了山枝仁中槲皮素、芦丁和柽柳素-3-O-芸香糖苷的含量，但未对山枝仁标准汤剂及配方颗粒剂进行研究。在各省中药材标准及炮制规范中，均未在含量测定方面对山枝仁药材进行规定。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，检测其中异槲皮苷的含量，本方法稳定性好，精密度高。
为实现上述目的，本发明的技术方案为一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，包括：采用高效液相色谱法检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中的异槲皮苷的含量；所述高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以水、0.1～0.4％醋酸、0.1～0.4％磷酸和0.1～0.4％甲酸中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。
本发明所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法还包括：将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂进行前处理，所述前处理具体为将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合，进行回流提取或超声提取。
本发明所述前处理过程中，将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合，所述溶剂为乙醇、水或30％～100％甲醇。在一个实施例中，将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合，所述溶剂为70％甲醇。本发明所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂的质量与体积比为(0.1～1)g:25mL，优选为(0.3～0.5)g:25mL。
将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合后，进行超声或回流提取，得到山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的供试品溶液，所述超声或回流提取时间为0.25～4h。在一个实施例中，山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合后，进行超声提取，所述超声提取时间为15～45min。在一个实施例中，山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合后，进行回流提取，所述回流提取时间为1～4h。在一个实施例中，将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合后，进行超声提取，所述超声提取的功率为500W，频率为40kHz。
本发明所述前处理过程具有制备简单、选择范围宽的优点，实验结果表明，山枝仁药材、饮片、提取物及制剂采用本发明提供的溶剂和提取方法进行提取，均能实现其中异槲皮苷的分离。
得到山枝仁药材、饮片、提取物及制剂供试品溶液后，采用高效液相色谱法检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中异槲皮苷的峰面积，计算异槲皮苷的含量。
本发明所述高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以水、0.1～0.4％醋酸、0.1～0.4％磷酸和0.1～0.4％甲酸中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。
在一个实施例中，高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸水溶液为流动相B，进行梯度洗脱；所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比例变化为：
0～10min，流动相A 25％→40％，流动相B 75％→60％；
10～30min，流动相A 40％→60％，流动相B 60％→40％。
本发明所述高效液相色谱法以十八烷基键合硅胶为色谱柱填充剂，在一个实施例中，色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm。
本发明所述高效液相色谱法的流速为0.8～1.2mL/min，在一个实施例中，高效液相色谱法的流速为1.0mL/min。
本发明所述高效液相色谱法的检测波长为350～360nm，在一个实施例中，高效液相色谱法的检测波长为355nm。
本发明所述高效液相色谱法的柱温为25～35℃。在一个实施例中，高效液相色谱法的柱温为30℃。
在一个实施例中，检测波长为355nm，流速为1mL/min，柱温为30℃。
实验结果表明，本发明采用的不同流动相B、波长、柱温、流速范围内检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂，山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中异槲皮苷均能达到有效分离。
本发明采用所述高效液相色谱法色谱条件检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中异槲皮苷的含量，可以实现对山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的质量控制。
在一个实施例中，山枝仁药材的质量标准为“山枝仁药材按干燥品计，异槲皮苷不得少于0.07％”。在一个实施例中，山枝仁饮片的质量标准为“山枝仁饮片按干燥品计，异槲皮苷不得少于0.08％”。在一个实施例中，山枝仁标汤的质量标准为“山枝仁标汤每1g含异槲皮苷为5.1～11.1mg/g”。在一个实施例中，山枝仁配方颗粒的质量标准为“山枝仁配方颗粒每1g含异槲皮苷为0.5mg～2.3mg”。
本发明提供了一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的HPLC含量测定方法包括：采用高效液相色谱法检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中的异槲皮苷的含量；所述高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以水、0.1～0.4％醋酸溶液、0.1～0.4％磷酸和0.1～0.4％甲酸中的一种为流动相B，进行梯度洗脱。本发明以异槲皮苷作为山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的一个新的指标成分，采用高效液相法进行含量测定，测定方法稳定性好、精密度高、重现性好、便捷且易于掌握，可以对山枝仁药材、饮片、提取物及制剂进行更为正规、全面、有效地的质量控制，保证药物的疗效。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为异槲皮苷紫外吸收光谱图；
图2为山枝仁药材不同波长色谱图；
图3为山枝仁药材不同流动相色谱图；
图4为山枝仁药材不同柱温色谱图；
图5为山枝仁药材不同流速色谱图；
图6为山枝仁药材中异槲皮苷含量测定专属性分析；
图7为异槲皮苷标准曲线；
图8为山枝仁标汤不同流动相色谱图；
图9为山枝仁标汤不同柱温色谱图；
图10为山枝仁标汤不同流速色谱图；
图11为山枝仁标汤中异槲皮苷含量测定专属性分析；
图12为山枝仁配方颗粒不同流动相色谱图；
图13为山枝仁配方颗粒不同柱温色谱图；
图14为山枝仁配方颗粒不同流速色谱图；
图15为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷含量测定专属性分析。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。但本发明不限于以下实施例，基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
仪器：岛津LC-20AD高效液相色谱仪，Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent 5TC-C18(2)色谱柱(250×4.6mm，5μm)，万分之一天平(ME204E，梅特勒-托利多公司)，百万分之一天平(XP26，梅特勒-托利多公司)，超纯水***(Mocell 1820A型，Molecular)。
试剂：甲醇、磷酸为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水(实验室自制)。
样品：山枝仁药材(批号：XLS202107316～XLS202107335、010400-1801001)、山枝仁饮片(批号：SZR210801～SZR210820、SZR210901)、山枝仁标汤(批号：SZRBT210901～SZRBT210921)、山枝仁配方颗粒(批号：2104016～2104018)。
对照品：异槲皮苷对照品(批号：111809～201804，含量：97.2％，中国食品药品检定研究院)。
实施例1：
山枝仁药材HPLC检测方法
1、样品制备：
1.1供试品溶液的制备：精密称定山枝仁药材0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL70％甲醇，密塞，称定重量，进行回流提取，提取时间为3小时，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得山枝仁药材供试品溶液。
1.2对照品溶液的制备：将异槲皮苷对照品溶于甲醇中，制成浓度为50μg/mL的异槲皮苷对照品溶液。
2、色谱条件与***适用性试验：
HPLC分析色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表1中的梯度进行洗脱，表1为实施例采用的流动相洗脱梯度；检测波长为355nm。理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于5000。
表1 实施例采用的流动相洗脱梯度
测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定。
2.1检测波长考察：将1.2得到的异槲皮苷对照品溶液进行全波长光谱采集，结果如图1所示，图1为异槲皮苷紫外吸收光谱图，通过对光谱图的分析，确定异槲皮苷的含量测定的最佳检查波长为255nm和355nm。
采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁药材供试品溶液，其中，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。结果如图2所示，图2为山枝仁药材不同波长色谱图，结果表明，山枝仁药材中异槲皮苷的检测波长为255nm时，得到的色谱图基线不稳定；山枝仁药材中异槲皮苷的检测波长为355nm时，得到的色谱图基线稳定，因此以355nm为山枝仁药材中异槲皮苷的检测波长。
2.2流动相考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁药材供试品溶液，考察了4种不同流动相下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，流动相分别为：甲醇-水、甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.2％醋酸、甲醇-0.2％甲酸，检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进行考察。结果如图3所示，图3为山枝仁药材不同流动相色谱图，结果表明，流动相为甲醇-0.2％甲酸和甲醇-0.2％磷酸时，山枝仁药材供试溶液中异槲皮苷的保留时间和峰形差异不大。因此，暂时选择流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液梯度洗脱为洗脱条件。
2.3柱温考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁药材供试品溶液，考察了3种不同柱温下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，柱温分别为25、30和35℃，检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，进行考察。结果如图4和表2所示，图4为山枝仁药材不同柱温色谱图，表2为山枝仁药材不同柱温分析结果，结果表明，3种柱温均能对山枝仁药材中的异槲皮苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。在一定范围内，随着柱温升高，理论塔板数降低。因此，暂时选择柱温为30℃。
表2 山枝仁药材不同柱温分析结果
2.4流速考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁药材供试品溶液，考察了3种不同流速下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，流速分别为0.8、1.0和1.2mL/min，检测波长为355nm，柱温为30℃，进行考察。结果如图5和表3所示，图5为山枝仁药材不同流速色谱图，表3为山枝仁药材不同流速分析结果，结果表明，3种流速均能对山枝仁药材中的异槲皮苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。在一定范围内，随着流速增加，理论塔板数降低。因此，暂时选择流速为1.0mL/min。
表3 山枝仁药材不同流速分析结果
综上所述，HPLC分析色谱条件确定为：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按表1中的梯度进行洗脱，检测波长为355nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。
3、供试品溶液制备方法考察
采用确定的HPLC分析色谱条件进行样品测定。
3.1提取溶剂考察：分别精密称定12份0.5g的山枝仁药材供试品，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇和水各25mL，回流提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，过滤，取续滤液，得到供试品溶液。取10μL供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分析计算不同溶剂提取山枝仁药材中异槲皮苷含量。
结果见表4，表4为山枝仁药材不同提取溶剂分析结果，结果表明，以50％甲醇、70％甲醇、甲醇为提取溶剂时，样品中异槲皮苷含量差异不大，因此，暂定70％甲醇作为山枝仁药材提取溶剂。
表4 山枝仁药材不同提取溶剂分析结果
3.2提取方式考察：分别精密称定4份0.5g的山枝仁药材供试品，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，制成山枝仁药材溶液。将其中2份山枝仁药材溶液进行超声提取，超声提取功率为600W，频率为40kHz，将2份山枝仁药材溶液进行回流提取，提取时间均为30min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行测定，分析计算不同提取方式下异槲皮苷含量。
结果见表5，表5为山枝仁药材不同提取方式分析结果，结果表明，回流提取所得异槲皮苷含量较高，故以回流提取作为提取方式。
表5 山枝仁药材不同提取方式分析结果
3.3提取时间考察：精密称定10份0.5g的山枝仁药材，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，分别回流提取1h、2h、3h和4h，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤取滤液，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行测定，计算不同提取时间下异槲皮苷含量。
结果见表6，表6为山枝仁药材不同提取时间分析结果，结果表明，山枝仁药材样品中异槲皮苷在3h时可提取完全，故选择提取时间为3h。
表6 山枝仁药材不同提取时间分析结果
3.4取样量考察：分别精密称定山枝仁药材供试品0.3g、0.5g和1.0g，各2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取3h，放冷，再次称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行检测，分析计算不同取样量下异槲皮苷含量。
结果见表7，表7为山枝仁药材不同取样量分析结果，结果表明，山枝仁药材样品取样量为0.5g时，异槲皮苷可提取完全，故选择取样量为0.5g。
表7 山枝仁药材不同取样量分析结果
综上所述，山枝仁药材供试品溶液制备方法确定为：精密称定0.5g山枝仁药材供试品，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取3小时，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
4、方法学考察
按照确定的方法制备供试品溶液，采用确定的HPLC分析色谱条件进行方法学考察。
4.1专属性实验：制备对照品溶液，将甲醇作为阴性对照溶液，进行检测，结果如图6所示。图6为山枝仁药材中异槲皮苷含量测定专属性分析，结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
4.2精密度考察：将制备得到的对照品溶液连续进样6次，记录异槲皮苷的峰面积，计算RSD值，结果见表8。表8为异槲皮苷精密度考察，结果表明，异槲皮苷的峰面积RSD值为0.13％，本方法的进样精密度良好。
表8 异槲皮苷精密度考察
4.3重复性考察：精密称定6份同一批山枝仁药材供试品0.5g，由同一操作人员制成供试品溶液，进行样品检测，计算6份供试品溶液中异槲皮苷的含量，结果见表9。表9为山枝仁药材中异槲皮苷的重复性考察，结果表明，山枝仁药材中异槲皮苷的含量RSD值为0.04％，本方法重复性良好。
表9 山枝仁药材中异槲皮苷的重复性考察
4.4中间精密度考察：
4.4.1不同仪器考察：分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD高效液相色谱仪上进行样品测定，高效液相色谱仪采用的色谱柱均为Agilent 5TC-C18(2)5μm4.6×250mm)，结果见表10。表10为山枝仁药材中异槲皮苷不同仪器考察，结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，异槲皮苷含量的RSD值为1.55％，本方法中间精密良好。
表10 山枝仁药材中异槲皮苷不同仪器考察
4.4.2不同人员和不同时间考察：取同一供试品由不同人员(A和B)在不同时间(Ⅰ和II)制备供试品溶液，计算供试品溶液中异槲皮苷的含量，结果见表11。表11为山枝仁药材中异槲皮苷不同人员和不同时间考察，结果表明，山枝仁药材中异槲皮苷的含量测定结果RSD值为0.03％，本方法中间精密度良好。
表11 山枝仁药材中异槲皮苷不同人员和不同时间考察
4.5线性考察：精密称取5.069mg异槲皮苷对照品置于25ml量瓶中，加甲醇定容至刻度线，摇匀，得到混合对照品储备液。分别精密吸取对照品储备液适量，采用甲醇分别稀释0、2、4、8、16和32倍，即得系列浓度的混合对照品溶液。精密吸取系列混合对照品溶液10μL，进行分析，记录色谱峰峰面积，以对照品浓度为横坐标(X)，以色谱峰峰面积为纵坐标(Y)，绘制响应曲线，结果见表12和图7。表12为异槲皮苷线性关系考察，图7为异槲皮苷标准曲线，结果表明，异槲皮苷进样浓度在6.158835～197.082720μg/mL范围内，线性关系良好，异槲皮苷标准曲线为Y＝24212.4542X-26652.3582，R2＝0.9999。
表12 异槲皮苷线性关系考察
4.6稳定性考察：精密称定供试品粉末，制备供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h和24h时进行检测，结果见表13。表13为山枝仁药材中异槲皮苷峰面积稳定性考察，结果表明，在本实验条件下，山枝仁药材中异槲皮苷的峰面积RSD值为0.74％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
表13 山枝仁药材中异槲皮苷峰面积稳定性考察
4.7加样回收实验：精密称定已知含有0.14％异槲皮苷的山枝仁药材供试品约0.25g，共6份，分别精密加入一定量的混合对照品，制备供试品溶液，进行色谱分析，计算异槲皮苷回收率，结果见表14，表14为加样回收实验结果。计算公式如下：
回收率(％)＝100％*(测定量-样品中含量)/加入量。
结果表明，异槲皮苷回收率平均值为104.48％，回收率结果的RSD值为1.02％，本方法准确度良好。
表14 加样回收实验结果
4.8耐用性考察：采用不同品牌C18色谱柱(Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm，5μm；Phenomenex Luna C18(2)100A 250×4.6mm，5μm；岛津Wondasil C18 for HerbalMedicine 250×4.6mm，5μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表15。表15为方法耐用性考察，结果表明，不同色谱柱的分析测量结果的RSD值为0.85％，本方法耐用性良好。
表15 方法耐用性考察
5、供试品含量测定验证
按照确定的山枝仁药材供试品溶液制备方法，采用确定的HPLC分析色谱条件进行山枝仁药材供试品含量测定。
药材验证：以21批山枝仁药材为供试品，按确定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算异槲皮苷的含量，结果见表16。表16为21批山枝仁药材含量测定验证，结果表明，山枝仁药材中异槲皮苷含量的平均值为0.13％，平均值加减30％的限量为0.09％～0.17％，SD值为0.02，平均值加减SD的限量为0.07％～0.19％。
综上所述，暂定山枝仁药材含量范围为“本品按干燥品计，异槲皮苷不得少于0.07％”。
表16 21批山枝仁药材含量测定验证
实施例2：
山枝仁饮片HPLC检测方法
供试品溶液的制备：精密称定山枝仁饮片0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取3小时，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：精密称取异槲皮苷对照品适量，加入甲醇制成浓度为50μg/mL的对照品溶液。
色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％醋酸溶液为流动相B，按实施例1中表1规定的梯度进行洗脱；检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃。理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于5000。
供试品含量测定验证：以21批山枝仁饮片为供试品，制备供试品溶液并进行测定，记录异槲皮苷的峰面积，计算异槲皮苷的含量，结果见表17。表17为21批山枝仁饮片含量测定验证，结果表明，山枝仁饮片中异槲皮苷含量的平均值为0.12％，平均值加减30％的限量为0.08％～0.16％，SD值为0.01，平均值加减SD的限量为0.09％～0.15％。
表17 21批山枝仁饮片含量测定验证
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综上所述，暂定山枝仁饮片含量范围为“本品按干燥品计，异槲皮苷不得少于0.08％”。
实施例3：
山枝仁标汤HPLC检测方法
1、样品制备：
1.1供试品溶液的制备：精密称定山枝仁标汤0.3g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL70％甲醇，密塞，称定重量，进行超声提取，提取时间为30min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得山枝仁标汤供试品溶液。
1.2对照品溶液的制备：将异槲皮苷对照品溶于甲醇中，制成浓度为50μg/mL的异槲皮苷对照品溶液。
2、色谱条件与***适用性试验：
HPLC分析色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按实施例1中表1进行梯度洗脱；检测波长为355nm。理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于5000。
测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定。
2.1检测波长考察：根据实施例1中山枝仁药材的检测波长选择，以355nm作为山枝仁标汤中异槲皮苷的检测波长。
2.2流动相考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁标汤供试品溶液，考察了4种不同流动相下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，流动相分别为：甲醇-水、甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.2％醋酸、甲醇-0.2％甲酸，检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进行考察。
结果如图8所示，图8为山枝仁标汤不同流动相色谱图，结果表明，流动相为甲醇-0.2％甲酸和甲醇-0.2％磷酸时，山枝仁标汤供试溶液中异槲皮苷的保留时间和峰形差异不大。因此，暂时选择流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液梯度洗脱为洗脱条件。
2.3柱温考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁标汤供试品溶液，考察了3种不同柱温下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，柱温分别为25、30和35℃，检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，进行考察。
结果如图9和表18所示，图9为山枝仁标汤不同柱温色谱图，表18为山枝仁标汤不同柱温分析结果，结果表明，3种柱温均能对山枝仁标汤中的异槲皮苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。在一定范围内，随着柱温升高，理论塔板数降低。因此，暂时选择柱温为30℃。
表18 山枝仁标汤不同柱温分析结果
2.4流速考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁标汤供试品溶液，考察了3种不同流速下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，流速分别为0.8、1.0和1.2mL/min，检测波长为355nm，柱温为30℃，进行考察。
结果如图10和表19所示，图10为山枝仁标汤不同流速色谱图，表19为山枝仁标汤不同流速分析结果，结果表明，3种流速均能对山枝仁标汤中的异槲皮苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。在一定范围内，随着流速增加，理论塔板数降低。因此，暂时选择流速为1.0mL/min。
表19 山枝仁标汤不同流速分析结果
综上所述，HPLC分析色谱条件确定为：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按实施例1中表1的梯度进行洗脱，检测波长为355nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。
3、供试品溶液制备方法考察
采用确定的HPLC分析色谱条件进行样品测定。
3.1提取溶剂考察：分别精密称定12份0.3g的山枝仁标汤供试品，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇和水各25mL，回流提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，过滤，取续滤液，得到供试品溶液。取10μL供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分析计算不同溶剂提取山枝仁标汤中异槲皮苷含量。
结果见表20，表20为山枝仁标汤不同提取溶剂分析结果，结果表明，以30％甲醇和70％甲醇为提取溶剂时，样品中异槲皮苷含量差异不大，因此，暂定70％甲醇作为山枝仁标汤提取溶剂。
表20 山枝仁标汤不同提取溶剂分析结果
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3.2提取方式考察：分别精密称定4份0.3g的山枝仁标汤供试品，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，制成山枝仁标汤溶液。将其中2份山枝仁标汤溶液进行超声提取，超声提取功率为600W，频率为40kHz，将2份山枝仁标汤溶液进行回流提取，提取时间均为30min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行测定，分析计算不同提取方式下异槲皮苷含量。
结果见表21，表21为山枝仁标汤不同提取方式分析结果，结果表明，回流提取效率较高，故以回流提取作为提取方式。
表21 山枝仁标汤不同提取方式分析结果
3.3提取时间考察：精密称定6份0.3g的山枝仁标汤，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL70％甲醇，密塞，称定重量，分别回流提取15min、30min和45min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤取滤液，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行测定，计算不同提取时间下异槲皮苷含量。
结果见表22，表22为山枝仁标汤不同提取时间分析结果，结果表明，山枝仁标汤样品中异槲皮苷在15min时可提取完全，为保证其他批次样品充分提取，故选择提取时间为30min。
表22 山枝仁标汤不同提取时间分析结果
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3.4取样量考察：分别精密称定山枝仁标汤供试品0.1g、0.3g和0.5g，各2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取30min，放冷，再次称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行检测，分析计算不同取样量下异槲皮苷含量，结果见表23。表23为山枝仁标汤不同取样量分析结果，结果表明，取样量为0.3g时，异槲皮苷可提取完全，故选择取样量为0.3g。
表23 山枝仁标汤不同取样量分析结果
综上所述，山枝仁标汤供试品溶液制备方法确定为：精密称定0.1g山枝仁标汤供试品，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取30min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
4、方法学考察
按照确定的方法制备供试品溶液，采用确定的HPLC分析色谱条件进行方法学考察。
4.1专属性实验：制备对照品溶液，将甲醇作为阴性对照溶液，进行检测，结果如图11所示。图11为山枝仁标汤中异槲皮苷含量测定专属性分析，结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
4.2精密度考察：将制备得到的对照品溶液连续进样6次，记录异槲皮苷的峰面积，计算RSD值，结果见表24。表24为异槲皮苷精密度考察，结果表明，异槲皮苷的峰面积RSD值为0.05％，本方法的进样精密度良好。
表24 异槲皮苷精密度考察
4.3重复性考察：精密称定6份同一批山枝仁标汤供试品0.3g，由同一操作人员制成供试品溶液，进行样品检测，计算6份供试品溶液中异槲皮苷的含量，结果见表25。表25为山枝仁标汤中异槲皮苷的重复性考察，结果表明，山枝仁药材中异槲皮苷的含量RSD值为1.08％，本方法重复性良好。
表25 山枝仁标汤中异槲皮苷的重复性考察
4.4中间精密度考察：
4.4.1不同仪器考察：精密称定山枝仁标汤供试品0.3g，制备山枝仁标汤供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD高效液相色谱仪上进行样品测定，高效液相色谱仪采用的色谱柱均为Agilent 5TC-C18(2)5μm 4.6×250mm)，结果见表26。表26为山枝仁标汤中异槲皮苷不同仪器考察，结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，异槲皮苷含量的RSD值为0.61％，本方法中间精密度良好。
表26 山枝仁标汤中异槲皮苷不同仪器考察
4.4.2不同人员和不同时间考察：取同一供试品由不同人员(A和B)在不同时间(Ⅰ和II)制备供试品溶液，计算山枝仁标汤供试品溶液中异槲皮苷的含量，结果见表27。
表27为山枝仁标汤中异槲皮苷不同人员和不同时间考察，结果表明，山枝仁标汤中异槲皮苷的含量测定结果RSD值为0.64％，本方法中间精密度良好。
表27 山枝仁标汤中异槲皮苷不同人员和不同时间考察
/>
4.5线性考察：根据实施例1的线性考察方法进行考察，得到的异槲皮苷标准曲线与实施例1相同。
4.6稳定性考察：精密称定供试品粉末，制备供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h和24h时进行检测，结果见表28。表28为山枝仁标汤中异槲皮苷峰面积稳定性考察，结果表明，在本实验条件下，山枝仁标汤中异槲皮苷的峰面积RSD值为1.54％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
表28 山枝仁标汤中异槲皮苷峰面积稳定性考察
4.7加样回收实验：精密称定已知含有1.9mg/g异槲皮苷的山枝仁标汤供试品约0.15g，共6份，分别精密加入一定量的混合对照品，制备供试品溶液，进行色谱分析，计算异槲皮苷回收率，结果见表29，表29为加样回收实验结果。计算公式如下：
回收率(％)＝100％*(测定量-样品中含量)/加入量。
结果表明，异槲皮苷回收率平均值为93.65％，回收率结果的RSD值为2.88％，本方法准确度良好。
表29 加样回收实验结果
4.8耐用性考察：采用不同品牌C18色谱柱(Agilent 5TC-C18(2)250×4.6mm，5μm；Phenomenex Luna C18(2)100A 250×4.6mm，5μm；岛津Wondasil C18 for HerbalMedicine 250×4.6mm，5μm)在同一仪器对同一供试品进行检测，结果见表30。表30为方法耐用性考察，结果表明，不同色谱柱的分析测量结果的RSD值为1.56％，本方法耐用性良好。
表30 方法耐用性考察
5、供试品含量测定验证
按照确定的山枝仁标汤供试品溶液制备方法，采用确定的HPLC分析色谱条件进行山枝仁标汤供试品含量测定。
标汤验证：以21批山枝仁标汤为供试品，按确定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算异槲皮苷的含量，结果见表31。表31为21批山枝仁标汤含量测定验证，结果表明，山枝仁标汤中异槲皮苷含量的平均值为8.1mg/g，平均值加减30％的限量为5.7～10.5mg/g，SD值为1.0，平均值加减3SD的限量为5.1～11.1mg/g。
根据以上数据，暂将山枝仁标汤的异槲皮苷含量测定范围确定为“本品每1g含异槲皮苷应为5.1mg～11mg。”。
表31 21批山枝仁标汤含量测定验证
/>
实施例4：
山枝仁配方颗粒HPLC检测方法
1、样品制备：
1.1供试品溶液的制备：精密称定山枝仁配方颗粒0.5g，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，进行超声提取，提取时间为30min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得山枝仁配方颗粒供试品溶液。
1.2对照品溶液的制备：将异槲皮苷对照品溶于甲醇中，制成浓度为50μg/mL的异槲皮苷对照品溶液。
2、色谱条件与***适用性试验：
HPLC分析色谱条件：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按实施例1中表1进行梯度洗脱；检测波长为355nm。理论板数按异槲皮苷峰计算应不低于5000。
测定：精密吸取对照品溶液、供试品溶液各10μL，注入液相色谱仪进行测定。
2.1检测波长考察：根据实施例1中山枝仁药材的检测波长选择，以355nm作为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷的检测波长。
2.2流动相考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁配方颗粒供试品溶液，考察了4种不同流动相下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，流动相分别为：甲醇-水、甲醇-0.2％磷酸、甲醇-0.2％醋酸、甲醇-0.2％甲酸，检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，柱温为30℃，进行考察。
结果如图12所示，图12为山枝仁配方颗粒不同流动相色谱图，结果表明，流动相为甲醇-0.2％甲酸和甲醇-0.2％磷酸时，山枝仁配方颗粒供试溶液中异槲皮苷的保留时间和峰形差异不大。因此，暂时选择流动相为甲醇-0.2％磷酸溶液梯度洗脱为洗脱条件。
2.3柱温考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁配方颗粒供试品溶液，考察了3种不同柱温下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，柱温分别为25、30和35℃，检测波长为355nm，流速为1.0mL/min，进行考察。
结果如图13和表32所示，图13为山枝仁配方颗粒不同柱温色谱图，表32为山枝仁配方颗粒不同柱温分析结果，结果表明，3种柱温均能对山枝仁配方颗粒中的异槲皮苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。在一定范围内，随着柱温升高，理论塔板数降低。因此，暂时选择柱温为30℃。
表32 山枝仁配方颗粒不同柱温分析结果
2.4流速考察：采用HPLC分析色谱条件检测山枝仁配方颗粒供试品溶液，考察了3种不同流速下供试品溶液中异槲皮苷的分离效果，流速分别为0.8、1.0和1.2mL/min，检测波长为355nm，柱温为30℃，进行考察。
结果如图14和表33所示，图14为山枝仁配方颗粒不同流速色谱图，表33为山枝仁配方颗粒不同流速分析结果，结果表明，3种流速均能对山枝仁配方颗粒中的异槲皮苷进行分离和检测，分离度均能达到要求。在一定范围内，随着流速增加，理论塔板数降低。因此，暂时选择流速为1.0mL/min。
表33 山枝仁配方颗粒不同流速分析结果
综上所述，HPLC分析色谱条件确定为：以十八烷基键合硅胶为填充剂(柱长250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm)；以甲醇为流动相A，以0.2％磷酸溶液为流动相B，按实施例1中表1的梯度进行洗脱，检测波长为355nm，柱温为30℃，流速为1.0mL/min。
3、供试品溶液制备方法考察
采用确定的HPLC分析色谱条件进行样品测定。
3.1提取溶剂考察：分别精密称定12份0.5g的山枝仁配方颗粒供试品，置于具塞锥形瓶中，分别精密加入30％甲醇、50％甲醇、70％甲醇、甲醇、乙醇和水各25mL，回流提取30min，放冷，以相应溶剂补足减失重量，过滤，取续滤液，得到供试品溶液。取10μL供试品溶液注入高效液相色谱仪进行测定，分析计算不同溶剂提取山枝仁配方颗粒中异槲皮苷含量。
结果见表34，表34为山枝仁配方颗粒不同提取溶剂分析结果，结果表明，以30％甲醇、50％甲醇和70％甲醇为提取溶剂时，样品中异槲皮苷含量差异不大，因此，暂定70％甲醇作为山枝仁配方颗粒提取溶剂。
表34 山枝仁配方颗粒不同提取溶剂分析结果
/>
3.2提取方式考察：分别精密称定4份0.3g的山枝仁配方颗粒供试品，置于具塞锥形瓶中，精密加入70％甲醇25mL，密塞，称定重量，制成山枝仁配方颗粒溶液。将其中2份山枝仁配方颗粒溶液进行超声提取，超声提取功率为600W，频率为40kHz；将2份山枝仁配方颗粒溶液进行回流提取，提取时间均为30min。提取结束后，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行测定，分析计算不同提取方式下异槲皮苷含量。
结果见表35，表35为山枝仁配方颗粒不同提取方式分析结果，结果表明，回流提取所得异槲皮苷含量较高，故以回流提取作为提取方式。
表35 山枝仁配方颗粒不同提取方式分析结果
3.3提取时间考察：精密称定8份0.5g的山枝仁配方颗粒，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，分别回流提取15min、30min和45min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤取滤液，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行测定，计算不同提取时间下异槲皮苷含量。
结果见表36，表36为山枝仁配方颗粒不同提取时间分析结果，结果表明，山枝仁配方颗粒样品中异槲皮苷在15min时可提取完全，为保证其他批次样品充分提取，故选择提取时间为30min。
表36 山枝仁配方颗粒不同提取时间分析结果
/>
3.4取样量考察：分别精密称定山枝仁配方颗粒供试品0.1g、0.3g、0.5g和1.0g，各2份，置具塞锥形瓶中，分别精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，回流提取30min，放冷，再次称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取滤液，即得供试品溶液。各取10μL供试品溶液注入色谱仪进行检测，分析计算不同取样量下异槲皮苷含量。
结果见表37，表37为山枝仁配方颗粒不同取样量分析结果，结果表明，在溶剂加入量一定的情况下，供试品取样量为0.5g时，异槲皮苷可提取完全，故选择取样量为0.5g。
表37 山枝仁配方颗粒不同取样量分析结果
综上所述，山枝仁配方颗粒供试品溶液制备方法确定为：精密称定0.5g山枝仁配方颗粒供试品，置于具塞锥形瓶中，精密加入25mL 70％甲醇，密塞，称定重量，超声提取30min，放冷，再称定重量，采用70％甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液，即得供试品溶液。
4、方法学考察
按照确定的方法制备供试品溶液，采用确定的HPLC分析色谱条件进行方法学考察。
4.1专属性实验：制备对照品溶液，将甲醇作为阴性对照溶液，进行检测，结果如图15所示。图15为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷含量测定专属性分析，结果表明，阴性溶液色谱图对待测峰的测定无干扰，表明该方法专属性好。
4.2精密度考察：将制备得到的对照品溶液连续进样6次，记录异槲皮苷的峰面积，计算RSD值，结果见表38。表38为异槲皮苷精密度考察，结果表明，异槲皮苷的峰面积RSD值为0.05％，本方法的进样精密度良好。
表38 异槲皮苷精密度考察
/>
4.3重复性考察：精密称定6份同一批山枝仁配方颗粒供试品0.3g，由同一操作人员制成供试品溶液，进行样品检测，计算6份供试品溶液中异槲皮苷的含量，结果见表39。表39为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷的重复性考察，结果表明，山枝仁配方颗粒中异槲皮苷的含量RSD值为1.36％，本方法重复性良好。
表39 山枝仁配方颗粒中异槲皮苷的重复性考察
4.4中间精密度考察：
4.4.1不同仪器考察：精密称定山枝仁配方颗粒供试品0.3g，制备山枝仁配方颗粒供试品溶液，分别在安捷伦1260、Waters e2695、岛津LC-20AD高效液相色谱仪上进行样品测定，高效液相色谱仪采用的色谱柱均为Agilent 5TC-C18(2)5μm 4.6×250mm)，结果见表40。表40为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷不同仪器考察，结果表明，用上述3种仪器对供试品进行检测时，异槲皮苷含量的RSD值为1.97％，本方法中间精密良好。
表40 山枝仁配方颗粒中异槲皮苷不同仪器考察
4.4.2不同人员和不同时间考察：取同一供试品由不同人员(A和B)在不同时间(Ⅰ和II)制备山枝仁配方颗粒供试品溶液，计算供试品溶液中异槲皮苷的含量，结果见表41。
表41为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷不同人员和不同时间考察，结果表明，山枝仁配方颗粒中异槲皮苷的含量测定结果RSD值为1.09％，本方法中间精密度良好。
表41 山枝仁配方颗粒中异槲皮苷不同人员和不同时间考察
/>
4.5线性考察：根据实施例1的线性考察方法进行考察，得到的异槲皮苷标准曲线与实施例1相同。
4.6稳定性考察：精密称定供试品粉末，制备供试品溶液，分别于0h、4h、8h、12h、16h和24h时进行检测，结果见表42。表42为山枝仁配方颗粒中异槲皮苷峰面积稳定性考察，结果表明，在本实验条件下，山枝仁配方颗粒中异槲皮苷的峰面积RSD值为0.25％，供试品溶液在24小时内稳定性良好。
表42 山枝仁配方颗粒中异槲皮苷峰面积稳定性考察
4.7加样回收实验：精密称定已知含有1.4mg/g异槲皮苷的山枝仁配方颗粒供试品约0.15g，共6份，分别精密加入一定量的混合对照品，制备供试品溶液，进行色谱分析，计算异槲皮苷回收率，结果见表43，表43为加样回收实验结果。计算公式如下：
回收率(％)＝100％*(测定量-样品中含量)/加入量。
结果表明，异槲皮苷回收率平均值为95.28％，回收率结果的RSD值为0.66％，本方法准确度良好。
表43 加样回收实验结果
4.8耐用性考察：采用不同品牌C18色谱柱(Agilent 5 TC-C18(2)250×4.6mm，5μm；Phenomenex Luna C18(2)100A 250×4.6mm，5μm；岛津Wondasil C18 for HerbalMedicine 250×4.6mm，5μm)在同一仪器对同一供试品溶液进行检测，结果见表44。表44为方法耐用性考察，结果表明，不同色谱柱的分析测量结果的RSD值为1.35％，本方法耐用性良好。
表44 方法耐用性考察
5、供试品含量测定验证
按照确定的山枝仁配方颗粒供试品溶液制备方法，采用确定的HPLC分析色谱条件进行山枝仁配方颗粒供试品含量测定。
标汤验证：以3批山枝仁配方颗粒为供试品，按确定的方法制备供试品溶液并测定，记录峰面积，计算异槲皮苷的含量，结果见表45。表45为3批山枝仁配方颗粒含量测定验证，结果表明，山枝仁配方颗粒中异槲皮苷含量的平均值为1.4mg/g，平均值加减30％的限量为1.0～1.8mg/g，SD值为0.3，平均值加减3SD的限量为0.5～2.3mg/g。
表45 3批山枝仁配方颗粒含量测定验证
综上所述，暂将山枝仁配方颗粒中山枝仁配方颗粒的异槲皮苷含量测定范围确定为“本品每1g含异槲皮苷(C21H20O12)应为0.5mg～2.3mg”。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
Claims (6)
1.一种山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，包括：
采用高效液相色谱法检测山枝仁药材、饮片、提取物及制剂中的异槲皮苷的含量；所述制剂为标汤或配方颗粒；
所述高效液相色谱法色谱条件为：以甲醇为流动相A，以0.1~0.4%磷酸为流动相B，进行梯度洗脱；
所述梯度洗脱过程中，流动相A和流动相B的体积比例变化为：
0~10min，流动相A 25%→40%，流动相B 75%→60%；
10~30min，流动相A 40%→60%，流动相B 60%→40%；
所述高效液相色谱法以十八烷基键合硅胶为色谱柱填充剂；
还包括：将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂进行前处理，所述前处理具体为将山枝仁药材、饮片、提取物及制剂与溶剂混合，进行回流提取或超声提取；
所述溶剂为乙醇、水或30%~100%甲醇。
2.根据权利要求1所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，以甲醇为流动相A，以0.2%磷酸水溶液为流动相B。
3.根据权利要求1所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，所述色谱柱柱长为250mm，内径为4.6mm，粒度为5μm。
4.根据权利要求1所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的流速为0.8~1.2 mL/min。
5.根据权利要求1所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的检测波长为350~360nm。
6.根据权利要求1所述山枝仁药材、饮片、提取物及制剂的检测方法，其特征在于，所述高效液相色谱法的柱温为25~35℃。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003012528A (ja) * | 2002-04-24 | 2003-01-15 | Daicel Chem Ind Ltd | イチョウエキス及びその製造法 |
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Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2003012528A (ja) * | 2002-04-24 | 2003-01-15 | Daicel Chem Ind Ltd | イチョウエキス及びその製造法 |
| CN103018371A (zh) * | 2012-12-24 | 2013-04-03 | 江苏苏中药业集团股份有限公司 | 黄蜀葵花药材及其提取物与制剂的质量控制方法 |
| CN113252821A (zh) * | 2021-05-18 | 2021-08-13 | 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司 | 一种银杏叶提取中间体或其制剂中黄酮类成分指纹图谱的建立方法及其建立的指纹图谱 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Christian Bäcker et al.Polyphenolic compounds from the leaves of Pittosporum angustifolium.Biochemical Systematics and Ecology.2014,第55卷101-103. * |
| Ilhem Rjeibi et al.Evaluation of nutritional values, phenolic profile, aroma compounds and biological properties of Pittosporum tobira seeds.Lipids in Health and Disease.2017,第16卷(第206期),1-10. * |
| 王李丽 等.RP-HPLC法测定罗布麻叶及其中成药中3个黄酮类成分的含量.药物分析杂志.2011,第31卷(第5期),903-906. * |
| 程聪梅 等.HPLC法同时测定桑叶药材及其炮制品中绿原酸、芦丁和异槲皮苷的含量.中国药房.2016,第27卷(第21期),2990-2992. * |
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